CN107084968A - 一种利用分子模板增强试剂提升sers基底检测灵敏度的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用分子模板增强试剂提升SERS基底检测灵敏度的方法，属于检测技术领域。本发明所述方法实现了待测分子在传统表面增强拉曼光谱(SERS)基底上提升2个数量级的超痕量检测，使SERS的检测灵敏度大幅度提高，具有广泛的应用前景。其是将表面自组装或蒸镀有金或银纳米粒子的SERS基底置于探针分子的乙醇溶液中浸泡20～30小时后取出；然后配置10‑4～10‑6M的正己硫醇的乙醇溶液，将上述基底浸泡在正己硫醇的乙醇溶液中4～10小时后用乙醇清洗，氮气吹干，得到构筑有分子模板的SERS基底；SERS测试结果表明利用分子模板增强试剂有效地提升了SERS基底检测灵敏度。本发明为进一步研究SERS的机理提供实验依据，同时也为发展SERS成为材料表面特殊性质的表征工具奠定基础。

Description

一种利用分子模板增强试剂提升SERS基底检测灵敏度的方法
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种利用分子模板增强试剂提升SERS基底检测灵敏度的方法，实现了待测分子在传统表面增强拉曼光谱(SERS)基底上提升2个数量级的超痕量检测，使SERS的检测灵敏度大幅度提高，具有广泛的应用前景。
背景技术
1928年印度物理学家拉曼(C.V.Raman)首次发现拉曼散射效应，荣获1930年诺贝尔物理学奖。拉曼光谱的频率、强度和偏振等标志着物质指纹信息，从这些信息中可以得到物质结构和组成成分的信息，因而拉曼光谱得到了广泛的应用。拉曼光谱是研究分子结构的一种重要手段，但是随着拉曼光谱的实际应用，它的缺点也逐渐体现出来。拉曼散射的强度非常弱，一般只有入射光强度的10-10左右，所以想要得到强度很弱的拉曼光谱迫切需要一种方法来增强拉曼光谱信号的强度。
Fleischmann等人于1974年对光滑银电极表面进行粗糙化处理后，首次获得吸附在银电极表面上单分子层吡啶分子的高质量的拉曼光谱。但Fleishmann认为这是由于电极表面的粗糙化，电极真实表面积增加而使吸附的吡啶分子的量增加引起的，而没有意识到粗糙表面对吸附分子的拉曼光谱信号的增强作用。一直到1977年，VanDuyne和Creighton两个研究组各自独立地发现，吸附在粗糙银电极表面的每个吡啶分子的拉曼信号要比溶液中单个吡啶分子的拉曼信号大约强106倍，指出这是一种与粗糙表面相关的表面增强效应，被称为表面增强拉曼光谱(SERS)效应。106倍这一数量级的SERS信号增强意味着表面增强拉曼光谱技术可以实现表面单分子层的研究，所以新型SERS活性基底成为了SERS技术最重要的研究领域，而且对于扩大SERS的研究范围和应用领域起着重要的作用。利用日益成熟的纳米材料的制备技术，已经可以获得颗粒形状和大小可以很好控制的纳米颗粒，并将其作为模型材料来研究SERS的增强机理。虽然在SERS基底制备领域涌现出了大量新材料，但在某些实际应用体系中，SERS技术的检测灵敏度仍然不尽如人意，实现超灵敏检测仍是一个亟待于解决的技术问题。
表面选择定则是表面增强拉曼光谱学中的一个重要概念。当分子吸附在SERS基底表面时，得到的SERS光谱强度与分子与基底之间的键合方式有关，当分子垂直于SERS基底或在垂直方向上有分量时，能够得到比较好的SERS增强效果。当极低浓度的待测物分子吸附在SERS基底上时，由于各种作用力的综合影响，待测物分子将随机的以近似平行于基底的接触角与SERS基底相结合，这种随机的且近似平行的接触方式不利于得到增强拉曼信号。尽管表面选择定则在理论上得到解释和证实，但是现实中能够根据表面选择定则进行调整待测分子取向的方法还未见报道。本专利利用表面选择定则的理论，以创新的分子模板技术策略对基底上极低浓度的待测物分子的分子构象进行约束，使之以垂直的键合方式与SERS基底进行结合，创造有利于得到良好增强效果的条件，成为一种大幅提升SERS基底检测灵敏度的新方法。
发明内容
针对上述问题，我们发明了一种专用的、具有特殊组成的分子模板增强试剂，首次采用传统金或银SERS基底与分子模板增强试剂相结合的方法，来大幅提高SERS检测灵敏度。该方法具有操作简单、增强效果好、具有广泛应用前景等优点，解决目前SERS检测的重大困难。
本发明的目的是提供一种利用分子模板增强试剂提升SERS基底检测灵敏度的方法，本发明在传统SERS基底的基础上将探针分子最低检出浓度降低了100倍左右，实现了对待测探针分子的超痕量检测，目前为止没有利用该方法提高SERS检测灵敏度的相关报道。
本发明采用吡啶、对巯基苯甲酸(MBA)、对巯基苯胺(PATP)、罗丹明B、罗丹明6G(R6G)、葡萄糖等作为探针分子，吸附在金或银纳米粒子基底表面，并首次使用分子模板增强试剂对吸附在基底上的探针分子构象进行约束，形成优化的增强条件。使用该方法得到的SERS信号相比于没有使用分子模板增强试剂有很明显的增强，增强因子在108左右。这项工作证明了分子模板增强试剂对表面增强拉曼光谱信号有很高的增强效果，并提供了实验和理论依据。该方法的增强机理是通过调整极低浓度时吸附在SERS基底上探针分子平行于基底的构象，形成有利于得到SERS信号的垂直于基底的分子构象，从而实现探针分子检测灵敏度的提高。
本发明通过制备传统的金或银纳米粒子自组装的SERS基底并吸附探针分子，之后采用分子模板增强试剂对极低浓度时探针分子的分子构象进行调整，与传统方法相比较，SERS信号有很大的增强。
本发明所述的一种利用分子模板增强试剂提升SERS基底检测灵敏度的方法，其步骤如下：
1.表面吸附探针分子的SERS基底的制备
1.1金纳米粒子溶胶的制备：采用柠檬酸钠还原法，即Frens法。这种方法制备的胶体金的颗粒大小一致，通过控制柠檬酸钠和氯金酸的比例可以制备出粒子直径从16～147nm范围内的金纳米粒子溶胶。
具体方法如下：把氯金酸先配制成质量浓度为0.01％的水溶液(实验所用水均为超纯水，下同)，取100mL水溶液加热至沸；搅拌下向其中加入0.5～8.5mL、质量浓度1％的柠檬酸钠水溶液，继续煮沸10～20分钟；此时可以观察到溶液从淡黄色很快变成灰色，继而转成黑色，随后逐渐稳定成红色，冷却至室温得到金纳米粒子溶胶。柠檬酸在开始的作用是还原剂。后来，带负电荷的柠檬酸根吸附到金纳米粒子表面，由于表面电荷的排斥作用使得金纳米粒子免于聚集。
1.2银纳米粒子溶胶的制备：柠檬酸钠还原的银溶胶的制备，将36mg硝酸银溶入200mL水中，快速加热至沸腾，在剧烈搅拌下迅速加入0.2～7.5mL、质量浓度1％的柠檬酸钠水溶液，保持微沸腾状态继续反应1～2小时，然后自然冷却至室温，得到褐灰色的银纳米粒子溶胶；该方法合成的银纳米粒子的直径范围为30～120nm。
1.3 SERS基底的制备
基片的预处理：把玻璃或硅片分别在水、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、乙醇、水中依次超声处理3～8分钟，然后放在质量浓度30％的H2O2水溶液和质量浓度98％的浓H2SO4水溶液的混合液(两种溶液的体积比为3：7)中煮15～30分钟，冷却后用水洗净；
聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)/银(金)薄膜的自组装方法：将预处理后的基片首先浸入0.01～0.1mol/L的PDDA水溶液中10～20分钟，取出后用水清洗，再浸入前面制备的金纳米粒子溶胶或银纳米粒子溶胶中5～8小时，取出后用水清洗，再用氮气吹干，从而得到表面自组装有金或银纳米粒子(纳米粒子层厚度为50～100nm)的SERS基底。
另外一种制备SERS基底的方法是，把预处理后的基片置于真空镀膜机中真空蒸镀上5～10nm厚的金或银薄膜，从而得到表面蒸镀有金或银纳米粒子的SERS基底。
1.4表面吸附探针分子的SERS基底的制备
将上述两种方法任一种方法制备的SERS基底置于探针分子的乙醇溶液(探针分子的浓度为10-6～10-9M)中浸泡20～30小时后取出，然后用乙醇清洗掉未被吸附的探针分子后氮气吹干，得到表面吸附探针分子的SERS基底；
上述方法所述的探针分子为能够吸附在SERS基底表面的分子，如吡啶、对巯基苯甲酸(MBA)、对巯基苯胺(PATP)、罗丹明B、罗丹明6G(R6G)、葡萄糖等。
2.在表面吸附探针分子的SERS基底上使用增强试剂；
配置10-4～10-6M的正己硫醇的乙醇溶液，将上述吸附探针分子的SERS基底浸泡在正己硫醇的乙醇溶液中4～10小时后用乙醇清洗，氮气吹干，得到构筑有分子模板的SERS基底。
3.增强试剂技术结合金或银纳米粒子SRES基底后的SERS测试
将前面制备得到的构筑有分子模板的SERS基底进行SERS测试，测试结果表明利用分子模板增强试剂有效地提升了SERS基底检测灵敏度。
本发明使用的仪器是Bruker公司的FTRaman光谱仪，激发源波长为633nm。
SERS光谱结果结合扫描电子显微镜(SEM)，原子力显微镜(AFM)，X射线光电子能谱(XPS)，初步判断引起信号明显增强的原因是化学增强，属于取向电荷转移机理。
本发明中，采用金或银纳米材料作为基底，结合新型的增强试剂技术，对探针分子进行表面增强拉曼光谱(SERS)检测。进一步提高了SERS基底的增强效果，实现了对待测物分子的超痕量检测。通过新方法的使用，得到更多探针分子与基底相互作用的信息。为进一步研究SERS的机理提供实验依据，同时也为发展SERS成为材料表面特殊性质的表征工具奠定基础。
附图说明
图1：实施例1所述的未使用增强试剂时不同浓度PATP分子(曲线1，探针分子浓度10-7M；曲线2，探针分子浓度10-8M；曲线3，探针分子浓度10-9M。)吸附在银基底上的SERS光谱；
图2：实施例1所述的增强试剂使用前(曲线1)和使用后(曲线2)10-9M的PATP分子的SESR光谱；
图3：实施例2所述的增强试剂使用前(曲线1)和使用后(曲线2)10-9M的MBA分子的SESR光谱；
图4：实施例3所述的增强试剂使用前(曲线1)和使用后(曲线2)10-9M的R6G分子的SERS光谱；
图5：实施例4所述的增强试剂使用前(曲线1)和使用后(曲线2)10-6M的葡萄糖分子的SERS光谱。
具体实施方案
实施例1：以表面自组装有银纳米粒子的SERS基底结合增强试剂技术在检测对巯基苯胺(PATP)分子中的应用
1.银溶胶的制备：将36mg硝酸银溶入200mL水中，快速加热至沸腾，在剧烈搅拌下迅速加入4mL、质量浓度1％的柠檬酸钠水溶液，保持微沸腾状态继续反应1.5小时，然后自然冷却，搅拌至室温，所得溶胶是褐灰色。得到粒径大小为70nm的银纳米粒子溶胶。银纳米粒子在玻璃基片上的组装：把玻璃基片分别在水、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、乙醇、水中超声清洗5分钟，然后放在质量浓度30％的H2O2水溶液和质量浓度98％的H2SO4水溶液(体积比为3:7)混合液中煮20分钟，冷却后用水洗净待用。PDDA/银薄膜的组装方法：把玻璃基片首先浸入0.01mol/L的PDDA水溶液中15分钟，取出后用水清洗，再浸入银纳米粒子溶胶中6小时，取出用水清洗后氮气吹干。
2.探针分子的吸附：将上述方法制备的SERS基底置于探针分子对巯基苯胺的乙醇溶液(探针分子浓度分别为10-7M、10-8M和10-9M)中浸泡24小时后取出，乙醇清洗掉未吸附的探针分子后氮气吹干。
3.基底表面使用增强试剂：配置10-5M的正己硫醇的乙醇溶液，将上述吸附有探针分子对巯基苯胺的SERS基底浸泡在正己硫醇的乙醇溶液中4小时后用乙醇清洗基底，氮气吹干待用。
4.探针分子的SERS检测：如图1所示，没有使用增强试剂时，吸附在SERS基底上的对巯基苯胺分子SERS信号强度随浓度降低而降低，当PATP浓度降低至10-9M时，SERS信号消失。这是由于当探针分子浓度极低时其在SERS基底上的构象发生变化，由高浓度时的直立状态转变为平行于基底的构象。根据SERS表面选择定则原理，这种构象不利于得到比较好的SERS增强效果。针对这个问题，我们提出了利用增强试剂技术改变极限浓度时PATP在SERS基底上的构象来达到增强SERS信号的效果。如图2所示，当在传统SERS基底上使用增强试剂后，得到了10-9M的PATP分子的信号，且在峰形和峰位置方面与增强试剂使用前没有明显变化，说明该方法具有很强的实用性。
实施例2：以金纳米粒子作为SERS基底结合增强试剂技术在检测对巯基苯甲酸(MBA)分子时的应用
1.金纳米粒子溶胶的制备：把氯金酸先配制成质量浓度0.01％的水溶液，取100mL加热至沸。搅拌下准确加入2.5mL、质量浓度1％的柠檬酸钠水溶液，继续煮沸15分钟。此时可以观察到溶液从淡黄色很快变成灰色，继而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。冷却至室温后得到金纳米粒子溶胶。
2.金纳米粒子在玻璃基片上的组装：把实验所用的玻璃基片分别在水、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、乙醇、水中超声清洗5分钟，然后放在质量浓度30％的H2O2水溶液和质量浓度98％的浓H2SO4水溶液(体积比为3:7)的混合液中煮20分钟左右，冷却后用水洗净待用。PDDA/金薄膜的组装方法是，把基片首先浸入0.01mol/L的PDDA水溶液中15分钟，取出后用水清洗，再浸入金纳米粒子溶胶中6小时，取出用水清洗后氮气吹干。
3.探针分子的吸附：将上述方法制备的SERS基底置于探针分子对巯基苯甲酸(MBA)的乙醇溶液中(探针分子的浓度为10-9M)浸泡24小时后取出，乙醇溶液清洗掉未吸附的探针分子后氮气吹干。
4.基底表面使用增强试剂：配置10-5M的正己硫醇的乙醇溶液，将上述吸附有探针分子的SERS基底浸泡在正己硫醇的乙醇溶液中4小时后用乙醇清洗基底，氮气吹干待用。
5.探针分子的SERS检测如图3所示，使用增强试剂前在传统SERS基底上不能得到10-9M的MBA分子的SERS信号，但在增强试剂使用之后可以得到信噪比非超高的SERS谱图，原理同实施例1，这里不在赘述。
实施例3：以银纳米粒子作为SERS基底结合增强试剂技术在检测罗丹明6G(R6G)分子时的应用
1.银溶胶的制备：将36mg硝酸银溶入200mL水中，快速加热至沸腾，在剧烈搅拌下迅速加入4mL、质量浓度1％的柠檬酸钠水溶液，保持微沸腾状态继续反应1.5小时，然后自然冷却，搅拌至室温。所得溶胶是褐灰色，得到了粒径大小为70nm的银纳米粒子溶胶。
2.银纳米粒子在玻璃基片上的组装：把实验所用的玻璃基片分别在水、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、乙醇、水中超声清洗5分钟，然后放在质量浓度30％的H2O2水溶液和质量浓度98％的浓H2SO4水溶液(体积比为3:7)的混合液中煮20分钟左右，冷却后用水洗净待用。PDDA/银薄膜的组装方法是，把基片首先浸入0.01mol/L的PDDA水溶液中15分钟，取出后用水清洗，再浸入银溶胶中6小时，取出用水清洗后氮气吹干。
3.探针分子的吸附：将上述方法制备的SERS基底置于罗丹明6G分子的乙醇溶液(探针分子浓度为10-9M)中浸泡24小时后取出，乙醇溶液清洗掉未吸附的探针分子后氮气吹干。
4.基底表面使用增强试剂：配置10-5M的正己硫醇乙醇溶液，将上述吸附有待测物分子的SERS基底浸泡在正己硫醇乙醇溶液中4小时后用乙醇清洗基底，氮气吹干待用。
5.如图4所示，在检测罗丹明6G(R6G)时使用增强试剂，得到了与PATP分子和MBA分子同样的结论，充分说明本方法具有普遍性。
实施例4：以真空蒸镀金薄膜作为SERS基底结合增强试剂技术在检测葡萄糖分子时的应用
1.真空蒸镀金薄膜的制备：将实验所用的玻璃基片分别在水、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、乙醇、水中超声清洗5分钟后置于蒸镀膜机中真空蒸镀上5nm厚的金薄膜，备用。
2.葡萄糖分子的吸附：将上述金基底浸泡在配置好的10-6M葡萄糖水溶液中8小时，取出后用水清洗氮气吹干。
3.增强试剂的使用：配置10-5M的正己硫醇乙醇溶液，将上述吸附有待测物分子的SERS基底浸泡在正己硫醇乙醇溶液中4小时后用乙醇清洗基底，氮气吹干待用。
4.样品SERS检测：如图5所示，使用增强试剂前后，葡萄糖样品的SERS强度有明显提高，证明增强试剂在检测葡萄糖分子时起到了巨大作用。

Claims (6)

1.一种利用分子模板增强试剂提升SERS基底检测灵敏度的方法，其步骤如下：
(1)表面吸附探针分子的SERS基底的制备
将预处理后的基片首先浸入0.01～0.1mol/L的PDDA水溶液中10～20分钟，取出后用水清洗，再浸入到金纳米粒子溶胶或银纳米粒子溶胶中5～8小时，取出后用水清洗，再用氮气吹干，得到表面自组装有金或银纳米粒子的SERS基底；
或将预处理后的基片真空蒸镀上5～10nm厚的金或银薄膜，从而得到表面蒸镀有金或银纳米粒子的SERS基底；
将上述任一种方法制备的SERS基底置于探针分子的乙醇溶液中浸泡20～30小时后取出，探针分子的浓度为10-6～10-9M，然后用乙醇清洗掉未被吸附的探针分子后氮气吹干，得到表面吸附探针分子的SERS基底；
(2)在表面吸附探针分子的SERS基底上使用增强试剂；
配置10-4～10-6M的正己硫醇的乙醇溶液，将上述吸附探针分子的SERS基底浸泡在正己硫醇的乙醇溶液中4～10小时后用乙醇清洗，氮气吹干，得到构筑有分子模板的SERS基底；
(3)增强试剂技术结合金或银纳米粒子SRES基底后的SERS测试
将前面制备得到的构筑有分子模板的SERS基底进行SERS测试，测试结果表明利用分子模板增强试剂有效地提升了SERS基底检测灵敏度。
2.如权利要求1所述的一种利用分子模板增强试剂提升SERS基底检测灵敏度的方法，其特征在于：基片为玻璃或硅片。
3.如权利要求1所述的一种利用分子模板增强试剂提升SERS基底检测灵敏度的方法，其特征在于：基片的预处理是将基片在水、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、乙醇、水中依次超声处理3～8分钟，然后放在质量浓度30％的H2O2水溶液和质量浓度98％的浓H2SO4水溶液的混合液中煮15～30分钟，两种溶液的体积比为3：7，冷却后用水洗净。
4.如权利要求1所述的一种利用分子模板增强试剂提升SERS基底检测灵敏度的方法，其特征在于：金纳米粒子溶胶的制备是将氯金酸先配制成质量浓度为0.01％的水溶液，取100mL水溶液加热至沸；搅拌下向其中加入0.5～8.5mL、质量浓度1％的柠檬酸钠水溶液，继续煮沸10～20分钟；冷却至室温得到粒子直径范围为16～147nm的金纳米粒子溶胶。
5.如权利要求1所述的一种利用分子模板增强试剂提升SERS基底检测灵敏度的方法，其特征在于：银纳米粒子溶胶的制备是将36mg硝酸银溶入200mL水中，快速加热至沸腾，在剧烈搅拌下迅速加入0.2～7.5mL、质量浓度1％的柠檬酸钠水溶液，保持微沸腾状态继续反应1～2小时，然后自然冷却至室温，得到粒子直径范围为30～120nm的银纳米粒子溶胶。
6.如权利要求1所述的一种利用分子模板增强试剂提升SERS基底检测灵敏度的方法，其特征在于：探针分子为吡啶、对巯基苯甲酸、对巯基苯胺、罗丹明B、罗丹明6G或葡萄糖。
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