CN107095850A - 治疗剂、用途和方法 - Google Patents

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皮亚·斯文森
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索伦·克拉格·莫斯楚普
霍尔格·乔恩·默勒
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Abstract

本发明涉及用于向单核细胞和/或衍生自单核细胞的细胞靶向递送免疫抑制剂的治疗剂，其包含免疫抑制剂和对单核细胞和/或衍生自单核细胞的细胞具有特异性的结合部分。在一个实施方式中，所述治疗剂是糖皮质激素‑抗体偶联物。本发明还涉及包含所述治疗剂的方法、用途、试剂盒和组合物。

Description

治疗剂、用途和方法
本申请是申请日为2010年9月29日，名称为“治疗剂、用途和方法”的中国专利申请201080054136.0号的分案申请。
本发明涉及用于向单核细胞和/或源自单核细胞的细胞靶向递送免疫抑制剂的治疗剂。本发明还涉及包含此类治疗剂的方法、用途、试剂盒和组合物。
糖皮质激素(例如地塞米松)是最有效的已知抗炎药物，常用于早期的类风湿性关节炎(RA)，在大部分患者中以低剂量长期使用。然而，在用于长期治疗时，糖皮质激素具有限制慢性治疗的严重不良副作用(例如，骨质疏松、肌肉萎缩、肾上腺抑制、感染风险提高、生长阻滞、II型糖尿病等)。
巨噬细胞是先天免疫防御的一部分，并且在很多感染性、自身免疫性和恶性疾病中发挥核心作用。在自身免疫性/炎性疾病(例如类风湿性关节炎)中，巨噬细胞是已知在疾病进程中至关重要的炎性分子(例如TNF-α)的主要来源。在很多感染性疾病(例如TB和HIV)中，巨噬细胞藏匿感染因子。少数恶性疾病来源于单核细胞/巨噬细胞系的细胞，例如组织细胞肉瘤。
CD163是在巨噬细胞上表达的膜受体分子，其作为血红蛋白-触珠蛋白复合物的胞吞受体发挥功能。通过这种在生理学上非常重要的功能，CD163每天摄取约1g的血红蛋白，因此，该蛋白质可能是巨噬细胞上表达最高的受体。
在第一方面，本发明提供了一种用于向单核细胞和/或源自单核细胞的细胞靶向递送免疫抑制剂的治疗剂，其包含：
(a)对单核细胞和/或源自单核细胞的细胞具有特异性的结合部分(bindingmoiety)；和
(b)免疫抑制剂。
药物对巨噬细胞的直接靶向(例如，下调炎性细胞因子的产生)能够对某些疾病产生显著影响，而不影响体内的其他细胞。因此，药物对巨噬细胞靶向以在巨噬细胞中发挥作用可降低由于对其他类型细胞的作用而导致的副作用。因此，靶向能够提高药物的治疗指数。
例如，将糖皮质激素特异性地靶向到受影响组织和/或疾病改性细胞的方法可提供较低副作用的独特前景并解决上述问题。特别地，将糖皮质激素选择性地指向患关节炎的关节但不伤害骨骼和软组织可具有显著的治疗优势。
众所周知，单核细胞是在免疫系统中发挥作用的单核吞噬细胞，也就是说，它们是具有单个细胞核的白细胞，其能够摄取外来物质。单核细胞从血液迁移到机体组织并分化成诸如巨噬细胞的细胞。因此，所述“源自单核细胞的细胞”包括已经从单核细胞分化而来的那些细胞类型。
所述“治疗剂”包括包含一个或多个分子的任何纯化或分离的天然或化学合成的实体。优选地，此术语包括一种或多种多肽和/或一种或多种小化学分子，其中所述多肽和/或小化学分子可经或未经化学基团离子性和/或疏水性和/或共价加成的修饰。
术语“结合部分”包括能够通过共价和/或离子性相互作用与一种或多种其他分子的一个或多个区域可逆和/或不可逆地结合的本发明治疗剂的一个或多个区域。
或者，可通过重组DNA技术产生作为融合化合物的治疗剂，从而使一段DNA包含编码本发明治疗剂的所述两个实体(即，上述实体(a)和(b))的各区域，所述区域彼此相邻，或由编码连接肽的区域分隔，所述连接肽不破坏所述治疗剂的期望性质。可信地，所述治疗剂的两个部分可完全或部分重叠。
所述对单核细胞和/或源自单核细胞的细胞的“结合特异性”是指结合部分能够与单核细胞和/或源自单核细胞的细胞结合。优选所述结合部分能够与单核细胞和/或源自单核细胞的细胞在体内结合，即在所述细胞存在于体内的生理条件下结合。此结合特异性可通过本领域熟知的方法确定，例如，使用表达单核细胞和/或源自单核细胞的细胞的特异性标记或其结构域或片段的转染细胞通过ELISA、免疫组织化学、免疫沉淀法、Western印迹以及流式细胞术(参见后附的实施例)。
在另一个实施方式中，所述结合部分能够选择性地结合单核细胞和/或源自单核细胞的细胞。所述“能够选择性地结合”包括如源自抗体的结合部分，其对单核细胞和/或源自单核细胞的细胞的结合强度是对其他细胞类型的结合强度的至少10倍，例如至少50倍，或至少100倍。所述结合部分能够在生理条件，例如在体内，选择性地结合单核细胞和/或源自单核细胞的细胞。用于测量相对结合强度的适合方法包括免疫分析，例如其中所述结合部分是抗体的免疫分析(参见Harlow&Lane，“Antibodies：A Laboratory”，Cold SpringHabor Laboratory Press，New York(通过引用并入本文)。或者，可使用竞争性分析或使用分析(Biacore International AB，Sweden)评估结合。
在其他实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段，或它们的变体、融合物或衍生物专门结合单核细胞和/或源自单核细胞的细胞。
优选地，本发明提供了一种治疗剂，其中对单核细胞和/或源自单核细胞的细胞具有特异性的结合部分选自以下组成的组：
(a)抗体或其抗原结合片段，或所述抗体或其抗原结合片段的变体、融合物或衍生物，或所述变体或衍生物的融合物；
(b)触珠蛋白-血红蛋白(Hp-Hb复合物)；
(c)脂质体；
(d)抗体模拟物(例如，基于非抗体骨架)；
(e)RNA适体；
(f)小分子；
(g)CovX体；和
(h)末端甘露糖部分。
CovX体通过将药效基团(pharmacophore)经由连接子与专门设计的抗体的结合位点共价连接而产生，有效地对抗体进行重编程(Tryder et al.，2007，Bioorg.Med.Chem.Lett.，17：501-66)。所得到的是新型的化学实体，所形成的化学实体中，每个组分均对完整的CovX体提供期望的特性，特别地，所述实体具有肽的生物作用和抗体的长半衰期。
已知末端甘露糖残基参与提高巨噬细胞对重组葡糖脑苷脂酶，例如Cerezyme(Edmunds，Directory of Therapeutic Enzymes，McGrath and Walsh(编辑)，CRC pressTaylor and Francis Group，Boca Ranton，2006；和Mistry et al.，1996，Lancet，348：1555-9)的摄取。
在一个实施方式中，所述结合部分对选自以下组成的组中的受体具有特异性：CD163受体(见下文)；甘露糖受体(例如，人甘露糖受体，例如具有登录号AAA60389的序列的MARCO甘露糖受体(参见Elomaa et al，1995，Cell80：603-609和Elomaa et al.，1998，J.Biol.Chem.273(8)：4530-4538))；M160/CD163b(参见Gronlund et al.，2000，J.Immunol.165：6406-6415)；巨噬细胞清道夫受体(例如，I型或II型巨噬细胞清道夫受体)；巨噬细胞特异性的补体受体(例如，Fc受体)；Siglec受体(即，“唾液酸结合性Ig样凝集素”受体)，例如Siglec 1、Siglec 5或Siglec 11(Crocker et al.，2007，Nat.Rev.Immunol.，7：255-66)。
优选地，所述结合部分对CD163受体具有特异性。
CD163是由九个细胞外清道夫受体的富半胱氨酸(SRCR)B型结构域组成的清道夫受体。其介导触珠蛋白-血红蛋白(Hp-Hb)复合物的清除并且参与炎症过程的调控，所述复合物是在血管内溶血期间血红蛋白被释放到循环系统中时形成的。CD163被认为专门表达于单核细胞系表面。其由循环系统中的驻留单核细胞表达，并且在向巨噬细胞成熟期间上调。其在驻留组织的巨噬细胞上以及替代性活化的巨噬细胞(M2)和TIE2+巨噬细胞上高度表达，并显示由造血干细胞/造血祖细胞的CD34+亚群表达，并且还提出其表达于髓系树突细胞亚类。
优选地，所述CD163受体是人蛋白，但其可来自任何哺乳动物，例如家养哺乳动物(优选具有农业或商业上的重要性的家养哺乳动物，包括马、猪、牛、羊、犬和猫)。所述“哺乳动物蛋白”包括见于、源自和/或分离自一种或多种哺乳动物细胞的任何蛋白，例如术语“人蛋白”包括见于、源自和/或分离自一种或多种人细胞的蛋白。
优选地，所述CD163受体选自由数据库登录号CAB45233；AAY99762；AAH51281；EAW8862；EAW8863；EAW8864；EAW8865；EAW8866；NP_004235；NP_98161；Swiss-Prot.Q86VB7.1所定义的蛋白质组成的组。
数据库登录号AAH51281、NP_004325和Swiss-Prot.Q86VB7.1：
＞sp|Q86VB7|C163A_人清道夫受体的富半胱氨酸I型蛋白M130 OS＝人GN＝CD163PE＝1 SV＝1
MSKLRMVLLEDSGSADFRRHFVNLSPFTITVVLLLSACFVTSSLGGTDKELRLVDGENKCSGRVEVKVQEEWGTVCNNGWSMEAVSVICNQLGCPTAIKAPGWANSSAGSGRIWMDHVSCRGNESALWDCKHDGWGKHSNCTHQQDAGVTCSDGSNLEMRLTRGGNMCSGRIEIKFQGRWGTVCDDNFNIDHASVICRQLECGSAVSFSGSSNFGEGSGPIWFDDLICNGNESALWNCKHQGWGKHNCDHAEDAGVICSKGADLSLRLVDGVTECSGRLEVRFQGEWGTICDDGWDSYDAAVACKQLGCPTAVTAIGRVNASKGFGHIWLDSVSCQGHEPAVWQCKHHEWGKHYCNHNEDAGVTCSDGSDLELRLRGGGSRCAGTVEVEIQRLLGKVCDRGWGLKEADVVCRQLGCGSALKTSYQVYSKIQATNTWLFLSSCNGNETSLWDCKNWQWGGLTCDHYEEAKITCSAHREPRLVGGDIPCSGRVEVKHGDTWGSICDSDFSLEAASVLCRELQCGTVVSILGGAHFGEGNGQIWAEEFQCEGHESHLSLCPVAPRPEGTCSHSRDVGVVCSRYTEIRLVNGKTPCEGRVELKTLGAWGSLCNSHWDIEDAHVLCQQLKCGVALSTPGGARFGKGNGQIWRHMFHCTGTEQHMGDCPVTALGASLCPSEQVASVICSGNQSQTLSSCNSSSLGPTRPTIPEESAVACIESGQLRLVNGGGRCAGRVEIYHEGSWGTICDDSWDLSDAHVVCRQLGCGEAINATGSAHFGEGTGPIWLDEMKCNGKESRIWQCHSHGWGQQNCRHKEDAGVICSEFMSLRLTSEASREACAGRLEVFYNGAWGTVGKSSMSETTVGVVCRQLGCADKGKINPASLDKAMSIPMWVDNVQCPKGPDTLWQCPSSPWEKRLASPSEETWITCDNKIRLQEGPTSCSGRVEIWHGGSWGTVCDDSWDLDDAQVVCQQLGCGPALKAFKEAEFGQGTGPIWLNEVKCKGNESSLWDCPARRWGHSECGHKEDAAVNCTDISVQKTPQKATTGRSSRQSSFIAVGILGVVLLAIFVALFFLTKKRRQRQRLAVSSRGENLVHQIQYREMNSCLNADDLDLMNSSENSHESADFSAAELISVSKFLPISGMEKEAILSHTEKENGNL
[SEQ ID NO：7]
数据库登录号AAY99762；CAB45233，NP_98161和Swiss-Prot.Q86VB7.2：＞sp|Q86VB7-3|C163A_清道夫受体的富半胱氨酸I型蛋白M130的人同种型短尾变体：OS＝人GN＝CD163
MSKLRMVLLEDSGSADFRRHFVNLSPFTITVVLLLSACFVTSSLGGTDKELRLVDGENKCSGRVEVKVQEEWGTVCNNGWSMEAVSVICNQLGCPTAIKAPGWANSSAGSGRIWMDHVSCRGNESALWDCKHDGWGKHSNCTHQQDAGVTCSDGSNLEMRLTRGGNMCSGRIEIKFQGRWGTVCDDNFNIDHASVICRQLECGSAVSFSGSSNFGEGSGPIWFDDLICNGNESALWNCKHQGWGKHNCDHAEDAGVICSKGADLSLRLVDGVTECSGRLEVRFQGEWGTICDDGWDSYDAAVACKQLGCPTAVTAIGRVNASKGFGHIWLDSVSCQGHEPAVWQCKHHEWGKHYCNHNEDAGVTCSDGSDLELRLRGGGSRCAGTVEVEIQRLLGKVCDRGWGLKEADVVCRQLGCGSALKTSYQVYSKIQATNTWLFLSSCNGNETSLWDCKNWQWGGLTCDHYEEAKITCSAHREPRLVGGDIPCSGRVEVKHGDTWGSICDSDFSLEAASVLCRELQCGTVVSILGGAHFGEGNGQIWAEEFQCEGHESHLSLCPVAPRPEGTCSHSRDVGVVCSRYTEIRLVNGKTPCEGRVELKTLGAWGSLCNSHWDIEDAHVLCQQLKCGVALSTPGGARFGKGNGQIWRHMFHCTGTEQHMGDCPVTALGASLCPSEQVASVICSGNQSQTLSSCNSSSLGPTRPTIPEESAVACIESGQLRLVNGGGRCAGRVEIYHEGSWGTICDDSWDLSDAHVVCRQLGCGEAINATGSAHFGEGTGPIWLDEMKCNGKESRIWQCHSHGWGQQNCRHKEDAGVICSEFMSLRLTSEASREACAGRLEVFYNGAWGTVGKSSMSETTVGVVCRQLGCADKGKINPASLDKAMSIPMWVDNVQCPKGPDTLWQCPSSPWEKRLASPSEETWITCDNKIRLQEGPTSCSGRVEIWHGGSWGTVCDDSWDLDDAQVVCQQLGCGPALKAFKEAEFGQGTGPIWLNEVKCKGNESSLWDCPARRWGHSECGHKEDAAVNCTDISVQKTPQKATTGRSSRQSSFIAVGILGVVLLAIFVALFFLTKKRRQRQRLAVSSRGENLVHQIQYREMNSCLNADDLDLMNSSGGHSEPH
[SEQ ID NO：8]
数据库登录号Swiss-Prot.Q86VB7.3
＞sp|Q86VB7-2|C163A_清道夫受体的富半胱氨酸I型蛋白M130的人同种型长尾变体2：OS＝人GN＝CD163
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[SEQ ID NO：9]
数据库登录号Swiss-Prot.Q86VB7.3
＞sp|Q86VB7-4|C163A_清道夫受体的富半胱氨酸I型蛋白M130的人同种型4：OS＝人GN＝CD163
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[SEQ ID NO：10]
方便地，所述CD163受体定位于细胞的表面上，优选表达CD163受体的恶性细胞，免疫调控细胞，发炎细胞或感染细胞。
在优选的实施方式中，所述CD163受体定位于单核细胞的表面上和/或源自单核细胞的细胞的表面上，其可有利地选自以下组成的组：单核细胞、巨噬细胞、源自单核细胞的树突细胞和活化的巨噬细胞亚型(例如，M1，M2)。
“定位于细胞的表面上”包括的含义为CD163受体与细胞结合，从而使CD163受体的一个或多个区域存在于所述细胞表面的外表面上。例如，CD163受体可插入到细胞质膜中(即，定位为跨膜蛋白)，且一个或多个区域存在于细胞外表面上。或者，整个CD163受体可在细胞外侧，并通过共价和/或离子相互作用使其定位到所述细胞表面的一个或多个特定区域。
细胞生物学领域的技术人员可以理解术语“免疫调控细胞”，其包括能够改变或调控免疫反应的细胞。此类细胞包括辅助T细胞、γδT细胞、B淋巴细胞(B细胞)、肥大细胞和树突细胞。
细胞生物学领域的技术人员可以理解术语“感染细胞”，其包括被感染性或致病性微生物侵袭或与感染性或致病性微生物相关的任何细胞。此类微生物包括细胞内病原体，例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和人免疫缺陷病毒(HIV)。
细胞生物学领域的技术人员可以理解术语“发炎细胞”，其包括已经被诱导出炎性反应的任何细胞。
最优选地，所述细胞是巨噬细胞。
免疫学领域的技术人员熟知，巨噬细胞是源自单核细胞的吞噬细胞，且其功能在于破坏某些细菌、原生动物和肿瘤细胞，释放刺激其他免疫细胞的物质，并参与抗原呈递。
在一个优选的实施方式中，本发明提供了一种治疗剂，其中所述结合部分包含对CD163受体具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段，或保留了对CD163受体的结合特异性的所述抗体或其抗原结合片段的变体、融合物或衍生物或所述变体或衍生物的融合物，或由它们组成。
“抗体”包括基本完整的抗体分子，以及嵌合抗体、人源化抗体、人抗体(其中相对于天然存在的人抗体至少一个氨基酸发生突变)、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同源二聚体和异源二聚体，及其抗原结合片段和衍生物。
例如，所述抗体或其抗原结合片段，或它们的变体、融合物或衍生物可包含完整抗体，由完整抗体组成或基本由完整抗体组成。所述“基本由……组成”是指所述抗体或其抗原结合片段或它们的变体、融合物或衍生物由足以保留对CD163受体的结合特异性的完整抗体的一部分组成。
“保留结合特异性”是指所述抗体或其抗原结合片段或它们的变体、融合物或衍生物能够结合CD163受体。例如，在一个实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的变体、融合物或衍生物显示的结合亲和力(Kd)为所述抗体或其抗原结合片段的结合亲和力的50％或以上。
在一个实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段或它们的变体、融合物或衍生物结合于选自以下组成的组中的CD163受体的结构域：结构域1、结构域2、结构域3、结构域4、结构域5、结构域6、结构域7、结构域8和结构域9。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段或它们的变体、融合物或衍生物结合于CD163受体的结构域1。
在可选的优选实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段或它们的变体、融合物或衍生物结合于CD163受体的结构域3。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段或它们的变体、融合物或衍生物显示出在钙存在下对CD163受体的结合亲和力高于钙不存在时的情况。本文描述了可用于测定结合部分对CD163受体的结合亲和力的方法，其可见于后附的实施例中。
术语“抗体”还包括所有类型的抗体，包括IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。因此，所述抗体可以是IgG分子，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子。
优选地，所述抗体是IgG抗体，例如IgG2或IgG4抗体。在一个优选的实施方式中，所述抗体是IgG4抗体，其中在241位的丝氨酸已经被脯氨酸残基取代(即，S241P)，已知此取代稳定了IgG4分子中的二硫键，从而产生更为稳定的抗体(Angal et al.，1993，Mol.Immunol.，30：105-8)。
在优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段、它们的变体、融合物或衍生物是分离和/或纯化的形式。
在一个实施方式中，所述抗体是非天然存在的抗体。当然，在所述抗体是天然存在抗体的情况下，将其以分离的形式提供(即，不同于其天然存在的形式)。
在本发明特别优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段或它们的变体、融合物或衍生物能够诱导CD163受体和/或所述治疗剂的内化(internalisation)。
所述“能够诱导内化”是指所述结合部分能够引起与将分子从细胞的细胞外表面转移到细胞的细胞内表面的过程相关的分子、生物化学和细胞事件。负责分子的细胞内内化的过程是分子和细胞生物学领域的技术人员熟知的，能够参与细胞外分子(例如激素、抗体和有机小分子)、膜相关分子(例如细胞表面受体)和与细胞外分子结合的膜相关分子的复合物(例如，与跨膜受体结合的配体，或与膜相关分子结合的抗体)的内化。
在一个实施方式中，所述结合部分是完整的抗体。
然而，本领域技术人员可以理解，抗体或其抗原结合片段的结合特异性是由存在于重链和轻链成分的可变区内的互补决定区(CDR)所赋予的。
抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)参与抗原识别，这是首先通过早期蛋白酶消化实验而认识到的事实。通过啮齿类抗体的“人源化”发现了进一步的证据。源于啮齿类的可变区可与源于人的恒定区融合，从而使所得的抗体保留啮齿源抗体的抗原特异性(Morrison et al(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，6851-6855)。
根据涉及均包含一种或多种可变区的抗体片段的细菌表达的实验，已知抗原特异性由可变区赋予，并且与恒定区无关。这些分子包括Fab样分子(Better et al(1988)Science 240，1041)；Fv分子(Skerra et al(1988)Science 240，1038)；通过柔性寡肽连接VH和VL配偶区的单链Fv(ScFv)分子(Bird et al(1988)Science 242，423；Huston et al(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5879)和包含分离的V区的单域抗体(dAb)(Ward etal(1989)Nature 341，544)。涉及合成保留其特异结合位点的抗体片段的技术的综述可见于Winter&Milstein(1991)Nature 349，293-299。
由此，术语“抗原结合片段”是指能够结合CD163受体的抗体的功能性片段。
本发明的示例性抗原结合片段可选自Fv片段(例如，单链Fv和二硫键键合的Fv)和Fab样片段(例如，Fab片段，Fab′片段和F(ab)2片段)组成的组。
在优选的实施方式中，所述抗原结合片段是scFv。
使用抗体片段而非完整抗体具有数倍的优势。所述片段较小的尺寸可产生改进的药理学性质，例如更好的实体组织穿透性。此外，抗原结合片段，例如Fab、Fv、ScFv和dAb抗体片段能够在大肠杆菌(E.coli)或酵母中表达并分泌，由此可容易地生产大量的所述片段。本发明的范围还包括抗体及其抗原结合片段的修饰形式，例如通过共价连接聚乙二醇或其他合适聚合物的修饰。
在更优选的实施方式中，所述抗原结合片段是域抗体(dAb)，例如纳米抗体(nanobody)。所述“域抗体”是指对应于人抗体重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的多肽。域抗体具有约13kDa的分子量，或小于完整抗体尺寸的十分之一。与常规抗体不同，域抗体在细菌、酵母和哺乳细胞系统中表达良好。此外，很多dAb高度稳定，并且即便在经历严酷条件，例如冻干或热变性后仍保持活性。这些特征使得域抗体可适应广泛的药物制剂条件和制造过程。此外，dAb的小尺寸允许每克产品中更高的摩尔数量，其能够提供显著提高的每剂量药效，并降低整体的制造成本。
可将针对特定靶标选择的域抗体用作构建单元以产生具有常规抗体或蛋白质无法获得的独特特征的治疗产品，例如在一个易于生成的分子中与两种治疗性靶标结合的双靶向dAb，具有可控血清半衰期的dAb，用于肺或胃肠(GI)道疾病的肺或口服给药的dAb，以及针对无法由IgG轻易解决的靶标的dAb。
此类抗体可通过重组产生，但也已知存在于骆驼(Curr.Opin.Pharmacol.，8，(2008)，600-608)和鲨鱼(例如，IgNAR；Curr.Opin.Pharmacol.，8，(2008)，600-608)中。其他优选的抗体变体包括分离的重链可变区(VH)或分离的轻链可变区(VL)，例如来自人抗体(Curr.Opin.Pharmacol.，8，(2008)，600-608)，和iMab(WO 03/050283)。因此，所述域抗体可选自来自骆驼的单域抗体、来自鲨鱼的单域抗体和来自人的分离的VH或VL域。
用于产生抗体和抗体片段的方法是本领域熟知的。例如，抗体的产生可通过采用诱导抗体分子的体内产生、筛选免疫球蛋白库的多种方法中的任一种(Orlandi.et al，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：3833-3837；Winter et al.，1991，Nature 349：293-299)，或通过培养的细胞系产生单克隆抗体分子。这些包括但不限于杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术和EB病毒(EBV)-杂交瘤技术(Kohler et al.，1975.Nature 256：4950497；Kozbor et al.，1985.J.Immunol.Methods 81：31-42；Cote et al.，1983.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2026-2030；Cole et al.，1984.Mol.Cell.Biol.62：109-120)。
所述抗体或其抗原结合片段或它们的衍生物可通过重组的方式产生(即，所述抗体为重组抗体)。
优选地，所述抗体是单克隆抗体。
可通过已知的技术制备针对所选抗原的适合的单克隆抗体，例如在“MonoclonalAntibodies：A manual of techniques”，H Zola(CRC Press，1988)和“MonoclonalHybridoma Antibodies：Techniques and Applications”，J G R Hurrell(CRC Press，1982)中公开的那些，以上文献通过引用并入本文。
抗体片段还可通过使用本领域熟知的方法获得(参见，例如Harlow&Lane，1988，“Antibodies：A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，该文献通过引用并入本文)。例如，本发明的抗体片段可通过抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌或哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞培养物或其他蛋白表达系统)中表达编码所述片段的DNA来制备。或者，可通过常规方法由完整抗体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶降解获得抗体片段。或者，如本领域所知，可通过无细胞的体外表达获得抗体片段。
如本文的定义，所述结合部分可以是抗体或其抗原结合片段的变体、融合物或衍生物，只要所述变体、融合物或衍生物保留了对CD163受体的结合特异性。
可通过本领域熟知的蛋白质工程和定点突变的方法，使用重组多核苷酸制备变体(参见，例如Molecular Cloning：a Laboratory Manual，第3版，Sambrook&Russell，2001，Cold Spring Harbor Laboratory Press，通过引用并入本文)。
所述“融合物”包括与任何其他多肽融合的抗体或其抗原结合片段(如本文定义)。例如，所述抗体或其抗原结合片段可以与诸如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或蛋白A的多肽融合，以有利于其纯化。此类融合物的实例是本领域技术人员熟知的。类似地，所述抗体或其抗原结合片段可以与寡聚组氨酸标签例如His6或由其他抗体识别的表位(例如熟知的Myc标签表位)融合。
所述融合物可包含赋予本发明所述抗体或其抗原结合片段期望特征的其他部分，例如所述部分可用于检测或分离所述抗体或其抗原结合片段，或促进所述抗体或其抗原结合片段的细胞摄取。如本领域技术人员所熟知，所述部分可以是，例如生物素部分、放射性部分、荧光性部分，例如小荧光团或绿色荧光蛋白(GFP)荧光团。所述部分可以是免疫原性标签，例如，本领域技术人员所知的Myc标签，或者可以是本领域技术人员所知的能够促进细胞摄取的亲脂性分子或多肽域。
用于使其他部分与抗体(或其融合物、变体或衍生物)偶联的方法是本领域熟知的。示例性的方法描述于Bioconjugate Techniques，第2版(2008)；Hermanson(AcademicPress，Inc.)和Veronese et al.，(1999；Farmaco 54(8)：497-516)；Stayton et al.，(2005；Orthod Craniofac Res 8(3)：219-225)；Schrama et al.，(2006；Nat Rev DrugDiscov 5(2)：147-159)；Doronina et al.(2003；Nat Biotechnol 21(7)：778-784)；Carter et al.，(2008；Cancer J 14(3)：154-169)；Torchilin(2006；Annu Rev BiomedEng 8：343-375)；Rihova(1998；Adv Drug Deliv Rev 29(3)：273-289)；Goyal et al.(2005；Acta Pharm 55(1)：1-25)；Chari(1998；Adv Drug Deliv Rev 31(1-2)：89-104)；Gamett(2001；Adv Drug Deliv Rev 53(2)：171-216)；Allen(2002；Nat Rev Cancer 2(10)：750-763)。
本发明抗体或其抗原结合片段的所述“变体”包括保守或非保守性的插入、删除和取代。特别地，其包括所述抗体或其抗原结合片段的序列的变体，其中的所述变化基本不改变所述抗体或其抗原结合片段的活性。特别地，其包括所述抗体或其抗原结合片段的变体，其中所述改变基本不改变对CD163受体的结合特异性。
所述多肽变体可具有与本文定义的本发明抗体或其抗原结合片段的一种或多种氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，例如，与如本文定义的本发明抗体或其抗原结合片段的一种或多种氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
可使用适合的计算机程序确定两条多肽之间的序列同一性百分比，例如University of Wisconsin Genetic Computing Group的GAP程序，并且应理解，所述同一性百分比是相对于其序列经最佳比对的多肽而计算的。
或者，也可以使用Clustal W程序(如Thompson et al.，1994，Nucl.Acid Res.22：4673-4680中所述，该文献通过引用并入本文)进行比对。
所用的参数可如下：
-快速成对比对参数：K元组(字)大小，1；窗口大小，5；空位罚分，3；上对角线(topdiagonals)的数量，5；计分方法，x百分比。
-多比对参数：空位开放罚分，10；空位延伸罚分，0.05。
-计分矩阵：BLOSUM。
或者，可使用BESTFIT程序测定局部序列的比对。
本发明所述的抗体或其抗原结合片段、或它们的变体、融合物或衍生物可包含经修饰或衍生化的一个或多个氨基酸。
可通过与官能侧基的反应实现一个或多个氨基酸的化学衍生。此类衍生化的分子包括，例如其中的游离氨基经衍生形成胺的盐酸盐，p-甲苯磺酰基、羧基苯酰氧基、叔丁氧基羰基、氯乙酰基或甲酰基。游离羧基可经衍生形成盐，甲基酯和乙基酯或其他类型的酯和肼类。游离羟基可经衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。化学衍生物还包括包含20种标准氨基酸的天然存在氨基酸衍生物的那些肽。例如：可由4-羟基脯氨酸取代脯氨酸；由5-羟基赖氨酸取代赖氨酸；由3-甲基组氨酸取代组氨酸；由高丝氨酸取代丝氨酸，以及由鸟氨酸取代赖氨酸。衍生物还包括包含一个或多个添加或删除的肽，只要必需的活性得到保留。所包括的其他修饰为酰胺化、氨基末端酰化(例如，乙酰化或巯基乙酸酰胺化)、末端羧基酰胺化(例如，使用氨或甲胺)，以及类似的末端修饰。
本领域技术人员还可以理解拟肽化合物也是有用的。因此，本发明包括能够结合CD163受体的拟肽化合物。术语“拟肽”是指模拟作为治疗剂的具体肽的构象和期望特征的化合物。
例如，本发明的抗体、抗原结合片段、它们的变体、融合物或衍生物不仅包含其中的氨基酸残基通过肽键(-CO-NH-)连接的分子，还包括其中的肽键被反转(reversed)的分子。此类反转型(retro-inverso)拟肽可使用本领域已知的方法制备，例如Meziere et al.(1997)J.Immunol.159，3230-3237中描述的那些，该文献通过引用并入本文。此方法包括制备包含涉及骨架变化但侧链定位不变的拟肽。包含替代CO-NH肽键的NH-CO键的反转肽对蛋白水解的抗性高很多。或者，本发明的抗体、抗原结合片段、它们的变体、融合物或衍生物可以是拟肽化合物，其中一个或多个氨基酸残基通过-y(CH2NH)-键而不是常规酰胺键连接。
或者，可无需所述肽键，只要使用保留了氨基酸残基的碳原子之间的间隙的适合的连接子部分；连接子部分具有与肽键基本相同的电荷分布和基本相同极性是有利的。
应理解，可方便地封闭本发明抗体、抗原结合片段、它们的变体、融合物或衍生物的N末端或C末端，从而有助于降低对外切蛋白酶降解的易感性。
现已使用多种非编码的或修饰的氨基酸，例如D-氨基酸和N-甲基氨基酸，来修饰哺乳动物肽。此外，可通过共价修饰来稳定推测的生物活性构象，例如环化，或通过引入内酰胺或其他类型的桥键，例如参见Veber et al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：2636和Thursell et al.，1983，Biochem.Biophys.Res.Comm.111：166，该两篇文献通过引用并入本文。
很多合成策略中的常见主题是向基于肽的骨架中引入一些环状部分。所述环状部分限制肽结构的构象空间，这常常导致肽对特定生物受体的特异性提高。这种策略的额外优点是将环状部分引入到肽中还可产生对细胞肽酶的敏感性降低的肽。
因此，示例性的本发明抗体、抗原结合片段、它们的变体、融合物或衍生物可包含末端的半胱氨酸。此类多肽可通过末端半胱氨酸的巯基形成的二硫键以杂环形式(heterodetic cyclic form)存在，或通过末端氨基酸之间形成酰胺肽键以均环形式(homodetic form)存在。如上所述，通过N末端和C末端半胱氨酸之间的二硫键或酰胺键使小肽环化可以通过减少蛋白水解且还提高结构刚性以产生特异性更高的化合物，而克服了有时见于线性肽中特异性和半衰期的问题。通过二硫键环化的多肽具有游离的氨基和羧基末端，其仍可能对蛋白降解敏感，而通过在N-末端氨基和C-末端羧基之间形成酰胺键环化的肽由此不再包含游离的氨基或羧基末端。因此，肽可通过C-N键或二硫键连接。
本发明不以任何方式受限于用于对肽进行环化的方法，而是包括其环状结构可通过任何适合的合成方法获得的肽。因此，杂键(heterodetic linkage)可包括但不限于通过二硫键桥、亚烷基桥或硫键桥形成的杂键。合成包含二硫键桥、硫键桥和亚烷基桥的均环肽和杂环肽的方法公开在US 5,643,872，该文献通过引用并入本文。US 6,008,058中讨论并公开了环化方法的其他实例，该文献通过引用并入本文。
用于合成环状的稳定拟肽化合物的其他方法是闭环复分解反应(RCM)。此方法包括合成肽前体和使其与RCM催化剂接触以产生构象限制性肽的步骤。适合的肽前体可包含两个或更多的不饱和C-C键。此方法可使用固相肽合成技术进行。在此实施方式中，使锚定在固体支持物上的前体接触RCM催化剂，随后从所述固体支持物切出产物以获得构象限制性肽。
由D.H.Rich在Protease Inhibitors，Barrett and Selveson编辑，Elsevier(1986)(通过引用并入本文)中公开的另一种方法通过将过渡态类似物的概念应用于酶抑制剂设计而设计出了肽模拟物。例如，已知staline的仲醇模拟了胃蛋白酶底物的易切割酰胺键的四面体过渡态。
总之，已知末端修饰有助于降低对蛋白酶降解的易感性，并由此延长肽在溶液中的半衰期，特别是在其中具有蛋白酶的生物流体中的半衰期。因为通过环化形成的稳定结构，以及对于见于环状肽的生物活性的考虑，多肽环化也是有用的修饰。
在一个优选的实施方式中，所述抗体、抗原结合片段，它们的变体、融合物或衍生物能够与选自以下组中的抗体分子竞争结合CD163受体：
Mac2-158(下划线为CDR)
VH：
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITYSGITNYNPSLKSQISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCVSGTYYFDYWGQGTTLTVSS
[SEQ ID NO：1]
VL：
SVVMTOTPKSLLISIGDRVTITCKASQSVSSDVAWFQQKPGQSPKPLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCGQDYTSPRTFGGGTKLEIKRA
[SEQ ID NO：2]
Mac2-48(下划线为CDR)
VH：
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGFISYSGITSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCVSGTYYFDYWGQGTTLTVSS
[SEQ ID NO：3]
VL：
SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSHDVSWFQQKPGQSPKLLIYYTSNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAIYFCQQDYSSPRTFGGGTKLEIKRA
[SEQ ID NO：4]
示例性人源化mAb(下划线为CDR)
VH：
QVQLOESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAWNWIRQFPGKKLEWMGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCVSGTYYFDYWGOGTTLTVSS
[SEQ ID NO：5]
VL：
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSDVAWFQQKPGKSPKPLIYYASNRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYFCGQDYTSPRTFGGGTKLEIKRA
[SEQ ID NO：6]
优选地，所述抗体、抗原结合片段，它们的变体、融合物或衍生物能够与选自Mac2-158、Mac2-48和示例性人源化mAb组成的组中的抗体竞争结合相同的表位。或者，所述抗体、抗原结合片段，它们的变体、融合物或衍生物源自于选自Mac2-158、Mac2-48和示例性人源化mAb的抗体。
例如，所述抗体、抗原结合片段，它们的变体、融合物或衍生物可结合的CD163受体表位与本发明的一种或多种示例性抗体(即，如后附实施例中所述的Mac2-158、Mac2-48、5C6-FAT和/或BerMac3)结合的CD163受体表位相同。
Mac2-158可得自于荷兰的IQ Products，(货号：CD163-158U.http：// www.iqproducts.nl/catalog/index.php？pr＝782)
Mac2-48可得自于荷兰的IQ Products，(货号：CD163-48U.http：// www.iqproducts.nl/catalog/index.php？pr＝783)
所述能够与本文定义的抗体分子(或保留了对CD163受体的结合特异性的所述抗体或其抗原结合片段的变体、融合物或衍生物或所述变体或衍生物的融合物)“竞争”结合CD163受体，是指所测试的抗体、抗原结合片段、它们的变体、融合物或衍生物能够至少部分地抑制或干扰本文定义的抗体分子(或所述抗体或其抗原结合片段的变体、融合物或衍生物，或所述变体或衍生物的融合物)的结合。
例如，所述抗体或其抗原结合片段，它们的变体、融合物或衍生物，或所述变体或衍生物的融合物能够至少10％地抑制本文定义的抗体分子(例如，Mac2-158、Mac2-48、5Cd-FAT或BerMac3)的结合，例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、35％乃至100％抑制。
可通过本领域技术人员熟知的方法测定竞争性结合，例如ELISA(如本文所述)和/或SPR(如后附实施例所述)。
在“夹心ELISA”中，在包被96孔板(例如，如Maxisorp NuncTM)时，使用例如适量的靶向CD163受体的胞质尾的多克隆抗体，例如10μg/ml的多克隆兔抗体作为捕获抗体。根据本领域已知的标准方法进行包被。使用于TBS-T中的3％BSA，在例如室温下，将孔封闭1小时。随后，在分析缓冲液(例如，补充了0.1％BSA、1mM MgCl2和10μM CaCl2的TBS-T)中稀释细胞提取物，所述细胞提取物来自用表达CD163受体的表达载体稳定转染的HEK细胞，或来自表达CD163的细胞。随后，在每孔中添加适量的稀释的细胞提取物，例如50μl，并温育以使其与包被的抗体结合，例如在室温温育1小时。随后，使用TBS-T洗板三次。随后，添加适量(例如在分析缓冲液中2μg/ml)的与生物素偶联的一级抗体(例如，Mac2-48、Mac2-158、5C6FAT、BerMac3或对照抗体)。随后，尽可能将平板温育足够的时间以允许Mac2-48、Mac2-158、5C6FAT或BerMac3以及对照抗体结合，例如在室温温育1小时，随后在TBS-T中清洗三次。在使用生物素化的一级抗体的情况下，可使用链霉亲和素-HRP抗体(DAKO)并相应地在分析缓冲液中稀释(1∶5000)，并加入到孔中。随后，将平板温育足够的时间，例如，在室温温育1小时，以形成链霉亲和素-生物素复合物。清洗(例如用TBS-T清洗三次)后，使用过氧化物酶底物(例如，OPD SigmaFast，Sigma)使平板显色。在适合的波长(在此情况下为490nm)测定色度变化吸光度。
如果一级抗体未偶联，可更换使用与HRP直接偶联的抗人IgG4的二级抗体来温育相同的ELISA，例如，来自例如Serotec的小鼠抗人IgG4-HRP，或者，如果未偶联，则继而使用来自例如DAKO的HRP偶联的抗小鼠抗体。随后，清洗平板，并按照上文所述显色。
本领域技术人员可以理解，其他方法包括反转上述的夹心ELISA，并且使用CD163抗体(例如，Mac2-48、Mac2-158、5C6FAT、BerMac3)作为捕获抗体代替。
以上ELISA试验可用于评估表位修饰性或封闭性抗体。适合用于鉴定竞争性抗体的其他方法公开在Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow&Lane，该文献通过引用并入本文(例如，参见567～569页，574～576页，583页和590～612页，1988，CSHL，NY，ISBN 0-87969-314-2)。
本文中的“表位”旨在表示分子与抗体结合的位置，即抗原的分子区域。表位可以是线性表位，其通过例如抗原的氨基酸序列(即一级结构)确定，或者是三维表位，其由抗原的二级结构限定，例如肽链折叠成β片层或α螺旋，或通过抗原的三级结构限定，例如螺旋或片层折叠或排列以产生三维结构。
有利地，本发明提供了一种治疗剂，其中所述抗体或其抗原结合片段是人的或人源化的。
本领域技术人员可以理解，人源化抗体可用于人的治疗或诊断。人源化形式的非人(例如鼠)抗体是基因工程化的嵌合抗体或具有源自非人抗体的极小部分的抗体片段。人源化抗体包括这样的抗体：即，其中人抗体(受者抗体)的互补决定区被来自具有期望功能性的非人物种，例如小鼠、大鼠或兔(供体抗体)的互补决定区的残基取代的抗体。在一些情况下，人抗体的Fv框架残基被相应的非人残基取代。人源化抗体还可包含既没有见于受者抗体中，也没有见于引入的互补决定区(CDR)或框架序列中的残基。通常，人源化抗体可包含基本全部的至少一个且通常两个可变域，其中全部或基本全部的互补决定区对应于非人抗体的那些，且全部或基本全部的框架区对应于相关的人共有序列的那些。最佳地，人源化抗体还包括至少一部分的抗体恒定区，例如Fc区，其通常源自人抗体(参见，例如Jones etal.，1986.Nature 321：522-525；Riechmann et al.，1988，Nature 332：323-329；Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596，该两篇文献通过引用并入本文)。
用于将非人抗体人源化的方法是本领域熟知的。通常，所述人源化抗体具有引入其中的来自非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些常被称作引入残基的非人氨基酸残基通常来自引入的可变域。人源化可基本按照文献描述(参见，例如Jones et al.，1986，Nature 321：522-525；Reichmann et al.，1988.Nature 332：323-327；Verhoeyen et al.，1988，Science 239：1534-15361；US4,816,567，这些文献通过引用并入本文)，通过使用对应的啮齿类互补决定区取代人的互补决定区而进行。因此，此类人源化抗体为嵌合抗体，其中，基本小于完整的人可变域的序列已经被来自非人物种的对应序列取代。实际上，人源化抗体通常可以是其中一些互补决定区残基、且可能地一些框架残基被来自啮齿类抗体中类似位点的残基取代的人抗体。
也可以使用本领域中已知的多种技术鉴定人抗体，包括噬菌体展示文库(参见，例如Hoogenboom&Winter，1991，J.Mol.Biol.227：381；Marks et al.，1991，J.Mol.Biol.222：581；Cole et al.，1985，Monoclonal antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页；Boerner et al.，1991.J.Immunol.147：86-95；Soderlind et al.，2000，NatBiotechnol 18：852-6和WO 98/32845，这些文献通过引用并入本文)。
一旦获得适合的抗体，可检测其活性，例如所述抗体的结合特异性或生物活性，例如，通过ELISA、免疫组织化学法、流式细胞术、免疫沉淀法、Western印迹等。所述生物活性可在读出该具体特征的不同试验中检测。
在特别优选的实施方式中，本发明的治疗剂和/或其结合部分组分是多肽(即，氨基酸聚合物)。
本文使用的术语“氨基酸”包括20种遗传编码的氨基酸及其相应的′D′型(与天然的′L′型相比)立体异构体，ω-氨基酸，其他非天然存在氨基酸，非常规氨基酸(例如，α，α-双取代的氨基酸，N-烷基氨基酸等)和化学衍生化的氨基酸(见下文)。
除非另有明确指明，氨基酸在专门列出时，例如“丙氨酸”或“Ala”或“A”，此术语是指L-丙氨酸和D-丙氨酸二者。其他非常规氨基酸也可以是本文定义的多肽序列的组分，只要所述多肽序列保留了期望的功能性质。对于本文显示的多肽序列，在适合的情况下，每个编码的氨基酸残基由对应于常规氨基酸的俗名的单个字母名称表示。
在一个实施方式中，本发明的多肽包含L-氨基酸或由其组成。
用于生产多肽的方法是本领域熟知的(例如，参见Molecular Cloning：aLaboratory Manual，第3版，Sambrook&Russell，2000，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，该文献通过引用并入本文)。
本领域技术人员可以理解，本发明的治疗剂可包含抗体及其片段之外的结合部分。
在可选的实施方式中，所述结合部分是触珠蛋白-血红蛋白(Hp-Hb)复合物。如上所述，CD163介导Hp-Hb复合物的清除，所述复合物是在血管内溶血期间，血红蛋白被释放到循环系统中时形成的，并且还参与炎症过程的调控。CD163被认为专门表达在单核细胞系表面上。其由循环系统中的驻留单核细胞表达，并且在向巨噬细胞成熟期间上调。其在驻留组织的巨噬细胞上以及替代性活化的巨噬细胞(M2)和TIE2+巨噬细胞上高度表达。因此，CD163对Hb-Hp复合物的亲和力使其成为有效的单核细胞靶向部分。
Hp-Hb复合物的制备和应用描述于WO 02/32941。
在另一个可选实施方式中，所述结合部分包含脂质体或由其组成。
例如，所述结合部分包含与靶向性抗体(例如，抗CD163抗体)偶联的脂质体(负载了免疫抑制剂)。
用于制备此类脂质体-抗体偶联物的方法描述于Avnir et al.，2008，ArthritisRheum.58：119-129和Torchilin et al.，2001，Biophys Acta 1511：397-411中。
在另一个可选的方面，本发明提供了一种治疗剂，其中所述结合部分是抗体模拟物(例如，非抗体骨架)。
应理解，抗体模拟物(例如，具有高度的稳定性并可在某些位点引入可变性的非抗体骨架结构)可用于产生可衍生出结合部分的分子文库。生物化学领域的技术人员熟悉很多此类分子。此类分子可用作本发明治疗剂中的结合部分。
Skerra et al.(2007，Curr.Opin.Biotech.，18：295-304)，Nuttall&Walsh(2008，Curr.Opin.Biotech.，8：309-615)和Gill&DAmle(2006，Curr.Opin.Biotech.，17：653-8)中讨论了适合的抗体模拟物及其制备方法。
示例性的抗体模拟物包括：亲和体(affibodies)(也称为Trinectin；Nygren，2008，FEBS J，275，2668-2676)；CTLD(也称为Tetranectin；InnovationsPharmac.Technol.(2006)，27-30)；adnectin(也称为单体(monobodies)；Meth.Mol.Biol.，352(2007)，95-109)；anticalin(Drug Discovery Today(2005)，10，23-33)；DARPin(锚蛋白类(ankyrins)；Nat.Biotechnol.(2004)，22，575-582)；avimers(Nat.Biotechnol.(2005)，23，1556-1561)；iMab(WO 03/050283)；微体(FEBS J，(2007)，274，86-95)；肽适体(Expert.Opin.Biol.Ther.(2005)，5，783-797)；Kunitz域(J.Pharmacol.Exp.Ther.(2006)318，803-809)；affilin(Trends.Biotechnol.(2005)，23，514-522)。
因此，优选所述抗体模拟物选自包含下述的组或由下述组成的组：亲和体、tetranectin(CTLD)、adnectin(单体)、anticalin、DARPin(ankyrin)、avimer、iMab、微体、肽适体、Kunitz域和affilin。
在另一个可选实施方式中，所述结合部分是RNA适体。
RNA适体代表了治疗剂的独特新类型(Que-Gewirth et al，Gene Ther.74：283(2007)；Ireson et al，Mol.Cancer Ther.5：2957(2006))。其为相对短(12-30个核苷酸)的单链RNA寡核苷酸，其呈现稳定的三维形状，从而紧密且特异地结合所选的蛋白靶标以引发生物反应。与反义寡核苷酸不同，RNA适体能够有效地靶向细胞外靶标。与抗体类似，适体具有低纳摩尔至皮摩尔范围的结合亲和力。此外，适体对热稳定，无免疫原性，且具有极小的批间差异性。化学修饰，例如在嘧啶2′位的氨基或氟取代，可以减少核酸酶的降解。适体的生物分布和清除也可通过诸如聚乙二醇和胆固醇的部分的化学添加而改变。
适体可通过重复的选择方法开发，例如SELEX(指数级富集的配体系统进化)以通过良好确定的互补三维结构的方式特异地识别其靶标并与其紧密结合。此外，SELEX(和其他此类方法)可进行文库选择，从而产生对纯化的生物靶标具有高亲和力的寡核苷酸配体。近期，适体哌加他尼(pegaptanib)被批准用于年龄相关性黄斑变性的治疗(Wong et al，Lancet 370：204(2007))。在肿瘤学领域，最近证实了源自人胶质母细胞瘤细胞系的DNA适体GBI-10结合韧粘素-C(tenascin-C)(Daniels et al，Proc.Natl Acad.ScL USA 100：15416(2003))。类似地，现已证明RNA适体靶向Ku DNA修复蛋白，导致乳腺癌细胞对依托泊甙(etoposide)致感(Zhang et al，Int.J.Mol.Med.74：153(2004))。
在另一种实施方式中，本发明提供了一种治疗剂，其中所述结合部分是小分子。
所述“小分子”是指900道尔顿或更小的小分子量有机化合物。尽管大的生物聚合物，例如核酸、蛋白和多糖(例如淀粉或纤维素)不包含在“小分子”中，但其组成单体(分别为，核糖核苷酸或脱氧核苷酸、氨基酸和单糖)和寡聚体(即，短聚合物，例如二核苷酸，肽，例如抗氧化剂谷胱甘肽，和二糖，例如蔗糖)包括在内。
小分子的制备描述于Mayes&Whitcombe，2005，Adv.Drug Deliv.Rev.57：1742-78和Root-Bernstein&Dillon，2008，Curr.Pharm.Des.14：55-62。
优选地，所述结合部分是分离和/或纯化的形式。
本发明第一方面的治疗剂的第二个关键成分是免疫抑制剂。
在一个实施方式中，所述免疫抑制剂是抗炎剂。例如，所述免疫抑制剂可以选自包含以下的组或由以下组成的组：糖皮质激素、皮质类固醇、氨甲喋呤、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、环孢霉素、他克莫司(tacrolimus)、霉酚酸吗啉乙酯(mycophenolate mofetil)、西罗莫司(sirulimus)、依维莫司(everolimus)，能够抑制促炎细胞因子(例如TNF)合成的siRNA分子、非甾体抗炎药(NSAID，例如阿斯匹林、布洛芬)、类固醇(例如，维生素D)、调节疾病的抗风湿药(DMARD，例如青霉胺、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazin)、环孢霉素)。
更优选地，所述免疫抑制剂是糖皮质激素。
示例性的糖皮质激素可选自包含以下的组或由以下组成的组：可的松及其衍生物(例如氢化可的松)；强的松及其衍生物(例如强的松龙、甲基强的松龙、甲基强的松龙醋酸酯、甲基强的松龙琥珀酸酯)；地塞米松及其衍生物；去炎松及其衍生物(例如，己酸去炎松(triamcinolonehexacetonuid)、醋酸去炎松)；帕拉米松；倍他米松；氟氢化可的松(fluhydrocortisone)；醋酸氟轻松(fluocinolone acetonide)；氟轻松(fluocinolone)。
在一个实施方式中，所述糖皮质激素是地塞米松。
在另一个实施方式中，所述糖皮质激素是强的松龙。在另一个实施方式中，所述糖皮质激素是甲基强的松龙。在另一个实施方式中，所述糖皮质激素是醋酸氟轻松。
在可选的优选实施方式中，所述免疫抑制剂是糖皮质激素-半琥珀酸酯衍生物。
在优选的实施方式中，所述免疫抑制剂是通过组织蛋白酶B敏感性连接子与一种或多种其他蛋白连接的糖皮质激素。例如，在一个实施方式中，所述免疫抑制剂是与一种或多种部分还原的蛋白连接的糖皮质激素。
在可选的实施方式中，所述免疫抑制剂被包封在脂质体内，所述脂质体包含能够靶向所述脂质体的治疗剂或部分。
本领域技术人员可以理解，所述结合部分和所述免疫抑制剂可通过任何已知的方式连接。
然而，优选所述结合部分与所述免疫抑制剂共价连接。
有利地，糖皮质激素分子与结合部分分子之比在6和16之间，或1和12之间，例如8和12之间或1和8之间，或3和5之间或7和9之间。
在本发明特别优选的实施方式中，所述治疗剂包含以下组分或由以下组分组成：
(a)对单核细胞和/或源自单核细胞的细胞具有特异性的所述结合部分是对CD163受体具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段，或保留了对CD163受体的结合特异性的所述抗体或其抗原结合片段的变体、融合物或衍生物或所述变体或衍生物的融合物；和
(b)所述免疫抑制剂是糖皮质激素。
本领域技术人员可以理解，本发明第一方面的治疗剂可进一步包含可检测部分和/或细胞毒性部分。
因此，在一个实施方式中，所述治疗剂进一步包含可检测部分。
所述“可检测部分”包括的含义为在将本发明的治疗剂施用给患者后，当所述部分位于靶位点时，所述部分能够被检测，通常从体外和靶标的定位位点通过非侵入的方式检测。所述可检测部分可以是单个原子或分子，其可以直接或间接地参与所述可检测物的生成。因此，本发明的此实施方式的治疗剂可用于成像和诊断。
适合的可检测部分是医药化学领域已知的，而且，将这些部分与多肽和蛋白进行连接也是本领域熟知的。可检测部分的实例包括，但不限于以下：放射性同位素(例如，3H、14C、35S、123I、125I、131I、99Tc、111In、90Y、188Re)、放射性核素(例如，11C、18F、64Cu)、荧光标签(例如，FITC、若丹明、镧系元素磷光剂、羰花青)、酶标签(例如，辣根过氧物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光剂、生物素基团和由第二报告子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合域、表位标签)。在一些实施方式中，标签通过不同长度的间隔臂(spacer arm)连接以减少潜在的空间位阻。
优选地，所述可检测部分包含放射性原子，例如选自由以下组成的放射性原子：锝-99、锝-99m、碘-123、碘-124、碘-131、铟-111、氟-18、氟-19、碳-11、碳-13、铜-64、氮-13、氮-15、氧-15、氧-17、砷-72、钆、锰、铁、氘、氚、钇-86、锆-89。
可通过已知的方式将放射性标签或其他标签掺入到本发明的治疗剂中。例如，如果所述结合部分是多肽，其可经生物合成，或使用适合的氨基酸前体(包括例如氟-19取代氢)通过化学氨基酸合成法而合成。例如99mTc、123I、186Rh、188Rh和111In的标签可，例如通过所述结合部分中的半胱氨酸残基连接。钇-90可通过赖氨酸残基连接。可使用IODOGEN法(Fraker et al(1978)Biochem.Biophys.Res.Comm.80，49-57，其通过引用并入本文)掺入123I。参考文献(“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”，J-F Chatal，CRCPress，1989，其通过引用并入本文)详细描述了其他的方法。
在一个实施方式中，本发明提供了一种治疗剂，其还包含细胞毒性部分。
所述“细胞毒性部分”包括的含义是所述部分是能够在体内或体外(例如在施用给患者时)诱导细胞死亡的部分。所述细胞毒性部分可以是单个原子或分子，其可以直接或间接地参与诱导细胞死亡。因此，本发明此实施方式的治疗剂可用于治疗(例如，在期望除去或破坏个体中的一种或多种细胞的情况下)。
适合的细胞毒性部分是医药化学领域已知的，而且，将这些部分与多肽和蛋白进行连接也是本领域熟知的。例如，当本发明治疗剂的各部分是多肽时，可通过交联多肽的任意常规方式将所述两部分连接在一起，例如O′Sullivan et al(1979)Anal.Biochem.100，100-108中大致描述的那些。例如，所述结合部分可富含巯基，且另一部分与能够与这些巯基反应的二官能剂反应，例如碘乙酸(NHIA)的N-羟基琥珀酰亚胺酯，或N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)。酰胺和硫醚键，例如使用间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯获得的键，在体内通常比二硫键更稳定。
细胞毒性部分的实例包括，但不限于以下：放射性同位素(例如，123I、125I、131I、111In、90Y)，烷化剂(例如，顺铂)，抗代谢物(例如，氨甲喋呤)，抗有丝分裂剂(例如，长春新碱)，拓扑异构酶抑制剂(例如，依托泊甙)和毒素(例如，卡奇霉素(calicheamicin))。在一些实施方式中，通过不同长度的间隔臂连接细胞毒性部分以减少潜在的空间位阻。
在一个实施方式中，所述细胞毒性部分包含放射性原子，例如选自以下组成的组中的放射性原子：碘-123、碘-125、碘-131、铟-111、溴-77、铜-67、砷-77、砹-211、锕-225、铋-212、铋-213、镥-177、钬-166、磷-33、铂-193、铂-195、铼-186、铼-188、锶-89、钇-90。
在另一个实施方式中，所述细胞毒性部分包括选自以下组成的组中的药物：烷化剂(例如，顺铂、卡铂)，抗代谢物(例如，咪唑硫嘌呤、氨甲喋呤)，抗有丝分裂剂(例如，长春新碱)，拓扑异构酶抑制剂(例如，阿霉素(doxorubicine)、依托泊甙)和毒素(例如，卡奇霉素)。
本发明的治疗剂在炎性和/或自身免疫性病变和病症的治疗中具有功效。
所述“治疗”包括对受试者/患者的治疗性和预防性处理。术语“预防性”用于包括本文所述的治疗剂、药物或药用制剂的应用，其用于预防患者或受试者中炎性和/或自身免疫性病变或病症或降低患者或受试者中炎性和/或自身免疫性病变或病症的可能性。
应理解，为了预防或治疗病变或病症，治疗剂的适合剂量可取决于待治疗的病变或病症的类型，所述病变或病症的严重性和病程，所述治疗剂的施用是出于预防性还是治疗性的目的，此前疗法的疗程，以及患者的病史和对所述治疗剂的反应。根据本发明的另一个实施方式，本发明治疗剂的功效在于缓解症状，对所述病变或病症的预防或治疗可通过连续给药，或与对所述病变或病症有效的其他治疗剂(例如已知用于目标治疗指征的常规治疗剂)组合给药而改进。
在一个实施方式中，所述病症或病变可选自以下组成的组：关节炎疾病(例如，类风湿性关节炎、脊椎炎、骨关节炎)、慢性炎性肠道疾病(IBD，例如克罗恩病、溃疡性结肠炎)、牙周炎、银屑病、哮喘、系统性红斑狼疮、多发性硬化、自身免疫性慢性炎性疾病、结缔组织病、自身免疫性肝病(例如，胆汁性肝硬化)、脓毒症、噬血细胞综合症、肝病、肝功能衰竭、肝炎、动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、关节炎、炎症诱导的软骨损伤、肝硬变、器官移植、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、结节病、葡萄膜炎、HLA-B27阳性葡萄膜炎、急性葡萄膜炎、巨噬细胞活化综合症、巨细胞关节炎。
有利地，所述病症或病变是类风湿性关节炎。
在一个实施方式中，所述病症或病变是主要涉及肝脏的炎性病症或病变，例如非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、自身免疫性肝病、脓毒症。
在另一个实施方式中，所述病症或病变是部分或主要涉及受累器官接触内毒素/LPS的炎性病症或病变，例如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、自身免疫性肝病、脓毒症。
在一个实施方式中，所述治疗剂显示的治疗功效是不存在所述结合部分的对应免疫抑制剂的至少10倍。优选地，在治疗有效剂量下，所述治疗剂的副作用谱低于不存在所述结合部分的对应免疫抑制剂的副作用谱。用于测试治疗剂的相对功效或副作用的方法是本领域熟知的。用于测试治疗剂相对功效的适合的方法描述在后附的实施例中。
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含有效量的本文定义的治疗剂和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
根据本发明，本文使用的“药物组合物”是指在治疗上有效的制剂。
本文使用的“治疗有效量”或“有效量”或“治疗上有效的”是指对给定的病症和给药方案提供治疗作用的量。其为经计算以与所需的添加剂和稀释剂(即载体或给药赋形剂)组合而产生期望的治疗作用的活性物质的预定量。此外，其还指足以降低或预防宿主的活动、功能和反应的临床显著性缺陷的量。或者，治疗有效量足以导致宿主中的临床显著病症的改进。本领域技术人员可以理解，化合物的量可根据其具体活性而改变。适合的剂量可包含经计算与所需稀释剂组合而产生期望的治疗作用的活性组合物的预定量。
在用于制备本发明组合物的方法和用途中，提供了治疗有效量的所述活性成分。如本领域所熟知的，普通医药或兽医工作者可基于患者的特征，例如年龄、体重、性别、健康状态、并发症、其他疾病等确定治疗有效量。
可使用可注射的缓释给药系统递送本发明的治疗剂、药物和药物组合物。这些经过专门设计以降低注射的频率。此类系统的实例是Nutropin Depot，其将重组人生长激素(rhGH)包封在可生物降解的微球中，其一经注射，即在较长的时期中缓慢地释放rhGH。优选地，通过肌肉内(i.m.)和/或皮下(s.c.)和/或静脉内(i.v.)进行递送。
可通过将药物直接释放到所需位点的手术植入装置施用本发明的治疗剂、药物和药物组合物。例如，Vitrasert将更昔洛韦直接释放到眼中以治疗巨细胞病毒(CMV)视网膜炎。将此毒性剂直接应用到患病位点实现了有效的治疗，而没有药物的显著的全身副作用。
也可应用电穿孔治疗(EPT)系统来施用本发明的治疗剂、药物和药物组合物。向细胞施加脉冲电场的装置提高了所述细胞膜对药物的可透性，导致细胞内药物递送显著增强。
还可通过电引入(electro-incorporation，EI)递送本发明的治疗剂、药物和药物组合物。EI发生在皮肤表面上直径达30微米的小颗粒受到与用于电穿孔相同或类似的电脉冲的情况下。在EI中，这些颗粒被驱动穿过角质层，并进入皮肤的较深层。所述颗粒可负载或包被药物或基因，或能够仅充当在皮肤中产生使药物能够由此进入的孔的“子弹”。
用于递送本发明的治疗剂、药物和药物组合物的可选方法是热敏的ReGel注射系统。低于体温时，ReGel是可注射的液体，而在体温下，其立即形成缓慢消蚀并溶解成已知安全的可生物降解聚合物的凝胶库。活性物质随着生物聚合物的溶解而随时间递送。
本发明的治疗剂、药物和药物组合物还可以通过口服递送。此方法利用了口服摄取维生素B12和/或维生素D以在体内共递送蛋白和肽的天然过程。借助维生素B12和/或维生素D摄取系统，本发明的治疗剂、药物和药物组合物能够移动通过肠壁。在维生素B12类似物和/或维生素D类似物与药物之间合成复合物，所述药物既保留了复合物的维生素B12部分和/或维生素D部分中对内因素(IF)的显著亲和力，还保留了所述复合物的活性物质的显著生物活性。
本发明的治疗剂、药物和药物组合物可通过“特洛伊肽(Trojan peptide)”引入到细胞。这是被称作“穿透素(penetratin)”的一类多肽，其具有转位性质，并且能够携带亲水化合物跨过质膜。此系统可以引导寡肽靶向细胞质和细胞核，并且具有非细胞类型特异性和高效性。参见Derossi et al.(1998)，Trends Cell Biol8，84-87。
优选地，本发明的药物和/或药物组合物是包含日剂量或单位、日亚剂量或其适合的小部分的活性成分的单位剂型。
本发明的治疗剂、药物和药物组合物通常通过口服或任何胃肠外途径施用，其可以是药学可接受的剂型的包含活性成分的药物组合物的形式，其中任选地，所述活性成分是无毒的有机酸或无机酸，或有机碱或无机碱，加成盐的形式。根据待治疗的病变和患者，以及给药途径，所述组合物可以以不同剂量施用。
在对人的治疗中，本发明的治疗剂、药物和药物组合物可以单独施用，但通常与根据给药途径和标准制药实践而选择的适合药物赋形剂、稀释剂或载体混合施用。
例如，本发明的治疗剂、药物和药物组合物可以以片剂、胶囊剂、栓剂(ovule)、酏剂、溶液或悬浮液的形式经口服、颊部或舌下施用，其可包含调味剂或着色剂，以用于速释、缓释或控释应用。本发明的治疗剂、药物和药物组合物还可以通过海绵体内注射施用。
此类片剂可包含：赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂，例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素纳和某些复合硅酸盐；以及粒化粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。此外，还可包含润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油山嵛酸酯和滑石。
近似类型的固体组合物也可以用作明胶胶囊中的填充物。在此方面，优选的赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milk sugar)或高分子量聚乙二醇。对于水悬浮液和/或酏剂，本发明的治疗剂、药物和药物组合物可以组合多种甜味剂或调味剂、着色剂或染料，以及乳化剂和/或悬浮剂，以及稀释剂，例如水、乙醇、丙二醇和甘油，及其组合。
本发明的治疗剂、药物和药物组合物可以经胃肠外施用，例如经静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌肉内或皮下施用，或者通过输注技术施用。其最好以无菌水溶液的形式使用，所述无菌水溶液包含其他物质，例如，足以使所述溶液与血液等渗的盐或葡萄糖。如果必要，所述水溶液应经过适当的缓冲(优选缓冲至pH 3-9)。可通过本领域技术人员熟知的标准制药技术容易地在无菌条件下制备适合的胃肠外制剂。
适合胃肠外施用的药物和药物组合物包括含水和无水的无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使所述制剂与目标受者血液等渗的溶质；还包括含水和无水的无菌悬浮液，其可包含悬浮剂和增稠剂。所述药物和药物组合物可以存在于单位剂量或多剂量的容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可在冷冻干燥(冻干)的条件下贮存，仅需要在临用前添加无菌液体载体，例如注射用水。即用型注射溶液和悬浮液可以由此前描述的各种无菌粉末、颗粒和片剂制备。
对于人患者的口服和胃肠外施用，本发明治疗剂、药物和药物组合物的日剂量水平通常可以是每个成年人每天以单个剂量或分开的剂量施用5至1500mg。
因此，例如，本发明治疗剂、药物和药物组合物可包含5mg至1400mg(例如，7mg至1400mg，或5mg至1000mg)的活性剂，并可优选包含5mg至200mg的活性剂，以供单次施用，或者，适当地，每次施用两份或更多。
在一个实施方式中，本发明治疗剂、药物和药物组合物的给药剂量从0.02mg/kg至2mg/kg，频率范围从每周两次至每月一次。
本发明治疗剂、药物和药物组合物还可以经鼻内或通过吸入施用，并以使用适合的推进剂由加压容器、泵、喷器或喷雾器喷送提供的干粉吸入剂或气雾剂形式方便地递送，所述适合的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷，氢氟烷，例如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134A3)或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA 227EA3)，二氧化碳或其他适合的气体。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀门以递送经计量的量来确定剂量单位。所述加压容器、泵、喷器或喷雾器可包含所述活性剂的溶液或悬浮液，例如使用乙醇和所述推进剂的混合物作为溶剂，其还可包含润滑剂，例如脱水山梨醇三油酸酯。用于吸入器或吹入器中的胶囊和药筒(例如由明胶制成)可经配制而包含本发明治疗剂和适合的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
优选地，气雾剂或干粉制剂的配置使得每个计量的剂量或每“喷”包含至少1mg的本发明治疗剂以递送给患者。应理解，使用气雾剂的总日剂量对各个患者各不相同，并且可在全天中以单个剂量，或更常见地，以分开的剂量施用。
或者，本发明的治疗剂、药物和药物组合物可以以栓剂或阴道栓剂的形式施用，或以洗剂、溶液、乳剂、凝胶、软膏或粉剂的形式局部施用。本发明的治疗剂、药物和药物组合物还可以透皮施用，例如，通过使用皮肤贴剂施用。其还可以通过经眼途径施用，特别是用于治疗眼睛的疾病。
对于眼科应用，本发明的治疗剂、药物和药物组合物可配制成于等渗的、pH经调节的无菌盐水中的微粉化悬浮液，或优选地，配制成于等渗的、pH经调节的无菌盐水中的溶液，并任选地，与诸如苯扎氯铵的防腐剂组合。或者，可将其配制在诸如矿脂的软膏中。
对于用于皮肤的局部应用，可将本发明的治疗剂、药物和药物组合物配制成包含所述活性剂的适合软膏，所述活性剂悬浮或溶于，例如包含以下一种或多种物质的混合物中：矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯剂，乳化蜡和水。或者，可将其配制成适合的洗剂或乳剂，悬浮或溶于，例如以下一种或多种物质的混合物中：矿物油、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
适合在口中局部施用的制剂包括包含在调味基(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)中的活性成分的糖锭(lozenge)；包含在惰性基(例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)中的活性成分的锭剂(pastille)，以及包含在适合的液体载体中的活性成分的漱口液。
通常，对于人，口服或胃肠外施用本发明的治疗剂、药物和药物组合物是优选的途径，其最为便利。
对于兽医应用，将本发明的治疗剂、药物和药物组合物作为适合的可接受剂型，根据通常的兽医实践来施用，兽医可确定对具体动物最适合的给药方案和施用途径。
本发明的治疗剂可配制成不同的浓度，其取决于所使用化合物的功效/毒性，例如，如后附实施例中的描述。对于体外应用，制剂可包含较低浓度的本发明化合物。
因此，本发明提供了一种药物组合物，其包含一定量的本发明的抗体或其抗原结合片段，或它们的变体、融合物或衍生物，以治疗各种病症(如上下文所述)。
优选地，所述药物组合物适合经胃肠外(例如，静脉内、关节内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肺、肌肉内或皮下)，经鼻内，通过吸入或经眼内递送。
本发明还包括包含药学可接受的本发明的多肽结合部分的酸或碱加成盐的药物组合物。用于制备可用于本发明的上述基础化合物的药学可接受酸加成盐的酸是形成无毒酸加成盐的那些，即包含药学可接受的阴离子的盐，例如氢氯酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、乙酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、琥珀酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、糖质酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和扑酸盐(即，1，1′-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐)等。
药学可接受的碱加成盐也可用于制备药学可接受的盐形式的本发明治疗剂。
可用作制备本发明酸性性质治疗剂的药学可接受碱盐的试剂的化学碱是与此类化合物形成无毒碱盐的那些。此类无毒碱盐包括，但不限于源自药理学可接受阳离子的那些，例如碱金属阳离子(例如，钾和钠)和碱土金属阳离子(例如，钙和镁)、铵或水溶性胺加成盐，例如N-甲基葡糖胺-(甲葡胺)，和低级烷醇铵，以及药学可接受的有机胺的其他碱盐等。
可将本发明的治疗剂和/或多肽结合部分冻干以贮存，并在使用前复溶在适合的载体中。可采用任何适合的冻干方法(例如，喷雾干燥、滤饼干燥(cake drying))和/或复溶技术。本领域技术人员可以理解，冻干和复溶会导致不同程度的抗体活性损失(例如，对于常规免疫球蛋白，IgM抗体的活性损失往往大于IgG抗体)，因此，可能必须上调使用水平以进行补偿。在一个实施方式中，冻干(冷冻干燥)的多肽结合部分在复溶时损失不超过约20％，或不超过约25％，或不超过约30％，或不超过约35％，或不超过约40％，或不超过约45％，或不超过约50％的活性(冻干前)。
在另一方面，本发明提供了包含本文定义的治疗剂或药物组合物的试剂盒。
因此，本发明提供了用于治疗性处理本文定义的病症的试剂盒。
或者，所述试剂盒可包含适合用于诊断的本发明的可检测抗体或其抗原结合片段或衍生物。此类诊断试剂盒可包含足以进行至少一次检测的量的，作为独立包装试剂的诊断治疗剂。通常，还包含关于包装试剂的应用的说明书。此类说明书通常包括描述试剂浓度和/或至少一个检测方法参数，例如试剂与待混合样品的相对量、试剂/样品混合物的保持时间段、温度、缓冲条件等的明确表述。
另一方面，本发明提供了医用治疗剂。因此，所述治疗剂可用于炎性病症或病变的治疗。
在一个实施方式中，所述治疗剂用于自身免疫性疾病的治疗。
例如，所述病症、病变或疾病可选自以下组成的组：关节炎疾病(例如，类风湿性关节炎、脊椎炎、骨关节炎)、慢性炎性肠道疾病(IBD，例如克罗恩病、溃疡性结肠炎)、牙周炎、银屑病、哮喘、系统性红斑狼疮、多发性硬化、自身免疫性慢性炎性疾病、结缔组织病、自身免疫性肝病(例如，胆汁性肝硬化)、脓毒症、噬血细胞综合症、肝病、肝功能衰竭、肝炎、动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、关节炎、炎症诱导的软骨损伤、肝硬化、器官移植、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、结节病、葡萄膜炎、HLA-B27阳性葡萄膜炎、急性葡萄膜炎、巨噬细胞活化综合症、巨细胞关节炎。
有利地，所述病症、病变或疾病是类风湿性关节炎。
在一个实施方式中，所述病症或病变是主要涉及肝脏的炎性病症或病变，例如：非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、自身免疫性肝病、脓毒症。
在另一个实施方式中，所述病症或病变是部分或主要涉及受累器官接触内毒素/LPS的炎性病症或病变，例如：非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、自身免疫性肝病、脓毒症。
使用诸如本发明治疗剂的活性剂制备药物的方法是医学和制药领域的技术人员所熟知的。
在另一方面，本发明提供了本发明的治疗剂在用于治疗在本文中均有定义的炎性病症或病变和/或自身免疫性疾病，或增殖性病症或病变，或遗传性病症或病变，或由微生物导致的病症或病变中的用途。一个实施方式提供了本发明的治疗剂在用于治疗自身免疫性疾病中的用途。
在另一方面，本发明提供了治疗剂在制备用于治疗在本文中均有定义的炎性病症或病变和/或疾病，或增殖性病症或病变，或遗传性病症或病变，或由微生物导致的病症或病变的药物中的用途。优选地，所述用途是用于治疗自身免疫性疾病。
有利地，所述病症、病变或疾病选自以下组成的组：关节炎疾病(例如，类风湿性关节炎、脊椎炎、骨关节炎)、慢性炎性肠道疾病(IBD，例如克罗恩病、溃疡性结肠炎)、牙周炎、银屑病、哮喘、系统性红斑狼疮、多发性硬化、自身免疫性慢性炎性疾病、结缔组织病、自身免疫性肝病(例如，胆汁性肝硬化)、脓毒症、噬血细胞综合症、肝病、肝功能衰竭、肝炎、动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝病、关节炎、炎症诱导的软骨损伤。
优选地，所述病症、病变或疾病是类风湿性关节炎。
在一个实施方式中，所述病症或病变是主要涉及肝脏的炎性病症或病变，例如：非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、自身免疫性肝病、脓毒症。
在另一个实施方式中，所述病症或病变是部分或主要涉及受累器官接触内毒素/LPS的病症或病变，例如：非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、自身免疫性肝病、脓毒症。
在另一方面，本发明提供了用于降低和/或缓解在本文中均有定义的炎性病症或病变和/或自身免疫性病症或病变，或增殖性病症或病变，或遗传性病症或病变，或由微生物导致的病症或病变的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的本发明的治疗剂或药物组合物的步骤。优选地，所述方法用于治疗自身免疫性疾病(优选类风湿性关节炎)。
有利地，所述病症、病变或疾病选自以下组成的组：关节炎疾病(例如，类风湿性关节炎、脊椎炎、骨关节炎)、慢性炎性肠道疾病(IBD，例如克罗恩病、溃疡性结肠炎)、牙周炎、银屑病、哮喘、系统性红斑狼疮、多发性硬化、自身免疫性慢性炎性疾病、结缔组织病、自身免疫性肝病(例如，胆汁性肝硬化)、脓毒症、噬血细胞综合症、肝病、肝功能衰竭、肝炎、动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、关节炎、炎症诱导的软骨损伤、肝硬化、器官移植、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、结节病、葡萄膜炎、HLA-B27阳性葡萄膜炎、急性葡萄膜炎、巨噬细胞活化综合症、巨细胞关节炎。
优选地，所述病症、病变或疾病是类风湿性关节炎。
在一个实施方式中，所述病症或病变是主要涉及肝脏的炎性病症或病变，例如：非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、自身免疫性肝病、脓毒症。
在另一个实施方式中，所述病症或病变是部分或主要涉及受累器官接触内毒素/LPS的病症或病变，例如：非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、自身免疫性肝病、脓毒症。
除非另有明确说明，本文使用的单数形式(“a”、“and”和“the”)包括复数的对象。因此，例如“抗体”包括多个此类抗体，且所述“剂量”包括一个或多个剂量，以及本领域技术人员已知的等同物，等等。
本说明书中对明显为此前公开文献的列举或讨论不一定等于承认所述文献是现有技术的一部分或是公知常识。
优选地，将参考以下附图描述体现本发明某些方面的非限定实施例：
图1：使用不同抗CD163克隆，外周血单核细胞CD163在新鲜抽取样品中的分布。在前向散射[FSC]与侧散射[SSC]中对单核细胞进行门控(gating)处理后，使用CD14 APC与CD163 PE克隆重新标绘经门控的细胞：(A)MAC2-158，SRCR域-1；(B)R-20，SRCR域-4；(C)GHI/61，SRCR域-7和(D)RM3/1，SRCR域-9。
图2：使用不同的抗CD163克隆，在不同抗凝剂影响下血液样品中单核细胞CD163表达。在使用三种常用抗凝剂稳定的新鲜抽取全血中，研究不同的细胞外钙浓度对单核细胞表面CD163表达测定的影响：(A)EDTA；(B)柠檬酸盐和(C)肝素。在前向散射[FSC]与侧散射[SSC]中对单核细胞进行门控处理后，使用CD14 APC与CD163 PE克隆重新标绘经门控的细胞：(左图)MAC2-158，SRCR域-1；(第二图)R-20，SRCR域-4；(第三图)GHI/61，SRCR域-7；和(右图)RM3/1，SRCR域-9。
图3：使用不同的抗CD163 mAb，在由EDTA、柠檬酸盐和肝素抗凝的样品中的单核细胞CD163表达的图示。在前向散射[FSC]与侧散射[SSC]中对单核细胞进行门控处理后，使用CD14 APC与CD163 PE克隆重新标绘经门控的细胞。随后，评估：(A)CD163阳性的单核细胞的比例和(B)平均每个细胞结合的R-藻红蛋白偶联CD163抗体数。使用Quantibrite PE珠将细胞群的FL2线性荧光染色转化成反映受体密度的平均每个细胞结合的CD163 R-藻红蛋白分子数。结果表示为一式三份样品的平均值±标准差(SE)。所显示的数据代表了多个独立进行的实验。
图4：在2mM游离Ca2+(实线)或10mM EDTA(虚线)中与固定化CD163结合的mAb。除了R-20和5C6-FAT(10μg/ml)和GHI/61(20μg/ml)之外，mAb的浓度为5μg/ml。
图5：不同的125I标记单克隆CD163抗体克隆的细胞结合和摄取。为了比较不同的单克隆CD163抗体克隆的胞吞能力，将CD163转染的Flp-In CHO细胞与不同的125I标记CD163抗体一起温育。在未转染的Flp-In CHO细胞中检测的细胞相关放射性的程度不显著。
图6：CD163抗体在人巨噬细胞中的结合和摄取。将源自单核细胞的巨噬细胞与结合CD163的免疫荧光性mAb一起温育0或30分钟，使用荧光激光显微镜检测。可见MAc2-158显示了最佳的结合和摄取。
图7A和B：CD163抗体在表达CD163的CHO细胞和对照CHO细胞中的结合和摄取。将细胞与结合CD163的免疫荧光性mAb一起温育0或30分钟，使用共焦显微镜检测。可见Mac2-48和MAc2-158显示了最佳的结合和摄取。
图8A和B：与Mac2-158的竞争。A和B中的小图显示了完整的传感图，而放大部分则显示了展示不同mAb与Mac2-158饱和的CD163芯片结合的部分传感图。由图8A可见，在2mM游离钙缓冲液中，Mac2-158、Mac2-48、Ber-Mac3和GHI/61不能结合由Mac2-158饱和的CD163-Fc。除GHI/61之外，所有的mAb均结合SRCR域1，而GHI/61在富钙环境中没有显示结合。无论是否饱和，单克隆抗体EdHU-1、Ki-M8、RM3/1和R20均能够结合CD163-Fc，因此，不与Mac2-158竞争结合CD163。
图9：表达巨噬细胞清道夫受体CD163的未知组织成分的鉴定。在前向散射[FSC]与侧散射[SSC]的标绘图中，对CD163阳性细胞进行门控处理(G1)(A)，并使用CD14APC与CD163PE重新标绘经门控的细胞。在仍未鉴定的CD14-CD163+细胞群周围设定门控(G2)(B)，并使用CD163PE与HLA-DR FITC重新标绘(C)。在FSC/SSC标绘图(D)中的CD14-HLA-DR+CD163+细胞(环绕的散点图覆盖层)的反向门控(backgating)分析显示定位在淋巴细胞和单核细胞之间的相对不同的细胞群。
图10：外周血中树突细胞上CD163表达的流式细胞分析。在前向散射[FSC]与侧散射[SSC]中，对单核细胞簇进行门控处理(G1)(A)，并使用CD14APC与ILT3PE-Cy5重新标绘经门控的细胞(B)，并在CD14-ILT3+细胞(树突细胞；G2)周围设定门控。使用CD163 PE与HLA-DR FITC重新标绘经门控的树突细胞，标绘出两个亚类的CD163+树突细胞(C)。在FSC/SSC标绘图(D)中的CD14-ILT3+HLA-DR+CD163+细胞(环绕的散点图覆盖层)的反向门控分析显示了树突细胞在淋巴细胞和单核细胞之间的预期定位。同种型匹配的非特异性PE偶联IgG1用作阴性染色对照(E)。
图11：使用不同CD163 mAb，对外周血树突细胞CD163表达的流式细胞分析。在对单核细胞和树突细胞(CD14-ILT3+)进行门控处理后，使用CD163PE与HLA-DR FITC重新标绘经门控的细胞，其中使用抗CD163的GHI/61(A)或MAC2-158(C)克隆。FSC/SSC标绘图(D)中，使用MAC2-158的CD14-ILT3+HLA-DR+CD163+细胞(灰色散点图覆盖层)的反向门控分析显示了比FSC/SSC标绘图(B)中使用GHI/61(10.5％[95％CI：8.0-12.5％])(红色散点图覆盖层)时，显著较高比例的表达CD163的外周血树突细胞(32.3％[95％CI：19.6-45.1％])。
图12：表达CD163的外周血树突细胞的表型分析。外周血中树突细胞上CD163、HLA-DR、ILT3、CD11c、CD16和CD91的流式细胞分析。在对单核细胞和树突细胞(CD14-ILT3+)进行门控处理后，使用CD163 PE与(A)HLA-DR PerCP；(B)ILT3 PE-Cy5；(C)CD11c FITC；(D)CD16FITC和(E)CD91 FITC重新标绘经门控的细胞。
图13：HIV-1感染中的树突细胞CD163表达。与健康成年人相比，来自HIV-1患者的外周血中的树突细胞上CD163表达的流式细胞分析。(a)正常对照(n＝31)和HIV-1感染患者(n＝15)中的CD163+树突细胞的比例。方框图显示了中值、25-75百分位数值和范围。(b)对照和HIV-1感染患者中CD163在CD163低和CD163高亚群中的表达水平。(c)对照和HIV-1感染患者中CD163在CD163低和CD163高亚群中的表达水平。使用Quantibrite PE珠将细胞群的FL2线性荧光染色转化成平均每个细胞结合的CD163 PE分子数。结果表示为平均值±标准误(SE)。***p＜0.001。
图14：HIV-1感染中树突细胞CD163表达的典型标绘图。(a)在对单核细胞和树突细胞(CD14-ILT3+)进行门控处理后，使用CD163 PE与HLA-DR FITC重新标绘经门控的细胞((A)，(B)和(C))。源自三位不同患者的标绘图代表了在HIV-1感染患者(n＝15)中调查的树突细胞CD163表达。
表1：使用不同的CD163 mAb，在使用EDTA、柠檬酸盐和肝素抗凝的样品中的单核细胞CD163表达的概况。在类似于生理学上钙水平的肝素稳定血样品中的单核细胞CD163表达与使用钙螯合剂、EDTA和柠檬酸抗凝的样品进行比较。数值在95％置信区间(95％CI)，且使用t检验分析EDTA数值分别与肝素和柠檬酸酯数值之间差异的统计显著性。
表2：使用不同的CD163 mAb，在使用EDTA、柠檬酸盐和肝素抗凝的样品中的单核细胞CD163表达的概况。在类似于生理学上钙水平的肝素稳定血样品中的单核细胞CD163表达与使用钙螯合剂、EDTA和柠檬酸抗凝的样品进行比较。数值在95％置信区间(95％CI)，且使用t检验分析肝素数值分别与EDTA和柠檬酸酯数值之间差异的统计显著性。
图15：在人源化过程期间产生的扩增片段的琼脂糖凝胶。1％琼脂糖凝胶分析显示了用于扩增工作可变区的PCR。左图：Mac2-158(100bp标记物，重链可变区，轻链可变区)。右图：Mac2-48(100bp标记物，3x重链可变区，3x轻链可变区)。
图16：所测试的序列变体。用于VH和VL的模板是全序列的最佳匹配，且种系(Germline)是在种系V-序列中的最佳匹配。其他序列是在表达和ELISA中检测的序列。
图17：与K8轻链或NRY轻链配对的重链的反应性比较。Cγ(cgamma)(6)/K8和Cγ(6)/NRY获得了针对CD163的明显类似的反应性。抗体样品Cγ(6)/K8包含约两倍的抗体以获得如Cγ(6)/NRY所获得的相同反应性。
图18：人源化重链变体的结合。人源化重链变体KN2、KN1IN5、VR1和DQ2(均与轻链NRY配对)对CD163具有相当的反应性。*或**试验在相同ELISA平板上进行。
图19：KN2/NRY和Mac2-158与固定在Biacore芯片上的人CD163的结合的表面等离子共振检测。实际上，两种mAb显示了类似的亲和力。
图20：由HisTrapTM纯化的所表达的scFv的级分的ELISA。将每个级分样品以1∶10稀释在1％BSA，PBS中。随后，将稀释的样品加入到CD163包被的孔中。
图21：重折叠的scFv样品的ELISA。将重折叠的scFv加入到孔中，并进行2倍的系列稀释。直至在1％BSA，PBS中稀释128倍，重折叠的scFv仍与CD163结合。非稀释样品(无BSA的缓冲液中的scFv)具有高背景(左侧的灰色柱)。
图22：ELISA中直接检测的细胞培养上清。即便对于非稀释上清，ELISA信号也非常低。
图23：ELISA中检测的30倍浓缩的细胞培养上清。30倍浓缩上清的ELISA信号证实了Fab片段的存在。所述强度与100ng/ml完整长度的IgG4抗体标准品相当。
图24：65354的SDS-PAGE分析：泳道M：分子量标记物(Cat.No.MM0900，GenScript)；泳道1：粗收获物；泳道2：流通物(Flow through)；泳道3：50mM咪唑的洗脱物；泳道4-5：100mM咪唑的洗脱物；泳道6-8：250mM咪唑的洗脱物；泳道9：500mM咪唑的洗脱物。此方法产生了约6.0mg的小鼠CD163可溶蛋白域1-3，其在SDS-PAGE分析中的纯度超过80％。
图25：cDNA珠上VL PCR的PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳。泳道M：100bp标记物。泳道2显示了大小约400bp的产物。通过凝胶提取纯化此条带，随后测序。
图26：cDNA珠上VH PCR的PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳。泳道M：100bp标记物。泳道7显示了大小约500bp的产物。通过凝胶提取纯化此条带，随后测序。
图27：KN2/NRY和Mac2-158的表位绘图，敲入和敲除表位。
A：以下样品的Western印迹：SeeBlue plus2预染标记物(泳道1)；人CD163wt(泳道2)；人CD163 R60D(泳道3)；人CD163 VKVQEE--＞LKIHEK(泳道4)；人CD163双突变体(泳道5)和阴性转染对照(泳道6)。使用多克隆兔抗人CD163抗体和作为二级抗体的与辣根过氧化物酶偶联的抗兔抗体，进行蛋白表达的检测。
B：以下样品的Western印迹：SeeBlue plus2预染标记物(泳道1)；人CD163wt(泳道2)；人CD163 R60D(泳道3)；人CD163 VKVQEE--＞LKIHEK(泳道4)；人CD163双突变体(泳道5)和阴性转染对照(泳道6)。使用mac2-158检测表位，并使用与辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠抗体作为二级抗体。
C：以下样品的Western印迹：SeeBlue plus2预染标记物(泳道1)；人CD163wt(泳道2)；人CD163 R60D(泳道3)；人CD163 VKVQEE--＞LKIHEK(泳道4)；人CD163双突变体(泳道5)和阴性转染对照(泳道6)。使用KN2/NRY-HRP检测表位。
D：以下样品的Western印迹：(泳道1)小鼠CD163 1-5LKIHDK--＞VKVQEE，Y60R突变体；(泳道2)小鼠CD163 1-5wt；(泳道3)阴性转染对照；(泳道4)SeeBlue plus2预染标记物；(泳道5)阳性印迹对照(小鼠CD163，与V5标签重组)。所使用的一级抗体是抗V5抗体。使用与辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠抗体作为二级抗体进行所结合的一级抗体的检测。
E：以下样品的Western印迹：(泳道1)小鼠CD163 1-5LKIHDK--＞VKVQEE，Y60R突变体；(泳道2)小鼠CD163 1-5wt；(泳道3)阴性转染对照；(泳道4)SeeBlue plus2预染标记物；(泳道5)阳性印迹对照(人CD163)。所使用的一级抗体是Mac2-158。使用与辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠抗体作为二级抗体进行所结合的一级抗体的检测。
图28：地塞米松和地塞米松-NHS标准品的色谱图(A)，和游离地塞米松/地塞米松-NHS(B)以及ED2-地塞米松偶联物样品中的总地塞米松(C)的测定。地塞米松-NHS在柱上转化成地塞米松-半琥珀酸酯，因此，地塞米松-NHS与地塞米松-半琥珀酸酯之间没有区别。
表3
A：不同抗体-皮质类固醇-NHS偶联物的偶联参数。
B：不同抗体-MVCP-地塞米松偶联物的偶联参数。
图29：
A：KN2/NRY和KN2/NRY-NHS-地塞米松偶联物的SDS-PAGE。泳道1：分子量标记物；泳道2：KN2/NRY；和泳道3：KN2/NRY-NHS-地塞米松。
B：显示KN2/NRY和KN2/NRY-NHS-地塞米松偶联物(使用NHS-地塞米松与伯胺偶联)的CD163结合的传感图。
C：用于偶联以产生KN2/NRY-NHS-地塞米松的地塞米松-NHS分子的图示结构。
D：左侧KN2/NRY和KN2/NRY-MVCP-地塞米松偶联物的SDS-PAGE。泳道1：分子量标记物；泳道2：KN2/NRY；和泳道4：还原的KN2/NRY；泳道5：KN2/NRY-MVCP(非还原)。
E：显示KN2/NRY和KN2/NRY-地塞米松偶联物(偶联至限制性还原的KN2/NRY的游离SH基团)的CD163结合的传感图。
A和B显示偶联后仅非常有限降低的亲和力，和偶联后聚集没有增加。
F：用于偶联以产生KN2/NRY-MVCP-地塞米松的地塞米松-MVCP分子的图示结构。
图30：触珠蛋白-地塞米松偶联物对人单核细胞的作用
A：显示与地塞米松偶联的触珠蛋白对从血沉棕黄层(buffy coat，过期血浆)分离的人单核细胞的作用，以及此后与血红蛋白复合以诱导偶联物与CD163结合的数据。所测量的作用是通过地塞米松诱导CD163 mRNA合成。Hp-地塞米松后的数字是指Hp-地塞米松的不同批次。
B：显示10nM地塞米松对分离自血沉棕黄层(过期血浆)的人单核细胞中CD163表达的作用的时间研究。
图31：Mac2-158地塞米松偶联物对人巨噬细胞的作用。
A：显示与地塞米松偶联的Mac2-158对分离自血沉棕黄层(过期血浆)的体外成熟的人巨噬细胞的作用的数据。所测量的作用是对LPS诱导的TNF产生的抑制。
B：显示在相同设置下10nM地塞米松的作用的时间研究。
图32：KN2/NRY与人单核细胞的结合
A-C)：使用Mac2-158-FITC、抗CD14-PE抗体和KN2/NRY-Alexa Fluor647对分离自血沉棕黄层的人单核细胞染色，并通过流式细胞术进行分析D)。包括使用IgG-FITC染色的阴性对照和与AlexaFluor647(ATNP-Alexa Fluor647)偶联的无关抗体。
图33：KN2/NRY-地塞米松与表达CD163的CHO细胞的结合。将表达人CD163的CHO细胞与KN2/NRY(灰色柱状图)或KN2/NRY-地塞米松偶联物(黑色柱状图)一起温育，清洗并用抗人IgG抗体染色，随后进行流式细胞术分析。白色柱状图表示了使用抗人IgG抗体-FITC染色的阴性对照。
图34：KN2/NRY-地塞米松在体外抑制LPS介导的TNFα。培养人单核细胞，并与系列稀释的KN2/NRY-NHS-地塞米松、KN2/NRY-MVCP-地塞米松或游离地塞米松一起温育15分钟，清洗并温育过夜。在LPS刺激4小时后分析细胞上清的TNFα。
图35：ED2与大鼠巨噬细胞的结合。使用抗大鼠CD172a-PE抗体(ED9)和抗大鼠CD163-FITC抗体(ED2)对腹膜巨噬细胞染色，并通过流式细胞术分析(左侧散点图)。CD163-FITC阳性巨噬细胞的百分比显示在右上象限中。还包括了使用IgG-FITC染色的阴性对照(右侧散点图)。
图36：ED2-地塞米松与表达CD163的CHO细胞的结合。将表达大鼠CD163的CHO细胞与ED2(灰色柱状图)或ED2-NHS-地塞米松偶联物(黑色柱状图)一起温育，清洗并用抗小鼠IgG抗体染色，随后进行流式细胞术分析。白色柱状图表示了使用抗小鼠IgG抗体-FITC染色的阴性对照。
图37：ED2-地塞米松在体外抑制LPS介导的TNFα刺激。将大鼠腹膜巨噬细胞和脾细胞悬液与1μg/ml ED2-NHS-地塞米松、地塞米松、ED2或PBS一起温育3小时，随后以LPS刺激20小时。通过BDTM流式微球阵列(CBA)Flex Set试验测定细胞培养上清中的TNFα浓度(一式三份)。
图38：LPS介导的脾细胞TNFα诱导的滴定。培养大鼠脾细胞，并与系列稀释的ED2-NHS-地塞米松偶联物或游离的地塞米松一起温育(A)15分钟、(B)30分钟或(C)60分钟，清洗并温育过夜。在LPS刺激4小时后分析细胞上清的TNFα。
图39：ED2-地塞米松在体内抑制LPS介导的TNFα刺激。在静脉注射LPS前20小时，对雌性Lewis大鼠静脉注射ED2-NHS-地塞米松(n＝4)，游离地塞米松(以地塞米松-21-醋酸酯的形式以提高溶解性，浓度类似的地塞米松和地塞米松-21-醋酸酯的作用相同(数据未显示))(n＝4)或赋形剂(n＝4)。
A)在注射LPS后2小时测定血清样品中的TNFα浓度。在夹心ELISA试验中分析血清样品，一式三份。
B)LPS注射后2天的胸腺重量。
C)LPS注射后2天的脾重量。
图40：与连接氨基和连接Cys的偶联物相比，ED2-地塞米松在体内抑制LPS介导的TNFα刺激。(A)培养大鼠脾细胞，并与系列稀释的ED2-NHS-地塞米松偶联物或游离的地塞米松一起温育15分钟，清洗并温育过夜。在LPS刺激4小时后分析细胞上清的TNFα。在静脉(i.v.)注射LPS前20小时，对雌性Lewis大鼠静脉注射ED2-NHS-地塞米松(n＝5)，ED2-MVCP-地塞米松(n＝5)，游离地塞米松(以地塞米松-21-醋酸酯的形式以提高溶解性)(n＝5)或赋形剂(n＝5)。(B)在注射LPS后2小时测定血清样品中的TNFα浓度。在夹心ELISA试验中分析血清样品，一式三份。(C)LPS注射后2天的胸腺重量。(D)LPS注射后2天的脾重量。组间的统计学显著性差异以p值表示。
图41：醋酸氟轻松和强的松龙偶联的ED2对LPS介导的体内TNFα产生的作用。在静脉(i.v.)注射LPS前20小时，对雌性Lewis大鼠静脉注射ED2-醋酸氟轻松(n＝4)，ED2-强的松龙(n＝4)，游离的醋酸氟轻松(n＝4)，游离的强的松龙(n＝4)或赋形剂(n＝4)。在注射LPS后2小时测定血清样品中的TNFα浓度。在夹心ELISA试验中分析血清样品，一式三份。
图42：不同3E10B10-地塞米松偶联物的体外和体内作用。(A)培养小鼠脾细胞，并与系列稀释的3E10B10-地塞米松偶联物或游离的地塞米松一起温育15分钟，清洗并温育过夜。在LPS刺激4小时后分析细胞上清的TNFα。(B)在静脉(i.v.)注射LPS前20小时，对雌性Balbc/A小鼠静脉注射3E10B10-NHS-地塞米松(n＝5)，3E10B10-MVCP-地塞米松(n＝5)，游离的地塞米松(以地塞米松-21-醋酸酯的形式以提高溶解性)(n＝5)或赋形剂(n＝5)。在注射LPS后2小时测定血清样品中的TNFα浓度。在夹心ELISA试验中分析血清样品，一式三份。
图43：对小鼠胶原抗体诱导性关节炎的治疗作用。对小鼠每个爪的关节炎症候评分，每周6次。(A)总关节炎评分定义为每天所有爪的评分和。此图显示了所有处理组中平均临床关节炎总分与时间的关系图。每个点代表组平均值(n＝5)。(B)累积的关节炎评分定义为从第0天至第14天获得的总临床关节炎评分之和。*代表甲基强的松龙组与赋形剂组相比，p＜0.05；和#代表甲基强的松龙-3E10B10组与赋形剂组相比，p＜0.05。
图44：地塞米松-MVCP合成途径的概况。
图45：地塞米松-NHS合成途径的概况。
图46：CD163序列的比较。
图47：处理对体重的影响。
对各大鼠个体称重，每周6次，并且计算每个处理组的平均体重。每个点代表组平均值(n＝4)。注：两图中均显示了相同的赋形剂和0.01mg/kg地塞米松组。
图48：处理对发病日的影响。
发病日定义为观察到＞0的临床评分的连续三天中的第一天。如果大鼠在试验期间没有发病，则将发病日任意地定为第21天。各条表示组平均值±SD。*表示与赋形剂组相比，p＜0.05。Dexa＝地塞米松；Dexa-conj＝地塞米松-偶联物。
图49：处理对发病率的影响。疾病定义为每天＞0的临床评分。此图显示了所有处理组中发病率与时间的关系图。
图50：处理对总临床关节炎评分的影响。对大鼠每个爪的关节炎症候评分，每周6次。总关节炎评分定义为每天所有爪的评分和。此图显示了所有处理组中平均临床关节炎总分与时间的关系图。每个点代表组平均值(n＝4)。注：两图中均显示了相同的赋形剂和0.01mg/kg地塞米松组。
图51：处理对累积临床关节炎评分的影响。此图显示了累积关节炎评分，其定义为从第0天至第14天获得的总临床关节炎评分之和。各条表示组平均值±SD。*表示与赋形剂组相比，p＜0.05；#表示地塞米松组与0.01mg/kg地塞米松-偶联物相比，p＜0.05。Dexa＝地塞米松；Dexa-conj＝地塞米松-偶联物。
图52：处理对左后爪厚度的影响。采用激光扫描测微计测量后爪的厚度。爪厚度每周测量5次。每个点代表组平均值(n＝4)。注：两图中均显示了相同的赋形剂和0.01mg/kg地塞米松组。
图53：处理对累积左后爪肿胀的影响。此图显示了累积的爪肿胀，其定义为从第10天至第21天的Δ厚度值之和(Δ厚度是爪厚度减去基线值的差值，所述基线值是第0天至第9天的平均值)。各条表示组平均值±SD。*表示与赋形剂组相比，p＜0.05。Dexa＝地塞米松；Dexa-conj＝地塞米松-偶联物。
图54：处理对右后爪厚度的影响。采用激光扫描测微计测量后爪的厚度。爪厚度每周测量5次。每个点代表组平均值(n＝4)。注：两图中均显示了相同的赋形剂和0.01mg/kg地塞米松组。
图55：处理对累积右后爪肿胀的影响。此图显示了累积的爪肿胀，其定义为从第10天至第21天的Δ厚度值之和(Δ厚度是爪厚度减去基线值的差值，所述基线值是第0天至第9天的平均值)。各浮标表示组平均值±SD。*表示与赋形剂组相比，p＜0.05；#表示与0.01mg/kg地塞米松-偶联物相比，p＜0.05。Dexa＝地塞米松；Dexa-conj＝地塞米松-偶联物。
图56：处理对器官重量的影响。在处死时收集脾、胸腺和肝脏并称重。针对体重对数据进行标准化。各条表示组平均值±SD。*表示与赋形剂组相比，p＜0.05；#表示地塞米松组与0.01mg/kg地塞米松-偶联物相比，p＜0.05。Dexa＝地塞米松；Dexa-conj＝地塞米松-偶联物。
实施例
实施例1：抗CD163受体的SRCR域1的抗体
序言
CD163是由九个细胞外清道夫受体的富半胱氨酸(SRCR)B型域组成的清道夫受体。其介导触珠蛋白-血红蛋白(Hp-Hb)复合物的清除并且还参与炎症过程的调控(3；4)，所述复合物是在血管内溶血过程中血红蛋白被释放到循环系统中时形成的(1；2)。CD163被认为专门表达于单核细胞系表面。其由循环系统中的驻留单核细胞表达(5；6)，并且在向巨噬细胞成熟期间上调。其在驻留组织的巨噬细胞(6-10)上，以及替代性活化的巨噬细胞(M2)(11-14)和TIE2+巨噬细胞(15；16)上高度表达。此外，CD163还显示由造血干/祖细胞的CD34+亚群(17)表达，并且还提出其表达在髓系树突细胞的亚类(18；19)上。
为了响应Toll样受体(TLR)活化，通过蛋白酶介导的释放机制，将CD163从细胞膜切下(20-22)，形成可溶性CD163(sCD163)，现已证明血清中的sCD163可用于诊断，例如脓血症和噬血症(23-25)。
CD163局限于单核细胞/巨噬细胞系的严格表达已得到越来越多的关注。现已积累了大量证据，证明炎性疾病、恶性疾病和感染疾病中的细胞和可溶性CD163的水平显著变化(11；23；24；26-31)。CD163可以作为影响单核细胞/巨噬细胞系统的病症的诊断标记，并且作为治疗候选物。
然而，尽管已经详细描述了sCD163的正常浓度范围、生物变异和分子结构(21；32；33)，但系统阐述单核细胞CD163表达的现有研究有限。重要的是，使用不同抗凝剂、抗体克隆和通用测试条件，流式细胞研究一直显示出显著差异的单核细胞CD163表达水平，报道其在极少至99％之间变化(3；5-7；34-41)。最近，阐述了单核细胞CD163表达的流式细胞术评估根据测试条件而显著不同(38)，且本发明人此前揭示，在使用不同抗体克隆时，树突细胞CD163表达可显示差异(18)。显然，单核细胞CD163表达作为诊断工具和治疗候选物的应用依赖于对病理和生理条件二者的可比且可靠的测量。
材料和方法
抗体和其他试剂：
以下单克隆抗体(mAb)用于流式细胞术、免疫荧光、SPR分析以及使用125I标记的抗CD163抗体的胞吞实验：抗CD163抗体(MAC2-158)、APC-偶联的抗CD14抗体(UCHM1)和R-PE偶联的小鼠IgG1；k同种型对照(MCG1)得自于荷兰格罗宁根的IQ Products。抗CD163抗体(GHI/61)得自于BD Biosciences，CA，USA。抗CD163抗体(R-20)得自于TrilliumDiagnostics，LLC，Scarborough，Maine，USA。抗CD163抗体(RM3/1)得自于BioLegend，SanDiego，CA，USA。所购买的所有CD163mAb克隆均为纯化且R-PE偶联的。山羊抗小鼠偶联的488得自于Molecular Probes，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA。小鼠抗人CD163抗体Ki-M8和5C6-Fat得自于德国Acris Antibodies(货号BM4112和BM4041，http：// www.a.cris-antibodies.com/BM4112.htm，http：//www.acris-antibodies.com/ bm4041.htm)。小鼠抗人CD163EDHu-1得自于德国Acris Antibodies(货号SM2160P，http：// www.acris-antibodies.com/SM260P.htm)。抗CD163抗体Mac2-48得自于荷兰IQ Products，货号CD163-48U，http：//www.iqproducts.nl/catalog/index.php？pr＝783)。小鼠抗人CD163抗体R20得自于Trillium，Maine，USA(货号CD163-20U，http：//trilliumdx.com/ products/content.php？products_id＝33)。小鼠抗人CD163抗体Ber-Mac3可得自于MBL，MA，USA，(货号K-0147，http：//www.mblintl.com/mbli/account/search_results.asp？ search＝K0147-3)。
血样品和PBMC的制备：
在真空采血管(Terumo Europe NV，Leuven，Belgium)中，通过标准的静脉穿刺从健康供体获得由EDTA、柠檬酸盐和肝素稳定的外周血样品。使用AccuspinSystem-1077(Sigma-Aldrich Denmark A/S，Broendby，Denmark)，通过梯度分离离心，从富含白细胞的血沉棕黄层分离外周血单核细胞(PBMC)。血沉棕黄层由CPD-A(Baxter，Munich，Germany)抗凝的健康志愿者捐献的全血单位(约472ml)制备。此研究得到了地区伦理委员会的批准(j.nr.20040068)。
定量流式细胞术：
在4℃，使用同种型匹配的对照抗体或相关抗体对新鲜抽取的外周全血样品或PBMC(约3x106个细胞)避光染色1小时。在全血染色时，使用4℃冷氯化铵溶液裂解红细胞15分钟。在需要间接免疫荧光染色时，先将细胞与未偶联的一级CD163抗体一起在4℃温育1小时，用D-PBS(pH 7.4)清洗三次，随后与山羊抗小鼠偶联的488(1∶200稀释；Molecular Probes，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)一起在4℃避光温育1小时。用D-PBS(pH7.4)清洗染色细胞两三次，重悬在400μl FACSflow(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)中，并在冰上静置直至分析。使用FACSCalibur流式细胞计数器分析所有样品，并使用用于8.3版Macintosh软件的FlowJo(TreeStar，San Carlos，CA)补偿光谱重叠。对于CD163密度的定量，按照厂商的推荐，使用Quantibrite PE珠(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)进行抗体结合/细胞(ABC)的流式细胞术评估。如下文详述，在细胞染色后，在获取样品前，使用一套4支预标定的荧光标记珠进行标准化。Quantibrite PE珠在与测试相同的仪器设定下运行，并将使用Quantibrite PE珠获得的线性回归用于将细胞群的FL2线性荧光染色转化成每个细胞(ABC)结合的(CD163)PE分子数。
酶联免疫吸附测定(ELISA)：
按照此前的描述(32)，使用内部(in-house)ELISA测定测量可溶性CD163。
源自人单核细胞的巨噬细胞和稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的制备、刺激和温育：
根据厂商提供的说明书，使用来自Dynal的磁珠(MyPureTMMonocyte Kit 2；Invitrogen A/S，Taastrup，Denmark)，通过阴性选择从PBMC分离单核细胞。通过流式细胞术确定单核细胞制备物的纯度大于95％(CD14+)。使用磷酸缓冲盐水清洗分离的细胞两次。通过将单核细胞(约1×107个细胞)在5％CO2和37℃，带有包含100ng/mlM-CSF的20％FCS的RPMI1640培养基(RPMI 1640+25mM HEPES+l-谷氨酰胺)(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA，USA)中培养4天来制备源自单核细胞的巨噬细胞(MDM)。随后，通过与细胞分离缓冲剂(Invitrogen A/S，Taastrup，Denmark)一起在4℃温育30分钟，随后冲洗并剥离，从而使MDM从培养瓶脱离。随后，将所述细胞在37℃，95％空气和5％CO2在Lab-TekTM腔室培养玻片(Thermo Fisher Scientific，Roskilde，Denmark)中的补充了包含100ng/ml M-CSF的20％FCS的RPMI 1640培养基(RPMI 1640+25mM HEPES+1-谷氨酰胺)(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，USA)中培养24小时。在培养期间，添加200nM地塞米松(Merck KGaA，Darmstadt，Germany)以提高CD163表达。如此前所述(2)，将如上所述表达全长人CD163的稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养在包含300μg/ml潮霉素B的无血清CHO培养基(HyQ-CCM，HyClone，Logan，UT)中。
如下文所述，使用4℃的冷D-PBS(pH 7.4)清洗细胞，重悬并对CD163表达染色。
荧光标记CD163抗体的细胞结合和摄取：
在Lab-TekTM腔室培养玻片(Thermo Fisher Scientific，Roskilde，Denmark)中，使用包含1％BSA的4℃冷D-PBS(pH 7.4)清洗MDM或CHO细胞。随后，将所述细胞与10μg/ml的不同抗CD163抗体克隆一起在4℃温育1小时，随后使用带有1％BSA的D-PBS(pH 7.4)清洗三次。然后，使用4％甲醛在4℃固定细胞1小时，或在95％空气和5％CO2的潮湿气氛下，在37℃温育30分钟。随后，将温育30分钟的细胞用包含1％BSA的D-PBS(pH 7.4)清洗三次，并使用4％甲醛在4℃固定1小时。将所有细胞用D-PBS(pH 7.4)清洗一次，并在室温下用包含0.05％Triton X-100(Merck)的D-PBS(pH 7.4)渗透15分钟。此后，将细胞与山羊抗小鼠偶联的488(1∶200稀释；Molecular Probes，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)一起在室温下温育1小时，用包含0.05％Triton X-100的D-PBS(pH 7.4)清洗五次。使用包含4′，6′-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的封固剂(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)封固玻片以鉴定细胞核。使用带有x100倍油浸物镜的Zeiss Axiovert200M显微镜(Carl Zeiss GmbH，Jena，Germany)观察荧光。使用AxioCam MRm数码相机(CarlZeiss GmbH，Jena，Germany)获取代表性图片。或者，使用Zeiss LSM-510共焦显微镜(CarlZeiss GmbH，Jena，Germany)，通过共焦免疫荧光显微镜检查分析免疫染色的细胞。使用NIHImageJ软件(1.38w版)和Adobe Photoshop CS4进行图片处理。
125I标记的抗CD163抗体的细胞结合和摄取：
按文献所述(Madsen，M.，Moller，H.J.，Nielsen，M.J.，Jacobsen，C.，Graversen，J.H.，van den Berg，T.and Moestrup，S.K.(2004)Molecular characterization of thehaptoglobin.hemoglobin receptor CD163.Ligand binding properties of thescavenger receptor cysteine-rich domain region.J.Biol.Chem.，279，51561-51567)，在CD163转染的Flp-In中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和模拟转染的Flp-In中研究125I标记的抗CD163抗体的胞吞。
数据和统计分析：
由范围值或95％置信区间完成所有评估。使用t检验分析数值间差异的统计学显著性。对于缺少数值高斯分布的较小组之间的比较，使用非参数的Mann-Whitney秩和检验。在p＜0.05时，认为差异显著。使用Window系统的STATA统计包(版本10)进行统计学计算。
mAb CD163结合的表面等离子共振(SPR)分析：
在Biacore 2000仪器(Biacore，Uppsala，Sweden)上进行mAb与CD163结合的SPR分析。使用于水中的0.2M N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和0.05M N-羟基琥珀酰亚胺的1∶1混合物活化Biacore传感芯片(CM5型)。将纯化的重组CD163在10mM乙酸钠(pH4.0)中固定，使用1M乙醇胺(pH8.5)封闭剩余的结合位点。由固定的重组CD163蛋白产生的SPR信号对应于40-70fmol的蛋白/mm2。使用5-100nM范围的mAb浓度产生传感图。使用1.6M甘氨酸-HCl(pH 3)再生流动细胞。用于试验的运行缓冲剂为CaHBS 10mM Hepes、150mMNaCl、3.0mM CaCl2、1.0mM EGTA和0.005％Tween20(pH 7.4)或10mM Hepes、150mM NaCl、3.0mM EDTA和0.005％Tween20(pH 7.4)，将mAb样品溶于与所用运行缓冲剂相同的缓冲剂中。使用Biamolecular InteractionAnalysis评估程序(版本3.1)分析所有结合数据。
与Mac2-158表位结合的竞争：
为了评估一系列mAb与CD163的结合中是否存在竞争，本发明人首先通过注射50μL50μg/ml Mac2-158，由Mac2-158饱和CD163-芯片，随后，注射5μg/ml的相关mAb。结合缓冲剂为CaHBS 10mM Hepes、150mM NaCl、3.0mM CaCl2、1.0mM EGTA和0.005％Tween 20(pH7.4)。
结果
使用不同的单克隆抗体克隆测定人外周血单核细胞上的表面CD163表达：
使用将单核细胞限定为CD14+细胞的特异mAb对EDTA稳定的新鲜抽取全血染色，从而使用覆盖多个SRCR域的CD163mAb克隆研究单核细胞表面的CD163表达。相对于分别结合SRCR域4、7和9的R-20(75.93％[95％CI：72.49-79.38％]；p＜0.005)(图1B)，GHI/61(63.03％[95％CI：54.34-71.73％]；p＜0.001)(图1C)和RM3/1(0.33％[95％CI：0.068-0.59]；p＜0.0001)(图1D)，结合SRCR域1的MAC2-158克隆识别显著较大部分的外周血单核细胞(84.06％[95％CI：76.20-91.92％])(图1A)。与R-20(1,650[95％CI：1,139-2,163]；p＜0.0001)(图1B)、GHI/61(1,030[95％CI：807-1,253]；p＜0.0001)(图1C)和RM3/1(101[95％CI：28-175]；p＜0.0001)(图1D)相比，使用MAC2-158时，所测量的每个单核细胞的CD163受体密度显著较高(17,725[95％CI：13,335-22,133])。为了比较，使用同种型匹配的非特异性IgG评估非特异性结合，且显示了低背景染色(94[95％CI：76-112])(未显示)。在先后使用未偶联的一级CD163抗体克隆和Alexa488二级抗体偶联物对全血染色时，观察到类似的CD163表达变化模式(未显示)。
通过密度梯度离心分离的外周血单核细胞上的单核细胞表面CD163表达：
纯化外周血单核细胞以评估histopaque梯度分离对单核细胞表面CD163表达的影响。流式细胞分析显示了与利用EDTA稳定的新鲜抽取全血所示类似的CD163表达模式。在使用MAC2-158时，对CD163染色的CD14+单核细胞的比例为81.10％[95％CI：73.95-88.25％]，在使用RM3/1时，为2.50％[95％CI：0.29-4.71％]。然而，在密度梯度离心后，对于R-20克隆和GHI/61克隆，CD163染色为阳性的CD14+单核细胞的比例显著下降。在分离后，使用R-20，54.40％[95％CI：29.10-79.70％]的CD14+单核细胞为CD163染色阳性，这显著低于EDTA稳定的新鲜抽取全血(p＜0.05)。使用GHI/61，CD163阳性的单核细胞比例显著减少，几乎不可测(1.26％[95％CI：0.91-1.61％])。所测试的每个单核细胞的CD163受体密度显示出类似的模式：MAC2-158(11，417[95％CI：8,058-14,777])，p＜0.01；R-20(836.7[95％CI：654.4-1,019]；p＜0.0001)；GHI/61(108.0[95％CI：81.71-134.3]；p＜0.0001)和RM3/1(132.3[95％CI：66.97-197.7]；p＜0.05)。
不同抗凝剂对单核细胞表面CD163表达的影响：
为了研究不同的细胞外钙浓度对单核细胞表面CD163表达的影响，使用不同的mAb克隆，测量在使用三种常用抗凝剂稳定的新鲜抽取的全血样品中的CD163水平(图2和3，和表1)。使用MAC2-158克隆，无论细胞外钙浓度如何，CD163染色为阳性的CD14+单核细胞比例均不受影响：以EDTA为抗凝剂，CD163染色为阳性的CD14+单核细胞比例为87.23％[95％CI：81.10-93.37％]；使用柠檬酸盐，为83.97％[95％CI：80.52-87.41％]；在使用肝素时，为84.43％[95％CI：77.82-91.05％](图2左侧；图3A和表1)。每个单核细胞的受体密度显示出类似的模式，使用EDTA作为抗凝剂，显示为17,725[95％CI：13,335-22,133]的受体，在使用柠檬酸盐时，为17,726[95％CI：14,675-20,777]，在使用肝素时，为18,929[95％CI：14,261-23,597](图2左侧；图3B和表1)。
使用R-20克隆对CD163染色，在使用EDTA为抗凝剂时，75.93％[95％CI：72.49-79.38％]的CD14+单核细胞为CD163染色阳性，在使用柠檬酸盐时，为74.73％[95％CI：70.36-79.11％]；然而，使用肝素时则显著较低(63.03％[95％CI：60.38-65.69％]；p＜0.005)(图2，中左侧；图3A和表1)。所测试的每个单核细胞的CD163受体密度为：EDTA中1,760[95％CI：1,600-1,920]，柠檬酸盐中1,988[95％CI：1,750-2,226]；但在肝素稳定样品中，预想不到地较高(3，019[95％CI：2,648-3,390])(图2，中左侧；图3B和表1)。
然而，在使用GHI/61克隆时，CD163染色为阳性的CD14+单核细胞比例明显受到抗凝剂的影响，与使用EDTA(63.03％[95％CI：54.34-71.73％]；p＜0.0001)和柠檬酸盐(64.37％[95％CI：58.17-70.56％]；p＜0.0001)抗凝的血样相比，在使用肝素作为抗凝剂时，表现出显著较低的单核细胞表面CD163表达(0.82％[95％CI：0.55-1.08％])(图2，中右侧；图3A和表1)。此发现得到了每个单核细胞的CD163受体密度的验证：肝素中的该密度为58.33[95％CI：24.42-92.24]，而EDTA中为1,030[95％CI：806.9-1,252](p＜0.0001)，柠檬酸盐稳定的样品中为1,152[95％CI：962.9-1,342](p＜0.0001)(图2，中右侧；图3B和表1)。
使用RM3/1，流式细胞分析显示非常小比例的CD163染色阳性CD14+细胞，在EDTA稳定的血样中为0.33％[95％CI：0.068-0.59％]，在柠檬酸盐中为12.50％[95％CI：9.57-15.43％]，且在肝素中为3.33％[95％CI：1.84-4.82％](图2右侧；和图3A)。在使用RM3/1克隆时，所测定的单核细胞表面CD163表达也非常低：EDTA中为86.00[95％CI：66.28-105.7]，柠檬酸盐中为207.0[95％CI：167.0-247.0]，肝素中为210.3[95％CI：163.3-257.4]，而与细胞外钙浓度无关(图2右侧；图3B和表1)。
所测表面表达的变化不是由于CD163脱落(shedding)造成的：
在使用不同抗凝剂稳定的相同新鲜抽取全血样品中测量可溶性CD163(sCD163)的水平。经过样品制备期间的稀释调整，使用ELISA测定的sCD163水平：EDTA稳定的血样中为832.1μg/l，柠檬酸盐稳定的血样中为738.3μg/l，肝素稳定的血样中为897.8μg/l，表明所使用的抗凝剂(和因此存在的钙)不影响sCD163的脱落。
与CD163的结合：
Mac2-48、Mac2-158、5C6-Fat、Ki-M8、EdHu1和BerMac3在2mM游离Ca2+和10mM EDTA二者中均与CD163结合，然而，在Ca2+和EDTA缓冲剂之间显示出某程度的不同亲和力，但所有的亲和力都在纳摩尔或亚纳摩尔的范围。名为GHI/61的mAb却仅在含钙缓冲剂中显示对CD163的极弱结合，但其在10mM EDTA中显示29nM表观Kd的结合。RM3/1在EDTA缓冲剂中没有显示与CD163的结合，而在2mM游离Ca2+中的表观Kd为0.6nM。图4显示了典型的传感图，比较了在钙和EDTA中的结合。
125I标记的CD163抗体在稳定CD163转染的Flp-In CHO细胞中的胞吞作用：
为了比较胞吞能力，用125I标记mAb克隆并与表达CD163的Flp-In CHO细胞一起温育至提高的时间点。如图5A所示，对于大多数抗体，细胞相关的放射性(结合或内化)的时间进程在温育1小时后达到平台，但在使用125I标记的GHI/61时，细胞相关的放射性水平为低水平，表明胞吞减少或没有胞吞。相比之下，在与125I标记的Mac2-48和Mac2-158一起温育时，细胞相关的放射性的时间进程在温育2小时、甚至4小时后都没有达到平台。使用MAC2-158，细胞相关的放射性百分比在稳定CD163转染的Flp-In CHO细胞中达到61.27％[95％CI：56.56-65.97％]。作为比较，使用相同的mAb克隆，细胞相关的放射性百分比在非转染的Flp-In CHO细胞中达到1.37％[95％CI：0.426-2.31％]。使用R-20(18.97％[95％CI：18.09-19.84％]与0.97％[95％CI：0.59-1.35％])、GHI/61(1.23％[95％CI：0.854-1.61％]与1.23％[95％CI：0.72-1.75％])和RM3/1(7.77％[95％CI：4.11-11.43％]与1.47％[95％CI：0.099-2.84％])所达到的细胞相关的放射性百分比较低。如所期望的，如图5B所示，在非转染的Flp-In CHO细胞中检测的细胞相关放射性程度对于所有单克隆抗体均较低。
荧光CD163抗体在源自人单核细胞的巨噬细胞中的胞吞作用：
由外周血单核细胞制备源自单核细胞的人巨噬细胞，并使用200nM地塞米松刺激以评估不同CD163 mAb的结合和摄取。MAC2-158、R-20、GHI/61和RM3/1能够结合人巨噬细胞表面上的CD163受体，该CD163受体由免疫荧光染色显示。然而，荧光显微镜检查表明，使用MAC2-158和R-20的染色显示了比GHI/61和RM3/1明显的细胞表面染色(图6上部)。
在温育30分钟后，免疫荧光染色显示出独特斑点状(punctuate)的亚细胞染色，其是所研究的所有CD163 mAb的特征(图6下部)。然而，与R20、GHI/61和RM3/1相比，使用MAC2-158时，细胞内染色密度显示最为明显(图6下部)，表明MAC2-158的摄取更为有效。通过共焦激光扫描显微分析，在CD163转染的FIp-In CHO细胞观察到类似模式的表面染色和细胞摄取(未显示)。
在表达CD163的CHO细胞上进行类似的试验，使用共焦显微术筛选较大组的mAb(图7a和7b)。
与Mac2-158的竞争：
图8显示了不同CD163 mAb与首先用Mac2-158饱和的CD163传感芯片结合的传感图，这意味着实际上用于Mac2-158的所有表位都已经被mAb结合，因此，与Mac2-158竞争结合的mAb应当不能结合固定在芯片上的CD163并诱导所测量的反应单位的进一步提高，而不竞争结合的mAb应当能够结合固定的CD163，并由此提高所测量的反应单位。由图8可见，在2mM游离钙缓冲剂中，Mac2-158、Mac2-48、Ber-Mac3和GHI/61不能结合Mac2-158饱和的CD163-Fc。除GHI/61之外，所有的mAb均结合SRCR域1，GHI/61在富钙环境中没有表现出结合。无论是否饱和，mAb EdHU-1、Ki-M8和RM3/1均能够结合CD163-Fc，因此不与Mac2-158竞争结合CD163。因此，可见结合域1的所有单克隆抗体均与Mac2-158竞争结合。
讨论
对用于诊断目的的CD163的关注不断增加，促使本发明人详细检查影响通过流式细胞术检测外周血中单核细胞CD163表达的因素。此前的研究已经报道了不同的结果，提出从仅仅极少至99％的单核细胞表达CD163(3；5-7；34-41)。这些研究使用了对分布于9个细胞外SRCR域的不同表位具有特异性的各种单克隆CD163抗体克隆(42)。
本发明人此前证明了使用识别SRCR域1中的表位的MAC2-158时，单核细胞和树突细胞表面CD163表达高于使用识别定位接近细胞膜的SRCR域7的GHI/61的情况(18)。这促使本发明人设想反应性的差别可能是由于结合接近细胞膜时的空间位阻造成的。因此，本发明人基于其不同的表位特异性(分别为域1、4、7和9)(42)选择了4个抗体(MAC2-158、R-20、GHI/61和RM3/1)，并且研究其在流式细胞术中评估外周血单核细胞表面CD163表达的性能。
实际上，本发明人观察到了依赖于SRCR域的结合模式，其可以解释大量研究者提出的单核细胞CD163表达中的巨大不一致性(3；5-7；34-41)。有趣的是，在使用已知识别位于SRCR域9中的表位的RM3/1时，只有很小部分的单核细胞被染色。相反，在使用识别SRCR域1的MAC2-158克隆时，始终能够鉴别大比例的表达CD163的循环单核细胞(＞80％)。通过流式细胞术检测的受体密度显示了类似的模式，这进一步证实了上述观察结果。因此，可猜测，针对定位接近细胞膜的SRCR域而产生的抗体的亲和力较低可能部分反映了本发明人此前提出的空间位阻(18)。
此外，关于使用不同克隆的CD163mAb的反应性变化还有其他解释。此现象可能仅仅表明了使用荧光染料-蛋白偶联物对抗体的标记程度不同。为了保持最佳的偶联度以给出最大的荧光强度，使用可商购的偶联一级抗CD163抗体进行所有的直接免疫荧光染色。此外，偶联蛋白的荧光强度并不随偶联度线性变化，而是在相对低的偶联度时达到最大。因此，产生最大荧光的最低偶联度是优选的，因为其所导致的抗体物理和生物性能的变化最小(43-46)。然而，在使用未偶联一级CD163抗体克隆和相同的荧光二级抗体偶联物评估间接免疫荧光染色时，通过免疫荧光显微术和流式细胞术观察到了类似模式的CD163细胞表面免疫染色。荧光淬灭是在使用针对定位接近细胞膜的SRCR域而产生的抗体时单核细胞CD163表达减少的另一种可信解释。在常规的有机荧光染料(例如FITC和PE)中，分子间相互作用和分子之间的能量转移能够使荧光强度自淬灭，导致吸收的激发能损失和荧光强度降低(47)。
在最近的研究中，作者发现，使用两种不同的抗CD163抗体克隆，在由EDTA抗凝的血样中的单核细胞CD163细胞表达显著高于使用肝素抗凝的情况(38)。在一定程度上，本发明人在EDTA和肝素稳定的血样中观察到了类似模式的所测定的单核细胞CD163表达。在使用GHI/61时，CD163染色阳性的CD14阳性单核细胞的比例的差异最为显著。然而，在使用MAC2-158时，CD163染色阳性的CD14阳性单核细胞的比例不受所使用的抗凝剂的影响。已知基质金属蛋白酶将CD163从细胞膜切下，导致可溶形式CD163的释放(20；48)。此外，通过证明所研究的样品中可溶性CD163的水平不受影响，发明人排除了使用不同抗凝剂的CD163表达差异是由CD163脱落造成的。由于肝素稳定的血样类似于生理的钙水平，而EDTA稳定的血样中除去了游离的钙，本发明人猜想，CD163表达的变化可能是由于钙依赖性结合亲和力的损失造成的。SPR分析清楚地证明这一点，其显示在使用GHI/61时，配体结合活性在钙的存在下几乎完全丧失。使用RM3/1观察到相反的模式，其在介质中存在钙时显示结合活性。R-20略受钙影响，而无论细胞外钙水平如何，MAC2-158均显示出结合活性，这与使用流式细胞术时的观察结果一致。
钙依赖性配体结合还见于CD163与其唯一已知生理相关配体的结合；Hp-Hb复合物与SRCR域3的结合(42)。包含蛋白凝集素的SRCR域与IgA的结合是由B型SRCR域以钙依赖的方式介导的(49)，而且，现已确定介导钙依赖性配体结合的来自MARCO的A型SRCR域的结构(50)。发现MARCO的SRCR的三个残基，即Asp447、Asp 448和Glu511，对钙连接至关重要。所述域的钙结合位点不与配体相互作用，但表明钙结合具有促进正确结构构象以使配体能够结合的作用(50)。MARCO的SRCR域与CD163的SRCR域的序列比对(未显示)证明，CD163的SRCR域2、3、4、7和9保持了这三个残基，而在SRCR域1、5、6和8中，这三个残基中的一个或多个具有非保守的取代。尽管这四个域中的其他残基能够代替作为用于二价阳离子的配体，但序列观察的结果与本发明人的如下观察结果相符：即，钙对SRCR域1的mAb(MAC2-158)的结合影响较小，而钙对域4、7和9的mAb的结合影响较大。尽管除SRCR域3之外，CD163的具体SRCR域的功能和可能的配体是已知的，但可以猜想钙在这些相互作用中的功能，而且其可能不参与SRCR域1、5、6和8的配体结合。
现已提出，CD163介导的巨噬细胞对Hb-Hp复合物的内化作用可能是研发在单核细胞/巨噬细胞系的表达CD163的赘生性细胞中的靶特异性药物递送的机制(51)。涉及细胞摄取的大多数研究在稳定CD163转染的FIp-In CHO细胞(2；4；42)中进行，或使用荧光偶联的Hb-Hp复合物(4；51)。然而，CD163转染的细胞不类似于单核细胞/巨噬细胞系的细胞，而且，使用单克隆抗体而不使用Hb-Hp复合物，可使未来的药物标记更为可行。因此，本发明人着手研究和评估不同的单克隆CD163抗体克隆在源自单核细胞的巨噬细胞中的细胞摄取，所述源自单核细胞的巨噬细胞代表了具有功能性和免疫活性的CD163表达细胞。
意外的是，免疫荧光显微术分析显示，使用CD163 mAb克隆可实现细胞摄取，而与其SRCR域识别无关。然而，根据流式细胞分析，使用MAC2-158，染色细胞的比例，荧光强度和细胞摄取明显更好。通过使用CD163转染的FIp-In CHO细胞的CD163结合和细胞摄取试验证实了这一点。通过共焦激光扫描显微镜分析，在CD163转染的FIp-In CHO细胞中观察到类似模式的表面染色和细胞摄取，表明MAC2-158识别的表位更易于接近，或可能显现用于抗体结合的正确构象。通过研究由125I标记的不同抗CD163克隆在CD163转染的FIp-In CHO细胞中的结合和胞吞作用，进一步证实了此观察结果。在使用R-20和GHI/61温育1小时后，细胞相关放射性的时间进程达到平台，这与评估125I标记的Hp-Hb复合物时的细胞相关放射性的时间进程相当(2)。然而，在使用125I标记的Mac2-158温育时，细胞相关放射性的时间进程在温育2小时内没有达到平台，并且显示出与其他克隆相比较高百分比的摄取方式。
由于现已提出CD163作为急性髓细胞性白血病中药物递送的可能靶标(51)，因此本发明人的发现具有重要性。使用流式细胞术，研究者已经发现，约5％(范围：0％至38.5％)的M4型AML的白血病母细胞以及23％(范围：1％至77％)的M5型AML的白血病母细胞表达CD163(51；52)。然而，与CD163在单核细胞和巨噬细胞上细胞分布的矛盾数据类似，现已报道了髓单核细胞性赘生性细胞上CD163表达的差异。使用不同的方法和单克隆细胞克隆，最近的研究证实了在49％的具有单核细胞分化的AML病例中的CD163免疫活性(53)。考虑现有的数据，可设想髓单核细胞(M4)和单核细胞(M5)亚型的AML二者中均有高比例的白血病母细胞表达CD163，表明此受体作为急性髓细胞性白血病中靶向特异性药物递送的潜在候选物。
综上，本发明人证明了，使用识别SRCR域1的MAC2-158克隆，始终能够鉴别出大比例的循环性表达CD163的单核细胞。此外，本发明人首次发现了在源自单核细胞的巨噬细胞中CD163抗体介导的细胞摄取的能力，其在使用MAC2-158时最为有效。本发明人的发现强化了CD163在影响单核细胞/巨噬细胞系统的疾病中作为诊断工具和治疗候选物的临床应用。
本发明人意外地观察到表达CD163的细胞对Mac2-158和Mac2-48的细胞摄取和结合明显高于其他测试的抗体(图5)。由于Biacore研究显示，尽管Mac2-158与CD163结合的亲和力高，但很多其他mAb也以实质上相似的强度结合，并且，例如5C6-Fat的结合甚至更强，所以这与那些抗体相对于其他抗体对CD163的亲和力提高无关。
由于例如5C6-Fat同样与域1结合，并且如Biacore测量判决，其结合更强(图4)，但与细胞表面的结合弱于Mac2-158的观察结果(图5和6)，所以摄取提高也不仅是在于发生了与域1的结合。大体上，除了相当强结合的Mac2-48和Mac2-158，以及在含钙介质中不结合的GHI/61之外，所有mAB均以实际上类似的强度结合展示在细胞表面上的CD163(图5)，这与CD163结合发生在哪个SRCR域无关。这有力地证明了Mac2-158结合特异目标的表位，并且Mac2-48也与细胞强力结合，且由图8可见，Mac2-48与Mac2-158竞争结合。
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实施例2：CD163阳性亚类的树突细胞
材料和方法
材料和方法如实施例1中所述。
定量流式细胞术
使用同种型匹配的对照抗体(小鼠IgG1 PE，k同种型对照，MOPC-21，BDPharmingenTM，San Diego，CA，USA)或相关抗体(抗CD3FITC抗体，UCHT1，BD Biosciences，San Diego，CA，USA；抗CD11c FITC抗体，KB90，DAKO A/S，Glostrup，Denmark；抗CD14 FITC抗体，RMO52，Beckman and Coulter，Marseille，France；抗CD16FITC抗体，3G8，BD Biosciences，San Diego，CA，USA；抗CD19 FITC抗体，SJ25C1，BD Biosciences，SanDiego，CA，USA；抗CD20 FITC抗体，CAT 13.6E12，Diatec.com A/S，Oslo，Norway；抗CD56FITC抗体，NCAM16.2，BD Biosciences，San Diego，CA，USA；抗CD91 FITC抗体，A2MR-a2，BDBiosciences，San Diego，CA；抗HLA-DR FITC抗体，EDU-1，Diatec.com A/S，Oslo，Norway；抗CD163 PE抗体，MAC2-158，1QProducts，Groningen，The Netherlands；抗CD163 PE抗体，GHI/61，BD Biosciences，CA，USA；抗ILT3/CD85k PE-Cy5抗体，ZM3.8，Beckmanand Coulter，Marseille，France；抗HLA-DR PerCP抗体，L234，BD Biosciences，SanDiego，CA；抗CD4 APC抗体，EDU-2，Diatec.com A/S，Oslo，Norway；抗CD14 APC抗体，18D11，Diatec.com A/S，Oslo，Norway)，在室温下，对新鲜抽取的外周全血样品(约3x106个细胞)避光染色15分钟。使用4℃的冷氯化铵溶液裂解红细胞15分钟。随后，使用D-PBS(pH7.4)清洗染色细胞两次，并重悬在400μl FACSflow(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)。使用BD FACSCaliburTM流式细胞计数器(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)分析所有样品，并使用用于6.3版Macintosh软件的FlowJo(TreeStar，San Carlos，CA)补偿光谱重叠。获取至少100,000个事件以确保足够数量的细胞用于分析。使用非特异性mAb控制所有的染色。在正向散射[FSC]对侧向散射[SSC]的2参数相关散点图中，在单核细胞(MNC)簇周围设置门控(gate)。使用两个不同的4色染色方案，以及将树突细胞定义为CD14-ILT3+HLA-DR+或[CD3，CD14，CD16，CD19，CD20，CD56]-CD4+HLA-DR+谱系的细胞定义策略，重新绘制经门控的MNC。对于CD163密度的定量，按照厂商的推荐，使用Quantibrite PE珠(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)进行抗体结合/细胞(ABC)的流式细胞术评估。如下文详述，在细胞染色后，在获取样品前，使用一套4支预标定的荧光标记珠进行标准化。Quantibrite PE珠在与流式细胞测试相同的仪器设定下运行，并将使用Quantibrite PE珠获得的线性回归用于将细胞群的FL2线性荧光染色转化成每个细胞结合的(CD163)PE分子数。
结果
CD163阳性亚类的血树突细胞：清道夫巨噬细胞受体CD163和CD91在人树突细胞和单核细胞上共表达。
使用将树突细胞定义为CD14-CD163+的样品染色方案，本发明人鉴定出了表达CD163但不表达单核细胞标记CD14的细胞群。在正向散射[FSC]对CD163PE的图中，门控出表达CD163的细胞(图9A)。随后，在CD14 APC对CD163 PE的图中重新绘制经门控的细胞，鉴定出小比例(＜1％)的表达CD163的CD14细胞(图9B)。此新型细胞群还高度表达HLA-DR(图9C)，且反向门控分析显示，CD14-CD163+细胞作为定位于淋巴细胞和单核细胞之间相对独特的细胞群(图9D)。
将树突细胞定义为CD14-ILT3+HLA-DR高(图10A-C)或[CD3，CD14，CD16，CD19，CD20，CD56]-CD4+HLA-DR+谱系(未显示)的流式细胞分析显示，10.5％(95％CI：8.0-12.5)的外周血树突细胞表达CD163(图10C)。如图10C所示，表达CD163的外周血树突细胞可细分成两个群：高水平表达CD163的亚群(CD163高，MFI：34.6[95％CI：30.5-40.7])和染色较弱的亚群(CD163低，MFI：4.2[95％CI：3.7-5.1])。为了进行比较，基本上所有CD14+ILT3+HLA-DR+单核细胞(88.0％[95％CI：85.0-91.0％])的CD163染色均为阳性(未显示)，这与文献I一致。反向门控分析证明，Lin-CD4+HLA-DR+CD163+细胞作为属于淋巴细胞和单核细胞之间树突细胞预期定位的独特细胞群。同种型匹配的非特异性IgG1作为阴性染色对照(MFI：1.23[95％CI：1.14-1.46])(图10E)。
为了排除非特异性的交叉反应性，利用抗CD163的MAC-158克隆重复树突细胞CD163表达分析。根据文献I，与结合SRCR域7的GHI/61克隆(10.5％[95％CI：8.0-12.5％])(图11B)相比，结合SRCR域1的MAC2-158克隆识别了显著较高比例的外周血树突细胞(32.3％[95％CI：19.6-45.1％])(图11D)。与GHI/61(22.3[95％CI：19.2-25.4])(图11A)相比，对于MAC2-158抗体克隆，反映每个细胞的CD163受体量的MFI也显著较高(107.5[95％CI：74.7-140.3])(图11C)，表明MAC2-158能够鉴定出更多的每个细胞的CD163受体量。
为了评估两个新型CD163表达亚类的外周血细胞的可能功能，进行进一步的表型分型。表面抗原评估显示，表达低水平CD163的亚类还表达低水平的HLA-DR(图12A)和ILT3(图12B)，而表达高水平CD163的亚类高度表达HLA-DR(图12A)和ILT3(图12B)。两个亚类均表达CD11c，表明了其与髓系(DC1)的树突细胞的关系(图12C)。CD163低亚类为CD16+，而CD163高亚类为CD16-(图12D)。然而，两个亚类均为CD91+(图12E)，从而组成了近期描述的CD91+CD11c+树突细胞亚类的亚级分。
由于已经累积的证据显示树突细胞可能是HIV-1传染和致病的重要因子，本发明人计划研究HIV-1患者中的外周血树突细胞的CD163表达。一般而言，HIV-1患者中表达CD163的树突细胞比例(19.3％[95％CI：14.7-26.3％])显著高于健康患者(10.5％[95％CI：8.0-12.5])，p＜0.001(图13A)。
所研究的所有HIV-1感染患者均表达两个亚类的CD163+树突细胞(CD163低和CD163高)，而约半数的健康对照仅表达CD163低或CD163高亚类(图13B和图14A-C)。
有趣的是，与健康对照相比，估计HIV-1患者中CD163高亚类的每个细胞CD163受体平均数量显著升高。
讨论
自从发现CD163是新型的巨噬细胞限定型标记以来，已经在影响单核细胞/巨噬细胞系统的病理生理状况中对此受体进行了深入的研究。
CD163具有作为炎性病症中单核细胞/巨噬细胞活性的诊断标记以及作为治疗候选物的潜能。CD163表达受到促炎症和抗炎症刺激物的紧密调控，表明CD163的免疫调节功能，且CD163胞质剪接变体对促炎症刺激物产生不同的反应。研究还证明了在细胞和可溶性CD163病症，例如炎性疾病、恶性疾病和感染疾病中的显著变化，表明单核细胞/巨噬细胞系统的疾病与CD163密切相关。本发明人还显示了，肿瘤浸润性巨噬细胞高度表达CD163，肿瘤中表达CD163的巨噬细胞的密度与患者存活率差相关。此外，近期的研究显示，直接参与血管发生的TIE2+巨噬细胞表达高水平的CD163。还发现，CD163在M4/M5白血病的母细胞上和乳腺癌的肿瘤细胞上表达。
在生理条件下，CD163在免疫细胞和恶性细胞上的细胞分布仍不清楚。多个研究者报道的不同CD163表面表达和巨大的差异影响了CD163作为炎性病症中单核细胞/巨噬细胞活性的诊断标记以及作为治疗候选物的应用。
在该实施例和上文的实施例中，本发明人报道了基于可靠的多色流式细胞术的试验的研发，其恒定地鉴定出大部分(＞80％)的表达CD163的循环单核细胞。CD163表达已经成为近二十年来文献中争论的主题。使用不同的抗凝剂、抗体克隆和一般测试条件，所报道的单核细胞CD163表达水平在很少至99％之间变化(Venneri et al.，2007；Backe et al.，1991；Hogger et al.1998；Philippidis et al.2004；Sulahian et al.2000；Van denHeuvel et al.，1999；Fabriek et al.2005；Moniuszko et al.2006；Kim et al.2006；Davis et al.2005；Buechler et al.2000)。然而，本发明人证实了在使用针对不同SRCR域产生的多种单克隆抗体克隆时的SRCR域依赖性结合模式，其可以解释大量研究者提出的单核细胞CD163表达的巨大差异。
使用识别SRCR域1的MAC2-158抗体克隆，本发明人显示了明显高于R-20(SRCR域4)、GHI/61(SRCR域7)和RM3/1(SRCR域9)的表达CD163的循环单核细胞比例。此观察结果得到了平均荧光强度的进一步证实，其反映了每个细胞的CD163受体量。此现象可仅仅表明抗体结合亲和力之间的显著差异；然而，似乎更可能的是这种SRCR域依赖性结合模式可能部分是由于抗体结合的空间位阻造成的，所述抗体是针对定位接近于细胞膜的SRCR域而产生的，而MAC2-158识别可暴露的SRCR域1。
在近期的研究中，本发明人发现，使用两种不同的抗CD163克隆，使用EDTA抗凝的血样中的单核细胞CD163表达显著高于使用肝素抗凝的情况(Fabriek et al.2005)。在一定程度上，本发明人在EDTA和肝素稳定的血样中观察到类似模式的CD163表达。在使用GHI/61时，对CD163染色的CD14阳性单核细胞的比例差异最为显著。然而，在使用MAC2-158时，对CD163染色的CD14阳性单核细胞的比例与所用的抗凝剂无关。由于所研究的样品中可溶性CD163的水平没有受到影响，本发明人排除了使用不同抗凝剂的CD163表达差异是由CD163脱落造成的。由于肝素稳定的血样类似于生理的钙水平，而EDTA稳定的血样中除去了游离的钙，本发明人猜想，所观察到的现象可能是由于钙螯合剂EDTA的抗凝作用的内在机理造成的，而肝素的作用则与钙无关。在使用其他单核细胞/巨噬细胞标记，例如CD36、CD91和CD206时，未能展示相同的钙依赖性结合模式。然而，此前已经表明，针对钙结合蛋白而产生的一些抗体优先识别特异的钙诱导的蛋白构象状态(206)，且这些抗体的免疫反应性依赖于钙结合状态(Gao et al.，1997)。
一些研究已经显示，高密度的肿瘤浸润性巨噬细胞与乳腺癌、膀胱癌和浅表食管癌的不良预后相关；然而，在其他癌症，例如消化道恶性肿瘤中，其浸润似乎与良好的预后相关。这些研究中的大多数利用CD68作为巨噬细胞标记。遗憾地，CD68是在不同亚群(无论是抑制肿瘤或促进肿瘤的巨噬细胞群)和新鉴定的表达Tie2的巨噬细胞之间没有差别的通用标记。由于目前公认在肿瘤环境内存在多种巨噬细胞亚群，其中一些显示肿瘤抑制能力，而其他显示肿瘤促进能力，因此，诸如CD168的通用标记的有效性受到严重挑战。研究表明巨噬细胞浸润与良好预后之间的关系是有争议的；因此，常见的观点是巨噬细胞被吸引到肿瘤表面并受肿瘤细胞极化以有利于肿瘤生长和发展。使用用于具有肿瘤促进能力的巨噬细胞的不适合的标记可解释所观察到的高密度肿瘤浸润性巨噬细胞的差异结果。
使用石蜡包埋的组织样品，对于CD163表达的大量免疫组织化学测定已经认识到，所述受体是正常状况和肿瘤病症中的单核细胞/巨噬细胞谱系细胞的新标记(Shabo etal.，2008)。然而，在造血病症中评估CD163免疫反应性时，研究证明，在所检测的46例急性单核细胞性白血病(AML-M5A)中仅有1例为CD163阳性。此外，研究者未能表明急性髓单核细胞性白血病(AML-M4)中的任何CD163免疫反应性(Shabo et al.，2008)。然而，使用流式细胞术的后续研究显示约20％的M4型和M5型AML的白血病母细胞显示CD163的组成型表达(Lau et al.，2004)。近期的研究显示了49％具有单核细胞分化的AML病例中的CD163免疫反应性(18)。然而，由于利用了不同的方法和识别不同SRCR域的CD163抗体，因此这些研究几乎不可比较。
基于本发明人在流式细胞术中使用不同抗体克隆的SRCR域依赖性结合模式的观察结果，本发明人计划评估石蜡包埋组织样品中的免疫组织化学CD163表达。
最佳的免疫反应性依赖于表位的保持。修复溶液的组成、pH、加热类型和量均对表位的修复和保持程度具有显著的影响。压倒多数的证据证明不是所有表位都在表位修复过程期间等同地被暴露(unmasked)。更重要地，从临床的观点来看，这表明在正常状况和肿瘤病症中的单核细胞/巨噬细胞谱系两种细胞上的CD163表达都被低估了，特别是在进行免疫组织化学时。
CD163介导的巨噬细胞对Hb-Hp复合物的内化作用可能是研发在单核细胞/巨噬细胞谱系的表达CD163的赘生性细胞中的靶特异性药物递送的机制。涉及细胞摄取的大多数研究在稳定CD163转染的FIp-In CHO细胞(Bowen et al.1997)上进行，或使用荧光偶联的Hb-Hp复合物(Lau et al.，2004)。然而，CD163转染的CHO细胞不类似于单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞，而且，使用单克隆抗体而不使用Hb-Hp复合物，可使未来的药物标记更为可行。由于CD163仅结合复合物中的Hb和Hp，这意味着呈递了新的表位，因此，似乎合理的是，只有针对结合Hb-Hp复合物(Chakraborty et al.2004)的SRCR域3而产生的抗体才能促进CD163介导的胞吞。因此，本发明人最初计划研究和评估CD163用于未来靶向治疗的应用性，评估不同的单克隆CD163抗体克隆在CD163转染的FIp-In中国仓鼠卵巢细胞中的结合和细胞摄取。
有趣的是，共聚焦激光扫描显微镜分析显示，使用单克隆CD163抗体克隆可实现细胞摄取，而与其SRCR域识别无关。根据流式细胞分析显示，使用MAC2-158，染色细胞的比例，荧光强度和细胞摄取明显更好。由于单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞代表了具有功能性和免疫活性的表达CD163的细胞，本发明人随后使用源自单核细胞的巨噬细胞重复了这些CD163结合和细胞摄取试验。在源自单核细胞的巨噬细胞中观察到了类似模式的表面染色和细胞摄取，表明MAC2-158很可能是在用于靶向特异性药物递送时给出最强反应的CD163克隆。
CD163被认为是专门表达在单核细胞和组织巨噬细胞表面上(RadzunHJ.Blood.1987；Backé E.J Clin Pathol.1991；Pulford K.Immunology.1992)。CD163和CD91在单核细胞分化成抗炎性巨噬细胞表型期间高度表达。现已发现CD91在源自单核细胞的树突细胞中表达，而该受体在源自单核细胞的树突细胞中发挥T细胞刺激的重要功能(Hart，JP.J.Immunol.2004)。此外，已有证据表明，作为单核CD163表达，CD163可由未知的组织成分表达，且sCD163水平与单核细胞绝对量不相关(Davis.Cytometry Part BClinical cytometry.2005；Zarev PV.Lab Hematol.2004)。CD91和CD163二者在铁代谢(Hvidberg，V.Blood.2005；Kristiansen，M.Nature.2001)和免疫调节中的双重作用促使本发明人设想除髓单核细胞源的其他细胞之外，CD163与CD91类似，也在树突细胞中表达。
使用将树突细胞定义为CD14-CD163+的简单染色方案，本发明人鉴定出显示树突细胞表型特征的CD163表达细胞群。此发现与此前的报道相反(Ritter.Pathobiology.1999)，并且因为已知树突细胞的异质性，本发明人利用了将树突细胞定义为CD14-ILT3+HLA-DR高或[CD3，CD14，CD19，CD20，CD56]-CD4+HLA-DR+谱系的两种不同染色方案以证实对表达CD163的树突细胞的观察结果。
流式细胞分析显示了两种不同亚类的表达CD163的树突细胞，即CD163低和CD163高，其共同构成了约10.5％(95％CI：8.0-12.5)的外周血树突细胞。然而，根据上一个实施例，本发明人证明了使用MAC2-158克隆代替GHI/61，能够鉴定出显著较高比例的表达CD163的树突细胞(32.3％[95％CI：19.6-45.1％])，表明达到几乎半数的循环外周血树突细胞可表达血红蛋白清道夫受体。深入的表型分析将两个亚类的表达CD163的树突细胞表征为CD91+CD11c+，因此，代表了近期描述的CD91+CD11c+髓系(DC1)树突细胞亚群(Hart，JP.J.Immunol.2004)。由于CD91和CDl63在单核细胞上共表达，其在外周血树突细胞的亚级分上的共表达强调了这两种受体之间的关系。有趣的是，进一步的表型分析显示，表达高水平CD163的亚类还高度表达HLA-DR和ILT3，表明这种亚类具有炎性和致耐受性能力。相反，表达低水平CD163的亚类为CD16+且表达低水平的HLA-DR和ILT3。已报道此亚类构成大部分的骨髓DC(MacDonald KP.Blood.2002)，微阵列分析已经提出toll样受体8(TLR8)在这些细胞中最为显著(Lindstedt M.J Immunol.2005)，表明在ssRNA反应中的主要作用。CD16(FcγRIII)最先被鉴定为NK细胞限制性受体；然而，其还由单核细胞/巨噬细胞、粒细胞和树突细胞表达(Schakel K.Eur J Immunol.1998)。已知表达CD16的树突细胞显示出比CD16阴性树突细胞更大的吞噬和氧化活性，包括产生大量的细胞因子(Almeida J.ClinImmunol.2001)，并且具有激活原态T细胞的显著能力(Schakel K.Eur JImmunol.1998)。
髓系树突细胞是强效的抗原呈递细胞，并且在宿主防御中发挥关键作用。已知这些具有部分活化表型的细胞在无症状的慢性HIV1感染期间累积在淋巴组织中。树突细胞可能对HIV-1传染和致病的重要因子。这促使本发明人研究HIV-1患者中的外周血树突细胞CD163表达。
意外的是，HIV-1患者中表达CD163的树突细胞比例(19.3％[95％CI：14.7-26.3％])显著高于健康个体(10.5％[95％CI：8.0-12.5])，p＜0.001。这些发现与显示HIV-1感染患者中CD163+CD16+单核细胞的频率高于血清反应阴性的个体的近期研究相符。因此，CD163+CD16+单核细胞可以成为HIV-1感染的有效生物标记以及用于治疗干预的可能靶标。
此外，另一项近期研究证明，已知在银屑病发展中发挥重要作用，并且在慢性发炎组织中积累的炎性髓系真皮树突细胞可能源自表达CD163的外周血树突细胞前体(CD11c+HLA-DR+CD16+)。该作者猜想，这些“促炎症树突细胞”可以迁移到皮肤中以响应趋化因子梯度或其他刺激物。因此，提示这些诱导性炎性树突细胞可代表银屑病的新型治疗靶标(Zaba.J Invest Dermatol.2009)。
通过特异性表面受体直接靶向树突细胞是增强疫苗免疫原性的有前景的方法(Gamvrellis.Immunol.Cell Biol.2004)。CD163在树突细胞和其他抗原呈递细胞上的受限表达强化了CD163作为诊断工具以及用于靶向特异性药物递送的推定候选物的应用性。实体瘤不仅包含恶性细胞，还包含大量炎性浸润细胞，包括巨噬细胞，其驻留在原发肿瘤和次发肿瘤二者的微环境中(Albini A.Nat Rev Cancer.2007)。
综上，本实施例和上文的实施例已经鉴定出表达血红蛋白清道夫受体CD163的未知组织成分，其由两种不同亚类的表达CD163的树突细胞——CD163低和CD163高组成，合计构成高达50％的外周血树突细胞。所鉴定表达CD163的树突细胞亚类之一(ILT3高CD163高)潜在地具有炎性和致耐受性特征。本发明人显示在HIV-1感染患者中的表达CD163的树突细胞比血清反应阴性个体显著提高，这进一步支持了所提出的CD163的免疫调控作用。此外，本发明人还证明了，使用识别SRCR域1的MAC2-158克隆，始终能够鉴别出大比例(＞80％)的循环性表达CD163的单核细胞。此外，本发明人还显示了CD163转染的CHO细胞和源自单核细胞的巨噬细胞二者中的CD163-抗体介导的细胞摄取的能力，其在使用MAC2-158时最为显著。
本发明的数据提出了CD163作为涉及单核细胞/巨噬细胞系统的病理生理状况的诊断工具的临床应用性，其着重于单核细胞、巨噬细胞、树突细胞上的限定性CD163表达。通过提出CD163作为推定候选物用于在血液学恶性肿瘤和实体瘤以及涉及单核细胞/巨噬细胞系统的其他疾病中的靶向特异性药物递送的应用性，肿瘤促进型巨噬细胞和恶性细胞上的CD163表达使得血红蛋白清道夫受体CD163成为恶性疾病中的双刃剑。本发明的数据还意味着使用CD163作为靶的预期副作用谱与目前可用的相当大的治疗作用相比潜在的临床意义不大。
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实施例3：CD163抗体的人源化
材料和方法
获得杂交瘤：
杂交瘤克隆(Mac2-158和Mac2-48)得自于Trillium Diagnostics LCC，Maine，USA(http：//www.trilliumdx.com/)。将细胞解冻并使其扩增数轮。
引物：
用于杂交瘤克隆Mac2-158和Mac2-48的重链可变区和轻链可变区的PCR扩增和测序的引物如(1)中所述，但使5′(GAGG-定向)和3′(平端)序列适于TOPO定向克隆。所有引物均得自于TAG Copenhagen(Copenhagen，Denmark)。引物目录：
测序：
在Eurofins MWG operon(Ebersberg，Germany)进行作为数值读数管服务(ValueRead Tube Service)的测序。通过测序证实了所有的质粒制备物和突变。
提取总RNA：
根据厂商的说明，通过QIAamp血RNA试剂盒(QIAGEN Corporation，Copenhagen，Denmark)，使用每种杂交瘤细胞系各2x106个细胞提取总RNA。简要而言，将细胞重悬在600μl缓冲剂RLT(QIAGEN)中，通过使其通过装有21-G(0.8mm)针头的注射器匀浆至少5次。添加600μl 70％乙醇(EtOH)并通过抽打混合。将悬液施于QIAamp离心柱，并通过数次离心上样。使用750μl RW1(Qiagen)和750μl RPE(QIAGEN)清洗柱。使用2x50μl去RNA酶水(QIAGEN)洗脱RNA。
用于cDNA合成的缓冲剂的制备
使用超纯水或分子生物学级化学品和焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水制备用于cDNA合成的所有缓冲剂。通过如下操作来制备DEPC处理的水：添加DEPC(Sigma-Aldrich，Denmark)至0.1％的终浓度，并将溶液搅拌过夜，随后高压灭菌。通过向DEPC处理的水添加所述化学品并随后高压灭菌来制备Tris和EDTA储液。通过将LiCl溶于MQ水中和添加DEPC至0.1％并搅拌过夜来制备包含LiCl的缓冲剂。随后，对溶液高压灭菌，添加Tris和EDTA溶液至适合的浓度，调节pH，并对溶液再次高压灭菌。
cDNA合成：
通过Omniscript反转录酶(QIAGEN，Copenhagen，Denmark)合成cDNA。所有缓冲剂都经过DEPC处理，并与分子生物学级化学品混合。简言之，通过在65℃加热2分钟破坏RNA中的二级结构。将100μl Dynalbeads寡聚(dT)25(Invitrogen，Taastrup，Denmark)在1ml结合缓冲剂(20mM Tris，1M LiCl，2mM EDTA)中清洗二次，并重悬在100μl结合缓冲剂中。将加热的纯化RNA样品添加到微珠中，并在室温下旋转温育3-5分钟以退火。随后，将微珠在1ml缓冲剂B(10mM Tris，0.15M LiCl，1mM EDTA)中清洗两次，并在1ml冰预冷的DEPC水中清洗两次。通过在37℃、温和振荡下温育2小时，在总体积80μl的4单位ORT、8μl 10x缓冲剂(Qiagen提供)、0.5mM dNTP、40单位RNA酶抑制剂(RiboLock，Fermentas，St.Leon-Rot，Germany)中，使用Omniscript反转录酶(Omniscript反转录试剂盒，QIAGEN，Copenhagen，Denmark)反转录所捕获的mRNA。最后，将合成的cDNA在1ml TE缓冲剂(20mM Tris，1mM EDTA)中清洗两次。
轻链和重链可变区的PCR扩增：
根据Zhou及其合作者(1)的简并引物序列设计用于扩增可变区基因的引物。制备100μM总引物浓度的引物混合物。VH正向引物混合物为每种引物各25μM，VH反向引物混合物为每种引物各10μM。VL正向引物混合物为每种引物浓度各20μM，VL反向引物混合物为每种引物浓度各10μM。
制备100μl PCR反应物以扩增各VH克隆和VL克隆。所述反应物包含以下成分：含有MgSO4的10μl Pfu缓冲剂；2μl 10mM dNTP混合物；10μl正向引物混合物(VH或VL)；10μl反向引物混合物(VH或VL)；67μl高压灭菌水；1μl Pfu(2.5单位)；和一半的来自克隆的含cDNA微珠。
循环反应如下：在95℃3分钟的初始变性；95℃50秒，55℃50秒和72℃3分钟的30个循环。在使用EtBr染色的1％琼脂糖凝胶上检测扩增的DNA，并通过凝胶提取试剂盒(Machery-Nagel，AH-Diagnostics，Aarhus，Denmark)纯化。
测序：
使用正向引物混合物(VH或VL)或反向引物混合物(VH或VL)对各PCR产物(VH或VL)(作为与引物预混的数值读数管)测序。二者均以各引物1μM为终浓度。使用ClustalW2(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)(2)比对所接收的序列。
使用引物CMV和TK聚A验证pcDNA3.3中VH插入物的序列。
使用引物CMV和EMCV IRES验证pOptiVec中VL插入物的序列。
二级PCR引物设计：
为了评估是否由于引物设计而导致任何必需氨基酸被突变，设计了二级PCR引物对。前导区引物(VK6leader和VH leader2)基于见于(3)中的序列，且γ和κ引物(VHgconstant和VKconstant)按照文献(4)改进。通过标准PCR，使用引物对(VK6leader和VKconstant)和(VH leader2和VHgconstant)，扩增PCR产物。纯化PCR产物，并使用用于产生所述PCR产物的引物进行正向和反向测序。
序列分析和供体框架设计：
以下服务器和程序用于可变区的分析：http：//www.bioinf.org.uk/abs/，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/，http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，http：//swissmodel.expasy.org//，和Swiss PDB Viewer。
所进行的人源化是将CDR植入到人框架上。整体方案按照(5)所述。使用VH或VL的“最匹配完整序列”作为受体框架。将完整的高变环植入到所选的受体框架上。回复突变处于VH-VL界面，保留该回复突变以确保可变域(如Morea et al.中的定义，表2)的正确朝向，并且还保留了对于超变环的正则结构(canonical structure)具有重要性的关键位点的小鼠残基(如Morea et al.，表1)。
用于重链的受体框架是dbj|BAG64279.1|和种系IGHV4-b*01。用于轻链的受体框架是emb|CAD43020.1|和种系IGKV1D-39*01。根据NCBI BLAST(sp|P01861.1|IGHG4_HUMAN和dbj|BAC01725.1|)设计用于人源化γ4变体和人源化κ变体的完整序列，并在GenScript(Piscataway，NJ，USA)合成。
嵌合重链的产生
通过重叠剪接延伸(SOE)PCR产生嵌合重链(6)。进行三次标准PCR反应以产生用于SOE-PCR的模板：(1)对来自GenScript的合成γ4序列的PCR反应中的引物Hfor1和leaderbackH；(2)对来自GenScript的合成γ4序列的PCR反应中的引物CHfor和Hback1；和(3)对包含Mac2-158cDNA的微珠的PCR反应中的引物VHfor和VHback。通过凝胶提取试剂盒(Macherey-Nagel，AH-Diagnostic，Aarhus，Denmark)纯化PCR产物。利用引物Hfor1和Hback1进行作为标准PCR反应的SOE-PCR。向反应中添加模板PCR产物(1-3)各2μl。通过凝胶提取纯化约1500bp的条带。根据厂商的说明，将纯化的SOE-PCR产物插入到来自OptiCHO蛋白表达试剂盒(Invitrogen，Taastrup，Denmark)的pcDNA3.3Topo载体中。通过引物CMV和TK聚A的测序确认了所述序列。
表达质粒的构建：
将来自GenScript的合成序列插入到来自OptiCHO蛋白表达试剂盒(Invitrogen，Taastrup Denmark)的表达载体中。使用引物Lfor1和Lback1，通过标准PCR扩增κ链，并使用引物Hfor1和Hback1扩增γ4链。根据厂商的说明，将轻链和重链PCR产物插入到来自OptiCHO蛋白表达试剂盒的pOptiVec(轻链)和pcDNA3.3(重链)Topo载体中。
定点诱变：
通过Quickchange定点诱变引入三个突变。在轻链中，将53SLQ55回复突变为NRY。使用引物SLQ-NRY for和SLQ-NRY back，按照Stratagene的方案(http：// www.stratagene.com/manuals/200518.pdf)，进行作为标准诱变的所述诱变。模板是pOptiVec-κ8质粒。
SLIM诱变：
对剩余的突变体，使用不依赖于连接的定点诱变(SLIM)方法(7)。引物列出在引物表中。模板为：用于K-N引物的是pcDNA3.3-γn1重链，用于SY-IN引物的是pcDNA3.3-KN1质粒，用于其他重链突变的模板是pcDNA3.3-KN1IN5。用于轻链中其他人源化的模板是质粒pOptiVec-NRY。这通过使用引物组P46L(第一轮)和G89Q、T93S(第二轮)对pOptiVec-NRY的连续两轮SLIM完成。
抗体的表达：
将IgG4形式的人源化抗体和嵌合小鼠/人抗体克隆到由Invitrogen的OptiCHO蛋白表达试剂盒提供的载体(pcDNA3.3和pOptiVec)中。将表达质粒热激至Top10细胞中，并涂布到包含氨苄青霉素(Amp)的LB平板上。挑取菌落以过夜培养，并使用带有终止剂(finalizer)的Nucleobond质粒试剂盒(Macherey-Nagel，AH-Diagnostic，Aarhus，Denmark)从培养物制备质粒。通过测序确认了所有质粒的序列。
抗体的各种突变体和不同组合在CHO-S细胞中的瞬时表达如下所述：
将20μg包含重链的pcDNA3.3与20μg包含轻链的pOptiVec混合。将DNA在OptiCHOPro SFM(8mM L-谷氨酰胺)中稀释至0.6ml的总体积。将DNA与包含40μl FreeStyleMAX转染剂(Invitrogen，Taastrup，Denmark)的0.6ml OptiCHOPro SFM轻柔混合。在室温下温育10分钟后，添加DNA-FreeStyle MAX混合物至25ml中1x 106个细胞/ml。三天后，通过离心收集上清，并通过ELISA分析。
ELISA抗体反应性比较：
在避光、4℃，使用以下(50μl/孔)包被Nunc Maxisorp平板过夜：
4μg/ml山羊抗人κ链抗体(AbD Serotec，Oxford，UK)和约4μg/ml人CD163(按文献8中所述纯化)。缓冲剂为碳酸盐缓冲剂，pH 9.0。各测试一式两份进行。
ELISA步骤如下：
1)将ELISA在PBS中清洗3次；
2)使用包含3％BSA的PBS将平板封闭1小时；
3)任选地，重复步骤1；
4)封闭后，添加一级抗体(100μl/孔)。
样品
向孔中添加来自转染细胞的未稀释上清(100μl/孔)。
标准品
稀释在包含1％BSA的PBS中的100ng/ml人IgG/κ(Sigma)抗体；
稀释在包含1％BSA的PBS中的100ng/ml Mac2-158；
对所有样品和标准品进行2倍系列稀释。在包含1％BSA的PBS中稀释。
将样品在平板上温育1小时。
5)重复步骤1；
6)添加二级抗体(100μl/孔)。
对于抗κ/抗γELISA：
100μl/孔的山羊抗人IgGγ链特异性HRP，1∶6000稀释在包含1％BSA的PBS中。
对于CD163 ELISA：
100μl/孔的山羊抗人IgG(H&L)HRP(1∶6000稀释在包含1％BSA的PBS中)。
对于Mac2-158，向孔中添加山羊抗小鼠HRP(1∶2000稀释在包含1％BSA的PBS中)。
7)重复步骤1；
8)通过向每个孔添加75μl TMB底物使ELISA显色。温育进行3分钟；
9)通过向孔中添加30μl 2N H2SO4终止反应；
10)在ELISA读数仪中于450nm读取平板。
测量没有包被的孔和没有一级抗体的孔的背景读数。
结果
可变区基因的PCR扩增：
1％琼脂糖凝胶分析显示，mRNA纯化、cDNA产生和用于扩增可变区的PCR有效(参见图15)。
PCR产物的序列：
对来自所产生的cDNA(Mac2-48和Mac2-158)的PCR的纯化PCR产物(VH和VL)的测序在Eurofins MWG Operon(Ebersberg，Germany)进行。对序列进行比对。
VL48
TDIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSHDVSWFQQKPGQSPKLLIYYTSNRYTGVPDRFTGSGYGT
VL158
-DIVMTQSPKSLLISIGDRVTITCKASQSVSSDVAWFQQKPGQSPKPLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGT
VL48 DFTFTISTVQAEDLAIYFCQQDYSSPRTFGGGTKLEIKRA
VL158 DFTFTISSVQAEDLAVYFCGQDYTSPRTFGGGTKLEIKRA
VH48
DVKLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGFISYSGITSYNPSLKSRISITRD
VH158
DVKLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITYSGITNYNPSLKSQISITRD
VH48
TSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCVSGTYYFDYWGQGTTLTVSS
VH158
TSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCVSGTYYFDYWGQGTTLTVSS
二级PCR产物确认了VH和VL的全部序列。少数差别见于：
VL158中第2位的V可对轻链的功能具有重要意义。此外，还发现κ恒定区和γ恒定区二者的连接子均为正常IgG1连接子。
人源化抗体的设计：
被选为用于CDR植入受体的骨架：用于重链的是dbj|BAG64279.1和种系IGHV4-b*01，用于轻链的是emb|CAD43020.1和种系IGKV1D-39*01。下文以DNA和蛋白质序列显示了作为带有前导肽的全长κ链的轻链和作为带有前导肽的全长γ4的重链：
轻链
DNA序列
Atggacatgagagtgcctgctcagctgctgggactgctgctgctgtggctgcctggagctaggtgtgacatcgtgatgacacagtctcccagcagcctgagcgcctctgtgggcgacagggtgaccatcacctgcagggctagccagagcgtgagcagcgacgtggcctggttccagcagaagcccggcaagagccccaagcccctgatctactatgccagcagcctgcagtctggagtgcccagcaggttcagcggcagcggcagcggaacagacttcaccctgaccatcagcagcctgcaggccgaggacttcgccgtgtacttctgcggccaggactacaccagccctaggaccttcggtggcggaaccaagctggagatcaagaggaccgtggccgcccccagcgtgttcatcttccctccaagcgacgagcagctgaagagcggcaccgccagcgtggtgtgcctgctgaacaacttctaccccagggaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaacagccaggagagcgtgaccgagcaggacagcaaggacagcacctacagcctgagcagcaccctgaccctgagcaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaggtgacccaccagggcctgagcagccccgtgaccaagagcttcaacaggggcgagtgc
[SEQ ID NO：52]
蛋白质序列
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCDIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSDVAWFQQKPGKSPKPLIYYASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYFCGQDYTSPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[SEQ ID NO：53]
重链
DNA序列
atgaagcacctgtggttcttcctgctgctggtggctgcccccaggtgggtgctgtctcaggtgcagctgcaggagtctggaccaggactggtgaagccatctgagaccctgagcctgacctgcaccgtgagcggctacagcatcaccagcgactacgcctggaactggatcaggcagttccccggcaagaagctggagtggatgggcagcatctactacagcggcagcacctactacaaccccagcctgaagagcagggtgaccatcagcgtggacaccagcaagaaccagttcagcctgaagctgagcagcgtgaccgccgccgacaccgccacctactactgcgtgagcggcacctactacttcgactactggggccagggcaccaccctgaccgtgagcagcgccagcaccaagggaccaagcgtgttcccactggctccatgcagcaggagcaccagcgagagcacagccgccctgggatgcctggtgaaggactacttccctgagcctgtgaccgtgagctggaattctggcgccctgaccagcggagtgcacaccttcccagccgtgctgcagagctctggactgtacagcctgagcagcgtggtgaccgtgccttcttccagcctgggcaccaagacctacacctgcaacgtggaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagggtggagtctaagtatggacctccatgcccaagctgtcctgctcctgagttcctgggcggcccaagcgtgttcctgttccctccaaagccaaaggacaccctgatgatcagcaggacccctgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccaggaggaccccgaggtgcagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagcccagggaggagcagttcaacagcacctacagggtggtgagcgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtgagcaacaagggcctgcccagcagcatcgagaagaccatcagcaaggccaagggccagcccagggagccccaggtgtacaccctgcctccaagccaggaggagatgaccaagaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccacccctccagtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaggctgaccgtggacaagagcaggtggcaggagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgagcctgggcaag
[SEQ ID NO：54]
蛋白质序列
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAWNWIRQFPGKKLEWMGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCVSGTYYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
[SEQ ID NO：55]
克隆和诱变：
对得自于GenScript的序列的克隆产生了具有正确序列的轻链κ8(K8)和重链γn1。
重链变体：通过SLIM反应产生构建体，其中以γn1为第一反应的模板并使用产生K43N、S50Y和Y52T突变的引物。这产生了pcDNA3.3质粒KN1和KN2。将质粒KN1用作S56I和Y58N突变的模板。这产生了作为用于至少两个单点突变V71R(质粒VR1)和Q1D(QD2)的模板的KN1IN5。随后的测序显示，KN1在第19位中具有错误突变(N)，从而使V71R突变成为了V71E突变。克隆KN2具有正确的序列。
轻链变体：通过Quick Change诱变生成的构建体产生了具有正确序列的轻链质粒pOptiVec-NRY。两个连续SLIM诱变反应(P46L和G89Q、T93S)后的质粒分析显示，在质粒d3中仅存在两个突变(P46L和T93S)。
mAb ELISA反应性：
图16中显示了在ELISA中测试的不同人源化重链和轻链变体的序列。检测了三种不同的轻链K8、NRY和d3和五种不同的重链嵌合物：Cγ(6)、KN2、KN1IN5、QD2和VR1。
在均与嵌合重链Cγ(6)配对的两个轻链变体(K8和NRY)之间进行第一ELISA比较。ELISA的结果显示在图17中。Cγ(6)/K8显示了最高的表达水平，而Cγ(6)/NRY的表达水平最低。两种变体显示的对CD163的反应性几乎相同。因此，在反应性比较中包含表达水平时，轻链NRY比K8轻链更好。
图18显示了均与轻链NRY配对的带有额外回复突变的人源化重链变体的比较。ELISA显示所有组合都或多或少地显示了对抗原CD163类似的反应性。反应性也与Mac2-158对CD163的反应性相当。
在轻链NRY中引入数个正向突变以产生更加人源化形式的轻链(d3)。
用于KN2/NRY制备和小规模表达的稳定CHO-DG44细胞系的开发
使用OptiCHO抗体表达试剂盒(Invitrogen，Taastrup，Denmark)进行克隆并表达命名为KN2/NRY的人源化IgG4抗体。根据厂商的说明，将pcDNA3.3γKN2和pOptiVEC κ NRY质粒(实施例3)线性化，并转入二氢叶酸还原酶(DHFR)阴性的CHO-DG44细胞(cGMPbanked)。转染2天后，在补充了8mM L-谷氨酰胺的CD OptiCHO培养基中，选择稳定转染了OptiVEC κ NRY质粒的CHO DG44细胞。每2-3天，将所述细胞在1100rpm离心10分钟，通过抽吸除去培养基，并添加完全CD OptiCHO培养基至25ml的终体积。选择3周后，细胞存活率为100％，并使细胞在添加500ug/ml遗传霉素(G418)的完全CD OptiCHO培养基中进一步增殖以选择稳定转染了pOptiVEC κ NRY和pcDNA3.3γKN2质粒的CHO-DG44细胞。按照上文所述，对细胞进行为期2周的选择。当细胞存活率达到100％时，通过有限稀释在96孔培养板(10个细胞/孔)中克隆选择小细胞群。在蛋白特异性ELISA中分析所得小细胞群的KN2/NRY表达，并在通过氨甲喋呤(MTX)进行基因扩增前增殖高产克隆。在通过有限稀释克隆稳定转染且经MTX扩增的细胞前，按照厂商的说明，进行数轮的MTX选择(50-2000mM MTX)。最后，通过ELISA分析通过克隆选择的细胞，并增殖高产的克隆以用于KN2/NRY的小规模制备。将小规模制备物以0.5x106个细胞/ml接种到三层组织培养瓶(Nalge-Nunc)内150-200ml含500ug/ml遗传霉素(G418)的完全CD OptiCHO培养基中，培养4天，通过离心和过滤分离培养基上清。
KN2/NRY的纯化：
将来自表达KN2/NRY的CHO细胞的上清添加Tris-HCl(pH 8.0)缓冲剂至50mM的终浓度，通过0.22μm滤器过滤，并上样到HiTrap MabSelct SuRe柱(Ge Healtcare，Denmark)。上样后，使用10倍体积的PBS(pH 7.4)洗柱，并使用0.1M柠檬酸钠缓冲剂(pH3.2)将蛋白洗脱至分馏管中，所述分馏管中填充了1/10终分馏体积的1M Tris-HCl(pH8.0)。使用Sephadex G-25(Ge Healtcare，Denmark)将蛋白缓冲凝胶过滤到终缓冲剂中，备用。。
KN2/NRY与CD163结合的Biacore亲和力测试
已测试了KN2/NRY与固定在Biacore芯片上的CD163的结合，并和Mac2-158与相同CD163芯片的结合进行比较。
在Biacore 2000仪器(Biacore，Uppsala，Sweden)上进行mAb与CD163结合的SPR分析。使用于水中的0.2M N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和0.05M N-羟基琥珀酰亚胺的1∶1混合物活化Biacore传感芯片(CM5型)。将纯化的重组CD163在10mM乙酸钠(pH4.0)中固定，并使用1M乙醇胺(pH8.5)封闭剩余的结合位点。由固定的重组CD163蛋白产生的SPR信号对应于40-70fmol蛋白/mm2。使用5-100nM范围的mAb浓度产生传感图。使用1.6M甘氨酸-HCl(pH 3)再生流动细胞。用于试验的运行缓冲剂为CaHBS 10mM Hepes、150mMNaCl、3.0mM CaCl2、1.0mM EGTA和0.005％Tween 20(pH7.4)或10mM Hepes、150mM NaCl、3.0mM EDTA和0.005％Tween 20(pH7.4)，将KN2/NRY和Mac-158样品以5μg/ml的浓度溶解于与运行缓冲剂相同的缓冲剂中。使用3.1版生物分子相互作用分析(BiomolecularInteraction Analysis)评估程序分析所有结合数据。
结果显示在图19中，并且表明两种单克隆抗体对CD163的亲和力实际上相同。尽管由于高亲和力导致难以进行精确的匹配，但二者均显示出亚nM级的解离常数。
实施例3的参考文献
1.Zhou，H.，Fisher，R.J.&Papas，T.S.(1994).Optimization of primersequences for mouse scFv repertoire display library construction.NucleicAcids Res 22，888-9.
2.Larkin M.A.et al.(2007).Clustal W and Clustal X version2.0.Bioinformatics，23(21)：2947-8.
3.Lefranc，M.-P.et al.(2005)，Nucleic Acids Res，33，D593-D597.
4.Rohatgi，S.，et al.(2008).J Immunol Meth，339，205-219.
5.Morea，V.，et al.(2000).Antibody modeling：implications forengineering and design.Methods 20(3)：267-79.
6.Horton et al.(1989).Engineering hybrid genes without the use ofrestriction enzymes：gene splicing by overlap extension.Gene 77：61-8.
7.Chiu et al.(2004).Site-directed，Ligase-Independent Mutagenesis(SLIM)：a single-tube methodology approaching 100％efficiency in 4h.NucleicAcid Res，32(21)：e174.
8.Kristiansen M.et al.(2001).Identification of the haemoglobinscavenger receptor.Nature11：409(6817)：198-201.
实施例4：单链表达、重折叠和功能
材料和方法
获得scFv序列：
scFv(VH-15残基连接子-VL)的序列在GenScript合成，并在GenScript通过克隆位点NcoI/XhoI克隆到pET20b。选择(1)中描述的15残基连接子作为连接子。蛋白质和DNA序列如下所示。
蛋白质
MDQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCVSGTYYFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSDVAWFQQKPGKSPKPLIYYASNRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYFCGQDYTSPRTFGGGTKLEIKREQKLISEEDL[SEQ ID NO：56]
DNA
CCATGGACCAGGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGCCCGGGCCTGGTGAAACCGAGCGAAACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTATAGCATTACCAGCGATTATGCGTGGAACTGGATTCGTCAGTTTCCGGGCAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATTACTTATAGCGGCAGCACCTATTATAACCCGAGCCTGAAAAGCCGTGTGACCATTAGCGTGGATACCAGCAAAAACCAGTTTAGCCTGAAACTGAGCAGCGTGACCGCGGCGGATACCGCGACCTATTATTGCGTGAGCGGCACCTATTATTTTGATTATTGGGGCCAGGGTACCACCCTGACCGTGTCTAGCGGTGGGGGCGGAAGCGGGGGCGGTGGAAGCGGGGGCGGTGGATCTGATATTGTGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGTGTGACCATTACCTGCCGTGCGAGCCAGAGCGTGAGCAGCGATGTGGCGTGGTTTCAGCAGAAACCGGGCAAAAGCCCGAAACCGCTGATTTATTATGCGAGCAACCGGTATAGCGGTGTGCCGAGCCGTTTTAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGGCGGAAGATTTTGCGGTGTATTTTTGCGGCCAGGATTATACCAGCCCGCGTACCTTTGGTGGCGGAACCAAACTGGAAATTAAACGTGAACAGAAACTGATTAGCGAAGAAGATCTGCTCGAG
[SEQ ID NO：57]
scFv表达和纯化：
通过热激将pET20b-scFv质粒转化至BL21DE3Star细胞(Invitrogen，Taastrup，Denmark)中，并将转化的细胞平铺在包含LB培养基和0.1mg/ml氨苄青霉素的琼脂平板上。通过将一个菌落从平板转移到培养基，在补充了0.1mg/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖的LB培养基中制备起始培养物。将起始培养物在30℃振荡温育过夜。
如下在37℃振荡下进行scFv在包涵体中的表达：按1∶100将起始培养物接种于500ml LB培养基(补充了氨苄青霉素和1％葡萄糖)。在约0.6的OD600，使用2mM IPTG诱导培养物，并使表达持续4小时。随后，通过离心收集细菌，溶于PBS，超声处理并再次离心。抽去上清，将沉淀物在PBS中清洗并再次离心。
将沉淀物溶于20ml 20mM Tris(pH 8)和7M尿素溶液中，并旋降细菌残渣。在4℃，使用1升20mM Tris和3M尿素溶液对20ml上清透析过夜。将经透析的样品离心。在1mlHisTrapTM HP(GE Healthcare，Denmark)上，从上清纯化包含His标签的scFv，并使用20mM Tris、3M尿素和50mM EDTA溶液洗脱。将洗脱液收集在0.4ml的级分(fraction)中。
scFv重折叠：
如下所述，使经HisTrap纯化的蛋白重折叠：使用100ml缓冲剂B(20mMTris(pH 8)，3M尿素)对透析袋内3ml于20mM Tris(pH 8)、3M尿素和50mMEDTA中的蛋白进行透析。使用蠕动泵(0.2ml/分钟)将900ml缓冲剂C(20mM Tris，pH 8)加载到缓冲剂B中。透析进行约90小时。
scFv ELISA：
在4℃，使用50μl/孔的2μg/ml CD163(如(2)中所述纯化)包被Nunc MaxisorpELISA平板(NUNC，Roskilde，Denmark)过夜。将包被的平板在PBS中清洗3次，并使用含3％BSA的PBS封闭1小时。通过100μl/孔添加1∶10稀释在含1％BSA的PBS中的各样品，检测来自scFv纯化的级分。将重折叠的蛋白样品直接添加到孔中(100μl/孔)，使用于含1％BSA的PBS中稀释进行2倍的系列稀释。在4℃温育1小时后，再次将平板在PBS中清洗三次。通过与HRP偶联的抗His抗体(Sigma-Aldrich，Denmark)(以1∶4000稀释在含1％BSA的PBS中)一起温育1小时进行二级检测。在PBS中清洗三次后，使用75μg/孔的TMB底物(Invitrogen，Taastrup，Denmark)使ELISA显色。使用40μl/孔的1M H2SO4终止反应，并在ELISA读数仪中于450nm读取平板。
结果
表达和纯化：
对于溶解沉淀的透析在透析袋中产生了大量的沉淀物。根据Western印迹的评估(数据未显示)，大部分His标记蛋白没有沉淀。在HisTrapTM纯化后，通过ELISA评估所得级分。为了调节蛋白重折叠，将各级分的样品以10倍稀释在1％BSA中，导致尿素终浓度为0.3M，这将使得蛋白处于折叠状态。在ELISA中分析稀释样品与CD163的结合(图20)。ELISA信号主要见于级分9-14。将级分9-16混合。这样获得约3ml的纯化蛋白。
重折叠：
通过透析90小时以上进行缓慢的重折叠。终体积为4ml，且尿素浓度为0.3M。透析导致在离心后的少量沉淀。通过ELISA检测上清。
使用重折叠蛋白的ELISA：
重折叠scFv的ELISA显示了与CD163的结合。在低至128倍稀释时检测到信号(图21)。未稀释的样品(无BSA的缓冲剂中的样品)也发生了结合，但显示了与BSA结合的高背景信号。由于样品包含了未经分离的折叠蛋白和错折叠蛋白的集合，由存在的错折叠蛋白导致非特异性结合并不奇怪。在含1％BSA的PBS中稀释64或128倍时，与BSA结合的背景可以忽略，且仍分别给出0.29或0.15的信号，这清楚地显示了重折叠scFv与CD163的结合(图21)。
实施例4的参考文献：
1.Todorovska et al.(2001).Design and application of diabodies，triabodies and tetrabodies for cancer targeting.J Immunol Methods 248，47-66.
2.Kristiansen M.et al.(2001).Identification of the haemoglobinscavenger receptor.Nature 11：409(6817)：198-201.
实施例5：Fab片段的生成、制备和测试
材料和方法
引物：
Fab P--＞stop 5′-acaagagggtggagtctaagtatggatagccatgcccaagctg-3′
[SEQ ID NO：58]
Fab P--＞stop anti 5′-cagcttgggcatggctatccatacttagactccaccctcttgt-3′
[SEQ ID NO：59]
引物均得自于TAG Copenhagen(Copenhagen，Denmark)。
测序：
在Eurofins MWG operon(Ebersberg，Germany)进行作为数值读数管服务的测序。用于测序的引物是来自Eurofins MWG operon的CMV引物。
Quick change定点诱变：
使用来自Stratagene(USA)的QuickChange试剂盒，通过quick change定点诱变引入终止密码。根据厂商的说明进行作为标准诱变的所述诱变。在重链中，使用引物Fab P--＞stop和Fab P--＞stop anti，将P220突变成终止密码。模板是质粒pcDNA3.3-KN2。通过测序确认了突变体的序列。
Fab片段的表达：
将表达质粒热激至Top10细胞中，并平铺在包含氨苄青霉素的LB平板上。挑取菌落以过夜培养，并使用带有终止剂的Nucleobond质粒试剂盒(Macherey-Nagel，AH-Diagnostic，Aarhus，Denmark)从培养物制备质粒。通过测序确认了所有质粒的序列。
Fab片段在CHO-S细胞中的瞬时表达如下：
将20μg pcDNA3.3-Fab1与20μg pOptiVec-NRY混合。将DNA在OptiCHOPro SFM(8mML-谷氨酰胺)中稀释至0.6ml的总体积。将DNA与包含40μl FreeStyle MAX转染剂(Invitrogen，Taastrup，Denmark)的0.6ml OptiCHOPro SFM轻柔混合。在室温下温育10分钟后，添加DNA-FreeStyle MAX混合物至浓度为1x106个细胞/ml的25ml细胞中。三天后，通过离心收集上清，并通过ELISA分析。
通过ELISA测量Fab片段活性：
如下使用约1μg/ml人CD163(如Kristiansen，M.et al.((2001).Identificationof the haemoglobin scavenger receptor.Nature 11：409(6817)：198-201)中所述纯化)包被Nunc Maxisorp ELISA平板：按50μl/孔添加并在4℃温育过夜。用于包被的缓冲剂为碳酸盐，pH 9.0。每个测试一式两份进行。
ELISA中使用的一级抗体样品是来自转染细胞的未稀释上清或30倍浓缩的上清，或稀释在包含1％BSA的PBS中的抗体标准品100ng/ml KN2/NRY抗体。在VIVAspin离心浓缩机(10.000MWCO)(Sigma-Aldrich，Denmark)上浓缩上清。
ELISA步骤如下：将ELISA平板在PBS中清洗3次，并在含3％BSA的PBS封闭1小时。封闭后，向孔中添加一级抗体样品(100μl/孔)。对所有样品和标准品进行2倍系列稀释(稀释在包含1％BSA的PBS中)。将样品在平板上温育1小时。随后，将平板在PBS中清洗三次，并向孔中添加以1∶4000稀释在包含1％BSA的PBS中的山羊抗人κ链HRP二级抗体(AbD Serotec，Oxford，UK)。温育1小时后，使用PBS清洗孔三次，并通过向每个孔添加75μl的TMB底物使ELISA显色。10分钟后，通过向孔中添加40μl 1M H2SO4终止反应。在ELISA读数仪中于450nm读取平板。
还测量没有包被的孔和没有一级抗体的孔的背景读数。
结果
定点诱变
以下显示了诱变后纯化质粒的DNA序列和对应的蛋白质序列。
DNA
caggtgcagctgcaggagtctggaccaggactggtgaagccatctgagaccctgagcctgacctgcaccgtgagcggctacagcatcaccagcgactacgcctggaactggatcaggcagttccccggcaacaagctggagtggatgggctacatcacctacagcggcagcacctactacaaccccagcctgaagagcagggtgaccatcagcgtggacaccagcaagaaccagttcagcctgaagctgagcagcgtgaccgccgccgacaccgccacctactactgcgtgagcggcacctactacttcgactactggggccagggcaccaccctgaccgtgagcagcgccagcaccaagggaccaagcgtgttcccactggctccatgcagcaggagcaccagcgagagcacagccgccctgggatgcctggtgaaggactacttccctgagcctgtgaccgtgagctggaattctggcgccctgaccagcggagtgcacaccttcccagccgtgctgcagagctctggactgtacagcctgagcagcgtggtgaccgtgccttcttccagcctgggcaccaagacctacacctgcaacgtggaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagggtggagtctaagtatggatag
[SEQ ID NO：60]
蛋白质
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCVSGTYYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYG(终止)
[SEQ ID NO：61]
Fab的ELISA测试：
未稀释且未浓缩的上清在ELISA中产生了可测量但很小的信号(图22)。30x浓缩的上清产生了较大的ELISA信号。系列稀释物的信号强度与标准系列稀释物(100ng/ml)相当，清楚地表明了Fab片段与CD163的结合(图23)。
实施例6：大鼠抗小鼠CD163单克隆抗体的生成和表征
如下通过GenScript(Piscataway，New Jersey，USA)生成杂交瘤克隆大鼠抗小鼠E10B10(IgG2a)：
使用小鼠CD163域1-3作为免疫原，并免疫3只大鼠。所有大鼠均显示出免疫反应，并使用标准技术，将反应最高的大鼠用于细胞融合和杂交瘤的制备。制备并筛选出源自9个亲本克隆的总计18个杂交瘤细胞系。
小鼠CD163域1-3的制备如下：
1.亚克隆：
优化并合成带有C末端His标签的小鼠CD163域1-3的靶DNA序列，并亚克隆到用于瞬时转染和制备的哺乳动物表达载体中。
2.小鼠CD163域1-3表达和纯化的评估
收集1L 293细胞培养物，并使用HiTrap螯合柱，通过一步纯化法处理。靶蛋白首先洗脱在250mM咪唑的级分中。通过SDS-PAGE分析洗脱材料的目标蛋白，参见图24。本发明人在亲和纯化后获得了约6.0mg的蛋白。
克隆的筛选
使用标准技术，通过检测上清与上样到SDS-PAGE和Western印迹的溶解的小鼠脾中的小鼠CD163的结合，筛选克隆。选择在与非还原CD163结合后显示最高信号的克隆，此克隆命名为E10B10。
将杂交瘤细胞解冻并使其扩增数轮。在使用重组小鼠CD163免疫两只大鼠后，Genscript使用标准技术获得了杂交瘤。
引物：
用于杂交瘤克隆的轻链可变区的一级PCR扩增和测序的引物如(1)中所述，但使5′(GAGG-定向)和3′(平端)序列适于TOPO定向克隆。重链可变区的PCR扩增使用如(2)中所述的以下引物进行。
3b 5′-AGGT(C/G)(A/C)AACTGCAG(C/G)AGTC(A/T)GG-3′[SEQ ID NO：62]
45′-CCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT-3′
[SEQ ID NO：63]
所有引物均得自于TAG Copenhagen(Copenhagen，Denmark)。
测序：
在Eurofins MWG operon(Ebersberg，Germany)进行作为数值读数管服务的测序。
提取总RNA：
根据厂商的说明，通过QIAamp血RNA试剂盒(QIAGEN，Copenhagen，Denmark)，使用每种杂交瘤细胞系各2x106个细胞提取总RNA。简要而言，将细胞重悬在600μl缓冲剂RLT中，通过使其通过装有21-G(0.8mm)针头的注射器匀浆至少5次。添加600μl 70％乙醇并通过抽打混合。将悬液施于QIAamp离心柱，并通过数次离心上样。使用750μl RW1和750μl RPE清洗柱。使用2x50μl去RNA酶水洗脱RNA。
用于cDNA合成的缓冲剂的制备
使用超纯水或分子生物学级化学品和经DEPC处理的水制备用于cDNA合成的所有缓冲剂。通过如下操作来制备经DEPC处理的水：添加DEPC(Sigma-Aldrich，Denmark)至0.1％的终浓度，并将溶液搅拌过夜，随后高压灭菌。通过向经DEPC处理的水添加所述化学品随后高压灭菌来制备Tris和EDTA储液。通过将LiCl溶于MQ水中、添加DEPC至0.1％并搅拌过夜来制备包含LiCl的缓冲剂。随后，对溶液高压灭菌，添加Tris和EDTA溶液至适合的浓度，调节pH，并对溶液再次高压灭菌。
cDNA合成：
通过Omniscript反转录酶(QIAGEN，Copenhagen，Denmark)合成cDNA。所有缓冲剂都经过DEPC处理，并与分子生物学级化学品混合。简要地：通过在65℃加热2分钟破坏RNA中的二级结构。将100μl Dynalbeads寡聚(dT)25(Invitrogen，Taastrup，Denmark)在1ml结合缓冲剂(20mM Tris，1M LiCl，2mM EDTA)中清洗二次，并重悬在100μl结合缓冲剂中。将加热的纯化RNA样品添加到微珠中，并在室温下旋转温育3-5分钟以退火。随后，将微珠在1ml缓冲剂B(10mM Tris，0.15M LiCl，1mM EDTA)中清洗两次，并在1ml冰预冷的DEPC水中清洗两次。通过在37℃温和振荡下温育2小时，在总体积80μl的：4单位ORT、8μl 10x缓冲剂、0.5mMdNTP、40单位RNA酶抑制剂(RiboLock，Fermentas，St.Leon-Rot，Germany)中，使用Omniscript反转录酶(Omniscript反转录试剂盒，QIAGEN，Copenhagen，Denmark)反转录所捕获的mRNA。最后，将合成的cDNA在1ml TE缓冲剂(20mM Tris，1mM EDTA)中清洗两次。
轻链和重链的可变区的PCR扩增：
根据Zhou及其合作者(1)的简并引物序列设计用于扩增轻链可变区基因的引物。制备100μM总引物浓度的引物混合物。VL正向引物混合物为每种引物浓度各20μM，VL反向引物混合物为每种引物浓度各10μM。根据Dübel et al.(2)设计用于扩增重链可变区基因的引物(3b和4)。
制备100μl PCR反应物以扩增VH和VL。所述反应物包含以下成分：含有MgSO4的10μlPfu缓冲剂；2μl 10mM dNTP混合物；5μl正向引物混合物(VL)或5pMol引物3b(VH)；5μl反向引物混合物(VL)或5pMol引物4(VH)；77μl高压灭菌水；1μl Pfu(2.5单位)；和一半的来自E10B10克隆的含cDNA微珠。
循环反应如下：在95℃3分钟的初始变性；95℃50秒，55℃(VH为54℃)50秒和72℃3分钟的30个循环。在使用EtBr染色的1％琼脂糖凝胶上检测扩增的DNA，并通过凝胶提取试剂盒(Machery-Nagel，AH-Diagnostics，Aarhus，Denmark)纯化。
测序：
使用正向引物混合物和反向引物混合物(VL)或引物3和4(VH)对各纯化PCR产物(VH或VL)(作为与引物预混的数值读数管)测序。所有均以各引物1μM为终浓度。
结果
可变区基因的PCR扩增
1％琼脂糖凝胶分析显示，mRNA纯化、cDNA产生和用于扩增可变区的PCR有效(参见图25和26)。
序列：
通过凝胶提取纯化可变区PCR扩增的产物，并进行测序。VH和VL二者均被成功测序。所得DNA和相应的蛋白序列如下所示。
DNA
VH
caggtcaaactgcaggagtctggtggaggattggtgcagcctaaggagtctttgaaaatctcatgtgcagcctctggattcaccttcagtactgctgccatgtactgggtccgccaggctccaggaaagggtctggattgggttgctcgcataagaactaaacctgataattatgcaacatattaccctgcttcagtgaaaggcagattcaccatctccagagatgattcaaagggcatggtctacctacaaatggataacttaaagactgaggacacagccatttattactgtacagcagcttattactatgatggccgctttgattactggggccaaggagtcatggtcacagtcgcctcagctgaaacgacacccaagcttgtctatccactggcccctggaaaacactcg
[SEQ ID NO：64]
VL
gacattgtgatgacccagactccatcctcccaggctgtgtcagcaggggagagggtcactatgaggtgcaagtccagtcagagtcttttatacagtgaaaacaaaaagaactacttggcctggtaccaacagaaaccagggcagtctcctaaactgttgatttcctgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcataggcagtggatctgggacagatttcactctgaccatcagcagtgtgcaggcagaagacctggctgtttattactgtgaccagtattatgatcctccattcacgttcggctcagggacgaagttggaaataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcc
[SEQ ID NO：65]
蛋白质
VH
QVKLQESGGGLVQPKESLKISCAASGFTFSTAAMYWVRQAPGKGLDWVARIRTKPDNYATYYPASVKGRFTISRDDSKGMVYLQMDNLKTEDTAIYYCTAAYYYDGRFDYWGQGVMVTVASAETTPKLVYPLAPGKHS
[SEQ ID NO：66]
VL
DIVMTQTPSSQAVSAGERVTMRCKSSQSLLYSENKKNYLAWYQQKPGQSPKLLISWASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCDQYYDPPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVS[SEQ ID NO：67]
3E10B10的制备
使制备抗小鼠CD163(域1-3)抗体的大鼠杂交瘤3E10B10(Genscript，New Jersey，USA)适应血清Hybridoma-SFM无血清培养基(GIBCO，Invitrogen，Denmark，Taastrup，Denmark)，并在夹心ELISA试验中确认了抗体的产生。将小规模制备物以0.2x 106个细胞/ml接种到三层组织培养瓶(Nalge-Nunc，Roskilde，Denmark)的15-200ml Hybridoma-SFM培养基中，培养5-6天。
E10B10的纯化
将来自表达E10B10的杂交瘤细胞的上清添加Tris-HCl(pH 8.0)缓冲剂至50mM的终浓度，通过0.22μm滤器过滤，并上样到Protein G-resin柱(Genscript，New Jersey，USA)。上样后，使用10倍体积的PBS(pH 7.4)洗柱，并使用0.1M柠檬酸钠缓冲剂(pH 3.2)将蛋白洗脱至级分管中，所述级分管中填充了1/10终级分体积的1M Tris-HCl(pH 8.0)。使用Sephadex G-25(Ge Healtcare，Denmark)将蛋白缓冲凝胶过滤到终缓冲剂中，备用。
实施例6的参考文献：
1.Zhou，H.，Fisher，R.J.&Papas，T.S.(1994).Optimization of primersequences for mouse scFv repertoire display library construction.NucleicAcids Res 22，888-9.
2.Dübel et al.(1994).Isolation of IgG antibody Fv-DNA from variousmouse and rat hybridoma cell lines using the polymerase chain reaction with asimple set of primers.J Immunol Methods：175；89-95.
实施例7：Mac2-158和KN2/NRY表位绘图
材料和方法
引物：
使用引物进行人CD163的SLIM诱变以绘制Mac2-158和KN2/NRY表位图。引物均得自于TAG Copenhagen(Copenhagen，Denmark)。
引物列表：
测序：
在Eurofins MWG operon(Ebersberg，Germany)进行作为数值读数管服务的测序。用于测序的引物是来自Eurofins MWG operon的CMV引物。当至少域1被正确测序时，认为质粒经过测序。
SLIM诱变：
使用不依赖于连接反应的定点诱变(SLIM)方法(1)产生突变体。引物列在引物表中。用于产生两个第一突变体的模板是带有全长人CD163 cDNA的pcDNA5-FRT-人CD163质粒。使用引物LKI FT、RT、F和R产生突变体质粒pcDNA5-FRT-人CD163(VKVQEE--＞LKIHEK)，使用引物R60D FT、RT、F和R产生突变体质粒pcDNA5-FRT-人CD163(R60D)。通过使用引物R60D FT、RT、F和R在pcDNA5-FRT-人CD163(VKVQEE--＞LKIHEK)上进行SLIM反应进行双突变体的生成。
人CD163和突变体的表达：
将表达质粒热激至DH5α细胞中，并平铺在包含氨苄青霉素的LB平板上。挑取菌落以过夜培养，并使用带有终止剂的Nucleobond质粒试剂盒(Macherey-Nagel，AH-Diagnostic，Aarhus，Denmark)从培养物制备质粒。通过测序确认了所有质粒的序列。
人CD163wt和三种突变体在HEK 293细胞中的瞬时表达如下：
将8μg DNA在OptiCHOPro SFM(8mM L-谷氨酰胺)中稀释至0.15ml的总体积。将DNA与包含8μl FreeStyle MAX转染剂(Invitrogen，Taastrup，Denmark)的0.15ml OptiCHOProSFM轻柔混合。在室温下温育10分钟后，添加DNA-FreeStyle MAX混合物至浓度为1x 106个细胞/ml的5ml细胞中。三天后，通过离心收集细胞。
KN2/NRY的HRP偶联：
通过基本如(2)所述的高碘酸盐氧化法使HRP(P6782，Sigma-Aldrich，Denmark)偶联到MabSelect Sure纯化的KN2/NRY。通过在VIVAspin离心浓缩机(100,000MWCO)(Sigma-Aldrich，Denmark)上的超滤进行未偶联HRP与KN2/NRY-HRP偶联物的分离。将缓冲剂更换为包含10mM甘氨酸的PBS1000次，最后添加BSA至10mg/ml，将偶联物在4℃贮存。ELISA测定工作稀释度为1∶100-1∶2000。
人CD163和敲除突变体的Western印迹：
向各细胞沉淀物添加1ml裂解缓冲剂(10mM Tris(pH 8)，140mM NaCl，15mMMgSO4，1％Triton X-100)并在4℃旋转温育15分钟。在6000rpm离心30分钟后，对上清进行无菌过滤。
向90μl的各上清添加30μl的4x LDS样品缓冲剂。将3x 20μl的各上清样品和8μlSeeBlue plus2预染色标记上样到NuPage 4-12％Bis-Tris-Gel(Invitrogen，Taastrup，Denmark)，并根据厂商的说明，使用MOPS电泳缓冲剂进行SDS-PAGE(200V恒压50分钟)。根据厂商的说明，在iBLOT装置上进行对PVDF膜(Invitrogen，Taastrup，Denmark)的印迹。在印迹后，在含0.1％Tween的1x PBS中短暂清洗膜，并在室温振荡下在含2％Tween的1x PBS中封闭30分钟。封闭后，将膜在含0.1％Tween的1x PBS中清洗3次，每次5分钟，并与均稀释在含0.1％Tween的1x PBS中的(1)10ml 1μg/ml多克隆兔抗人CD163抗体；(2)10ml 1μg/mlMac2-158；(3)10ml 1∶500KN2/NRY-HRP一起温育1小时。再次将膜在含0.1％Tween的1x PBS中清洗3次，每次5分钟，并与(1)10ml的1∶1000山羊抗兔HRP(AbD Serotec，Oxford，UK)或(2)10ml的1∶1000山羊抗小鼠HRP(Dako，Glostrup，Denmark)一起温育1小时。将膜在含0.1％Tween的1x PBS中清洗3次，每次5分钟，并通过在MilliQ水中短暂清洗膜并向各印迹点添加10ml底物，使用Novex HRP生色底物进行显色。通过在MilliQ水中清洗两次终止色原的沉淀。
结果
定点诱变
以下显示了诱变后纯化质粒的DNA序列和对应的蛋白质序列。
DNA
VKVQEE--＞LKIHEK突变体
Atgagcaaactcagaatggtgctacttgaagactctggatctgctgacttcagaagacattttgtcaacctgagtcccttcaccattactgtggtcttacttctcagtgcctgttttgtcaccagttctcttggaggaacagacaaggagctgaggctagtggatggtgaaaacaagtgtagcgggagagtggaattgaaaatccacgagaagtggggaacggtgtgtaataatggctggagcatggaagcggtctctgtgatttgtaaccagctgggatgtccaactgctatcaaagcccctggatgggctaattccagtgcaggttctggacgcatttggatggatcatgtttcttgtcgtgggaatgagtcagctctttgggattgcaaacatgatggatggggaaagcatagtaactgtactcaccaacaagatgctggagtgacctgctcagatggatccaatttggaaatgaggctgacgcgtggagggaatatgtgttctggaagaatagagatcaaattccaaggacggtggggaacagtgtgtgatgataacttcaacatagatcatgcatctgtcatttgtagacaacttgaatgtggaagtgctgtcagtttctctggttcatctaattttggagaaggctctggaccaatctggtttgatgatcttatatgcaacggaaatgagtcagctctctggaactgcaaacatcaaggatggggaaagcataactgtgatcatgctgaggatgctggagtgatttgctcaaagggagcagatctgagcctgagactggtagatggagtcactgaatgttca[SEQ ID NO：76]
R60D
Atgagcaaactcagaatggtgctacttgaagactctggatctgctgacttcagaagacattttgtcaacctgagtcccttcaccattactgtggtcttacttctcagtgcctgttttgtcaccagttctcttggaggaacagacaaggagctgaggctagtggatggtgaaaacaagtgtagcgggagagtggaagtgaaagtccaggaggagtggggaacggtgtgtaataatggctggagcatggaagcggtctctgtgatttgtaaccagctgggatgtccaactgctatcaaagcccctggatgggctaattccagtgcaggttctggagacatttggatggatcatgtttcttgtcgtgggaatgagtcagctctttgggattgcaaacatgatggatggggaaagcatagtaactgtactcaccaacaagatgctggagtgacctgctcagatggatccaatttggaaatgaggctgacgcgtggagggaatatgtgttctggaagaatagagatcaaattccaaggacggtggggaacagtgtgtgatgataacttcaacatagatcatgcatctgtcatttgtagacaacttgaatgtggaagtgctgtcagtttctctggttcatctaattttggagaaggctctggaccaatc[SEQ ID NO：77]
双突变体
Atgagcaaactcagaatggtgctacttgaagactctggatctgctgacttcagaagacattttgtcaacctgagtcccttcaccattactgtggtcttacttctcagtgcctgttttgtcaccagttctcttggaggaacagacaaggagctgaggctagtggatggtgaaaacaagtgtagcgggagagtggaattgaaaatccacgagaagtggggaacggtgtgtaataatggctggagcatggaagcggtctctgtgatttgtaaccagctgggatgtccaactgctatcaaagcccctggatgggctaattccagtgcaggttctggagacatttggatggatcatgtttcttgtcgtgggaatgagtcagctctttgggattgcaaacatgatggatggggaaagcatagtaactgtactcaccaacaagatgctggagtgacctgctcagatggatccaatttggaaatgaggctgacgcgtggagggaatatgtgttctggaagaatagagatcaaattccaaggacggtggggaacagtgtgtgatgataacttcaacatagatcatgcatctgtcatttgtagacaacttgaatgtggaagtgctgtcagtttctct
[SEQ ID NO：78]
蛋白质
VKVQEE--＞LKIHEK突变体
MSKLRMVLLEDSGSADFRRHFVNLSPFTITVVLLLSACFVTSSLGGTDKELRLVDGENKCSGRVELKIHEKWGTVCNNGWSMEAVSVICNQLGCPTAIKAPGWANSSAGSGRIWMDHVSCRGNESALWDCKHDGWGKHSNCTHQQDAGVTCSDGSNLEMRLTRGGNMCSGRIEIKFQGRWGTVCDDNFNIDHASVICRQLECGSAVSFSGSSNFGEGSGPIWFDDLICNGNESALWNCKHQGWGKHNCDHAEDAGVICSKGADLSLRLVDGVTECS[SEQ ID NO：79]
R60D
MSKLRMVLLEDSGSADFRRHFVNLSPFTITVVLLLSACFVTSSLGGTDKELRLVDGENKCSGRVEVKVQEEWGTVCNNGWSMEAVSVICNQLGCPTAIKAPGWANSSAGSGDIWMDHVSCRGNESALWDCKHDGWGKHSNCTHQQDAGVTCSDGSNLEMRLTRGGNMCSGRIEIKFQGRWGTVCDDNFNIDHASVICRQLECGSAVSFSGSSNFGEGSGPI[SEQ ID NO：80]
双突变体
MSKLRMVLLEDSGSADFRRHFVNLSPFTITVVLLLSACFVTSSLGGTDKELRLVDGENKCSGRVELKIHEKWGTVCNNGWSMEAVSVICNQLGCPTAIKAPGWANSSAGSGDIWMDHVSCRGNESALWDCKHDGWGKHSNCTHQQDAGVTCSDGSNLEMRLTRGGNMCSGRIEIKFQGRWGTVCDDNFNIDHASVICRQLECGSAVSFS[SEQ ID NO：81]
突变体的Western印迹：
进行了三次Western印迹。SDS-PAGE的所有点如下上样：SeeBlue plus2预染标记(泳道1)；人CD163wt(泳道2)；人CD163 R60D(泳道3)；人CD163VKVQEE--＞LKIHEK(泳道4)；人CD163双突变体(泳道5)和阴性转染对照(泳道6)。使用多克隆兔抗CD163抗体进行Western印迹评估蛋白表达水平。此Western印迹(图27A)显示突变体R60D的表达没有达到野生型人CD163、VKVQEE--＞LKIHEK突变体或双突变体(以上均表达至相同的程度)的程度，但仍在可检测的水平。图27B显示了对不同突变体进行的Mac2-158测试。Mac2-158与人CD163wt和R60D突变体结合。与R60D突变体的结合非常弱。没有检测到与任何包含LKIHEK的突变体的结合。人源化抗体KN2/NRY-HRP偶联物显示仅与人CD163wt结合(图27C)。对于此抗体，没有检测到与R60D突变体的结合。
这显示了，本发明人能够敲除Mac2-158和KN2/NRY与相同突变体的结合，鉴定了这些mAb的至少部分结合表位。
敲入Mac2-158和KN2/NRY表位
材料和方法
质粒：
将中试(midiprep)的包含小鼠CD163域1-5的pEF4/V5/His载体(Invitrogen，Taastrup，Denmark)用于小鼠CD163域1-5/V5/His的表达。在GenScript(Piscataway，NewJersey，USA)订购作为中试的小鼠CD163 1-5的域1的突变体(LKIHDK--＞VKVQEE，Y60R)。下文显示了突变体的DNA和蛋白序列(仅域1的突变体)。
KN2/NRY的HRP偶联：
通过基本如(2)所述的高碘酸盐氧化法使HRP(P6782，Sigma-Aldrich，Denmark)偶联到MabSelect Sure纯化的KN2/NRY。通过在VIVAspin离心浓缩机(100.000MWCO)(Sigma-Aldrich，Denmark)上的超滤进行未偶联HRP与KN2/NRY-HRP偶联物的分离。将缓冲剂更换为包含10mM甘氨酸的PBS1000次，最后添加BSA至10mg/ml，将偶联物在4℃贮存。ELISA测定工作稀释度达1∶100-1∶2000(数据未显示)。
DNA
小鼠CD163 1-5wt
atgggtggacacagaatggttcttcttggaggtgctggatctcctggttgtaaaaggtttgtccatctaggtttctttgttgtggctgtgagctcacttctcagtgcctctgctgtcactaacgctcctggagaaatgaagaaggaactgagactggcgggtggtgaaaacaactgtagtgggagagtggaacttaagatccatgacaagtggggcacagtgtgcagtaacggctggagcatgaatgaagtgtccgtggtttgccagcagctgggatgcccaacttctattaaagcccttggatgggctaactccagcgccggctctggatatatctggatggacaaagtttcttgtacagggaatgagtcagctctttgggactgcaaacatgatgggtggggaaagcataactgtacccatgaaaaagatgctggagtgacctgctcagatggatctaatttggagatgagactggtgaacagtgcgggccaccgatgcttaggaagagtagaaataaagttccagggaaagtgggggacggtgtgtgacgacaacttcagcaaagatcacgcttctgtgatttgtaaacagcttggatgtggaagtgccattagtttctctggctcagctaaattgggagctggttctggaccaatctggctcgatgacctggcatgcaatggaaatgagtcagctctctgggactgcaaacaccggggatggggcaagcataactgtgaccatgctgaggatgtcggtgtgatttgcttagagggagcagatctgagcctgagactagtggatggagtgtccagatgttcaggaagattggaagtgagattccaaggagaatgggggaccgtgtgtgatgataactgggatctccgggatgcttctgtggtgtgcaagcaactgggatgtccaactgccatcagtgccattggtcgagttaatgccagtgagggatctggacagatttggcttgacaacatttcatgcgaaggacatgaggcaactctttgggagtgtaaacaccaagagtggggaaagcattactgtcatcatagagaagacgctggcgtgacatgttctgatggagcagatctggaacttagacttgtaggtggaggcagtcgctgtgctggcattgtggaggtggagattcagaagctgactgggaagatgtgtagccgaggctggacactggcagatgcggatgtggtttgcagacagcttggatgtggatctgcgcttcaaacccaggctaagatctactctaaaactggggcaacaaatacgtggctctttcctggatcttgtaatggaaatgaaactactttttggcaatgcaaaaactggcagtggggcggcctttcctgtgataatttcgaagaagccaaagttacctgctcaggccacagggaacccagactggttggaggagaaatcccatgctctggtcgtgtggaagtgaaacacggagacgtgtggggctccgtctgtgattttgacttgtctctggaagctgccagtgtggtgtgcagggaattacaatgtggaacagtcgtctctatcctagggggagcacattttggagaaggaagtggacagatctggggtgaagaattccagtgtagtggggatgagtcccatctttcactatgctcagtggcgcccccgctagacagaacttgtacccacagcagggatgtcagcgtagtctgctcaaatctagagggcccgcggttcgaaggtaagcctatccctaaccctctcctcggtctcgattctacgcgtaccggtcatcatcaccatcaccattga[SEQ ID NO：82]
小鼠CD163 1-5LKIHDK--＞VKVQEE，Y60R突变体
Atgggtggacacagaatggttcttcttggaggtgctggatctcctggttgtaaaaggtttgtccatctaggtttctttgttgtggctgtgagctcacttctcagtgcctctgctgtcactaacgctcctggagaaatgaagaaggaactgagactggcgggtggtgaaaacaactgtagtgggagagtggaagtgaaggtgcaggaggagtggggcacagtgtgcagtaacggctggagcatgaatgaagtgtccgtggtttgccagcagctgggatgcccaacttctattaaagcccttggatgggctaactccagcgccggctctggacggatctggatggacaaagtttcttgtacagggaatgagtcagctctttgggactgcaaacatgatgggtggggaaagcataactgtacccatgaaaaagatgctggagtgacctgctcagatggatctaatttggagatgagactggtgaacagtgcgggccaccgatgcttaggaagagtagaaataaagttccagggaaagtgggggacggtgtgtgacgacaacttcagcaaagatcacgcttctgtgatttgtaaacagcttggatgtggaagtgccattagtttctctggctcagctaaattgggagctggttctggaccaatctggctcgatgac[SEQ ID NO：83]
蛋白质
小鼠CD163 1-5wt
MGGHRMVLLGGAGSPGCKRFVHLGFFVVAVSSLLSASAVTNAPGEMKKELRLAGGENNCSGRVELKIHDKWGTVCSNGWSMNEVSVVCQQLGCPTSIKALGWANSSAGSGYIWMDKVSCTGNESALWDCKHDGWGKHNCTHEKDAGVTCSDGSNLEMRLVNSAGHRCLGRVEIKFQGKWGTVCDDNFSKDHASVICKQLGCGSAISFSGSAKLGAGSGPIWLDDLACNGNESALWDCKHRGWGKHNCDHAEDVGVICLEGADLSLRLVDGVSRCSGRLEVRFQGEWGTVCDDNWDLRDASVVCKQLGCPTAISAIGRVNASEGSGQIWLDNISCEGHEATLWECKHQEWGKHYCHHREDAGVTCSDGADLELRLVGGGSRCAGIVEVEIQKLTGKMCSRGWTLADADVVCRQLGCGSALQTQAKIYSKTGATNTWLFPGSCNGNETTFWQCKNWQWGGLSCDNFEEAKVTCSGHREPRLVGGEIPCSGRVEVKHGDVWGSVCDFDLSLEAASVVCRELQCGTVVSILGGAHFGEGSGQIWGEEFQCSGDESHLSLCSVAPPLDRTCTHSRDVSVVCSNLEGPRFEGKPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHH[SEQ IDNO：84]
小鼠CD163 1-5LKIHDK--＞VKVQEE，Y60R突变体
MGGHRMVLLGGAGSPGCKRFVHLGFFVVAVSSLLSASAVTNAPGEMKKELRLAGGENNCSGRVEVKVQEEWGTVCSNGWSMNEVSVVCQQLGCPTSIKALGWANSSAGSGRIWMDKVSCTGNESALWDCKHDGWGKHNCTHEKDAGVTCSDGSNLEMRLVNSAGHRCLGRVEIKFQGKWGTVCDDNFSKDHASVICKQLGCGSAISFSGSAKLGAGSGPIWLDD[SEQ IDNO：85]
小鼠CD163 1-5和突变体的表达：
小鼠CD163 1-5和小鼠CD163域1突变体在Lenti-X 293T细胞中的瞬时表达如下：将1.5μgDNA在OptiCHOPro SFM(8mM L-谷氨酰胺)中稀释至50μl的终体积。将DNA与包含1.5μl FreeStyle MAX转染剂(Invitrogen，Taastrup，Denmark)的50μl OptiCHOPro SFM轻柔混合。在室温下温育10分钟后，添加复合物至1ml的1x 106个细胞中。三天后，通过离心收集细胞上清。
小鼠CD163的Western印迹和敲入突变体。
在50mM Tris(pH 8)缓冲剂中清洗Ni-NTA His结合树脂(Merck-Chemicals，Darmstadt，Germany)，并向细胞培养上清添加60μlNi-NTA His结合树脂浆。在4℃振荡1小时后，抽吸上清，并使用90μl 50mM Tris(pH 8)和25mM EDTA的缓冲剂洗脱各纯化物。
向90μl的各洗脱物添加30μl的4x LDS样品缓冲剂。将20μl的各上清样品和8μlSeeBlue plus2预染色标记上样到NuPage 4-12％Bis-Tris-Gel(Invitrogen，Taastrup，Denmark)，并根据厂商的说明，使用MOPS电泳缓冲剂进行SDS-PAGE(200V恒压50分钟)。根据厂商的说明，在iBLOT装置上进行对PVDF膜(Invitrogen，Taastrup，Denmark)的印迹。在印迹后，在含0.1％Tween的1x PBS中短暂清洗膜，并在室温振荡下，在含2％Tween的1x PBS中封闭30分钟。封闭后，将膜在含0.1％Tween的1x PBS中清洗3次，每次5分钟，并与(1)1∶5000Anti-V5(Invitrogen，Taastrup，Denmark)；或(2)1μg/ml Mac2-158一起温育1小时。再次使用含0.1％Tween的1x PBS清洗膜3次，每次5分钟，并与1∶2000山羊抗小鼠HRP(Dako，Glostrup，Denmark)一起温育1小时。将膜在含0.1％Tween的1x PBS中清洗3次，每次5分钟，并通过在MilliQ水中短暂清洗膜并向各印迹点添加10ml底物，使用Novex HRP生色底物(Invitrogen，Taastrup，Denmark)进行显色。通过在MilliQ水中清洗两次终止色原的沉淀。
结果
小鼠CD163域1-5wt和突变体的序列：
DNA
小鼠CD163 1-5wt
atgggtggacacagaatggttcttcttggaggtgctggatctcctggttgtaaaaggtttgtccatctaggtttctttgttgtggctgtgagctcacttctcagtgcctctgctgtcactaacgctcctggagaaatgaagaaggaactgagactggcgggtggtgaaaacaactgtagtgggagagtggaacttaagatccatgacaagtggggcacagtgtgcagtaacggctggagcatgaatgaagtgtccgtggtttgccagcagctgggatgcccaacttctattaaagcccttggatgggctaactccagcgccggctctggatatatctggatggacaaagtttcttgtacagggaatgagtcagctctttgggactgcaaacatgatgggtggggaaagcataactgtacccatgaaaaagatgctggagtgacctgctcagatggatctaatttggagatgagactggtgaacagtgcgggccaccgatgcttaggaagagtagaaataaagttccagggaaagtgggggacggtgtgtgacgacaacttcagcaaagatcacgcttctgtgatttgtaaacagcttggatgtggaagtgccattagtttctctggctcagctaaattgggagctggttctggaccaatctggctcgatgacctggcatgcaatggaaatgagtcagctctctgggactgcaaacaccggggatggggcaagcataactgtgaccatgctgaggatgtcggtgtgatttgcttagagggagcagatctgagcctgagactagtggatggagtgtccagatgttcaggaagattggaagtgagattccaaggagaatgggggaccgtgtgtgatgataactgggatctccgggatgcttctgtggtgtgcaagcaactgggatgtccaactgccatcagtgccattggtcgagttaatgccagtgagggatctggacagatttggcttgacaacatttcatgcgaaggacatgaggcaactctttgggagtgtaaacaccaagagtggggaaagcattactgtcatcatagagaagacgctggcgtgacatgttctgatggagcagatctggaacttagacttgtaggtggaggcagtcgctgtgctggcattgtggaggtggagattcagaagctgactgggaagatgtgtagccgaggctggacactggcagatgcggatgtggtttgcagacagcttggatgtggatctgcgcttcaaacccaggctaagatctactctaaaactggggcaacaaatacgtggctctttcctggatcttgtaatggaaatgaaactactttttggcaatgcaaaaactggcagtggggcggcctttcctgtgataatttcgaagaagccaaagttacctgctcaggccacagggaacccagactggttggaggagaaatcccatgctctggtcgtgtggaagtgaaacacggagacgtgtggggctccgtctgtgattttgacttgtctctggaagctgccagtgtggtgtgcagggaattacaatgtggaacagtcgtctctatcctagggggagcacattttggagaaggaagtggacagatctggggtgaagaattccagtgtagtggggatgagtcccatctttcactatgctcagtggcgcccccgctagacagaacttgtacccacagcagggatgtcagcgtagtctgctcaaatctagagggcccgcggttcgaaggtaagcctatccctaaccctctcctcggtctcgattctacgcgtaccggtcatcatcaccatcaccattga[SEQ ID NO：86]
小鼠CD163 1-5LKIHDK--＞VKVQEE，Y60D突变体
Atgggtggacacagaatggttcttcttggaggtgctggatctcctggttgtaaaaggtttgtccatctaggtttctttgttgtggctgtgagctcacttctcagtgcctctgctgtcactaacgctcctggagaaatgaagaaggaactgagactggcgggtggtgaaaacaactgtagtgggagagtggaagtgaaggtgcaggaggagtggggcacagtgtgcagtaacggctggagcatgaatgaagtgtccgtggtttgccagcagctgggatgcccaacttctattaaagcccttggatgggctaactccagcgccggctctggacggatctggatggacaaagtttcttgtacagggaatgagtcagctctttgggactgcaaacatgatgggtggggaaagcataactgtacccatgaaaaagatgctggagtgacctgctcagatggatctaatttggagatgagactggtgaacagtgcgggccaccgatgcttaggaagagtagaaataaagttccagggaaagtgggggacggtgtgtgacgacaacttcagcaaagatcacgcttctgtgatttgtaaacagcttggatgtggaagtgccattagtttctctggctcagctaaattgggagctggttctggaccaatctggctcgatgac[SEQ ID NO：87]
蛋白质
小鼠CD163 1-5wt
MGGHRMVLLGGAGSPGCKRFVHLGFFVVAVSSLLSASAVTNAPGEMKKELRLAGGENNCSGRVELKIHDKWGTVCSNGWSMNEVSVVCQQLGCPTSIKALGWANSSAGSGYIWMDKVSCTGNESALWDCKHDGWGKHNCTHEKDAGVTCSDGSNLEMRLVNSAGHRCLGRVEIKFQGKWGTVCDDNFSKDHASVICKQLGCGSAISFSGSAKLGAGSGPIWLDDLACNGNESALWDCKHRGWGKHNCDHAEDVGVICLEGADLSLRLVDGVSRCSGRLEVRFQGEWGTVCDDNWDLRDASVVCKQLGCPTAISAIGRVNASEGSGQIWLDNISCEGHEATLWECKHQEWGKHYCHHREDAGVTCSDGADLELRLVGGGSRCAGIVEVEIQKLTGKMCSRGWTLADADVVCRQLGCGSALQTQAKIYSKTGATNTWLFPGSCNGNETTFWQCKNWQWGGLSCDNFEEAKVTCSGHREPRLVGGEIPCSGRVEVKHGDVWGSVCDFDLSLEAASVVCRELQCGTVVSILGGAHFGEGSGQIWGEEFQCSGDESHLSLCSVAPPLDRTCTHSRDVSVVCSNLEGPRFEGKPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHH[SEQ IDNO：88]
小鼠CD163 1-5LKIHDK--＞VKVQEE，Y60R突变体
MGGHRMVLLGGAGSPGCKRFVHLGFFVVAVSSLLSASAVTNAPGEMKKELRLAGGENNCSGRVEVKVQEEWGTVCSNGWSMNEVSVVCQQLGCPTSIKALGWANSSAGSGRIWMDKVSCTGNESALWDCKHDGWGKHNCTHEKDAGVTCSDGSNLEMRLVNSAGHRCLGRVEIKFQGKWGTVCDDNFSKDHASVICKQLGCGSAISFSGSAKLGAGSGPIWLDD[SEQ IDNO：89]
突变体的Western印迹：
SDS-PAGE凝胶的上样如下：(1)小鼠CD163 1-5LKIHDK--＞VKVQEE，Y60R突变体；(2)小鼠CDl63 1-5wt；(3)阴性转染对照；(4)SeeBlue plus2预染标记；(5)阳性印迹对照(小鼠CD163(D)，或人CD163(E))(图27)。使用V5抗体确认并评估蛋白表达。这显示了野生型小鼠CD163 1-5和突变体以合理的水平表达。与Mac2-158温育的印迹点显示了Mac2-158不结合野生型小鼠CD163 1-5，但Mac2-158确实结合了突变体小鼠CD163 1-5LKIHDK--＞VKVQEE，Y60R。在使用Kn2/NRY-HRP显色的印迹点中可见类似但模糊的条带(未显示)。因此，本发明人能够将假定的KN2/NRY和Mac2-158表位插入到小鼠CD163框架上，显示其确实是表位的至少一部分。
实施例7的参考文献：
1.Chiu et al.(2004).Site-directed Ligase Independent Mutagenesis(SLIM)：a single-tube methodology approaching 100％effciency in 4h.NucleicAcids Res 32(21)：e174.
2.Boorsma and Streefkerk(1979).Periodate or glutaraldehyde forpreparing peroxidase conjugates.J Immunol.Methods 30：245-55.
实施例8：皮质类固醇偶联抗体的制备
待偶联的抗体和触珠蛋白的来源
抗人CD163小鼠mAb Mac2-48和Mac 2-158来自荷兰的IQ-products。人源化CD163抗体KN2/NRY如实施例3中所述。抗大鼠CD163 ED2抗体购自荷兰的AbD-Serotec，商品号MCA342R，且如Dijkstra et al.(Immunology(1985)，54：589-99)所述，大鼠抗小鼠CD163抗体E10B10如实施例6中所述。1-1表型的触珠蛋白(Hp)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA，商品号H9762)。
后附实施例(例如实施例10)中给出了涉及地塞米松-MVCP和地塞米松-NHS及其制备的细节。
通过HPLC测定游离皮质类固醇和蛋白偶联的皮质类固醇
材料和方法
此方法用于测定含水样品中的游离皮质类固醇(地塞米松、地塞米松磷酸酯、地塞米松醋酸酯、强的松龙、甲基强的松龙或醋酸氟轻松)和皮质类固醇半琥珀酸酯(地塞米松半琥珀酸酯、强的松龙半琥珀酸酯、甲基强的松龙半琥珀酸酯或醋酸氟轻松半琥珀酸酯)的量，以及蛋白-皮质类固醇偶联物中的总皮质类固醇的量。
用于游离皮质类固醇和皮质类固醇半琥珀酸酯的样品制备
pH 5的HPLC
将约100μl样品或稀释样品通过0.45μm RC膜注射器式滤器(Phenomenex，Danmark)直接过滤到HPLC管中。
pH 2的HPLC
通过使用500μl水旋转两次清洗离心滤器(截留分子量30kD，体积500μl，Millipore，Danmark)，每次10分钟。弃去水，将50μl样品或稀释样品通过滤器过滤，并使用50μl的各样品缓冲剂清洗滤器。测定滤液的体积，并将滤液转至HPLC管。
蛋白-皮质类固醇偶联物中的总皮质类固醇
通过与50μl 0.1M氢氧化钠一起在室温下温育15分钟以水解20μl的蛋白-皮质类固醇偶联物样品。此后，使用50μl 0.1M盐酸调节pH。将样品通过0.45μm注射式滤器(Phenomenex，Danmark)过滤至HPLC管中。
负载了皮质类固醇的脂质体中的总皮质类固醇
使用10％乙醇溶液稀释20μl负载皮质类固醇的脂质体样品，并上样到HPLC管中，直接注射到柱上。通过光散射测量证实，工作缓冲剂中的40％乙腈使脂质体分解(数据未显示)。
样品的HPLC分析
将1-50μl样品经Shimadzu 10 A HPLC系统(Shimadzu，Japan)中的C18柱(Hyperclone C18，3μm，150x460，Phenomenex，Danmark)运行，使用50mM乙酸钾缓冲剂中的40％乙腈(pH 5.0)或含40％乙腈和0.005％三氟乙酸的溶液(Sigma-Aldrich，Danmark)(pH2)，以0.5ml/分钟等度洗脱。使用Shimadzu SPD10A VP检测器，通过240nm的吸光度测量检测洗脱峰。每次注射的运行时间在15至30分钟之间，取决于所分析的皮质类固醇的滞留时间。将柱加热器设置至30℃，且将自动取样器/管架设置至4℃。
所有溶剂均通过0.45μm RC膜滤器(Whatman，RC 55)过滤，并真空脱气。
用于皮质类固醇和皮质类固醇半琥珀酸酯的HPLC的校准
分别使用一式三份不同注射体积的于10％EtOH中的2ug/ml皮质类固醇溶液和各皮质类固醇半琥珀酸酯溶液(用于HPLC的地塞米松；地塞米松-21-磷酸酯二钠盐(Dexamethasone-21-phosphate disodium salt)98％；地塞米松-21-醋酸酯99％，强的松龙99％，强的松龙-21-半琥珀酸酯钠盐(Prednisolone21-hemisuccinate sodium salt)，醋酸氟轻松98％，6α-甲基强的松龙-21-半琥珀酸酯钠盐(6α-Methylprednisolone 21-hemisuccinate sodium salt)，均来自Sigma-Aldrich，Danmark)获得线性校准曲线。
通过峰面积积分，并由LC Solution软件(Shimadzu，Japan)根据各校准曲线来计算注射样品中皮质类固醇或皮质类固醇半琥珀酸酯的量。
残留MVCP-地塞米松的评估
为了评估偶联物中残留MVCP-地塞米松的量，将MVCP-地塞米松(10mg/ml，DMSO中)在50mM硼酸盐缓冲剂中稀释25倍，并按照上文所述，对所述混合物进行HPLC。将偶联物样品中对应于MVCP-地塞米松色谱图中各峰(3个峰)的所有峰面积加和，并根据地塞米松校准曲线评估MVCP-地塞米松的量。
图28显示了游离地塞米松/地塞米松半琥珀酸酯测定的典型色谱图，以及偶联物样品(ED2-地塞米松)中的总地塞米松。可通过此HPLC法可靠地分析介于0.02mg/l和3mg/l的皮质类固醇或皮质类固醇半琥珀酸酯的样品。由相同管注射3次的样品浓度的平均标准差为3.6％，(最高17.3％，最小0％，中值1.5％，n＝56*3次)。同一样品的两个独立测定(两次碱水解)中的总地塞米松浓度的平均标准差为3.4％，(最高8.1％，最小0％，中值2.9％，n＝46*2次)。
用于通过HPLC测定游离皮质类固醇和蛋白偶联皮质类固醇的所述方法对所测试范围的皮质类固醇和皮质类固醇半琥珀酸酯工作良好。所述方法快速、敏感且可重复性高。
抗体-皮质类固醇偶联物的合成
1.通过与皮质类固醇-NHS氨基偶联来合成
材料和方法
将皮质类固醇-NHS制备物(地塞米松-NHS、强的松龙-NHS、醋酸氟轻松-NHS，均冻干)在-20℃贮存，并在DMSO中新鲜制备1mg/ml溶液以用于各偶联反应。
抗体和蛋白溶液以于50mM硼酸盐缓冲剂(pH 8.3)中1mg/ml的终浓度使用。
通常，将每mg蛋白50μl 1mg/ml于DMSO中的皮质类固醇-NHS溶液缓慢添加到蛋白/抗体溶液中，并在实验室混合器上温和搅拌所述溶液。这样获得偶联皮质类固醇：蛋白(M/M，以ED2为抗体)为4-5的最终比例，但可通过增加或降低每mg抗体的皮质类固醇-NHS溶液体积调整比例。
随后，将反应混合物在热混合器(Thermomixer comfort，Eppendorf Ag)上在25℃温育15分钟，并温和振荡。
对每ml反应混合物添加于50mM硼酸盐缓冲剂(pH 8.3)中的100μl 5mM甘氨酸(Glycin)，并在25℃下温和振荡再温育30分钟，以终止结合反应。随后，将反应混合物在离心滤器(Amicon-Ultra，30K，Millipore Corp.)中渗滤至贮存缓冲剂中，所述贮存缓冲剂通常为PBS(Gibco，Invitrogen)+2.5％EtOH，或含10mM柠檬酸盐缓冲剂、144mM NaCl、2.5％EtOH的溶液(pH 6.0)，或含25mM柠檬酸盐缓冲剂、125mM NaCl、2.5％EtOH的溶液(pH 5.0)。将偶联物无菌过滤，并分析蛋白浓度，以及游离皮质类固醇和总(游离+结合)皮质类固醇的量。将其在各缓冲剂中稀释至期望的浓度，并在4℃或液氮中贮存。
表3A显示了不同NHS-偶联物的典型偶联参数。在所有不同种类的偶联物中，偶联后游离皮质类固醇-HS的百分比非常低(低于3％)，表明了良好的偶联效率。
还针对抗体ED2、E10B10、Mac2-158和KN2NRY检测了抗体与皮质类固醇-NHS的氨基偶联，以及与天然CD163蛋白配体触珠蛋白以及与皮质类固醇：地塞米松、强的松龙和醋酸氟轻松的氨基偶联。本发明人的数据显示，这是有效且在比例方面可重复的用于皮质类固醇与抗体偶联的方法。可见，反应性的程度不仅依赖于所用皮质类固醇的类型而且依赖于抗体的特性。将偶联物冷冻贮存。
2.通过蛋白二硫键的还原来合成和与MVCP-皮质类固醇偶联
材料和方法
将MVCP-地塞米松制备物(冻干)以10mg/ml溶于DMSO中，并在-20℃贮存。通过纯化内部制备(3E10B10，KN2NRY)或来自AbD Serotec(ED2)的细胞培养上清获得抗体溶液，并以于50mM硼酸盐缓冲剂(pH 8.3)中1mg/ml的终浓度使用。
抗体的还原
通常，以每mg蛋白添加70μl的100mM DTT(Fluka，＞99％)溶液，并在热混合器(Thermomixer comfort，EppendorfAG)上，将混合物在25℃温和振荡下温育30分钟。这导致抗体的链间二硫键完全还原。为了获得较低的偶联比例，可通过减少添加的DTT的量获得不完全的还原。
为了除去DTT，将反应混合物经凝胶过滤柱(Sephadex G 25，GE Heathcare)运行，所述凝胶过滤柱预先通过使用0.5M NaOH+0.5M NaCl清洁1小时，并在PBS+5mM EDTA中平衡。使用PBS+5mM EDTA洗脱蛋白以保存还原的半胱氨酸，并将包含蛋白的级分混合。通过OD280测量(Nanodrop ND-1000，Nanodrop Technologies)确定混合物中的蛋白浓度。
抗体与MVCP-地塞米松的偶联
添加150倍摩尔过量的MVCP-地塞米松。在实践中，将每mg抗体40μl10mg/ml于DMSO中的MVCP-地塞米松溶液缓慢添加到抗体溶液中，同时在实验室混合器上温和搅拌。将反应混合物在热混合器上温和振荡下于25℃温育1小时。随后，将反应混合物在离心滤器(Amicon-Ultra，30K，Millipore Corp.)中渗滤到贮存缓冲剂中，所述贮存缓冲剂通常为PBS(10x PBS；Gibco，Invitrogen)+2.5％EtOH。将偶联物无菌过滤，并分析蛋白浓度，以及游离地塞米松和总(游离+结合)地塞米松的量。将其在各缓冲剂中稀释至期望的浓度，并在4℃或液氮中贮存。
结果
表3B显示了不同MVCP-偶联物的典型偶联参数。通常达到约8-12的比例。已使用MVCP-地塞米松和抗体ED2、3E10B10和KN2NRY检测了皮质类固醇与还原抗体通过半胱氨酸连接子的偶联。本发明人的结果显示，此偶联方法可使用不同的抗体重复工作。
偶联KN2/NRY的亲和力检测
检测NHS-地塞米松和MVCP-地塞米松偶联的KN2/NRY与固定在Biacore芯片上的CD163的结合。按照实施例1进行结合试验。结果显示在图29B和29E中，其显示通过偶联诱导了最小的亲和力减少，这与所用的方法无关。
隐形脂质体的形成
使用Avnir et.al.(Avnir et al.Amphipathic weak acid glucocorticoidprodrugs remote-loaded into sterically stabilized nanoliposomes evaluated inarthritic rats and in a Beagle dog：a novel approach to treating autoimmunearthritis.Arthritis Rheum(2008)58卷(1)，第119-29页)所述的远距离上样方法，将甲基强的松龙半琥珀酸酯(MPS-HS，Sigma)负载到脂质体上，简要解释如下：使用乙醇注射法，由HSPC、mPEG2000-PE和胆固醇的混合物(摩尔比55∶40∶5)(均来自Avanti polar lipids，Alabaster，Alabama，USA)制备脂质体。将脂质在65℃的100μl EtOH中溶解15分钟，并在900ul的含水缓冲剂中水合以形成MLV。通过100nm滤器挤出25次筛分脂质体，并使用150mMNaCl(0.9％NaCl)透析两次，其中第二次透析在4℃过夜以产生跨膜钙梯度。为了将甲基强的松龙半琥珀酸酯负载到脂质体上，将甲基强的松龙半琥珀酸酯(按实施例10中所述制备)与脂质体一起在60℃温育15分钟(药物：脂质的摩尔比为1∶20)。最后，将负载MPS的脂质体冷却至4℃，并使用150mM NaCl透析以除去过量的药物。使用Wyatt minidawn光散射计(Wyatt Technologies，Santa Barbara，California，USA)评估脂质体的大小。
蛋白与pNP-PEG2000-PE的连接
为了蛋白或抗体与脂质体的连接，首先通过pNP-PEG2000-PE(NGPE)修饰抗体。按照Torchilin等人的描述(Torchilin et al.p-Nitrophenylcarbonyl-PEG-PE-liposomes：fast and simple attachment of specific ligands，including monoclonalantibodies，to distal ends of PEG chains via p-nitrophenylcarbonyl groups.(Biochim Biophys Acta(2001)1511卷(2)第397-411页))合成NGPE。使用氩气从氯仿干燥NGPE，随后溶解在50μl pH 5.0的CBS(5mM柠檬酸钠，140mM NaCl)+5mg/ml辛基葡糖苷中。添加蛋白质至溶解的NGPE中(1∶40摩尔比)，并使用PBS(pH 8.5)和0.1M NaOH调节pH至8.5，将混合物在4℃温育过夜。随后，向在4℃温育过夜的预制脂质体添加修饰的抗体或蛋白，最后通过在4℃使用150mM NaCl在Spectrum透析管(MWCO 250kDa)(SpectrumLaboratories，California，USA)中透析纯化。使用PIERCE BCA蛋白微分析(Fisher denmark，Slangerup，Denmark)测量蛋白浓度，并使用StewartAssay(Stewart，J.C.M.(1980)Anal Biochem，104：10)测量脂质浓度。使用上述的HPLC方法测定所制备的脂质体中的甲基强的松龙的量。
实施例9：使用靶向CD163的皮质类固醇偶联物的体外和体内试验
材料和方法
人单核细胞(MNC)的分离和培养
过期的血沉棕黄层得自于由Skejby大学医院血库。根据厂商的说明，使用Accuspin System-1077(Sigma-Aldrich Denmark A/S，Broendby，Denmark)分离MNC，并在组织培养瓶中的含10％胎牛血清(FCS)、青霉素/链霉素(pen/strep)的RMPI1640中，在37℃和5％CO2培养。通过冲洗使MNC从培养瓶脱离。
单核细胞(MNC)的地塞米松处理
通过向培养基添加指明的地塞米松构建物和浓缩物试剂，将培养的MNC与所述试剂一起温育，在37℃温育特定的时间，并测量CD163 mRNA水平。
获得cDNA和CD163 mRNA的实时定量PCR分析
根据厂商的说明，在RLT缓冲剂固定后，使用QUIAamp RNA blood Minin(Qiagen，Albertslund，Denmark)从MNC和巨噬细胞提取总细胞RNA，并在-80℃贮存备用。
通过向总体积为20μl的反应混合物中添加1μl提取的mRNA进行反转录，所述反应混合物由以下成分组成：补充了6.3mM MgCl2的2μl 10×PCR缓冲剂II(AppliedBiosystems，Naerum，Denmark)，每种0.3mM的四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP，dTTP，dGTP，dCTP)，2.5mM 16mer寡聚dT核苷酸，20U RNA酶抑制剂，和50U MULV反转录酶(所有试剂均来自Applied Biosystems，Naerum，Denmark)。在PCR系统9700热循环仪(AppliedBiosystems，Naerum，Denmark)中在42℃运行30分钟、随后在99℃运行5分钟进行cDNA合成。所得cDNA提供了用于实时qPCR试验的模板。将所合成的cDNA贮存在-20℃。
使用2μl cDNA作为用于实时qPCR的模板，反应混合物包含如下成分：10pmol的引物(CD163WT；正向引物5′-ACA TAG ATC ATG CAT CTG TCA TTT G-3′；反向引物5′-CAT TCTCCT TGG AAT CTC ACT TCT A-3′；MWG Biotech AG，Edersberg，Germany)或(TNF-α；正向引物5’-TGG GGT GGA GCT GAG AGA-3’；反向引物5’-GCA ATG ATC CCA AAG TAG ACC T-3’)，1.0μlFastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I(Roche Diagnostics，Hvidovre，Denmark)，其包含FastStart Taq DNA聚合酶，反应缓冲剂，脱氧核糖核苷三磷酸(dATP，dUTP，dGTP，dCTP)，SYBR Green I染料和10mM的MgCl2。使用无核酸酶的H2O调整体积至10μl。在系统(Roche Diagnostics，Hvidovre，Denmark)中如下进行实时热启动qPCR：使用95℃15分钟的初始变性步骤，随后为95℃变性10秒、65℃退火10秒和72℃延伸5秒的50个循环。通过解链曲线分析检查扩增的特异性。
单核细胞分离和巨噬细胞的体外成熟
根据厂商的说明，在分离后，使用Dynal单核细胞阴性分离试剂盒(Invitrogen)从MNC获得单核细胞。通过磁场中的阴性选择收集单核细胞。收集代表高度富集的单核细胞的作为阴性级分的流出物。
单核细胞至巨噬细胞的成熟：
将单核细胞在包含补充了100ng/ml M-CSF(GenScript Corporation，NewJersey，USA)的20％胎牛血清(FCS)和青霉素/链霉素(pen/strep)的RMPI 1640培养基(Sigma-Aldrich，Denmark)中重悬7天。前三天在37℃和5％CO2于组织培养瓶中培养。随后，通过冲洗和刮擦使单核细胞从培养瓶脱离。将单核细胞分成较小的份，并进一步培养4天。在用于TNF CBA应用的96孔组织培养板中，以每孔0.9x105个细胞进行培养。
将巨噬细胞活化成为促炎性亚型：
随后，在包含5％FCS，1ug/ml脂多糖(LPS)(Sigma-Aldrich，Denmark)和20ng/ml INF-γ(Genscript Corporation，New Jersey，USA)的RMPI1640中，活化巨噬细胞18小时，使其成为促炎性。
培养的促炎性巨噬细胞的地塞米松处理
使用包含地塞米松、Ab-地塞米松或不含药的具有5％FCS、1ug/ml LPS和20ng/mlINF-γ的RMPI160刺激促炎性巨噬细胞。
可溶性TNF浓度的流式微珠阵列(BD)测定
为了检测可溶性TNF-α浓度的变化，本发明人使用了流式微珠阵列试剂盒(BDBiosciences，New Jersey，USA)。根据厂商的说明，分析来自生长在96孔组织培养板中的体外刺激巨噬细胞(上文所述)的介质。
流式细胞术：
将细胞悬液在pH 7.4的PBS(0.1％NaN3)中清洗，并将细胞密度调节至3-5x106/ml。将0.3-0.5x106/ml的细胞与在100μl pH 7.4的PBS(0.1％NaN3和2％FBS)中的一级mAb(0.1-0.5μg)一起在4℃温育1小时。随后，将细胞在PBS(0.1％NaN3)中清洗，并与二级Ab(抗小鼠IgG-FITC或抗人IgG-FITC(二者均来自AbD-Serotec Dusseldorf，Germany))一起在4℃温育30分钟。在FACSCalibur(BD Biosciences，New Jersey，USA)上分析前，通过在1200rpm、4℃离心5分钟，将染色的细胞在pH 7.4的PBS(0.1％NaN3和2％FBS)中清洗两次。使用FlowJo7软件包(Tri Star，Origon，USA)进一步分析数据。
人、大鼠和小鼠的体外LPS模型
由雌性Lewis大鼠(Harlan)或BalB/cA小鼠(Taconic)制备大鼠或小鼠腹腔或脾细胞悬液。如上所述，从血沉棕黄层(Skejby大学医院)分离人单核细胞。将纯化的细胞悬浮在补充了10％FCS和2mM L-谷氨酰胺的RPMI培养基中，并在37℃和5％CO2下，在96孔平底板(125μl/孔)中培养过夜。将糖皮质激素偶联物(实施例8)、游离糖皮质激素或PBS系列稀释在补充性RPMI培养基中，并添加(100μl)到过夜细胞培养物中，终浓度范围为1-10-7μg糖皮质激素/ml。在温育30分钟至24小时的特定时间后，小心地吸出150μl上清，并向孔中添加150μl补充性RPMI培养基，之后进一步温育过夜。各温育条件一式两份或一式三份进行试验。在16-20小时后，使用脂多糖(LPS)(250ng/ml)攻击细胞4小时，随后从各孔吸出上清并在-20℃冷冻。根据厂商的说明，使用人、大鼠或小鼠CytoSet抗体对(Invitrogen，Taastrup，Denmark)，在夹心ELISA中分析上清中是否存在TNFα。
大鼠和小鼠的体内LPS模型
对雌性大鼠(9-11周)或雌性Balb/cA小鼠(8-9周)静脉注射游离糖皮质激素、糖皮质激素偶联物或赋形剂(pH 7.4的PBS，2.5％乙醇)。在18-20小时后，静脉注射脂多糖(LPS)(0.9mg/kg)。在以下时间点收集血样品：糖皮质激素注射前，LPS注射后2小时，并在24小时后重复。根据厂商的说明，使用大鼠或小鼠CytoSet抗体对(Invitrogen，Taastrup，Denmark)，在夹心ELISA中分析血清样品的TNFα。LPS攻击后2天，处死动物，将胸腺和脾切出并称重。
胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)的诱导和治疗方案。
在第0天，对雌性Balb/cA小鼠(7-8周)静脉注射1mg的5种单克隆抗体的混合物(Chondrex)。3天后，对所述小鼠静脉注射来自大肠杆菌(E.coli)0111：B4的35μgLPS以诱导较高的严重性和较长的活动性炎性关节炎期。在发病的第1天(总第4天)，将小鼠分成多个处理组。在第4天启动使用甲基强的松龙、脂质体-甲基强的松龙、包被了3E10B10的脂质体-甲基强的松龙或赋形剂(pH 7.4的PBS，2.5％乙醇)的处理，并每2-3天重复一次，在10日中处理总计4次。在处理过程中监控踝大小和体重的变化。通过个体关节的肿胀、前后爪中受累关节的数量测定CAIA的临床严重性。每只爪按1至4评分，因此包括所有四只爪在内的最大临床评分为16分。在第14天，将所有动物处死，将脾和肝切出并称重。
结果
Mac2-158-地塞米松偶联物。
图30A显示了与地塞米松偶联并随后与血红蛋白复合以诱导CD163表达的触珠蛋白对分离自血沉棕黄层(过期血浆)的人单核细胞的影响。所测量的影响是通过地塞米松诱导CD163mRNA合成。Hp-地塞米松后的数字是指Hp-地塞米松的不同批次。
图30B显示时间研究的结果，其显示了10nM地塞米松对分离自血沉棕黄层(过期血浆)的人单核细胞中CD163表达的影响。
为了能够测量试验中细胞TNF合成的变化，使分离的单核细胞成熟为产生TNF的促炎性巨噬细胞。此外，将地塞米松偶联至CD163mAb(Mac2-158)。随后，将巨噬细胞与浓度升高的地塞米松一起温育，所述地塞米松与Mac2-158偶联，或者为游离地塞米松。对于未经地塞米松偶联物处理的细胞，所测量的TNF浓度为112pg/ml(图31A)。
随后，在对相同促炎性巨噬细胞类型的时间研究中使用浓度为10nM的地塞米松(图31B)。可见，无论偶联至单克隆Ab还是Hp，偶联的地塞米松与游离的地塞米松同样有效。还对巨噬细胞检测了没有地塞米松的Mac2-158，其与缓冲剂的作用没有差异(结果未显示)。
KN2/NRY-地塞米松偶联物
首先，通过分离自血沉棕黄层的单核细胞的流式细胞术分析来分析人源化KN2/NRY抗体与人单核细胞的结合。图32证实了KN2/NRY与CD14阳性单核细胞的特异结合。约70％的外周血单核细胞显示了KN2/NRY和Mac2-158的共结合，表明与CD163的特异结合。
在对表达CD163的CHO细胞的流式细胞结合分析中，分析使用活化NHS酯方法的KN2/NRY与地塞米松的偶联效果(图33)，表明地塞米松偶联对与展示在CHO细胞上的CD163的结合没有或仅有很小的影响。
在体外分析KN2/NRY偶联物抑制LPS介导的人单核细胞的TNFα刺激的能力，且图34证实了游离地塞米松和KN2/NRY-地塞米松偶联物在抑制LPS介导的TNFα刺激中的类似作用。
在整体上，人细胞数据对应于本发明人得自于大鼠巨噬细胞的结果，表明偶联物药物在两种生物中同样有效。然而，显然非常难以获取成熟的脾衍生的人巨噬细胞，因此，对巨噬细胞的试验仅在大鼠和小鼠巨噬细胞上进行。
ED2-地塞米松偶联物
通过腹膜血巨噬细胞的流式细胞分析证实了大鼠CD163特异性抗体ED2与大鼠巨噬细胞的结合，且显示约42％的腹膜巨噬细胞为CD163阳性(图35)。在使用表达大鼠CD163的CHO细胞的类似结合试验中分析与ED2偶联的地塞米松偶联物的作用(图36)，且显示未偶联的ED2与CD163的结合与ED2-地塞米松偶联物与CD163的结合相当。
脂多糖(LPS)介导的体外大鼠巨噬细胞的TNFα刺激：
分析ED2-NHS-地塞米松偶联物体外抑制大鼠巨噬细胞的TNFα刺激的能力。ED2-NHS-地塞米松偶联物和游离地塞米松(1μg/ml)抑制了LPS介导的大鼠巨噬细胞刺激，而单独的ED2对TNFα分泌没有影响。在来自没有地塞米松或ED2-地塞米松偶联物的情况下(ED2或PBS)刺激20小时的巨噬细胞的细胞上清中的TNFα的浓度约10倍之高(图37)。使用上述温育条件，地塞米松和ED2-地塞米松的剂量效应相当，且观察到类似的滴定曲线(数据未显示)。在时间研究中，地塞米松和ED2-NHS-地塞米松的剂量效应在从15分钟至24小时的时期内相当(图38和未显示的数据)，并且显示，在温育15分钟后，ED2-NHS-地塞米松偶联物(1e-4至1e-5μg/ml地塞米松)的TNFα抑制水平是游离地塞米松的2倍。因此，认为大鼠体外模型是在进行动物研究前评估ED2-地塞米松偶联物的作用的有效方法，并且清楚地显示了偶联物功效提高的作用。由于游离地塞米松最后将消失在细胞中，无法预期延长的温育时间对游离地塞米松和偶联的地塞米松产生不同的效果。
大鼠体内LPS模型
在Lewis大鼠中建立LPS模型，以获得体内模型，用于使用ED2-地塞米松偶联物进一步表征地塞米松的巨噬细胞靶向。在注射LPS前20小时，通过静脉注射游离地塞米松、地塞米松偶联物或赋形剂(图39)。在施用LPS后2小时，在注射了地塞米松的大鼠中的TNFα水平是注射赋形剂的大鼠的1/2(图39A)。在偶联物的总地塞米松浓度为1/100的情况下，注射偶联物和游离地塞米松的大鼠中的TNFα水平相当。24小时后，所有组的TNFα水平恢复到正常水平(数据未显示)。因此，配制成ED2-地塞米松的地塞米松偶联物在降低TNFα水平中的功效显著高于游离地塞米松。还通过脾和胸腺重量说明了通过将其作为ED2-地塞米松偶联物施用而避免了地塞米松的全身副作用，在注射了地塞米松的大鼠中的脾和胸腺重量显著低于注射了ED2-地塞米松的大鼠(图39B和39C)，表明游离地塞米松导致了淋巴细胞的凋亡，而偶联形式未导致淋巴细胞的凋亡。
在建立大鼠LPS模型后，使用体外和体内LPS模型二者分析ED2-地塞米松偶联物的不同制剂。图40显示了ED2-NHS-地塞米松和ED2-MVCP-地塞米松的作用。在体外(图40A)，在1e-3至1e-6μg/ml的地塞米松浓度范围，ED2-MVCP-地塞米松的抑制作用是游离地塞米松的3倍，ED2-NHS-地塞米松的作用是游离地塞米松的约2倍。在整体上，滴定曲线表明ED2偶联物的地塞米松功效是游离地塞米松的100-1000倍。在注射至大鼠时，两种制剂的抑制作用显著高于游离地塞米松。在施用LPS后2小时，在剂量为偶联物50倍的总地塞米松剂量下，注射了地塞米松偶联物制剂的大鼠中的TNFα水平是注射游离地塞米松的大鼠的1/2(图40B)。同样，由于在赋形剂和偶联物组之间的器官重量没有显著差异，没有观察到器官重量降低(推定是由于游离地塞米松诱导的淋巴细胞凋亡导致的)形式的全身作用，而游离地塞米松组显著不同于使用偶联地塞米松制剂的游离地塞米松(图40C和40D)。因此，功效提高了超过50倍且避免了副作用。
综上，这些结果显示了ED2-地塞米松偶联物对表达CD163的巨噬细胞的选择靶向性。此外，偶联物的体内抑制性作用显示偶联物的功效是游离地塞米松的至少100倍。
ED2-强的松龙和ED2-氟轻松偶联物
使用ED2-强的松龙和ED2-醋酸氟轻松偶联物分析其他糖皮质激素对巨噬细胞的靶向作用。图41显示了氟轻松、游离强的松龙、ED2-NHS-醋酸氟轻松和ED2-NHS-强的松龙在体外(A)和体内(B)的抑制作用。醋酸氟轻松的体外抑制作用显著高于强的松龙，且ED2偶联的强的松龙和醋酸氟轻松的剂量效应分别与游离强的松龙和醋酸氟轻松相当。经静脉注射游离强的松龙和氟轻松并经LPS攻击的大鼠中的TNFα水平是赋形剂的1/5。经静脉向大鼠注射两种ED2-糖皮质激素偶联物以游离糖皮质激素的至少10倍的功效抑制了LPS介导的TNFα刺激。
综上，证实了使用ED2-糖皮质激素制剂的巨噬细胞靶向作用在体内抑制LPS介导的巨噬细胞的TNFα刺激中的功效显著高于游离糖皮质激素。重复的试验表明，ED2-地塞米松制剂的功效是游离糖皮质激素的达100倍。与游离糖皮质激素相比，偶联糖皮质激素对胸腺和其他器官重量的影响不显著，这清楚地证明了靶向巨噬细胞的糖皮质激素递送避免了不良的全身作用。
3E10B10-地塞米松偶联物
使CD163特异性小鼠抗体3E10B10与地塞米松偶联，并在预试验中分析偶联物。
小鼠的体外和体内LPS模型
图42中显示了3E10B10-NHS-地塞米松偶联物对LPS介导的脾细胞中的TNFα产生的抑制作用。所述剂量效应与游离地塞米松相当，或最终略高。经静脉向小鼠注射ED2-NHS-地塞米松、ED2-MVCP-地塞米松偶联物、游离地塞米松或赋形剂，并在LSP攻击后2小时分析血清TNFa水平。在注射了地塞米松的大鼠中的TNFα水平是注射赋形剂的大鼠的1/2(图42)。3E10B10-NHS-地塞米松的抑制作用低或没有，而3E10B10-MVCP-地塞米松的作用与总地塞米松剂量为偶联物的50倍的游离地塞米松相当。E10B10-NHS-地塞米松和E10B10-MVCP-地塞米松之间的差异是由于以下事实，即E10B10的氨基基团的修饰极大地消减了FACS中与鼠巨噬细胞的结合，以及与固定在Biacore芯片上的分离鼠CD163的结合(结果未显示)。
3E10B10-脂质体偶联物
CAIA模型
建立胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)动物模型以分析3E10B10-糖皮质激素制剂对小鼠中发生的关节炎的治疗作用。通过向Balb/cA小鼠注射1mg抗胶原抗体，并在3天后注射35μg LPS，诱导CAIA。在第4天，开始进行甲基强的松龙、脂质体-甲基强的松龙、脂质体-强的松龙-3E10B10或赋形剂的静脉注射治疗。此时，每个治疗组中至少有一只动物显示了关节炎的临床症状。在第7天，发病率为97％。与赋形剂治疗的CAIA小鼠相比，使用甲基强的松龙和脂质体-甲基强的松龙-3E10B10治疗的CAIA小鼠中的疾病严重性(平均临床评分和累积评分)显著较低(图43)。此外，使用脂质体-甲基强的松龙-3E10B10治疗的小鼠中的临床评分和累积评分与总强的松龙剂量为偶联物的50倍的游离强的松龙相当。使用没有3E10B10包被的脂质体-甲基强的松龙治疗的CAIA小鼠中的关节炎与赋形剂组中的关节炎没有显著不同。因此，在小鼠CAIA模型中全身施用时，可见3E10B10包被的脂质体选择性靶向巨噬细胞所需的强的松龙治疗剂量低于游离强的松龙和脂质体-强的松龙。
结论
由体外LPS模型、体内LPS模型和CAIA模型得到的数据表明，使用偶联物-糖皮质激素制剂的巨噬细胞靶向产生了糖皮质激素功效显著高于游离糖皮质激素的药物偶联物。在多个试验中，大鼠体内LPS模型显示了ED2-地塞米松具有达游离地塞米松100倍的抑制作用。其他ED2-糖皮质激素偶联物也显示在大鼠体内LPS模型中具有高于游离糖皮质激素的抑制作用。在CAIA模型中，显示由小鼠抗体3E10B10包被的脂质体-甲基强的松龙对发生的关节炎的显著治疗作用。此研究还表明3E10B10包被脂质体具有对巨噬细胞的选择性靶向作用以及低于游离糖皮质激素的剂量需求。此外，使用偶联糖皮质激素的所有研究均证实，避免了器官重量降低方面的全身副作用，而所述全身副作用见于使用具有药理作用剂量的游离糖皮质激素的情况。
实施例10：用于蛋白偶联的活化糖皮质激素的合成
地塞米松-MVCP的制备：
按照下文所述制备用于与蛋白质的游离SH基团偶联的地塞米松-MVCP，也称作Mal-Val-Cit-PABC-地塞米松。所有数字均参考图44。
Fmoc-Cit-PABA(2)
在室温下，向于150ml干DCM中的4-氨基苯甲醇(1，1.00g，8.12mmol)和Fmoc-Cit-OH(3.23g，8.13mmol)的搅拌悬浮液中添加HOBt(2.19g，16.21mmol)和EDC(1.26g，8.12mmol)。在形成白色沉淀物后，混合物迅速变清。2小时后，TLC分析显示仅有少量剩余的4-氨基苯甲醇。将反应混合物过滤，并使用DCM将残留物清洗多次。将过滤物溶于EtOH/DCM(9∶1)并过滤。真空除去溶剂，得到黄色固体的2(3.51g，86％)，其纯度足以用于后续的反应而无需进一步纯化。
Boc-Val-Cit-PABA(3)
将Fmoc-Cit-PABA(2，2.00g，3.98mmol)溶于包含20％哌啶的10ml DMF。将混合物在室温下搅拌30分钟，并在真空中除去溶剂。将剩余的固体溶于5ml干燥DMF。
将Boc-Val-OH(865mg，3.98mmol)溶于10ml干燥DCM并在冰浴上冷却至4℃。添加HOBt(1.08g，7.99mmol)和EDC(618mg，3.98mmol)并将混合物在4℃搅拌20分钟。添加脱保护Cit-PABA的DMF溶液，移去冰浴并在室温下搅拌反应过夜。除去溶剂，并通过快速色谱(DCM-MeOH；18：2→17：3)纯化产物，而无需进一步的处理。这样获得了淡黄色固体3(782mg，41％)。
Boc-Val-Cit-PABC-地塞米松(5)
将Boc-Val-Cit-PABA(200mg，0.417mmol)溶于5ml DMF-DCM(3∶7)，添加地塞米松21-(对硝基碳酸酯)(根据Ponpipom，M.M.；Bugianesi，R.L.；Robbins，J.C.；Doebber，T.W.；Shen，T.Y.，J.Med.Chem.，1981，24：1388-1395的方法制备)(4，698mg，1.25mmol)、吡啶(67μl，0.828mmol)和DMAP(255mg，2.09mmol)，并将混合物在室温(rt)下搅拌过夜。真空除去溶剂，并通过快速色谱(DCM-MeOH；19：1→23：2)纯化产物。这样获得了白色固体5(116mg，31％)。
Mal-Val-Cit-PABC-地塞米松(6)
将Boc-Val-Cit-PABA-地塞米松(6，116mg，0.129mmol)溶于包含20％TFA的5mlDCM。在TLC分析显示起始材料完全转化(10-30分钟)后，真空除去溶剂。将所得游离胺溶于5ml干燥DCM/DMF(1∶1)，随后添加6-马来酰亚胺丙酸(按照Figueiredo，R.M.de；Oczipka，P.；Froehlich，R.；Christmann，M.Synthesis，2008，8：1316-1318的方法制备)(33mg，0.195mmol)、TEA(125μl，0.900mmol)和EDC(40mg，0.258mmol)。在室温搅拌6小时后，真空除去溶剂，并通过快速色谱(DCM-MeOH；19：1→9：1)纯化产物。使用DCM(5-10ml)清洗所得白色固体三次，得到白色固体的期望产物6(34mg，28％)。
糖皮质激素-NHS的制备：
通常，按照用于地塞米松-NHS的下文所述，制备用于与蛋白质的伯氨基偶联的糖皮质激素-NHS，即所谓地塞米松-hs-NHS。所有数字均参考图45。
所示实施例是针对地塞米松，但也可使用其他糖皮质激素。使用相同的方法，还制备了甲基强的松龙、强的松龙和醋酸氟轻松半琥珀酸酯。
地塞米松-hs(7)
在室温下，将地塞米松(1.00g，2.55mmol)和琥珀酸酐(1.27g，12.69mmol)在15ml吡啶中搅拌过夜。将所述溶液倾入到50g冰和20ml浓盐酸的混合物中，过滤，并使用20ml冰预冷HCl(4M)清洗所得沉淀两次。将沉淀溶于THF并转入圆底烧瓶，使用甲苯脱水三次。这样获得了白色固体7(1.25g，97％)。
地塞米松-hs-NHS(8)
将地塞米松-hs(7，500mg，0.988mol)溶于20ml干THF。加入N-羟基琥珀酰亚胺(171mg，1.48mmol)和EDC(200mg，1.29mg)，并将反应混合物在室温搅拌过夜。真空除去溶剂，并通过快速色谱(戊烷-EtOAc；1∶1)纯化产物，得到白色固体8(376mg，63％)。
缩写：
Boc 叔丁氧基羰基；
Cit 瓜氨酸；
DCM 二氯甲烷；
DMF 二甲基甲酰胺；
EDC N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；
Fmoc 芴甲氧羰基；
HOBt 1-羟基苯并三唑；
hs 半琥珀酸酯；
MC 6-马来酰亚胺基己酸
NHS N-羟基琥珀酰亚胺；
PAPA 对-氨基苯甲醇；
PABC 对-氨基苯甲基碳酸酯；
TEA 三乙胺；
TFA 三氟乙酸；
THF 四氢呋喃；
Val 缬氨酸。
实施例11：使用地塞米松偶联物的进一步试验
介绍
概述
根据在赋形剂组中100％发病率，并结合总临床评分随时间增加，在研究结束时达到6.3a.u.的数值判断，此研究中成功建立了大鼠胶原诱导的关节炎(CIA)模型。地塞米松以剂量依赖的形式抑制了关节炎的临床症状，在0.1mg/kg和1mg/kg剂量水平显示出显著性。与赋形剂相比，施用0.01mg/kg地塞米松产生了较低的总临床评分并且减少了爪的肿胀。施用偶联的地塞米松使总临床评分和爪肿胀显著减少，表明偶联形式比非偶联形式更加有效。在0.01mg/kg剂量水平，没有观察到地塞米松或地塞米松偶联物对胸腺重量的影响，而较高剂量的地塞米松降低了胸腺重量。综上，此初步研究显示由0.01mg/kg剂量水平的地塞米松治疗的大鼠CIA模型中临床症状抑制最小，且在相同剂量水平下，地塞米松偶联物在抑制关节炎临床症状中显著更加有效。
目标
设计该研究以测定提高静脉施用的地塞米松剂量对发生实验性关节炎的影响。此研究的目的是为了测定对关节炎抑制作用最小或无抑制作用的地塞米松剂量，以能够在主要研究中以相同剂量水平显示地塞米松偶联物优越性。在此研究中，包括使用地塞米松偶联物治疗的组，以获得此偶联物与地塞米松相比在抑制关节炎方面的功效。
出于此目的，使用了Lewis大鼠胶原诱导关节炎(CIA)模型。Lewis大鼠对于皮内注射牛II型胶原的关节炎诱导高度敏感。CIA的主要病理特征包括炎性细胞对关节的浸润、软骨退化、骨组织侵蚀和纤维化。这些病理特征导致的临床症状包括爪负载减少和爪增厚。
研究设计
在三个剂量(0.01mg/kg，0.1mg/kg和1mg/kg)下检测地塞米松对大鼠CIA模型中发生的关节炎的影响。在第10(发病日)、13、16和19天，经静脉施用地塞米松。使用与地塞米松相同的治疗方案，检测0.01mg/kg的按实施例5中所述制备的地塞米松偶联物。将使用赋形剂(PBS/2.5％EtOH)的治疗作为阴性对照。在免疫21天后处死大鼠。
研究分组
结果参数
●个体体重(每周6次)
●临床关节炎评分(每周6次)
●后爪肿胀(每周5次)
●发病率
●发病日
●处死时的脾、胸腺和肝重量。
样品贮存
●免疫前的血清收集(第-4天)
●处死时的血清收集
●贮存后爪以用于组织学分析
材料和方法
试剂
●不完全弗氏佐剂，Chondrex，批号080292
●牛II型胶原，Chondrex，批号080280
测试化合物：
●地塞米松，Sigma，批号078H1176
●磷酸盐缓冲溶液(PBS)，Braun，批号8344A162
●乙醇，Merck，批号K37694210732
●地塞米松偶联物，由Cytoguide ApS提供的作为0.01mg/ml PBS/2.5％EtOH的即用溶液。将小瓶(包含1.25ml的化合物溶液)贮存在-20℃，备用。
地塞米松偶联物的制备如后附实施例中所述。
将地塞米松和地塞米松偶联物溶于PBS/2.5％EtOH以用于静脉注射。地塞米松每周一次新鲜制备。使用以下方案对大鼠以1ml/kg给药：
126-175克体重：150μl给药体积
176-225克体重：200μl给药体积
225-275克体重：250ul给药体积
动物
7周龄的雌性Lewis大鼠购自Charles River laboratories，体重波动范围最大至10％。将动物在21±3℃，相对湿度55±15％和光/暗周期12小时的常规清洁条件下圈养。大鼠自由进食啮齿饲料(SSNIFF，Bio-Services，The Netherlands)。在试验开始前，饲养大鼠2周。大鼠成对圈养。通过在其尾部标记鉴别动物个体。
关节炎的诱导
使用两步免疫方案，在9周龄的雌性Lewis大鼠中诱导胶原性关节炎。在第0天，通过背部多个位点皮内注射1mg/ml在不完全弗氏佐剂中乳化的牛II型胶原免疫所有的大鼠。在第7天，通过使用于IFA中的100Sg牛II型胶原在背和尾基部(tail-base)皮内强化注射来加速发生关节炎。为了进行免疫和皮内强化注射，通过吸入于氧和N2O的混合物中的3-4％异氟烷麻醉大鼠。
参数读取
体重
测量每只大鼠个体的体重，每周6次(周末期间测量一次)。
发病率
发病率被定义为组内具有大于0的临床关节炎评分的大鼠的百分比。
临床关节炎评分
每周6次(周末期间评估一次)，使用0-4的宏观评分系统评估大鼠每只爪的关节炎严重性，详细如下：
0＝无关节炎症状
0.5＝爪无负载和/或踝关节略发红
1＝踝关节发红和轻微肿胀
2＝爪发红且肿胀
3＝包括足趾在内的整个爪严重发红且肿胀
4＝爪极大肿胀，常涉及多个关节并延展至膝关节
大鼠个体的总临床评分被定义为每天所有四爪的临床评分之和。在研究结束时，计算每只大鼠的累积关节炎评分。此累积关节炎评分被定义为从第0天至第21天获得的总临床评分之和。
发病日
发病日被定义为观察到大于0的总关节炎评分的连续三天中的第一天。
后爪肿胀
在周末期间，采用激光扫描测微计(Mitutoyo，LSM-503S/6200)测量后爪的肿胀。在研究结束时，如下计算每只大鼠的累积爪肿胀：通过无可见的关节炎症状的第0-9天的平均爪厚度值确定基线值。随后，通过从第10-21天获得的爪厚度值减去基线值计算爪厚度(Δ值)。此累积爪肿胀被定义为从第10天至第21天获得的Δ爪厚度值之和。
器官重量
在处死时分离脾、胸腺和肝脏并称重。将所述重量对体重进行标准化。
样品贮存
在免疫前(第-4天)通过尾静脉穿刺收集血清(±100μl)，并在处死时通过心脏穿刺收集血清(±500μl)，贮存在-80℃。在处死时收集后爪，并在4％福尔马林中固定以用于日后的组织学分析。
与方案的偏差
如研究方案中所述，在第-4天而非第0天收集基线血清样品。可在第0天在将大鼠在麻醉下免疫时进行血清收集。然而，麻醉可能干扰血清的待测参数，因此，决定在第-4天收集基线血清样品。
在治疗的第1天(总第10天)，0.01mg/kg地塞米松偶联物组中的#4号大鼠仅接受了180μl而非200μl化合物。
地塞米松偶联的mAb的制备
如文献所述(Melgert)，对抗人CD163小鼠mAb Mac2-48和Mac 2-158进行偶联，本发明人发现，根据Biacore鉴定，在添加至触珠蛋白时，将活化地塞米松的溶剂从DMSO换成乙醇显著提高了对CD163的亲和力。检测了mAb和活化地塞米松之间不同的比例，以及用于保存CD163亲和力且避免凝集的最佳终比例为3-5地塞米松/mAb。
大鼠胶原诱导性关节炎模型(TNO)中的地塞米松剂量研究
通过皮内注射在不完全弗氏佐剂(IFA)中乳化的约1mg牛II型胶原(Chondrex)，在雌性Lewis大鼠(9周龄)中诱导出胶原诱导性关节炎(CIA)。在异氟烷麻醉下(第0天)，在背部的多个位点免疫大鼠，并在第7天使用100μg于IFA中的牛II型胶原在背部和尾基部进行皮内强化注射。每周6次，对大鼠的关节炎临床症状评分。通过个体关节的肿胀、前后爪中受累关节的数量测定CAI的临床严重性。每只爪的评分为1-4分，因此，包括四只爪的最大临床评分为16分。
将总计20只大鼠分成5个处理组(每组4只大鼠)。对三组经静脉内注射地塞米松(1.0mg/kg，0.1mg/kg或0.01mg/kg)，一组注射ED2-地塞米松(0.01mg/kg)，且一组注射赋形剂。在发病(第一只动物显示关节炎症状的日期)时开始CIA治疗，每三天重复，总计处理4次。在处理过程中监控踝大小和体重的变化。在第21天，处死所有动物，将关节组织、脾、肝和胸腺切出。
结果
序言
数据展示
结果参数的展示如下：
●将临床数据显示为在两个单独的图中的时间依赖性结果参数的线形图。在左图中，显示了赋形剂组和地塞米松组的数据。在右图中，显示了赋形剂组、0.01mg/kg地塞米松组和地塞米松偶联物组的数据。图47、49、50、52和54中显示了体重、发病率、总临床关节炎评分和爪厚度的变化。图示显示了组平均值。
●非时间依赖性结果参数以条形图显示。图48、51、53、55和56中显示了累积关节炎评分、发病日、累积爪肿胀和器官重量。组数据显示为平均值±标准差(SD)。
统计分析
使用Windows的统计软件程序SPSS 14.0(SPSS Inc.Chicago，USA)进行所有的统计分析。在周末期间，测定体重和关节炎评分一次。对于这些遗漏的数据点，使用各时间点的前一天和当天的平均值。
进行如下的基本统计分析：
●使用Kruskall Wallis H(KW)检验并之后使用Mann-Whitney U事后检验检测治疗组之间的非时间依赖性结果参数差异显著性，以评估各治疗组和对照(赋形剂)组之间的差异显著性。
●p值的解释：
p≤0.05表示统计学差异显著
p＞0.05认为无显著性
试验模型：赋形剂处理大鼠的表征
在适当的CIA模型中，赋形剂处理组必然显示出随时间提高的总临床评分以及高发病率(即，赋形剂处理的大鼠必然发生关节炎)。通过以下观察结果显示了本研究满足了这些标准：
●在因动物生长而导致体重初始增加后，从第10天起体重轻度降低，这对于发生关节炎的大鼠是预期之内的(图47)。在第10天观察到关节炎的初始临床症状，这与历史数据一致。发病的平均日为10.3±0.5天(平均值±SD，图48)。
●在第一只大鼠显示关节炎临床特征的一天之内，赋形剂组中的所有大鼠均发生关节炎。在整个研究中，此组中的发病率保持100％(图49)。
●在研究结束时，总临床评分稳定增加至6.3a.u.的数值(第21日，图50)。理论上，可达到每只大鼠16a.u.的最高评分，但在此CIA模型的时期内前爪几乎不受影响。平均累积关节炎评分达到51.6±14.9a.u.的数值(平均值±SD，图51)。
●通过后爪肿胀反映关节炎的发展。后爪的肿胀始于第10天左右，在第15天达到最大(图52和54)。
●赋形剂组中的脾、胸腺和肝重量的平均值分别为2.31±0.13、2.28±0.40、43.62±2.60mg/g体重。
剂量逐渐增加的地塞米松处理的影响。
在此研究中，以每三天一次的频率静脉施用地塞米松，以剂量依赖的形式抑制了关节炎的临床症状。这基于以下观察结果：
●对于赋形剂组，自使用治疗处理方案以后，也在第10天观察到关节炎的第一临床症状。然而，在0.1mg/kg和1mg/kg地塞米松组中，通过连续三天的关节炎定义的明确发病日显著延迟(分别为13.8±1.0天，p＝0.017；和18.3±2.1天，p＝0.017，图48)。
●在0.01mg/kg和0.1mg/kg地塞米松组中达到了100％的发病率，但与赋形剂组相比，在研究的较后阶段。1mg/kg地塞米松组从未达到100％发病率(图49)。
●在整个研究中，通过总临床评分判断的关节炎严重性在所有地塞米松组中都得到抑制(图50)。累积关节炎评分分别比赋形剂组降低39％、69％和91％。在0.1mg/kg和1mg/kg地塞米松组中观察到累积关节炎评分的显著差异(两组均为p＝0.021，图51)。
●地塞米松组中的后爪厚度在整个研究期间减少(图52和54)，并且在0.1mg/kg和1mg/kg地塞米松组中观察到后爪肿胀的显著差异(对于该两组，左爪分别为p＝0.021和0.021；右爪分别为p＝0.043和0.043，图53和55)。
其他观察结果：
●在地塞米松治疗开始后，大鼠的体重逐渐下降(图47)，这与关节炎的发生无关。在大鼠关节炎研究中始终观察到地塞米松治疗的这种作用，并且其是由于皮质类固醇治疗而非发生的关节炎造成的。体重下降与地塞米松剂量提高之间的关系可见于图47中。
●与赋形剂组相比，没有观察到地塞米松组中的脾和肝重量的显著差异(图56)。另一方面，0.1mg/kg和1mg/kg地塞米松组中的胸腺重量显著下降(分别为p＝0.043和p＝0.021)。
使用0.01mg/kg地塞米松偶联物处理的影响。
在相同的剂量水平下，以每三天一次的频率静脉施用0.01mg/kg地塞米松偶联物比地塞米松更有效地抑制了关节炎的临床症状。这基于以下观察结果：
●自使用治疗处理方案起，在第10天观察到关节炎的第一临床症状，这与赋形剂组相当。然而，在地塞米松偶联物组中，通过连续三天的关节炎定义的明确发病日显著延迟(13.8±3.0天；p＝0.025，图48)。此延迟与0.1mg/kg地塞米松组类似。
●达到了100％的发病率，但与赋形剂组相比，在研究明显较后的阶段(第18天)(图49)。与此相比，0.01mg/kg地塞米松组在第14天已达到100％发病率。
●0.01mg/kg地塞米松偶联物组中的总临床评分大大降低。结果，累积关节炎评分与赋形剂组相比显著降低(p＝0.021)。在相同的剂量水平，地塞米松偶联物对关节炎严重性的抑制优于地塞米松(p＝0.021，图50和51)。0.01mg/kg地塞米松偶联物对累积评分的作用介于0.1mg/kg和1mg/kg地塞米松组的作用之间(图51)。
●0.01mg/kg地塞米松偶联物组中的后爪厚度在整个研究中下降(图52和54)。后爪肿胀比赋形剂组显著降低(p＝0.021(左)和p＝0.043(右)，图53和55)。没有观察到地塞米松偶联物组和不同地塞米松剂量组之间的显著差异。
其他观察结果：
●0.01mg/kg地塞米松偶联物组的体重在处理开始后保持基本相同，这不同于显示一定程度的体重下降的0.01mg/kg地塞米松组(图47)。
●与赋形剂组相比，或与0.01mg/kg地塞米松组相比，没有观察到地塞米松偶联物组中脾、胸腺和肝重量的显著差异(图56)。
在第10天，开始进行地塞米松或ED2-地塞米松的静脉注射治疗。此时，每个治疗组中至少有一只动物显示了关节炎的临床症状。与注射赋形剂的对照组相比，使用地塞米松和ED2-地塞米松处理的大鼠显示了推迟的发病日(图48和49)。
疾病严重性(总临床关节炎评分和累积关节炎评分)与游离地塞米松剂量相关(图50和51)。有趣的是，0.01mg/kg ED2-地塞米松的抑制作用高于0.01mg/kg游离地塞米松的作用(p＝0.004)，与更高剂量的游离地塞米松的作用没有统计学差异。
综上，这些数据显示了剂量远低于游离地塞米松的ED2-地塞米松延迟并抑制了大鼠CIA模型中的严重关节炎。
在第21天，在ED2-地塞米松处理组中的大鼠的平均体重高于赋形剂组和地塞米松处理组(数据未显示)。ED2-地塞米松组中的胸腺重量与对照组中的胸腺重量类似(图56)，而在使用显示了与ED2-地塞米松相当作用的游离地塞米松剂量(0.1mg/kg)处理的大鼠中的胸腺重量显著较低(p＝0.005)。
因此，在小鼠CIA模型中全身施用时，可见ED2-地塞米松选择性靶向巨噬细胞需要较低的地塞米松治疗剂量，还可见使用游离地塞米松所见的不良副作用降低，所述不良副作用包括对胸腺的抑制以及生长迟缓。
讨论
在目前的大鼠胶原诱导性关节炎研究中，所有赋形剂处理的大鼠均发生关节炎，表明成功的关节炎诱导。自发病日开始，每三天经静脉施用提高剂量的地塞米松以测定最低有效剂量，以用于日后与地塞米松偶联物(预期此化合物由于靶向巨噬细胞而更优越)的比较。在0.01mg/kg地塞米松的剂量水平，观察到关节炎临床症状(临床评分和爪肿胀)的抑制。在较高的剂量水平，地塞米松较大程度地降低了疾病严重性，且总临床评分显示了地塞米松剂量和关节炎抑制之间的剂量依赖性关系。此外，在此研究中包括使用0.01mg/kg剂量水平地塞米松偶联物治疗的一个组。证明了此化合物比未偶联的地塞米松功效提高。在相同的剂量水平，累积关节炎评分被抑制了83％，与此相比地塞米松为39％。还观察到爪肿胀减少，但此作用并不显著。在整体上，使用浓度为地塞米松的1/100-1/10的地塞米松偶联物可获得对发生的关节炎的相同作用。在0.01mg/kg地塞米松偶联物组中没有观察到，而在相同剂量水平的地塞米松组中则观察到对胸腺重量的显著影响。地塞米松浓度的增加导致胸腺重量减少，表明在相同的功效水平，偶联物对胸腺重量的影响较小。
综上，测定观察到关节炎临床症状的次最大抑制的地塞米松浓度。此外，此研究产生了关于地塞米松偶联物性能的有价值的信息，在相同的剂量水平，其比地塞米松显著更有效地抑制关节炎。
实施例12：示例性药物制剂
尽管可以单独进行本发明制剂的给药，但优选将其作为药物或药物制剂与一种或多种可接受的载体一起提供。载体必须是“可接受的”，表示其与本发明制剂相容且对受者无害。通常，载体为无菌且无致热原的水或盐水。
以下实施例说明了本发明的药物和药物组合物，其中活性成分为本发明的治疗剂。
优选地，本发明的治疗剂以5mg至1400mg(例如7mg至1400mg，或5mg至1000mg)、优选5mg至200mg的量提供。应理解，可制备包含5mg至1400mg、或7mg至1400mg或5mg至1000mg和优选5mg至200mg的所述治疗剂的以下示例性药物和药物组合物。
例如，药剂可以以下示例性药物和药物组合物中所示含量的1/10或1/100或1/200或1/500的量存在，且其他成分的含量相应地改变。
因此，例如，在适合时，本发明药物和药物组合物的片剂或胶囊剂可包含用于单次给药或者一次给药两份或更多的活性剂。
实施例A：片剂
通过湿法制粒，随后压缩，由前述成分制备片剂。
实施例B：眼用溶液
实施例C：片剂制剂
通过使用聚维酮溶液将所述成分湿法制粒，随后加入硬脂酸镁并压缩，来制备以下制剂A和B。
制剂A
制剂B
制剂C
通过直接压缩混合成分来制备以下制剂D和E。制剂E中所用的乳糖为直接压缩型。
制剂D
制剂E
制剂F(控释制剂)
通过使用聚维酮溶液将以下成分湿法制粒，随后加入硬脂酸镁并压缩，来制备该制剂。
药物释放发生在约6-8小时的时期内，且在12小时后完全释放。
实施例D：胶囊制剂
制剂A
该胶囊制剂通过将上述实施例C中制剂D的成分混合并灌装入两件式(two-part)硬明胶胶囊中来制备。制剂B(如下)以类似方式制备。
制剂B
制剂C
该胶囊如下制备：将聚乙二醇4000BP熔化，将活性成分分散入熔体中，并将所述熔体灌装入两件式硬明胶胶囊中。
该胶囊的制备如下：将活性成分分散入卵磷脂和花生油中，并将所述分散体灌装入软的弹性明胶胶囊中。
制剂E(控释胶囊)
以下控释胶囊制剂通过使用挤压机挤出成分a、b和c、随后将挤出物滚圆(spheronisation)并干燥来制备。随后，将干燥颗粒用控释膜(d)包衣，并灌装入两件式硬明胶胶囊中。
实施例E：注射制剂
活性成分 1mg
无菌，无致热原磷酸盐缓冲液(pH7.0)，至10ml
将活性成分溶解在大部分磷酸盐缓冲液(35-40℃)中，随后补足体积并通过无菌微孔滤器过滤至无菌10ml琥珀色玻璃瓶中(1类)，并用无菌封闭物(closure)和瓶盖(overseal)密封。
实施例F：肌内注射剂
将活性成分溶解在三缩四乙二醇(glycofurol)中。随后加入苯甲醇并溶解，加水至3ml。随后将混合物通过无菌微孔滤器过滤，并随后密封在无菌3ml玻璃瓶(1类)中。
实施例G：糖浆悬浮液
将苯甲酸钠溶解在部分纯净水中，并加入山梨醇溶液。加入活性成分并分散。在甘油中分散增稠剂(可分散纤维素)。将两个分散体混合，并用纯净水补至所需体积。根据需要，通过额外剪切悬浮液实现进一步的增稠。
实施例H：栓剂
*将活性成分作为粉末使用，其中至少90％的颗粒具有63μm或更小的直径。
在最高45℃的温度下，将1/5的Witepsol H15在蒸汽釜中熔化。将所述活性成分通过200μm筛来过筛，并使用安装有切割头的分散机(silverson)混合加入熔融基料中，直至实现充分分散。将混合物保持在45℃，加入剩余Witepsol H15至悬浮液并搅拌以确保均匀混合。将所有悬浮液通过250μm不锈钢筛，并在连续搅拌下使其冷却至40℃。在38℃至40℃的温度下，将2.02g混合物灌装入适合的塑料模具中。将栓剂冷却至室温。
实施例I：阴道栓剂
将以上成分直接混合，并通过将所得混合物直接压缩来制备阴道栓剂。
序列表
<110> 赛托盖德公司和史蒂芬·爱德华·史密斯
<120> 治疗剂、用途和方法
<130> CYTBA/P47325PC
<140> PCT/GB2010/001828
<141> 28/09/2010
<150> GB0917054.9
<151> 29/09/2009
<160> 123
<170> SeqWin99
<210> 1
<211> 82
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mac2-158 VH
<400> 1
Asp Val Ser Gly Gly Val Lys Ser Ser Ser Thr Cys Thr Val Thr Gly
1 5 10 15
Tyr Ser Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Arg Gly Asn Lys Trp Met
20 25 30
Gly Tyr Thr Tyr Ser Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Lys Ser Ser Thr Arg
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Asn Asn Ser Val Thr Thr Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
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Cys Val Ser Gly Thr Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gly Thr Thr Thr Val
65 70 75 80
Ser Ser
<210> 2
<211> 77
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mac2-158 VL
<400> 2
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Lys Ala Ser Ser Val Ser Ser Asp Val Ala Trp Lys Gly Ser Lys Tyr
20 25 30
Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Asp Arg Thr Gly Ser Gly Tyr
35 40 45
Gly Thr Asp Thr Thr Ser Ser Val Ala Asp Ala Val Tyr Cys Gly Asp
50 55 60
Tyr Thr Ser Arg Thr Gly Gly Gly Thr Lys Lys Arg Ala
65 70 75
<210> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mac2-48 VH
<400> 3
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Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
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Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
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Met Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Val Ser Gly Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
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Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mac2-48 VL
<400> 4
Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser His Asp
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Val Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Tyr Thr Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
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<210> 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性人源化mAb VH
<400> 5
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
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Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性人源化mAb VL
<400> 6
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asp
20 25 30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Leu Ile
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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gly Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Arg
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<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 7
Met Ser Lys Leu Arg Met Val Leu Leu Glu Asp Ser Gly Ser Ala Asp
1 5 10 15
Phe Arg Arg His Phe Val Asn Leu Ser Pro Phe Thr Ile Thr Val Val
20 25 30
Leu Leu Leu Ser Ala Cys Phe Val Thr Ser Ser Leu Gly Gly Thr Asp
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Glu Val Lys Val Gln Glu Glu Trp Gly Thr Val Cys Asn Asn Gly Trp
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Ser Met Glu Ala Val Ser Val Ile Cys Asn Gln Leu Gly Cys Pro Thr
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Asp Leu Ile Cys Asn Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asn Cys Lys His
225 230 235 240
Gln Gly Trp Gly Lys His Asn Cys Asp His Ala Glu Asp Ala Gly Val
245 250 255
Ile Cys Ser Lys Gly Ala Asp Leu Ser Leu Arg Leu Val Asp Gly Val
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Thr Ile Cys Asp Asp Gly Trp Asp Ser Tyr Asp Ala Ala Val Ala Cys
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Ala Ser Lys Gly Phe Gly His Ile Trp Leu Asp Ser Val Ser Cys Gln
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Gly His Glu Pro Ala Val Trp Gln Cys Lys His His Glu Trp Gly Lys
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Ile Pro Glu Glu Ser Ala Val Ala Cys Ile Glu Ser Gly Gln Leu Arg
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Glu Gly Ser Trp Gly Thr Ile Cys Asp Asp Ser Trp Asp Leu Ser Asp
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Ala His Val Val Cys Arg Gln Leu Gly Cys Gly Glu Ala Ile Asn Ala
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Glu Asn Leu Val His Gln Ile Gln Tyr Arg Glu Met Asn Ser Cys Leu
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agggaaatar cccttgacca g 21
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<213> 人工序列
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<223> VH leader 2引物
<400> 14
atgagagtgc tgattctttt g 21
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VHfor引物
<400> 15
gatgtccagc ttcaggag 18
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LeaderbackH引物
<400> 16
ctcctgaagc tggacatcag acagcaccca cctgg 35
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CHfor引物
<400> 17
gcagcgccag caccaag 17
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VHback引物
<400> 18
cttggtgctg gcgctgctga ctgtgagagc ggtgc 35
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lfor1引物
<400> 19
gccatggaca tgagagtgcc tg 22
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lback1引物
<400> 20
tcagcactcg cccctgttg 19
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hfor1引物
<400> 21
gccatgaagc acctgtggtt c 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hback1引物
<400> 22
tcacttgccc aggctcaggc 20
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> K-N F引物
<400> 23
tcacctacag cggcagc 17
<210> 24
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> K-N FT引物
<400> 24
tggagtggat gggctacatc acctacagcg gcagc 35
<210> 25
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> K-N RT引物
<400> 25
tgtagcccat ccactccagc ttgttgccgg ggaac 35
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> K-N R引物
<400> 26
gcttgttgcc ggggaac 17
<210> 27
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SY-IN FT引物
<400> 27
gcggcatcac caactacaac cccagcctga ag 32
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SY-IN F引物
<400> 28
caaccccagc ctgaag 16
<210> 29
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SY-IN RT引物
<400> 29
tagttggtga tgccgctgta ggtgatgtag cc 32
<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SY-IN R引物
<400> 30
tgtaggtgat gtagcc 16
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V-R F引物
<400> 31
caagaaccag ttcagcctg 19
<210> 32
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V-R FT引物
<400> 32
tcagcgagga caccagcaag aaccagttca gc 32
<210> 33
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V-R RT引物
<400> 33
ctggtgtcct cgctgatggt caccctgctc tt 32
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V-R R引物
<400> 34
tggtcaccct gctcttcag 19
<210> 35
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Q-D F引物
<400> 35
gagtctggac caggacc 17
<210> 36
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Q-D R引物
<400> 36
gacagcaccc acctgg 16
<210> 37
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Q-D FT1引物
<400> 37
tgacgtgcag ctgcaggagt ctggaccagg ac 32
<210> 38
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Q-D RT1引物
<400> 38
ctgcagctgc acgtcagaca gcacccacct gg 32
<210> 39
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P-L FT引物
<400> 39
ggcaagagcc ccaagctcct gatctactat gccagc 36
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P-L F引物
<400> 40
ctgatctact atgccagc 18
<210> 41
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P-L RT引物
<400> 41
gagcttgggg ctcttgccgg gcttctgctg gaacc 35
<210> 42
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P-L R引物
<400> 42
gggcttctgc tggaacc 17
<210> 43
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GT-QS FT引物
<400> 43
ccagcaggac tactccagcc ctaggacctt cggtg 35
<210> 44
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GT-QS F引物
<400> 44
ccctaggacc ttcggtg 17
<210> 45
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GT-QS RT引物
<400> 45
ctggagtagt cctgctggca gaagtacacg gcgaag 36
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GT-QS R引物
<400> 46
cagaagtaca cggcgaag 18
<210> 47
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLQ-NRY for引物
<400> 47
gatctactat gccagcaacc ggtactctgg agtgcccagc 40
<210> 48
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLQ-NRY back引物
<400> 48
gctgggcact ccagagtacc ggttgctggc atagtagatc 40
<210> 49
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CMV for引物
<400> 49
caaatgggcg gtaggcgtg 19
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TKPA rev引物
<400> 50
ccttccgtgt ttcagttagc 20
<210> 51
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EMCV ires rev引物
<400> 51
ccttattcca agcggcttc 19
<210> 52
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体轻链
<400> 52
atggacatga gagtgcctgc tcagctgctg ggactgctgc tgctgtggct gcctggagct 60
aggtgtgaca tcgtgatgac acagtctccc agcagcctga gcgcctctgt gggcgacagg 120
gtgaccatca cctgcagggc tagccagagc gtgagcagcg acgtggcctg gttccagcag 180
aagcccggca agagccccaa gcccctgatc tactatgcca gcagcctgca gtctggagtg 240
cccagcaggt tcagcggcag cggcagcgga acagacttca ccctgaccat cagcagcctg 300
caggccgagg acttcgccgt gtacttctgc ggccaggact acaccagccc taggaccttc 360
ggtggcggaa ccaagctgga gatcaagagg accgtggccg cccccagcgt gttcatcttc 420
cctccaagcg acgagcagct gaagagcggc accgccagcg tggtgtgcct gctgaacaac 480
ttctacccca gggaggccaa ggtgcagtgg aaggtggaca acgccctgca gagcggcaac 540
agccaggaga gcgtgaccga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct gagcagcacc 600
ctgaccctga gcaaggccga ctacgagaag cacaaggtgt acgcctgcga ggtgacccac 660
cagggcctga gcagccccgt gaccaagagc ttcaacaggg gcgagtgc 708
<210> 53
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体轻链
<400> 53
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Ser Val Ser Ser Asp Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gly Gln
100 105 110
Asp Tyr Thr Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 54
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体重链
<400> 54
atgaagcacc tgtggttctt cctgctgctg gtggctgccc ccaggtgggt gctgtctcag 60
gtgcagctgc aggagtctgg accaggactg gtgaagccat ctgagaccct gagcctgacc 120
tgcaccgtga gcggctacag catcaccagc gactacgcct ggaactggat caggcagttc 180
cccggcaaga agctggagtg gatgggcagc atctactaca gcggcagcac ctactacaac 240
cccagcctga agagcagggt gaccatcagc gtggacacca gcaagaacca gttcagcctg 300
aagctgagca gcgtgaccgc cgccgacacc gccacctact actgcgtgag cggcacctac 360
tacttcgact actggggcca gggcaccacc ctgaccgtga gcagcgccag caccaaggga 420
ccaagcgtgt tcccactggc tccatgcagc aggagcacca gcgagagcac agccgccctg 480
ggatgcctgg tgaaggacta cttccctgag cctgtgaccg tgagctggaa ttctggcgcc 540
ctgaccagcg gagtgcacac cttcccagcc gtgctgcaga gctctggact gtacagcctg 600
agcagcgtgg tgaccgtgcc ttcttccagc ctgggcacca agacctacac ctgcaacgtg 660
gaccacaagc ccagcaacac caaggtggac aagagggtgg agtctaagta tggacctcca 720
tgcccaagct gtcctgctcc tgagttcctg ggcggcccaa gcgtgttcct gttccctcca 780
aagccaaagg acaccctgat gatcagcagg acccctgagg tgacctgcgt ggtggtggac 840
gtgagccagg aggaccccga ggtgcagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac 900
aacgccaaga ccaagcccag ggaggagcag ttcaacagca cctacagggt ggtgagcgtg 960
ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac 1020
aagggcctgc ccagcagcat cgagaagacc atcagcaagg ccaagggcca gcccagggag 1080
ccccaggtgt acaccctgcc tccaagccag gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg 1140
acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc 1200
cagcccgaga acaactacaa gaccacccct ccagtgctgg acagcgacgg cagcttcttc 1260
ctgtacagca ggctgaccgt ggacaagagc aggtggcagg agggcaacgt gttcagctgc 1320
agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agagcctgag cctgagcctg 1380
ggcaag 1386
<210> 55
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体重链
<400> 55
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile
35 40 45
Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Lys
50 55 60
Leu Glu Trp Met Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn
65 70 75 80
Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn
85 90 95
Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr
100 105 110
Tyr Tyr Cys Val Ser Gly Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
130 135 140
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
145 150 155 160
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
165 170 175
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
180 185 190
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
195 200 205
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
210 215 220
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
225 230 235 240
Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
245 250 255
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
260 265 270
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
275 280 285
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
290 295 300
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
305 310 315 320
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
325 330 335
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
340 345 350
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
355 360 365
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
370 375 380
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
385 390 395 400
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
405 410 415
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
420 425 430
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
435 440 445
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
450 455 460
<210> 56
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv序列
<400> 56
Met Asp Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
1 5 10 15
Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
20 25 30
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu
35 40 45
Glu Trp Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
65 70 75 80
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Ser Gly Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
130 135 140
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
145 150 155 160
Ser Val Ser Ser Asp Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser
165 170 175
Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro
180 185 190
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
195 200 205
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gly Gln Asp
210 215 220
Tyr Thr Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230 235 240
Arg Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
245 250
<210> 57
<211> 761
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv序列
<400> 57
ccatggacca ggtgcagctg caggaaagcg gcccgggcct ggtgaaaccg agcgaaaccc 60
tgagcctgac ctgcaccgtg agcggctata gcattaccag cgattatgcg tggaactgga 120
ttcgtcagtt tccgggcaac aaactggaat ggatgggcta cattacttat agcggcagca 180
cctattataa cccgagcctg aaaagccgtg tgaccattag cgtggatacc agcaaaaacc 240
agtttagcct gaaactgagc agcgtgaccg cggcggatac cgcgacctat tattgcgtga 300
gcggcaccta ttattttgat tattggggcc agggtaccac cctgaccgtg tctagcggtg 360
ggggcggaag cgggggcggt ggaagcgggg gcggtggatc tgatattgtg atgacccaga 420
gcccgagcag cctgagcgcg agcgtgggcg atcgtgtgac cattacctgc cgtgcgagcc 480
agagcgtgag cagcgatgtg gcgtggtttc agcagaaacc gggcaaaagc ccgaaaccgc 540
tgatttatta tgcgagcaac cggtatagcg gtgtgccgag ccgttttagc ggtagcggta 600
gcggtaccga ttttaccctg accattagca gcctgcaggc ggaagatttt gcggtgtatt 660
tttgcggcca ggattatacc agcccgcgta cctttggtgg cggaaccaaa ctggaaatta 720
aacgtgaaca gaaactgatt agcgaagaag atctgctcga g 761
<210> 58
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab P stop引物
<400> 58
acaagagggt ggagtctaag tatggatagc catgcccaag ctg 43
<210> 59
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab P stop anti引物
<400> 59
cagcttgggc atggctatcc atacttagac tccaccctct tgt 43
<210> 60
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 诱变后的纯化质粒序列
<400> 60
caggtgcagc tgcaggagtc tggaccagga ctggtgaagc catctgagac cctgagcctg 60
acctgcaccg tgagcggcta cagcatcacc agcgactacg cctggaactg gatcaggcag 120
ttccccggca acaagctgga gtggatgggc tacatcacct acagcggcag cacctactac 180
aaccccagcc tgaagagcag ggtgaccatc agcgtggaca ccagcaagaa ccagttcagc 240
ctgaagctga gcagcgtgac cgccgccgac accgccacct actactgcgt gagcggcacc 300
tactacttcg actactgggg ccagggcacc accctgaccg tgagcagcgc cagcaccaag 360
ggaccaagcg tgttcccact ggctccatgc agcaggagca ccagcgagag cacagccgcc 420
ctgggatgcc tggtgaagga ctacttccct gagcctgtga ccgtgagctg gaattctggc 480
gccctgacca gcggagtgca caccttccca gccgtgctgc agagctctgg actgtacagc 540
ctgagcagcg tggtgaccgt gccttcttcc agcctgggca ccaagaccta cacctgcaac 600
gtggaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaggg tggagtctaa gtatggatag 660
<210> 61
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 对应于诱变后的纯化质粒的蛋白序列
<400> 61
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ser Gly Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3b引物
<400> 62
aggtsmaact gcagsagtcw gg 22
<210> 63
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4引物
<400> 63
ccaggggcca gtggatagac aagcttgggt gtcgtttt 38
<210> 64
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经测序的VH区
<400> 64
caggtcaaac tgcaggagtc tggtggagga ttggtgcagc ctaaggagtc tttgaaaatc 60
tcatgtgcag cctctggatt caccttcagt actgctgcca tgtactgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg gtctggattg ggttgctcgc ataagaacta aacctgataa ttatgcaaca 180
tattaccctg cttcagtgaa aggcagattc accatctcca gagatgattc aaagggcatg 240
gtctacctac aaatggataa cttaaagact gaggacacag ccatttatta ctgtacagca 300
gcttattact atgatggccg ctttgattac tggggccaag gagtcatggt cacagtcgcc 360
tcagctgaaa cgacacccaa gcttgtctat ccactggccc ctggaaaaca ctcg 414
<210> 65
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经测序的VL区
<400> 65
gacattgtga tgacccagac tccatcctcc caggctgtgt cagcagggga gagggtcact 60
atgaggtgca agtccagtca gagtctttta tacagtgaaa acaaaaagaa ctacttggcc 120
tggtaccaac agaaaccagg gcagtctcct aaactgttga tttcctgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactctgacc 240
atcagcagtg tgcaggcaga agacctggct gtttattact gtgaccagta ttatgatcct 300
ccattcacgt tcggctcagg gacgaagttg gaaataaaac gggctgatgc tgcaccaact 360
gtatcc 366
<210> 66
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经测序的VH区
<400> 66
Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Thr Lys Pro Asp Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Pro Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Gly Met
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Ala Ala Tyr Tyr Tyr Asp Gly Arg Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Val Met Val Thr Val Ala Ser Ala Glu Thr Thr Pro Lys Leu
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Lys His Ser
130 135
<210> 67
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经测序的VL区
<400> 67
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Gln Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Arg Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Glu Asn Lys Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Asp Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Pro Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
115 120
<210> 68
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LKI FT引物
<400> 68
attgaaaatc cacgagaagt ggggaacggt gtgtaataat g 41
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LKI F引物
<400> 69
gtggggaacg gtgtgtaata atg 23
<210> 70
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LKI RT引物
<400> 70
ttctcgtgga ttttcaattc cactctcccg ctacac 36
<210> 71
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LKI R引物
<400> 71
tccactctcc cgctacac 18
<210> 72
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R60D FT引物
<400> 72
gttctggaga catttggatg gatcatgttt cttgtcgtg 39
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R60D F引物
<400> 73
tggatcatgt ttcttgtcgt g 21
<210> 74
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R60D RT引物
<400> 74
tccaaatgtc tccagaacct gcactggaat tagcccatc 39
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R60D R引物
<400> 75
ctgcactgga attagcccat c 21
<210> 76
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VKVQEE-LKIHEK突变体
<400> 76
atgagcaaac tcagaatggt gctacttgaa gactctggat ctgctgactt cagaagacat 60
tttgtcaacc tgagtccctt caccattact gtggtcttac ttctcagtgc ctgttttgtc 120
accagttctc ttggaggaac agacaaggag ctgaggctag tggatggtga aaacaagtgt 180
agcgggagag tggaattgaa aatccacgag aagtggggaa cggtgtgtaa taatggctgg 240
agcatggaag cggtctctgt gatttgtaac cagctgggat gtccaactgc tatcaaagcc 300
cctggatggg ctaattccag tgcaggttct ggacgcattt ggatggatca tgtttcttgt 360
cgtgggaatg agtcagctct ttgggattgc aaacatgatg gatggggaaa gcatagtaac 420
tgtactcacc aacaagatgc tggagtgacc tgctcagatg gatccaattt ggaaatgagg 480
ctgacgcgtg gagggaatat gtgttctgga agaatagaga tcaaattcca aggacggtgg 540
ggaacagtgt gtgatgataa cttcaacata gatcatgcat ctgtcatttg tagacaactt 600
gaatgtggaa gtgctgtcag tttctctggt tcatctaatt ttggagaagg ctctggacca 660
atctggtttg atgatcttat atgcaacgga aatgagtcag ctctctggaa ctgcaaacat 720
caaggatggg gaaagcataa ctgtgatcat gctgaggatg ctggagtgat ttgctcaaag 780
ggagcagatc tgagcctgag actggtagat ggagtcactg aatgttca 828
<210> 77
<211> 663
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R60D突变体
<400> 77
atgagcaaac tcagaatggt gctacttgaa gactctggat ctgctgactt cagaagacat 60
tttgtcaacc tgagtccctt caccattact gtggtcttac ttctcagtgc ctgttttgtc 120
accagttctc ttggaggaac agacaaggag ctgaggctag tggatggtga aaacaagtgt 180
agcgggagag tggaagtgaa agtccaggag gagtggggaa cggtgtgtaa taatggctgg 240
agcatggaag cggtctctgt gatttgtaac cagctgggat gtccaactgc tatcaaagcc 300
cctggatggg ctaattccag tgcaggttct ggagacattt ggatggatca tgtttcttgt 360
cgtgggaatg agtcagctct ttgggattgc aaacatgatg gatggggaaa gcatagtaac 420
tgtactcacc aacaagatgc tggagtgacc tgctcagatg gatccaattt ggaaatgagg 480
ctgacgcgtg gagggaatat gtgttctgga agaatagaga tcaaattcca aggacggtgg 540
ggaacagtgt gtgatgataa cttcaacata gatcatgcat ctgtcatttg tagacaactt 600
gaatgtggaa gtgctgtcag tttctctggt tcatctaatt ttggagaagg ctctggacca 660
atc 663
<210> 78
<211> 627
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 双突变体
<400> 78
atgagcaaac tcagaatggt gctacttgaa gactctggat ctgctgactt cagaagacat 60
tttgtcaacc tgagtccctt caccattact gtggtcttac ttctcagtgc ctgttttgtc 120
accagttctc ttggaggaac agacaaggag ctgaggctag tggatggtga aaacaagtgt 180
agcgggagag tggaattgaa aatccacgag aagtggggaa cggtgtgtaa taatggctgg 240
agcatggaag cggtctctgt gatttgtaac cagctgggat gtccaactgc tatcaaagcc 300
cctggatggg ctaattccag tgcaggttct ggagacattt ggatggatca tgtttcttgt 360
cgtgggaatg agtcagctct ttgggattgc aaacatgatg gatggggaaa gcatagtaac 420
tgtactcacc aacaagatgc tggagtgacc tgctcagatg gatccaattt ggaaatgagg 480
ctgacgcgtg gagggaatat gtgttctgga agaatagaga tcaaattcca aggacggtgg 540
ggaacagtgt gtgatgataa cttcaacata gatcatgcat ctgtcatttg tagacaactt 600
gaatgtggaa gtgctgtcag tttctct 627
<210> 79
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VKVQEE-LKIHEK突变体
<400> 79
Met Ser Lys Leu Arg Met Val Leu Leu Glu Asp Ser Gly Ser Ala Asp
1 5 10 15
Phe Arg Arg His Phe Val Asn Leu Ser Pro Phe Thr Ile Thr Val Val
20 25 30
Leu Leu Leu Ser Ala Cys Phe Val Thr Ser Ser Leu Gly Gly Thr Asp
35 40 45
Lys Glu Leu Arg Leu Val Asp Gly Glu Asn Lys Cys Ser Gly Arg Val
50 55 60
Glu Leu Lys Ile His Glu Lys Trp Gly Thr Val Cys Asn Asn Gly Trp
65 70 75 80
Ser Met Glu Ala Val Ser Val Ile Cys Asn Gln Leu Gly Cys Pro Thr
85 90 95
Ala Ile Lys Ala Pro Gly Trp Ala Asn Ser Ser Ala Gly Ser Gly Arg
100 105 110
Ile Trp Met Asp His Val Ser Cys Arg Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp
115 120 125
Asp Cys Lys His Asp Gly Trp Gly Lys His Ser Asn Cys Thr His Gln
130 135 140
Gln Asp Ala Gly Val Thr Cys Ser Asp Gly Ser Asn Leu Glu Met Arg
145 150 155 160
Leu Thr Arg Gly Gly Asn Met Cys Ser Gly Arg Ile Glu Ile Lys Phe
165 170 175
Gln Gly Arg Trp Gly Thr Val Cys Asp Asp Asn Phe Asn Ile Asp His
180 185 190
Ala Ser Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Cys Gly Ser Ala Val Ser Phe
195 200 205
Ser Gly Ser Ser Asn Phe Gly Glu Gly Ser Gly Pro Ile Trp Phe Asp
210 215 220
Asp Leu Ile Cys Asn Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asn Cys Lys His
225 230 235 240
Gln Gly Trp Gly Lys His Asn Cys Asp His Ala Glu Asp Ala Gly Val
245 250 255
Ile Cys Ser Lys Gly Ala Asp Leu Ser Leu Arg Leu Val Asp Gly Val
260 265 270
Thr Glu Cys Ser
275
<210> 80
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R60D突变体
<400> 80
Met Ser Lys Leu Arg Met Val Leu Leu Glu Asp Ser Gly Ser Ala Asp
1 5 10 15
Phe Arg Arg His Phe Val Asn Leu Ser Pro Phe Thr Ile Thr Val Val
20 25 30
Leu Leu Leu Ser Ala Cys Phe Val Thr Ser Ser Leu Gly Gly Thr Asp
35 40 45
Lys Glu Leu Arg Leu Val Asp Gly Glu Asn Lys Cys Ser Gly Arg Val
50 55 60
Glu Val Lys Val Gln Glu Glu Trp Gly Thr Val Cys Asn Asn Gly Trp
65 70 75 80
Ser Met Glu Ala Val Ser Val Ile Cys Asn Gln Leu Gly Cys Pro Thr
85 90 95
Ala Ile Lys Ala Pro Gly Trp Ala Asn Ser Ser Ala Gly Ser Gly Asp
100 105 110
Ile Trp Met Asp His Val Ser Cys Arg Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp
115 120 125
Asp Cys Lys His Asp Gly Trp Gly Lys His Ser Asn Cys Thr His Gln
130 135 140
Gln Asp Ala Gly Val Thr Cys Ser Asp Gly Ser Asn Leu Glu Met Arg
145 150 155 160
Leu Thr Arg Gly Gly Asn Met Cys Ser Gly Arg Ile Glu Ile Lys Phe
165 170 175
Gln Gly Arg Trp Gly Thr Val Cys Asp Asp Asn Phe Asn Ile Asp His
180 185 190
Ala Ser Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Cys Gly Ser Ala Val Ser Phe
195 200 205
Ser Gly Ser Ser Asn Phe Gly Glu Gly Ser Gly Pro Ile
210 215 220
<210> 81
<211> 209
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 双突变体
<400> 81
Met Ser Lys Leu Arg Met Val Leu Leu Glu Asp Ser Gly Ser Ala Asp
1 5 10 15
Phe Arg Arg His Phe Val Asn Leu Ser Pro Phe Thr Ile Thr Val Val
20 25 30
Leu Leu Leu Ser Ala Cys Phe Val Thr Ser Ser Leu Gly Gly Thr Asp
35 40 45
Lys Glu Leu Arg Leu Val Asp Gly Glu Asn Lys Cys Ser Gly Arg Val
50 55 60
Glu Leu Lys Ile His Glu Lys Trp Gly Thr Val Cys Asn Asn Gly Trp
65 70 75 80
Ser Met Glu Ala Val Ser Val Ile Cys Asn Gln Leu Gly Cys Pro Thr
85 90 95
Ala Ile Lys Ala Pro Gly Trp Ala Asn Ser Ser Ala Gly Ser Gly Asp
100 105 110
Ile Trp Met Asp His Val Ser Cys Arg Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp
115 120 125
Asp Cys Lys His Asp Gly Trp Gly Lys His Ser Asn Cys Thr His Gln
130 135 140
Gln Asp Ala Gly Val Thr Cys Ser Asp Gly Ser Asn Leu Glu Met Arg
145 150 155 160
Leu Thr Arg Gly Gly Asn Met Cys Ser Gly Arg Ile Glu Ile Lys Phe
165 170 175
Gln Gly Arg Trp Gly Thr Val Cys Asp Asp Asn Phe Asn Ile Asp His
180 185 190
Ala Ser Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Cys Gly Ser Ala Val Ser Phe
195 200 205
Ser
<210> 82
<211> 1827
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 82
atgggtggac acagaatggt tcttcttgga ggtgctggat ctcctggttg taaaaggttt 60
gtccatctag gtttctttgt tgtggctgtg agctcacttc tcagtgcctc tgctgtcact 120
aacgctcctg gagaaatgaa gaaggaactg agactggcgg gtggtgaaaa caactgtagt 180
gggagagtgg aacttaagat ccatgacaag tggggcacag tgtgcagtaa cggctggagc 240
atgaatgaag tgtccgtggt ttgccagcag ctgggatgcc caacttctat taaagccctt 300
ggatgggcta actccagcgc cggctctgga tatatctgga tggacaaagt ttcttgtaca 360
gggaatgagt cagctctttg ggactgcaaa catgatgggt ggggaaagca taactgtacc 420
catgaaaaag atgctggagt gacctgctca gatggatcta atttggagat gagactggtg 480
aacagtgcgg gccaccgatg cttaggaaga gtagaaataa agttccaggg aaagtggggg 540
acggtgtgtg acgacaactt cagcaaagat cacgcttctg tgatttgtaa acagcttgga 600
tgtggaagtg ccattagttt ctctggctca gctaaattgg gagctggttc tggaccaatc 660
tggctcgatg acctggcatg caatggaaat gagtcagctc tctgggactg caaacaccgg 720
ggatggggca agcataactg tgaccatgct gaggatgtcg gtgtgatttg cttagaggga 780
gcagatctga gcctgagact agtggatgga gtgtccagat gttcaggaag attggaagtg 840
agattccaag gagaatgggg gaccgtgtgt gatgataact gggatctccg ggatgcttct 900
gtggtgtgca agcaactggg atgtccaact gccatcagtg ccattggtcg agttaatgcc 960
agtgagggat ctggacagat ttggcttgac aacatttcat gcgaaggaca tgaggcaact 1020
ctttgggagt gtaaacacca agagtgggga aagcattact gtcatcatag agaagacgct 1080
ggcgtgacat gttctgatgg agcagatctg gaacttagac ttgtaggtgg aggcagtcgc 1140
tgtgctggca ttgtggaggt ggagattcag aagctgactg ggaagatgtg tagccgaggc 1200
tggacactgg cagatgcgga tgtggtttgc agacagcttg gatgtggatc tgcgcttcaa 1260
acccaggcta agatctactc taaaactggg gcaacaaata cgtggctctt tcctggatct 1320
tgtaatggaa atgaaactac tttttggcaa tgcaaaaact ggcagtgggg cggcctttcc 1380
tgtgataatt tcgaagaagc caaagttacc tgctcaggcc acagggaacc cagactggtt 1440
ggaggagaaa tcccatgctc tggtcgtgtg gaagtgaaac acggagacgt gtggggctcc 1500
gtctgtgatt ttgacttgtc tctggaagct gccagtgtgg tgtgcaggga attacaatgt 1560
ggaacagtcg tctctatcct agggggagca cattttggag aaggaagtgg acagatctgg 1620
ggtgaagaat tccagtgtag tggggatgag tcccatcttt cactatgctc agtggcgccc 1680
ccgctagaca gaacttgtac ccacagcagg gatgtcagcg tagtctgctc aaatctagag 1740
ggcccgcggt tcgaaggtaa gcctatccct aaccctctcc tcggtctcga ttctacgcgt 1800
accggtcatc atcaccatca ccattga 1827
<210> 83
<211> 672
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠CD163 LKIHDK-VKVQEE Y60R突变体
<400> 83
atgggtggac acagaatggt tcttcttgga ggtgctggat ctcctggttg taaaaggttt 60
gtccatctag gtttctttgt tgtggctgtg agctcacttc tcagtgcctc tgctgtcact 120
aacgctcctg gagaaatgaa gaaggaactg agactggcgg gtggtgaaaa caactgtagt 180
gggagagtgg aagtgaaggt gcaggaggag tggggcacag tgtgcagtaa cggctggagc 240
atgaatgaag tgtccgtggt ttgccagcag ctgggatgcc caacttctat taaagccctt 300
ggatgggcta actccagcgc cggctctgga cggatctgga tggacaaagt ttcttgtaca 360
gggaatgagt cagctctttg ggactgcaaa catgatgggt ggggaaagca taactgtacc 420
catgaaaaag atgctggagt gacctgctca gatggatcta atttggagat gagactggtg 480
aacagtgcgg gccaccgatg cttaggaaga gtagaaataa agttccaggg aaagtggggg 540
acggtgtgtg acgacaactt cagcaaagat cacgcttctg tgatttgtaa acagcttgga 600
tgtggaagtg ccattagttt ctctggctca gctaaattgg gagctggttc tggaccaatc 660
tggctcgatg ac 672
<210> 84
<211> 608
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 84
Met Gly Gly His Arg Met Val Leu Leu Gly Gly Ala Gly Ser Pro Gly
1 5 10 15
Cys Lys Arg Phe Val His Leu Gly Phe Phe Val Val Ala Val Ser Ser
20 25 30
Leu Leu Ser Ala Ser Ala Val Thr Asn Ala Pro Gly Glu Met Lys Lys
35 40 45
Glu Leu Arg Leu Ala Gly Gly Glu Asn Asn Cys Ser Gly Arg Val Glu
50 55 60
Leu Lys Ile His Asp Lys Trp Gly Thr Val Cys Ser Asn Gly Trp Ser
65 70 75 80
Met Asn Glu Val Ser Val Val Cys Gln Gln Leu Gly Cys Pro Thr Ser
85 90 95
Ile Lys Ala Leu Gly Trp Ala Asn Ser Ser Ala Gly Ser Gly Tyr Ile
100 105 110
Trp Met Asp Lys Val Ser Cys Thr Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asp
115 120 125
Cys Lys His Asp Gly Trp Gly Lys His Asn Cys Thr His Glu Lys Asp
130 135 140
Ala Gly Val Thr Cys Ser Asp Gly Ser Asn Leu Glu Met Arg Leu Val
145 150 155 160
Asn Ser Ala Gly His Arg Cys Leu Gly Arg Val Glu Ile Lys Phe Gln
165 170 175
Gly Lys Trp Gly Thr Val Cys Asp Asp Asn Phe Ser Lys Asp His Ala
180 185 190
Ser Val Ile Cys Lys Gln Leu Gly Cys Gly Ser Ala Ile Ser Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Ala Lys Leu Gly Ala Gly Ser Gly Pro Ile Trp Leu Asp Asp
210 215 220
Leu Ala Cys Asn Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asp Cys Lys His Arg
225 230 235 240
Gly Trp Gly Lys His Asn Cys Asp His Ala Glu Asp Val Gly Val Ile
245 250 255
Cys Leu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Arg Leu Val Asp Gly Val Ser
260 265 270
Arg Cys Ser Gly Arg Leu Glu Val Arg Phe Gln Gly Glu Trp Gly Thr
275 280 285
Val Cys Asp Asp Asn Trp Asp Leu Arg Asp Ala Ser Val Val Cys Lys
290 295 300
Gln Leu Gly Cys Pro Thr Ala Ile Ser Ala Ile Gly Arg Val Asn Ala
305 310 315 320
Ser Glu Gly Ser Gly Gln Ile Trp Leu Asp Asn Ile Ser Cys Glu Gly
325 330 335
His Glu Ala Thr Leu Trp Glu Cys Lys His Gln Glu Trp Gly Lys His
340 345 350
Tyr Cys His His Arg Glu Asp Ala Gly Val Thr Cys Ser Asp Gly Ala
355 360 365
Asp Leu Glu Leu Arg Leu Val Gly Gly Gly Ser Arg Cys Ala Gly Ile
370 375 380
Val Glu Val Glu Ile Gln Lys Leu Thr Gly Lys Met Cys Ser Arg Gly
385 390 395 400
Trp Thr Leu Ala Asp Ala Asp Val Val Cys Arg Gln Leu Gly Cys Gly
405 410 415
Ser Ala Leu Gln Thr Gln Ala Lys Ile Tyr Ser Lys Thr Gly Ala Thr
420 425 430
Asn Thr Trp Leu Phe Pro Gly Ser Cys Asn Gly Asn Glu Thr Thr Phe
435 440 445
Trp Gln Cys Lys Asn Trp Gln Trp Gly Gly Leu Ser Cys Asp Asn Phe
450 455 460
Glu Glu Ala Lys Val Thr Cys Ser Gly His Arg Glu Pro Arg Leu Val
465 470 475 480
Gly Gly Glu Ile Pro Cys Ser Gly Arg Val Glu Val Lys His Gly Asp
485 490 495
Val Trp Gly Ser Val Cys Asp Phe Asp Leu Ser Leu Glu Ala Ala Ser
500 505 510
Val Val Cys Arg Glu Leu Gln Cys Gly Thr Val Val Ser Ile Leu Gly
515 520 525
Gly Ala His Phe Gly Glu Gly Ser Gly Gln Ile Trp Gly Glu Glu Phe
530 535 540
Gln Cys Ser Gly Asp Glu Ser His Leu Ser Leu Cys Ser Val Ala Pro
545 550 555 560
Pro Leu Asp Arg Thr Cys Thr His Ser Arg Asp Val Ser Val Val Cys
565 570 575
Ser Asn Leu Glu Gly Pro Arg Phe Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro
580 585 590
Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His
595 600 605
<210> 85
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠CD163 LKIHDK-VKVQEE Y60R突变体
<400> 85
Met Gly Gly His Arg Met Val Leu Leu Gly Gly Ala Gly Ser Pro Gly
1 5 10 15
Cys Lys Arg Phe Val His Leu Gly Phe Phe Val Val Ala Val Ser Ser
20 25 30
Leu Leu Ser Ala Ser Ala Val Thr Asn Ala Pro Gly Glu Met Lys Lys
35 40 45
Glu Leu Arg Leu Ala Gly Gly Glu Asn Asn Cys Ser Gly Arg Val Glu
50 55 60
Val Lys Val Gln Glu Glu Trp Gly Thr Val Cys Ser Asn Gly Trp Ser
65 70 75 80
Met Asn Glu Val Ser Val Val Cys Gln Gln Leu Gly Cys Pro Thr Ser
85 90 95
Ile Lys Ala Leu Gly Trp Ala Asn Ser Ser Ala Gly Ser Gly Arg Ile
100 105 110
Trp Met Asp Lys Val Ser Cys Thr Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asp
115 120 125
Cys Lys His Asp Gly Trp Gly Lys His Asn Cys Thr His Glu Lys Asp
130 135 140
Ala Gly Val Thr Cys Ser Asp Gly Ser Asn Leu Glu Met Arg Leu Val
145 150 155 160
Asn Ser Ala Gly His Arg Cys Leu Gly Arg Val Glu Ile Lys Phe Gln
165 170 175
Gly Lys Trp Gly Thr Val Cys Asp Asp Asn Phe Ser Lys Asp His Ala
180 185 190
Ser Val Ile Cys Lys Gln Leu Gly Cys Gly Ser Ala Ile Ser Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Ala Lys Leu Gly Ala Gly Ser Gly Pro Ile Trp Leu Asp Asp
210 215 220
<210> 86
<211> 1827
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 86
atgggtggac acagaatggt tcttcttgga ggtgctggat ctcctggttg taaaaggttt 60
gtccatctag gtttctttgt tgtggctgtg agctcacttc tcagtgcctc tgctgtcact 120
aacgctcctg gagaaatgaa gaaggaactg agactggcgg gtggtgaaaa caactgtagt 180
gggagagtgg aacttaagat ccatgacaag tggggcacag tgtgcagtaa cggctggagc 240
atgaatgaag tgtccgtggt ttgccagcag ctgggatgcc caacttctat taaagccctt 300
ggatgggcta actccagcgc cggctctgga tatatctgga tggacaaagt ttcttgtaca 360
gggaatgagt cagctctttg ggactgcaaa catgatgggt ggggaaagca taactgtacc 420
catgaaaaag atgctggagt gacctgctca gatggatcta atttggagat gagactggtg 480
aacagtgcgg gccaccgatg cttaggaaga gtagaaataa agttccaggg aaagtggggg 540
acggtgtgtg acgacaactt cagcaaagat cacgcttctg tgatttgtaa acagcttgga 600
tgtggaagtg ccattagttt ctctggctca gctaaattgg gagctggttc tggaccaatc 660
tggctcgatg acctggcatg caatggaaat gagtcagctc tctgggactg caaacaccgg 720
ggatggggca agcataactg tgaccatgct gaggatgtcg gtgtgatttg cttagaggga 780
gcagatctga gcctgagact agtggatgga gtgtccagat gttcaggaag attggaagtg 840
agattccaag gagaatgggg gaccgtgtgt gatgataact gggatctccg ggatgcttct 900
gtggtgtgca agcaactggg atgtccaact gccatcagtg ccattggtcg agttaatgcc 960
agtgagggat ctggacagat ttggcttgac aacatttcat gcgaaggaca tgaggcaact 1020
ctttgggagt gtaaacacca agagtgggga aagcattact gtcatcatag agaagacgct 1080
ggcgtgacat gttctgatgg agcagatctg gaacttagac ttgtaggtgg aggcagtcgc 1140
tgtgctggca ttgtggaggt ggagattcag aagctgactg ggaagatgtg tagccgaggc 1200
tggacactgg cagatgcgga tgtggtttgc agacagcttg gatgtggatc tgcgcttcaa 1260
acccaggcta agatctactc taaaactggg gcaacaaata cgtggctctt tcctggatct 1320
tgtaatggaa atgaaactac tttttggcaa tgcaaaaact ggcagtgggg cggcctttcc 1380
tgtgataatt tcgaagaagc caaagttacc tgctcaggcc acagggaacc cagactggtt 1440
ggaggagaaa tcccatgctc tggtcgtgtg gaagtgaaac acggagacgt gtggggctcc 1500
gtctgtgatt ttgacttgtc tctggaagct gccagtgtgg tgtgcaggga attacaatgt 1560
ggaacagtcg tctctatcct agggggagca cattttggag aaggaagtgg acagatctgg 1620
ggtgaagaat tccagtgtag tggggatgag tcccatcttt cactatgctc agtggcgccc 1680
ccgctagaca gaacttgtac ccacagcagg gatgtcagcg tagtctgctc aaatctagag 1740
ggcccgcggt tcgaaggtaa gcctatccct aaccctctcc tcggtctcga ttctacgcgt 1800
accggtcatc atcaccatca ccattga 1827
<210> 87
<211> 672
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠CD163 LKIHDK-VKVQEE Y60D突变体
<400> 87
atgggtggac acagaatggt tcttcttgga ggtgctggat ctcctggttg taaaaggttt 60
gtccatctag gtttctttgt tgtggctgtg agctcacttc tcagtgcctc tgctgtcact 120
aacgctcctg gagaaatgaa gaaggaactg agactggcgg gtggtgaaaa caactgtagt 180
gggagagtgg aagtgaaggt gcaggaggag tggggcacag tgtgcagtaa cggctggagc 240
atgaatgaag tgtccgtggt ttgccagcag ctgggatgcc caacttctat taaagccctt 300
ggatgggcta actccagcgc cggctctgga cggatctgga tggacaaagt ttcttgtaca 360
gggaatgagt cagctctttg ggactgcaaa catgatgggt ggggaaagca taactgtacc 420
catgaaaaag atgctggagt gacctgctca gatggatcta atttggagat gagactggtg 480
aacagtgcgg gccaccgatg cttaggaaga gtagaaataa agttccaggg aaagtggggg 540
acggtgtgtg acgacaactt cagcaaagat cacgcttctg tgatttgtaa acagcttgga 600
tgtggaagtg ccattagttt ctctggctca gctaaattgg gagctggttc tggaccaatc 660
tggctcgatg ac 672
<210> 88
<211> 608
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 88
Met Gly Gly His Arg Met Val Leu Leu Gly Gly Ala Gly Ser Pro Gly
1 5 10 15
Cys Lys Arg Phe Val His Leu Gly Phe Phe Val Val Ala Val Ser Ser
20 25 30
Leu Leu Ser Ala Ser Ala Val Thr Asn Ala Pro Gly Glu Met Lys Lys
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Glu Leu Arg Leu Ala Gly Gly Glu Asn Asn Cys Ser Gly Arg Val Glu
50 55 60
Leu Lys Ile His Asp Lys Trp Gly Thr Val Cys Ser Asn Gly Trp Ser
65 70 75 80
Met Asn Glu Val Ser Val Val Cys Gln Gln Leu Gly Cys Pro Thr Ser
85 90 95
Ile Lys Ala Leu Gly Trp Ala Asn Ser Ser Ala Gly Ser Gly Tyr Ile
100 105 110
Trp Met Asp Lys Val Ser Cys Thr Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asp
115 120 125
Cys Lys His Asp Gly Trp Gly Lys His Asn Cys Thr His Glu Lys Asp
130 135 140
Ala Gly Val Thr Cys Ser Asp Gly Ser Asn Leu Glu Met Arg Leu Val
145 150 155 160
Asn Ser Ala Gly His Arg Cys Leu Gly Arg Val Glu Ile Lys Phe Gln
165 170 175
Gly Lys Trp Gly Thr Val Cys Asp Asp Asn Phe Ser Lys Asp His Ala
180 185 190
Ser Val Ile Cys Lys Gln Leu Gly Cys Gly Ser Ala Ile Ser Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Ala Lys Leu Gly Ala Gly Ser Gly Pro Ile Trp Leu Asp Asp
210 215 220
Leu Ala Cys Asn Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asp Cys Lys His Arg
225 230 235 240
Gly Trp Gly Lys His Asn Cys Asp His Ala Glu Asp Val Gly Val Ile
245 250 255
Cys Leu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Arg Leu Val Asp Gly Val Ser
260 265 270
Arg Cys Ser Gly Arg Leu Glu Val Arg Phe Gln Gly Glu Trp Gly Thr
275 280 285
Val Cys Asp Asp Asn Trp Asp Leu Arg Asp Ala Ser Val Val Cys Lys
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Gln Leu Gly Cys Pro Thr Ala Ile Ser Ala Ile Gly Arg Val Asn Ala
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Ser Glu Gly Ser Gly Gln Ile Trp Leu Asp Asn Ile Ser Cys Glu Gly
325 330 335
His Glu Ala Thr Leu Trp Glu Cys Lys His Gln Glu Trp Gly Lys His
340 345 350
Tyr Cys His His Arg Glu Asp Ala Gly Val Thr Cys Ser Asp Gly Ala
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Asp Leu Glu Leu Arg Leu Val Gly Gly Gly Ser Arg Cys Ala Gly Ile
370 375 380
Val Glu Val Glu Ile Gln Lys Leu Thr Gly Lys Met Cys Ser Arg Gly
385 390 395 400
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Gly Gly Glu Ile Pro Cys Ser Gly Arg Val Glu Val Lys His Gly Asp
485 490 495
Val Trp Gly Ser Val Cys Asp Phe Asp Leu Ser Leu Glu Ala Ala Ser
500 505 510
Val Val Cys Arg Glu Leu Gln Cys Gly Thr Val Val Ser Ile Leu Gly
515 520 525
Gly Ala His Phe Gly Glu Gly Ser Gly Gln Ile Trp Gly Glu Glu Phe
530 535 540
Gln Cys Ser Gly Asp Glu Ser His Leu Ser Leu Cys Ser Val Ala Pro
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Pro Leu Asp Arg Thr Cys Thr His Ser Arg Asp Val Ser Val Val Cys
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Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His
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<210> 89
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠CD163 LKIHDK-VKVQEE Y60R突变体
<400> 89
Met Gly Gly His Arg Met Val Leu Leu Gly Gly Ala Gly Ser Pro Gly
1 5 10 15
Cys Lys Arg Phe Val His Leu Gly Phe Phe Val Val Ala Val Ser Ser
20 25 30
Leu Leu Ser Ala Ser Ala Val Thr Asn Ala Pro Gly Glu Met Lys Lys
35 40 45
Glu Leu Arg Leu Ala Gly Gly Glu Asn Asn Cys Ser Gly Arg Val Glu
50 55 60
Val Lys Val Gln Glu Glu Trp Gly Thr Val Cys Ser Asn Gly Trp Ser
65 70 75 80
Met Asn Glu Val Ser Val Val Cys Gln Gln Leu Gly Cys Pro Thr Ser
85 90 95
Ile Lys Ala Leu Gly Trp Ala Asn Ser Ser Ala Gly Ser Gly Arg Ile
100 105 110
Trp Met Asp Lys Val Ser Cys Thr Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asp
115 120 125
Cys Lys His Asp Gly Trp Gly Lys His Asn Cys Thr His Glu Lys Asp
130 135 140
Ala Gly Val Thr Cys Ser Asp Gly Ser Asn Leu Glu Met Arg Leu Val
145 150 155 160
Asn Ser Ala Gly His Arg Cys Leu Gly Arg Val Glu Ile Lys Phe Gln
165 170 175
Gly Lys Trp Gly Thr Val Cys Asp Asp Asn Phe Ser Lys Asp His Ala
180 185 190
Ser Val Ile Cys Lys Gln Leu Gly Cys Gly Ser Ala Ile Ser Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Ala Lys Leu Gly Ala Gly Ser Gly Pro Ile Trp Leu Asp Asp
210 215 220
<210> 90
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD163 WT正向引物
<400> 90
acatagatca tgcatctgtc atttg 25
<210> 91
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD163 WT反向引物
<400> 91
cattctcctt ggaatctcac ttcta 25
<210> 92
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF-α正向引物
<400> 92
tggggtggag ctgagaga 18
<210> 93
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF-α反向引物
<400> 93
gcaatgatcc caaagtagac ct 22
<210> 94
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL48 PCR产物
<400> 94
Thr Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser His
20 25 30
Asp Val Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Thr Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr
50 55 60
Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln
65 70 75 80
Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
100 105 110
<210> 95
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL158 PCR产物
<400> 95
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Leu Leu Ile Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asp
20 25 30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gly Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
100 105
<210> 96
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH48 PCR产物
<400> 96
Asp Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ser Gly Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 97
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH158 PCR产物
<400> 97
Asp Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Gln Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ser Gly Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 98
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH模板dbj BAG64279.1
<400> 98
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr
1 5 10 15
Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Leu Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Arg Asn Tyr Met Asp Val Trp Gly Glu Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 99
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH种系IGHV4-b*01
<400> 99
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr
1 5 10 15
Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 100
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH KN2
<400> 100
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ser Gly Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 101
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH KN1IN5
<400> 101
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Asn Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
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Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Val Ser Gly Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 102
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH KN1IN5 VR1
<400> 102
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Asn Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Glu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ser Gly Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 103
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH KN1IN5 QD2
<400> 103
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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Thr Leu Asn Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
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Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ser Gly Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
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<210> 104
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL模板emb CAD43020.1
<400> 104
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1 5 10 15
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala
100 105
<210> 105
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL种系IGKV1D-39*01
<400> 105
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
<210> 106
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL NRY
<400> 106
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asp
20 25 30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gly Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
100 105
<210> 107
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL NRY d3
<400> 107
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asp
20 25 30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105
<210> 108
<211> 100
<212> PRT
<213> 人
<400> 108
Leu Val Asp Gly Glu Asn Lys Cys Ser Gly Arg Val Glu Val Lys Val
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
Val Thr Cys Ser
100
<210> 109
<211> 100
<212> PRT
<213> 猕猴(Macaca mulatta)
<400> 109
Leu Val Asp Gly Glu Asn Lys Cys Ser Gly Arg Val Glu Val Lys Val
1 5 10 15
Gln Glu Glu Trp Gly Thr Val Cys Asn Asn Gly Trp Ser Met Glu Ala
20 25 30
Val Ser Val Ile Cys Asn Gln Leu Gly Cys Pro Thr Ala Ile Lys Ala
35 40 45
Thr Gly Trp Ala Asn Ser Ser Ala Gly Ser Gly Arg Ile Trp Met Asp
50 55 60
His Val Ser Cys Arg Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asp Cys Lys His
65 70 75 80
Asp Gly Trp Gly Lys His Ser Asn Cys Thr His Gln Gln Asp Ala Gly
85 90 95
Val Thr Cys Ser
100
<210> 110
<211> 100
<212> PRT
<213> 黑猩猩（Pan troglodytes）
<400> 110
Leu Val Asp Gly Glu Asn Lys Cys Ser Gly Arg Val Glu Val Lys Val
1 5 10 15
Gln Glu Glu Trp Gly Thr Val Cys Asn Asn Gly Trp Ser Met Glu Ala
20 25 30
Val Ser Val Ile Cys Asn Gln Leu Gly Cys Pro Thr Ala Ile Lys Ala
35 40 45
Thr Gly Trp Ala Asn Ser Ser Ala Gly Ser Gly Arg Ile Trp Met Asp
50 55 60
His Val Ser Cys Arg Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asp Cys Lys His
65 70 75 80
Asp Gly Trp Gly Lys His Ser Asn Cys Thr His Gln Gln Asp Ala Gly
85 90 95
Val Thr Cys Ser
100
<210> 111
<211> 99
<212> PRT
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 111
Leu Thr Gly Gly Glu Asn Lys Cys Ser Gly Arg Val Glu Val Lys Val
1 5 10 15
Gln Glu Glu Trp Gly Thr Val Cys Asn Asn Gly Trp Asp Met Asp Val
20 25 30
Val Ser Val Val Cys Arg Gln Leu Gly Cys Pro Thr Ala Ile Lys Ala
35 40 45
Thr Gly Trp Ala Asn Phe Ser Ala Gly Ser Gly Arg Ile Trp Met Asp
50 55 60
His Val Ser Cys Arg Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asp Cys Lys His
65 70 75 80
Asp Gly Trp Gly Lys His Asn Cys Thr His Gln Gln Asp Ala Gly Val
85 90 95
Thr Cys Ser
<210> 112
<211> 99
<212> PRT
<213> 犬(Canis lupus familiaris)
<400> 112
Leu Thr Asp Gly Glu Asp Asn Cys Ser Gly Arg Val Glu Val Lys Val
1 5 10 15
Gln Glu Glu Trp Gly Thr Val Cys Asn Asn Gly Trp Gly Met Asp Glu
20 25 30
Val Ser Val Ile Cys Arg Gln Leu Gly Cys Pro Thr Ala Ile Lys Ala
35 40 45
Ala Gly Trp Ala Asn Ser Arg Ala Gly Ser Gly Arg Ile Trp Met Asp
50 55 60
His Val Ser Cys Arg Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asp Cys Lys His
65 70 75 80
Asp Gly Trp Gly Lys His Asn Cys Ser His Gln Gln Asp Ala Gly Val
85 90 95
Thr Cys Ser
<210> 113
<211> 99
<212> PRT
<213> 大鼠(Rattus norvegicus)
<400> 113
Leu Ala Gly Gly Glu Asn Asn Cys Ser Gly Arg Val Glu Leu Lys Ile
1 5 10 15
His Glu Lys Trp Gly Thr Val Cys Gly Asn Gly Trp Ser Met Asn Glu
20 25 30
Val Ser Val Val Cys Gln Gln Leu Gly Cys Pro Thr Leu Ile Lys Ala
35 40 45
Pro Gly Trp Ala Asn Ala Ser Ala Gly Ser Gly Asp Ile Trp Met Asp
50 55 60
Lys Val Ser Cys Thr Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asp Cys Lys His
65 70 75 80
Glu Gly Trp Gly Lys His Asn Cys Thr His Glu Gln Asp Ala Gly Val
85 90 95
Thr Cys Ala
<210> 114
<211> 98
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 114
Leu Ala Gly Gly Glu Asn Asn Cys Ser Gly Arg Val Glu Leu Lys Ile
1 5 10 15
His Lys Trp Gly Thr Val Cys Ser Asn Gly Trp Ser Met Asn Glu Val
20 25 30
Ser Val Val Cys Gln Gln Leu Gly Cys Pro Thr Ser Ile Lys Ala Leu
35 40 45
Gly Trp Ala Asn Ser Ser Ala Gly Ser Gly Tyr Ile Trp Met Asp Lys
50 55 60
Val Ser Cys Thr Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asp Cys Lys His Asp
65 70 75 80
Gly Trp Gly Lys His Asn Cys Thr His Glu Lys Asp Ala Gly Val Thr
85 90 95
Cys Ser
<210> 115
<211> 102
<212> PRT
<213> 人
<400> 115
Leu Arg Leu Val Asp Gly Glu Asn Lys Cys Ser Gly Arg Val Glu Val
1 5 10 15
Lys Val Gln Glu Glu Trp Gly Thr Val Cys Asn Asn Gly Trp Ser Met
20 25 30
Glu Ala Val Ser Val Ile Cys Asn Gln Leu Gly Cys Pro Thr Ala Ile
35 40 45
Lys Ala Pro Gly Trp Ala Asn Ser Ser Ala Gly Ser Gly Arg Ile Trp
50 55 60
Met Asp His Val Ser Cys Arg Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asp Cys
65 70 75 80
Lys His Asp Gly Trp Gly Lys His Ser Asn Cys Thr His Gln Gln Asp
85 90 95
Ala Gly Val Thr Cys Ser
100
<210> 116
<211> 101
<212> PRT
<213> 人
<400> 116
Met Arg Leu Thr Arg Gly Gly Asn Met Cys Ser Gly Arg Ile Glu Ile
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly Arg Trp Gly Thr Val Cys Asp Asp Asn Phe Asn Ile
20 25 30
Asp His Ala Ser Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Cys Gly Ser Ala Val
35 40 45
Ser Phe Ser Gly Ser Ser Asn Phe Gly Glu Gly Ser Gly Pro Ile Trp
50 55 60
Phe Asp Asp Leu Ile Cys Asn Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asn Cys
65 70 75 80
Lys His Gln Gly Trp Gly Lys His Asn Cys Asp His Ala Glu Asp Ala
85 90 95
Gly Val Ile Cys Ser
100
<210> 117
<211> 101
<212> PRT
<213> 人
<400> 117
Leu Arg Leu Val Asp Gly Val Thr Glu Cys Ser Gly Arg Leu Glu Val
1 5 10 15
Arg Phe Gln Gly Glu Trp Gly Thr Ile Cys Asp Asp Gly Trp Asp Ser
20 25 30
Tyr Asp Ala Ala Val Ala Cys Lys Gln Leu Gly Cys Pro Thr Ala Val
35 40 45
Thr Ala Ile Gly Arg Val Asn Ala Ser Lys Gly Phe Gly His Ile Trp
50 55 60
Leu Asp Ser Val Ser Cys Gln Gly His Glu Pro Ala Val Trp Gln Cys
65 70 75 80
Lys His His Glu Trp Gly Lys His Tyr Cys Asn His Asn Glu Asp Ala
85 90 95
Gly Val Thr Cys Ser
100
<210> 118
<211> 101
<212> PRT
<213> 人
<400> 118
Leu Arg Leu Arg Gly Gly Gly Ser Arg Cys Ala Gly Thr Val Glu Val
1 5 10 15
Glu Ile Gln Arg Leu Leu Gly Lys Val Cys Asp Arg Gly Trp Gly Leu
20 25 30
Lys Glu Ala Asp Val Val Cys Arg Gln Leu Gly Cys Gly Ser Ala Leu
35 40 45
Lys Thr Ser Tyr Gln Val Tyr Ser Lys Ile Gln Ala Thr Asn Thr Trp
50 55 60
Leu Phe Leu Ser Ser Cys Asn Gly Asn Glu Thr Ser Leu Trp Asp Cys
65 70 75 80
Lys Asn Trp Gln Trp Gly Gly Leu Thr Cys Asp His Tyr Glu Glu Ala
85 90 95
Lys Ile Thr Cys Ser
100
<210> 119
<211> 100
<212> PRT
<213> 人
<400> 119
Arg Leu Val Gly Gly Asp Ile Pro Cys Ser Gly Arg Val Glu Val Lys
1 5 10 15
His Gly Asp Thr Trp Gly Ser Ile Cys Asp Ser Asp Phe Ser Leu Glu
20 25 30
Ala Ala Ser Val Leu Cys Arg Glu Leu Gln Cys Gly Thr Val Val Ser
35 40 45
Ile Leu Gly Gly Ala His Phe Gly Glu Gly Asn Gly Gln Ile Trp Ala
50 55 60
Glu Glu Phe Gln Cys Glu Gly His Glu Ser His Leu Ser Leu Cys Pro
65 70 75 80
Val Ala Pro Arg Pro Glu Gly Thr Cys Ser His Ser Arg Asp Val Gly
85 90 95
Val Val Cys Ser
100
<210> 120
<211> 101
<212> PRT
<213> 人
<400> 120
Ile Arg Leu Val Asn Gly Lys Thr Pro Cys Glu Gly Arg Val Glu Leu
1 5 10 15
Lys Thr Leu Gly Ala Trp Gly Ser Leu Cys Asn Ser His Trp Asp Ile
20 25 30
Glu Asp Ala His Val Leu Cys Gln Gln Leu Lys Cys Gly Val Ala Leu
35 40 45
Ser Thr Pro Gly Gly Ala Arg Phe Gly Lys Gly Asn Gly Gln Ile Trp
50 55 60
Arg His Met Phe His Cys Thr Gly Thr Glu Gln His Met Gly Asp Cys
65 70 75 80
Pro Val Thr Ala Leu Gly Ala Ser Leu Cys Pro Ser Glu Gln Val Ala
85 90 95
Ser Val Ile Cys Ser
100
<210> 121
<211> 101
<212> PRT
<213> 人
<400> 121
Leu Arg Leu Val Asn Gly Gly Gly Arg Cys Ala Gly Arg Val Glu Ile
1 5 10 15
Tyr His Glu Gly Ser Trp Gly Thr Ile Cys Asp Asp Ser Trp Asp Leu
20 25 30
Ser Asp Ala His Val Val Cys Arg Gln Leu Gly Cys Gly Glu Ala Ile
35 40 45
Asn Ala Thr Gly Ser Ala His Phe Gly Glu Gly Thr Gly Pro Ile Trp
50 55 60
Leu Asp Glu Met Lys Cys Asn Gly Lys Glu Ser Arg Ile Trp Gln Cys
65 70 75 80
His Ser His Gly Trp Gly Gln Gln Asn Cys Arg His Lys Glu Asp Ala
85 90 95
Gly Val Ile Cys Ser
100
<210> 122
<211> 102
<212> PRT
<213> 人
<400> 122
Leu Arg Leu Thr Ser Glu Ala Ser Arg Glu Ala Cys Ala Gly Arg Leu
1 5 10 15
Glu Val Phe Tyr Asn Gly Ala Trp Gly Thr Val Gly Lys Ser Ser Met
20 25 30
Ser Glu Thr Thr Val Gly Val Val Cys Arg Gln Leu Gly Cys Ala Asp
35 40 45
Lys Gly Lys Ile Asn Pro Ala Ser Leu Asp Lys Ala Met Ser Ile Pro
50 55 60
Met Trp Val Asp Asn Val Gln Cys Pro Lys Gly Pro Asp Thr Leu Trp
65 70 75 80
Gln Cys Pro Ser Ser Pro Trp Glu Lys Arg Leu Ala Ser Pro Ser Glu
85 90 95
Glu Thr Trp Ile Thr Cys
100
<210> 123
<211> 101
<212> PRT
<213> 人
<400> 123
Ile Arg Leu Gln Glu Gly Pro Thr Ser Cys Ser Gly Arg Val Glu Ile
1 5 10 15
Trp His Gly Gly Ser Trp Gly Thr Val Cys Asp Asp Ser Trp Asp Leu
20 25 30
Asp Asp Ala Gln Val Val Cys Gln Gln Leu Gly Cys Gly Pro Ala Leu
35 40 45
Lys Ala Phe Lys Glu Ala Glu Phe Gly Gln Gly Thr Gly Pro Ile Trp
50 55 60
Leu Asn Glu Val Lys Cys Lys Gly Asn Glu Ser Ser Leu Trp Asp Cys
65 70 75 80
Pro Ala Arg Arg Trp Gly His Ser Glu Cys Gly His Lys Glu Asp Ala
85 90 95
Ala Val Asn Cys Thr
100

Claims (49)

1.用于向单核细胞和/或源自单核细胞的细胞靶向递送免疫抑制剂的治疗剂，其包含：
(a)对单核细胞和/或源自单核细胞的细胞具有特异性的结合部分；和
(b)免疫抑制剂，其中所述对单核细胞和/或源自单核细胞的细胞具有特异性的结合部分选自以下组成的组：
(i)对CD163受体具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段、或所述抗体或其抗原结合片段的融合物；和
(ii)脂质体(负载了免疫抑制剂)，其与所述对CD163受体具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段、或所述抗体或其抗原结合片段的融合物偶联，
其中，所述免疫抑制剂选自包含以下的组或由以下组成的组：糖皮质激素、糖皮质激素半琥珀酸酯衍生物、皮质类固醇、氨甲喋呤、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、环孢霉素、他克莫司、霉酚酸吗啉乙酯、西罗莫司、依维莫司，能够抑制促炎细胞因子(例如TNF)合成的siRNA分子、非甾体抗炎药(NSAID，例如阿斯匹林、布洛芬)、类固醇(例如，维生素D)以及改善病情的抗风湿药(DMARD，例如青霉胺、柳氮磺胺吡啶、环孢霉素)。
2.如权利要求1所述的治疗剂，其中所述CD163受体是人CD163受体。
3.如权利要求1或2所述的治疗剂，其中所述CD163受体选自由数据库登录号CAB45233、AAY99762、AAH51281、EAW8862、EAW8863、EAW8864、EAW8865、EAW8866、NP_004235、NP_98161和Swiss-Prot:Q86VB7.1限定的蛋白质组成的组。
4.如权利要求1-3中任一项所述的治疗剂，其中所述CD163受体定位在单核细胞表面上和/或源自单核细胞的细胞表面上。
5.如权利要求4所述的治疗剂，其中所述细胞选自由以下组成的组：单核细胞、巨噬细胞、源自单核细胞的树突细胞、活化的巨噬细胞亚型(例如，M1、M2)和表达CD163的恶性细胞。
6.如权利要求5所述的治疗剂，其中所述细胞是巨噬细胞，例如Kuppfer细胞。
7.如上述权利要求中任一项所述的治疗剂，其中所述抗体或其抗原结合片段或它们的融合物结合选自以下组成的组中的CD163受体域：域1、域2、域3、域4、域5、域6、域7、域8和域9。
8.如权利要求7所述的治疗剂，其中所述抗体或其抗原结合片段或它们的融合物结合CD163受体的域1。
9.如权利要求7所述的治疗剂，其中所述抗体或其抗原结合片段或它们的融合物结合CD163受体的域3。
10.如上述权利要求中任一项所述的治疗剂，其中所述抗体或其抗原结合片段或它们的融合物显示出在钙存在下对CD163受体的结合亲和力高于钙不存在时。
11.如上述权利要求中任一项所述的治疗剂，其中所述抗体或其抗原结合片段或它们的融合物能够诱导CD163受体和/或所述治疗剂的内化。
12.如上述权利要求中任一项所述的治疗剂，其中所述结合部分是完整抗体。
13.如权利要求1-11中任一项所述的治疗剂，其中所述抗体或其抗原结合片段或它们的融合物包含选自Fv片段(例如单链Fv、二硫键键合的Fv和域抗体)和Fab样片段(例如，Fab片段、Fab'片段和F(ab)2片段)组成的组中的抗原结合片段或由选自Fv片段(例如单链Fv、二硫键键合的Fv和域抗体)和Fab样片段(例如，Fab片段、Fab'片段和F(ab)2片段)组成的组中的抗原结合片段组成。
14.如权利要求13所述的治疗剂，其中所述抗原结合片段是scFv。
15.如权利要求13所述的治疗剂，其中所述抗原结合片段是域抗体。
16.如权利要求15所述的治疗剂，其中所述域抗体选自以下组成的组：来自骆驼的单域抗体、来自鲨鱼的单域抗体和来自人的分离的VH或VL域。
17.如上述权利要求中任一项所述的治疗剂，其中所述抗体是IgG抗体。
18.如权利要求17所述的治疗剂，其中所述IgG抗体是IgG2或IgG4抗体，例如241位的丝氨酸被脯氨酸残基取代的IgG4抗体。
19.如上述权利要求中任一项所述的治疗剂，其中所述抗体是重组抗体。
20.如上述权利要求中任一项所述的治疗剂，其中所述抗体是单克隆抗体。
21.如上述权利要求中任一项所述的治疗剂，其中所述抗体或其抗原结合片段是人的或人源化的。
22.如上述权利要求中任一项所述的治疗剂，其中所述抗体、其抗原结合片段或它们的融合物能够与选自以下组中的抗体分子竞争结合CD163受体：
Mac2-158(下划线为CDR)
VH:
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITYSGITNYNPSLKSQISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCVSGTYYFDYWGQGTTLTVSS
VL:
SVVMTQTPKSLLISIGDRVTITCKASQSVSSDVAWFQQKPGQSPKPLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCGQDYTSPRTFGGGTKLEIKR
Mac2-48(下划线为CDR)
VH:
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGFISYSGITSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCVSGTYYFDYWGQGTTLTVSS
VL:
SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSHDVSWFQQKPGQSPKLLIYYTSNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAIYFCQQDYSSPRTFGGGTKLEIKRA
示例性人源化mAb(下划线为CDR)
VH:
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAWNWIRQFPGKKLEWMGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCVSGTYYFDYWGQGTTLTVSS
VL:
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSDVAWFQQKPGKSPKPLIYYASNRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYFCGQDYTSPRTFGGGTKLEIKRA。
23.如权利要求22所述的治疗剂，其中所述抗体、其抗原结合片段或它们的融合物能够结合的表位与选自Mac2-158、Mac2-48和示例性人源化mAb组成的组中的抗体结合的表位相同。
24.如权利要求22或23所述的治疗剂，其中所述抗体、其抗原结合片段或它们融合物是或源自选自Mac2-158、Mac2-48和示例性人源化mAb组成的组中的抗体。
25.如上述权利要求中任一项所述的治疗剂，其中所述结合部分是分离和/或纯化的形式。
26.如上述权利要求中任一项所述的治疗剂，其中所述免疫抑制剂是糖皮质激素。
27.如权利要求26所述的治疗剂，其中所述糖皮质激素选自以下组成的组：可的松及其衍生物(例如氢化可的松)；强的松及其衍生物(例如强的松龙、甲基强的松龙、甲基强的松龙醋酸酯、甲基强的松龙琥珀酸酯)；地塞米松及其衍生物；去炎松及其衍生物(例如，己酸去炎松、醋酸去炎松)；帕拉米松；倍他米松；氟氢化可的松；醋酸氟轻松；以及氟轻松。
28.如上述权利要求中任一项所述的治疗剂，其中所述免疫抑制剂是糖皮质激素半琥珀酸酯衍生物。
29.如上述权利要求26-28中任一项所述的治疗剂，其中所述糖皮质激素经由组织蛋白酶敏感的肽连接子连接。
30.权利要求26-29中任一项所述的治疗剂，其中所述糖皮质激素是地塞米松。
31.权利要求26-29中任一项所述的治疗剂，其中所述糖皮质激素是强的松龙。
32.如上述权利要求26-29中任一项所述的治疗剂，其中所述糖皮质激素是醋酸氟轻松。
33.如上述权利要求中任一项所述的治疗剂，其中所述结合部分与所述免疫抑制剂共价连接。
34.如上述权利要求中任一项所述的治疗剂，其中所述糖皮质激素分子与所述结合部分分子的比例在6和16之间，或1和12之间，例如8和12之间或1和8之间，或3和5之间或7和9之间。
35.如上述权利要求中任一项所述的治疗剂，其中：
(a)所述对单核细胞和/或源自单核细胞的细胞具有特异性的结合部分是对CD163受体具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段，或保留了对CD163受体的结合特异性的所述抗体或其抗原结合片段的融合物；和
(b)所述免疫抑制剂是糖皮质激素。
36.如上述权利要求中任一项所述的治疗剂，其中所述治疗剂在炎性病症或病变的治疗中具有功效。
37.如上述权利要求中任一项所述的治疗剂，其中所述治疗剂在自身免疫性疾病的治疗中具有功效。
38.如权利要求36或37所述的治疗剂，其中所述病症或病变选自以下组成的组：关节炎疾病(例如，类风湿性关节炎、脊椎炎、骨关节炎)、慢性炎性肠道疾病(IBD，例如克罗恩病、溃疡性结肠炎)、牙周炎、银屑病、哮喘、系统性红斑狼疮、多发性硬化、自身免疫性慢性炎性疾病、结缔组织病、自身免疫性肝病(例如，胆汁性肝硬化)、脓毒症、噬血细胞综合症、肝病、肝功能衰竭、肝炎、动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、关节炎、炎症诱导的软骨损伤、肝硬变、器官移植、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、结节病、葡萄膜炎、HLA-B27阳性葡萄膜炎、急性葡萄膜炎、巨噬细胞活化综合症、巨细胞关节炎。
39.如权利要求38所述的治疗剂，其中所述炎性病症或病变是类风湿性关节炎。
40.如上述权利要求中任一项所述的治疗剂，其中所述治疗剂显示的治疗功效是不存在所述结合部分的对应免疫抑制剂的至少10倍。
41.如上述权利要求中任一项所述的治疗剂，其中，在治疗有效剂量下，所述治疗剂的副作用谱低于不存在所述结合部分的对应免疫抑制剂的副作用谱。
42.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1-41中任一项所述的治疗剂和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
43.如权利要求42所述的药物组合物，其适合通过胃肠外(例如，经静脉内、关节内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌肉内或皮下)、经鼻内、通过吸入或经眼内递送。
44.一种试剂盒，其包含权利要求1-41中任一项所述的治疗剂或权利要求42或43所述的药物组合物。
45.权利要求1-41中任一项所述的治疗剂在制备药物中的用途。
46.权利要求1-41中任一项所述的治疗剂在制备用于治疗炎性病症或病变的药物中的用途。
47.如权利要求46所述的用途，所述药物用于治疗自身免疫性疾病。
48.如权利要求46或47所述的用途，其中所述病症、病变或疾病选自以下组成的组：关节炎疾病(例如，类风湿性关节炎、脊椎炎、骨关节炎)、慢性炎性肠道疾病(IBD，例如克罗恩病、溃疡性结肠炎)、牙周炎、银屑病、哮喘、系统性红斑狼疮、多发性硬化、自身免疫性慢性炎性疾病、结缔组织病、自身免疫性肝病(例如，胆汁性肝硬化)、脓毒症、噬血细胞综合症、肝病、肝功能衰竭、肝炎、动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性能肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、关节炎、炎症诱导的软骨损伤、肝硬变、器官移植、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、结节病、葡萄膜炎、HLA-B27阳性葡萄膜炎、急性葡萄膜炎、巨噬细胞活化综合症、巨细胞关节炎。
49.如权利要求48所述的用途，其中所述病症、病变或疾病是类风湿性关节炎。
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