CN107075500A - 能改变果实大小的方法和材料 - Google Patents

Abstract

本发明提供了通过改变产生果实的植物中miRNA172的表达来产生改变尺寸的果实或产生改变尺寸的果实的植物的材料和方法。本发明提供了通过遗传修饰(GM)和非GM法来产生改变尺寸的植物和果实的方法和材料。本发明还提供了改变尺寸的植物和果实。所述改变的尺寸可以为增大或减小的尺寸。

Description

能改变果实大小的方法和材料

技术领域

本发明涉及用于产生改变尺寸的果实的方法和材料。

背景技术

果实大小是重要的农艺学性状。果实大小的显著变化伴随着实质上所有有果实作物种类的驯化，所述作物包括番茄、西瓜、苹果、香蕉、葡萄、浆果和其他热带、亚热带和温带物种的广泛分类。

尽管农艺学性状的基础和应用是重要的，人们对该重要的农艺学性状之下的分子遗传学仍然知之甚少，特别是对多年生物种而言。

显着有益的是，开发可用于遗传操纵以用来、和/或加速具有改变的果实尺寸的植物的育种的工具。能够产生或选择出具有相对于未操纵或未选择的植物而言，增大或减小的果实尺寸的植物将是有益的。

因此，本发明的目的是提供用于产生改变尺寸的果实的新方法和组合物，或至少为公众提供有用的选择。

发明内容

本申请人的发明涉及通过操纵或选择植物中microRNA(microRNA172或miRNA172)的表达改变来改变果实尺寸的方法和材料。具体而言，申请人已经表明，当miRNA172的表达降低时，果实尺寸增大，相反地，当miRNA172的表达增加时，果实尺寸减小。

本发明具有许多应用，例如在需要所需果实尺寸的植物的遗传修饰中的应用，以及在用于开发或选择具有所需果实尺寸的植物的传统育种中的应用。

方法

在第一方面，本发明提供了用于改变果实尺寸的方法，所述方法包括改变植物中microRNA172(miRNA172)的表达或活性。

在另一方面，本发明提供了用于产生尺寸改变的果实的方法，所述方法包括改变植物中miRNA172的表达或活性。

在另一方面，本发明提供了用于产生具有改变尺寸的果实的植物的方法，所述方法包括改变植物中miRNA172的表达或活性。

改变包括增大或减小果实的尺寸。

因此，改变尺寸的果实可以意味着更大的果实或更小的果实。

提高miRNA172的表达或活性以获得更小的果实

在一个实施方案中，miRNA172的表达或活性增加，果实尺寸减小。

在一个实施方案中，通过用编码miRNA172的多核苷酸转化植物从而提高miRNA172的表达或活性。

在另一个实施方案中，将编码miRNA172的多核苷酸有效地连接于启动子序列。

在一个实施方案中，所述启动子相对于编码miRNA172的多核苷酸是异源的。

在一个实施方案中，启动子为在天然状态下通常不与编码miRNA172的多核苷酸有效连接的启动子。

降低miRNA172基因的表达或活性以获得更大的果实

在另一个实施方案中，miRNA172的表达或活性降低，果实尺寸增大。

可以通过任何方式降低miRNA172的表达或活性。

用于选择具有改变的果实尺寸的植物的非GM选择方法

在另一方面，本发明提供了用于鉴定这样的植物的方法，所述植物具有表现出产生改变尺寸的果实的基因型，所述方法包括对植物测试以下中的至少一者：

a)至少一种miRNA172的表达改变，

b)至少一种miRNA172基因的表达改变，

c)存在与至少一种miRNA172的表达改变相关的标记，

d)存在与至少一种miRNA172基因的表达改变相关的标记。

在一个实施方案中，a)至d)中任一者的存在表明植物将产生改变尺寸的果实。

在一个实施方案中，改变的表达是增加的表达，并且改变尺寸的果实是减小尺寸的果实。

在另一个实施方案中，改变的表达是降低的表达，并且改变尺寸的果实是增大尺寸的果实。

在另一个实施方案中，所述方法提供了培养所鉴定的植物的额外步骤。

在另一个实施方案中，所述方法提供了由鉴定的植物进行育种的额外步骤。

对具有改变尺寸的果实的植物进行育种的方法

在另一方面，本发明提供了用于产生这样的植物的方法，该植物产生至少一个尺寸改变的果实，所述方法包括使以下之一与另一种植物杂交：

a)本发明的植物，

b)通过本发明的方法产生的植物，以及

c)通过本发明的方法选择的植物，

其中通过杂交产生的子代是产生至少一个尺寸改变的果实的植物。

在一个实施方案中，所产生的植物具有至少一种miRNA172的增加的表达，并且尺寸改变的果实是尺寸减小的果实。

在另一个实施方案中，改变的表达是至少一种miRNA172的表达降低，并且改变尺寸的果实是增大尺寸的果实。

产生

构建体

构建体(用于增加植物中至少一种miRNA172或miRNA172基因的表达)

在另一方面，本发明提供了用于增加植物中至少一种miRNA172或miRNA172基因的表达的构建体。

在一个实施方案中，构建体包含与编码miRNA172的序列有效连接的启动子序列。

在一个实施方案中，该启动子是花-器官-特异性启动子。

在另一个实施方案中，启动子是果实特异性启动子。

在一个实施方案中，构建体中的启动子相对于编码miRNA172的序列是异源的。

在一个实施方案中，构建体中的启动子在天然状态下通常不与编码miRNA172的序列相关。

构建体(用于降低或消除植物中至少一种miRNA172或miRNA172基因的表达)

在另一方面，本发明提供了用于降低或消除植物中至少一种miRNA172或miRNA172基因的表达的构建体。

在一个实施方案中，构建体包含有效连接到miRNA172基因的至少一部分的启动子序列。

在一个实施方案中，所述基因的所述部分相对于启动子序列处于反义方向，并且形成用于RNAi沉默的发夹结构的一部分。

在一个实施方案中，miRNA172基因的所述部分是内源miRNA172基因的启动子的一部分。

优选地，所述基因的所述部分的长度为至少21个核苷酸。

这种类型的构建体可用于定向于miRNA172基因启动子的转录基因沉默。

因此，在一个实施方案中，所述构建体可用于定向于miRNA172基因启动子的转录基因沉默。

在另一个实施方案中，构建体包含与编码miRNA172的突变靶位点(靶模拟物)的序列连接的启动子。

在一个实施方案中，靶模拟物包含至少一个，优选至少2个，更优选至少3个相对于目标内源miRNA172的错配。

优选地，错配对应于目标内源miRNA172的位置11至13。

这种类型的构建体可用于miRNA靶标模拟以降低目标内源miRNA172的活性。

因此，在一个实施方案中，所述构建体是miRNA靶模拟构建体。

在另一个实施方案中，构建体是人工的miRNA-定向的抗miRNA构建体。

在另一个实施方案中，人工的miRNA-定向的抗miRNA构建体包含连接至前体人工miRNA(茎环序列)的启动子。

人工miRNA可以设计成靶向成熟的miRNA172以便使所有miRNA172家族成员沉默，或者可以设计成靶向miRNA172前体转录物的茎-环区域，以便仅使待靶向的个体家族成员沉默。

在一个实施方案中，启动子是花-器官-特异性启动子。

在另一个实施方案中，启动子是果实特异性启动子。

在一个实施方案中，构建体中的启动子相对于miRNA172基因的至少一部分是异源的。

在一个实施方案中，构建体中的启动子通常与miRNA172基因的至少一部分不相关。

改变尺寸的果实

在另一方面，本发明提供了一种通过本发明的方法而产生的尺寸改变的果实。

在一个实施方案中，果实尺寸减小。

在另一个实施方案中，果实具有增加的尺寸。

在另一方面，本发明提供了尺寸改变的果实，其中所述果实具有至少一种miRNA172的改变的表达。

在一个实施方案中，果实包含本发明的构建体。

在一个实施方案中，改变的表达是增加的表达，并且尺寸改变的果实是尺寸减小的果实。

在另一个实施方案中，改变的表达是降低的表达，并且尺寸改变的果实是尺寸增加的果实。

产生尺寸改变的果实的植物

在另一方面，本发明提供了一种产生至少一个尺寸改变的果实的植物，该植物通过本发明的方法产生。

在另一方面，本发明提供了一种产生至少一个尺寸改变的果实的植物，其中所述植物具有至少一种miRNA172的改变的表达。

在一个实施方案中，植物包含本发明的构建体。

在一个实施方案中，改变的表达是增加的表达，并且改变尺寸的果实是减小尺寸的果实。

在另一个实施方案中，改变的表达是降低的表达，并且改变尺寸的果实是增加尺寸的果实

植物/果实

植物可以来自产生果实的任何物种。

优选的植物包括苹果、梨、桃、猕猴桃、番茄、草莓、香蕉和橙等植物。

优选的苹果种类是苹果属(Malus)。

优选的苹果种包括：窄叶海棠(Malus angustifolia)、花红(Malus asiatica)、山荆子(Malus baccata)、野香海棠(Malus coronaria)、台湾林檎(Malus doumeri)、弗洛伦萨海棠(Malus florentina)、多花海棠(Malus floribunda)、Malus fusca、垂丝海棠(Malus halliana)、河南海棠(Malus honanensis)、湖北海棠(Malus hupehensis)、爱荷华海棠(Malus ioensis)、陇东海棠(Malus kansuensis)、毛山荆子(Malus mandshurica)、西府海棠(Malus micromalus)、红肉苹果(Malus niedzwetzkyana)、沧江海棠(Malusombrophiila)、东方苹果(Malus orientalis)、西蜀海棠(Malus prattii)、楸子(Malusprunifolia)、苹果(Malus pumila)、撒氏海棠(Malus sargentii)、三叶海棠(Malussieboldii)、新疆野苹果(Malus sieversii)、塞威氏苹果(Malus sylvestris)、变叶海棠(Malus toringoides)、花叶海棠(Malus transitoria)、三裂叶海棠(Malus trilobata)、野木海棠(Malus tschonoskii)、苹果(Malus x domestica)、苹果新疆野苹果(Malus xdomestica x Malussieversii)、苹果西洋梨(Malus x domestica x Pyrus communis)、小金海棠(Malus xiaojinensis)和滇池海棠(Malus yunnanensis)。

特别优选的苹果种是苹果(Malus x domestica)。

优选的梨种类是梨属(Pyrus)。

优选的梨种包括：豆梨(Pyrus calleryana)、高加索梨(Pyrus caucasica)、西洋梨(Pyrus communis)、Pyrus elaeagrifolia、杂交梨品种(Pyrus hybrid cultivar)、沙梨(Pyrus pyrifolia)、柳叶梨(Pyrus salicifolia)、秋子梨(Pyrus ussuriensis)、中国白梨(Pyrus x bretschneideri)。

特别优选的梨种是西洋梨(Pyrus communis)和亚洲梨中国白梨(Pyrus xbretschneideri)。

优选的桃种类是李属(Prunus)。

优选的桃种包括：非洲李(Prunus africana)、奥丁宇樱(Prunus apetala)、Prunus arborea、杏(Prunus armeniaca)、欧洲甜樱桃(Prunus avium)、Prunus bifrons、犬樱(Prunus buergeriana)、绯寒樱(Prunus campanulata)、灰毛叶樱桃(Prunuscanescens)、樱桃李(Prunus cerasifera)、云南早樱(Prunus cerasoides)、酸樱桃(Prunus cerasus)、Prunus ceylanica、那不勒斯李(Prunus cocomilia)、光萼稠李(Prunus cornuta)、樱桃木(Prunus crassifolia)、山桃(Prunus davidiana)、欧洲李(Prunus domestica)、扁桃(Prunus dulcis)、灌木樱桃(Prunus fruticosa)、Prunusgeniculata、麦李(Prunus glandulosa)、Prunus gracilis、灰叶稠李(Prunus grayana)、柳树樱(Prunus incana)、富士樱(Prunus incisa)、阿富汗樱桃(Prunus jacquemontii)、郁李(Prunus japonica)、Prunus korshinskyi、Prunus kotschyi、桂樱(Prunuslaurocerasus)、Prunus laxinervis、葡萄牙桂樱(Prunus lusitanica)、斑叶稠李(Prunusmaackii)、圆叶樱桃(Prunus mahaleb)、东北杏(Prunus mandshurica)、黑樱桃(Prunusmaximowiczii)、小花桃(Prunus minutiflora)、梅(Prunus mume)、Prunus murrayana、Prunus myrtifolia、千岛樱(Prunus nipponica)、Prunus occidentalis、稠李(Prunuspadus)、碧桃(Prunus persica)、Prunus pleuradenia、中国樱桃(Prunuspseudocerasus)、山樱桃(Prunus prostrata)、中国李(Prunus salicina)、大山樱(Prunussargentii)、Prunus scoparia、细齿樱桃(Prunus serrula)、青肤樱(Prunus serrulata)、山杏(Prunus sibirica)、杏李(Prunus simonii)、樱桃李(Prunus sogdiana)、大岛樱(Prunus speciosa)、刺叶桂樱(Prunus spinulosa)、深山犬樱(Prunus ssiori)、大叶早樱(Prunus subhirtella)、矮扁桃(Prunus tenella)、毛樱桃(Prunus tomentosa)、榆叶梅(Prunus triloba)、Prunus turneriana、熊李(Prunus ursina)、Prunus vachuschtii、霞樱(Prunus verecunda)、江户樱(Prunus×yedoensis)、大叶桂樱(Prunus zippeliana)、Prunus alabamensis、阿利根尼李(Prunus alleghaniensis)、美洲李(Prunusamericana)、Prunus andersonii、奇克索李(Prunus angustifolia)、布里扬松杏(Prunusbrigantina)、Prunus buxifolia、美国桂樱(Prunus caroliniana)、Prunus cuthbertii、苦樱桃(Prunus emarginata)、Prunus eremophila、Prunus fasciculata、Prunusfremontii、灌樱(Prunus geniculata)、Prunus gentryi、Prunus havardii、郝图兰李(Prunus hortulana)、Prunus huantensis、圣叶樱桃(Prunus ilicifolia)、Prunusintegrifolia、海滩李(Prunus maritima)、巨树李(Prunus mexicana)、雁李(Prunusmunsoniana)、紫杏(Prunus nigra)、美国酸樱桃(Prunus pensylvanica)、沙樱桃(Prunuspumila)、松李(Prunus rigida)、Prunus rivularis、野黑樱(Prunus serotina)、Prunussphaerocarpa、奥勒冈州李(Prunus subcordata)、Prunus texana、伞花李(Prunusumbellate)和紫叶稠李(Prunus virginiana)。

特别优选的桃种是碧桃(Prunus persica)。

优选的猕猴桃种类是猕猴桃属(Actinidia)。

优选的猕猴桃种包括：软枣猕猴桃(Actinidia arguta)、阿里山猕猴桃(Actinidia arisanensis)、硬齿猕猴桃(Actinidia callosa)、肉叶猕猴桃(Actinidiacarnosifolia)、城口猕猴桃(Actinidia chengkouensis)、中华猕猴桃(Actinidiachinensis)、金花猕猴桃(Actinidia chrysantha)、灰毛猕猴桃(Actinidiacinerascens)、软枣猕猴桃(Actinidia cordifolia)、革叶猕猴桃(Actinidia coriacea)、柱果猕猴桃(Actinidia cylindrica)、美味猕猴桃(Actinidia deliciosa)、毛花猕猴桃(Actinidia eriantha)、粉毛猕猴桃(Actinidia farinosa)、簇花猕猴桃(Actinidiafasciculoides)、条叶猕猴桃(Actinidia fortunatii)、金叶猕猴桃(Actinidiafoveolata)、黄毛猕猴桃(Actinidia fulvicoma)、粉叶猕猴桃(Actinidia glauco-callosa-callosa)、华南猕猴桃(Actinidia glaucophylla)、圆果猕猴桃(Actinidiaglobosa)、纤小猕猴桃(Actinidia gracilis)、大花猕猴桃(Actinidia grandiflora)、长叶猕猴桃(Actinidia hemsleyana)、蒙自猕猴桃(Actinidia henryi)、全毛猕猴桃(Actinidia holotricha)、湖北猕猴桃(Actinidia hubeiensis)、中越猕猴桃(Actinidiaindochinensis)、狗枣猕猴桃(Actinidia kolomikta)、滑叶猕猴桃(Actinidialaevissima)、小叶猕猴桃(Actinidia lanceolata)、阔叶猕猴桃(Actinidia latifolia)、薄叶猕猴桃(Actinidia leptophylla)、两广猕猴桃(Actinidia liangguangensis)、漓江猕猴桃(Actinidia lijiangensis)、临桂猕猴桃(Actinidia linguiensis)、长果猕猴桃(Actinidia longicarpa)、大籽猕猴桃(Actinidia macrosperma)、海棠猕猴桃(Actinidiamaloides)、黑蕊猕猴桃(Actinidia melanandra)、美丽猕猴桃(Actinidia melliana)、倒卵叶猕猴桃(Actinidia obovata)、俄勒冈猕猴桃(Actinidia oregonensis)、桃花猕猴桃(Actinidia persicina)、贡山猕猴桃(Actinidia pilosula)、葛枣猕猴桃(Actinidiapolygama)、紫果猕猴桃(Actinidia purpurea)、融水猕猴桃(Actinidia rongshuiensis)、红茎猕猴桃(Actinidia rubricaulis)、昭通猕猴桃(Actinidia rubus)、糙叶猕猴桃(Actinidia rudis)、山梨猕猴桃(Actinidia rufa)、密花猕猴桃(Actinidiarufotricha)、清风藤猕猴桃(Actinidia sabiaefolia)、花楸猕猴桃(Actinidiasorbifolia)、星毛猕猴桃(Actinidia stellato-pilosa-pilosa)、安息香猕猴桃(Actinidia styracifolia)、栓叶猕猴桃(Actinidia suberifolia)、四萼猕猴桃(Actinidia tetramera)、毛蕊猕猴桃(Actinidia trichogyna)、榆叶猕猴桃(Actinidiaulmifolia)、伞花猕猴桃(Actinidia umbelloides)、对萼猕猴桃(Actinidia valvata)、显脉猕猴桃(Actinidia venosa)、葡萄叶猕猴桃(Actinidia vitifolia)和浙江猕猴桃(Actinidia zhejiangensis)。

特别优选的猕猴桃种是软枣猕猴桃(Actinidia arguta)、中华猕猴桃(Actinidiachinensis)和美味猕猴桃(Actinidia deliciosa)。

优选的番茄种类是茄属(Solanum)。

优选的番茄种是番茄(Solanum lycopersicum)。

优选的香蕉种类是芭蕉属(Musa)

优选的香蕉种包括：小果野蕉(Musa acuminata)、野蕉(Musa balbisiana)和粉花蕉(Musa×paradisiacal)。

优选的橙种类是柑橘属(Citrus)。

优选的橙种包括：来檬(Citrus aurantiifolia)、Citrus crenatifolia、柚子(Citrus maxima)、香橼(Citrus medica)、柑橘(Citrus reticulata)、枳(Citrustrifoliata)、澳大利亚来檬(Australian limes Citrus australasica)、澳洲圆青柠(Citrus australis)、澳洲沙漠青柠(Citrus glauca)、Citrus garrawayae、Citrusgracilis、无香指橘(Citrus inodora)、新几内亚野酸橙(Citrus warburgiana)、Citruswintersii、金橘(Citrus japonica)、金柑(Citrus indica)和甜橙(Citrus×sinensis).

特别优选的橙种是：柚子(Citrus maxima)、柑橘(Citrus reticulate)、甜橙(Citrus×sinensis)。

优选的葡萄种类是葡萄属(Vitis)。

优选的葡萄种包括：葡萄(Vitis vinifera)、美洲葡萄(Vitis labrusca)、河岸葡萄(Vitis riparia)、夏葡萄(Vitis aestivalis)、圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)、沙地葡萄(Vitis rupestris)、紫葛(Vitis coignetiae)、山葡萄(Vitis amurensis)、河岸葡萄(Vitis vulpine)。

特别优选的葡萄种是葡萄(Vitis vinifera)。

在优选的实施方案中，植物来自产生附果的物种。

附果

与源自子房组织的真果不同，附果源自其他花组织或花托组织。

来源于萼筒(hypanthium)组织的果实

优选的附果种类包括其中果肉来源于萼筒组织的那些。萼筒是围绕心皮的萼片、花瓣和雄蕊组织的管。

果肉来源于萼筒组织的优选的植物包括苹果和梨植物(如上所述)。其中果肉来源于萼筒组织的其他优选的植物包括温桲(quince)、枇杷和山楂。

优选的温桲种类是木瓜属(Chaenomeles)。优选的温桲种包括：毛叶木瓜(Chaenomeles cathayensis)和皱皮木瓜(Chaenomeles speciosa)。特别优选的温桲种是皱皮木瓜(Chaenomeles speciosa)。

优选的枇杷种类是枇杷属(Eriobotrya)。优选的枇杷种包括：枇杷(Eriobotryajaponica)和枇杷(Eriobotrya japonica)。特别优选的枇杷种是枇杷(Eriobotryajaponica)。

优选的山楂种类是山楂属(Crataegus)。优选的山楂种包括：南欧山楂(Crataegusazarolus)、哥伦比亚纳山楂(Crataegus columbiana)、白玉山楂(Crataegus crus-galli)、Crataegus curvisepala,彩叶山楂(Crataegus laevigata)、绯红山楂(Crataegusmollis),单子山楂(Crataegus monogyna)、欧洲黑山楂(Crataegus nigra)、Crataegusrivularis和Crataegus sinaic。

植物部分、繁殖体和子代

在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的植物的部分、子代或繁殖体。

优选地，所述部分、子代或繁殖体具有至少一种miRNA172或miRNA172基因的改变的表达。

优选地，所述部分、子代、繁殖体包含本发明的构建体。

术语植物的“部分”是指植物的任何部分。术语“部分”优选包括以下中的任意一种：组织、器官、果实和种子。

术语植物的“繁殖体”优选包括植物的可用于再生新植物的任何部分。优选地，术语“繁殖体”包括种子和插条(cutting)。

术语“子代”包括植物的任何后代。子代可以作为与另一种植物有性杂交的结果产生。子代植物也可以是无性产生的。

本发明的详述

定义

果实尺寸

术语果实尺寸是指果实的体积。

评估果实体积的便利方法可以是测量果实的直径或果实的重量。

改变的果实尺寸

术语改变的果实尺寸是指相对于对照植物的尺寸，果实的尺寸改变。

改变的果实尺寸可以是增大或减小的果实尺寸。在一个实施方案中，改变的果实尺寸是增大的果实尺寸。在另一个实施方案中，改变的果实尺寸是减小的果实尺寸。

对照植物可以是以下中的至少一者：

-野生型植物

-非转化植物

-用对照构建体转化的植物

-非选择的植物

MicroRNA

microRNA(缩写miRNA)是长度为20-22nt(核苷酸)的小RNA分子，存在于真核生物中并由真核生物的基因组编码。miRNA主要通过与靶基因的RNA互补配对从而识别靶基因，然后通过miRNA-RISC(RNA诱导的沉默复合物)抑制靶基因的表达(Jones-Rhoades M W,Bartel D P,and Bartel B.MicroRNAs and their regulatory roles in plants.AnnualReview of Plant Biology,2006,57:19-53)。

每个miRNA基因产生至少三种RNA种类，包括：

·原-miRNA(pri-miRNA)，

·前体-miRNA(pre-miRNA)，和

·成熟miRNA

这些miRNA通过连续的内切核苷酸成熟步骤产生(Kim VN MicroRNA biogenesis:coordinated cropping and dicing.Nat Rev Mol Cell Biol 2005,6:376-385)。

pri-miRNA是长度为约60至约2000个核苷酸的初级转录物。pri-miRNA在结构上类似于标准信使RNA(mRNA)，具有5'-CAP和3'poly(A)等特征。因此，pri-miRNA可以克隆到常规cDNA文库中或在常规cDNA文库中鉴定。

中间体pre-miRNA(前体miRNA)的长度为约60个核苷酸。Pre-miRNA形成稳定的回折二级结构，其被miRNA成熟所必需的酶识别。

pre-miRNA的加工导致产生长度为约20-22nt(核苷酸)核苷酸的成熟miRNA。

虽然pre-miRNA分子可以具有一些非常小的ORF，但是没有发现可以翻译蛋白质的pre-miRNA分子。

形成miRNA的Pre-miRNA位于miRNA基因的转录物中，并且通常长度为60nt至200nt。

miRNA在植物发育、生长和对生物和非生物应激的应答中具有重要的调节作用。许多miRNA的靶基因属于转录因子家族。相同的miRNA通常可抑制多种靶基因的功能，同时调节植物发育和生长期间的各种互连过程。

例如，miRNA156的过表达使拟南芥(Arabidopsis thaliana)的叶数增加超过100倍并且植物干重提高5倍，并延迟开花时间(Wu G and Poethig R S，Temporal regulationof shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its targetSPL3.Development,2006,133:3539-3547)。

在玉米(corm)中，miRNA172除了调节开花时间以外，还调节花器官的性别分化(Chuck G，Meeley R，Irish E，Sakai H和Hake S，The maize tasselseed4 microRNAcontrols sex determination and meristem cell fate by targeting Tasselseed6/indeterminate spikelet1.Nat Genet,2007,39:1517-1521)

miRNA172

像其他miRNA一样，miRNA172已经显示出调节植物中的各种过程。在玉米(maize)中，已报道microRNA172下调glossy15并由此促进营养阶段改变(Lauter等，Proc NatlAcad Sci USA.2005Jun28；102(26):9412-7.Epub 2005 Jun 15)。在大麦中，已经报道了利用HvAPETALA2和microRNA172的等位基因之间的相互作用来确定花序上的谷粒的密度。在拟南芥中，已经提出了miRNA172、Gigantea(GI)和WRKY44之间的相互作用通过影响糖信号来调节避旱性和耐旱性(Hanet et al，PLoS One.2013 Nov 6；8(11):e73541.doi:10.1371/journal.pone.0073541.eCollection 2013)。

miRNA172序列和编码它们的基因是本领域熟知的。

在许多植物物种中发现miRNA172并且其是高度保守的。

在一个实施方案中，miRNA172的长度为21个核苷酸。

在一个实施方案中，miRNA172包含与下表1中列出的、以及在序列表中示出的miRNA172序列中的任一者具有至少70％同一性的序列。

在另一个实施方案中，miRNA172包含SEQ ID NO:1的共有序列。

在另一个实施方案中，miRNA172包含SEQ ID NO:44的保守序列。

在另一个实施方案中，miRNA172包含与SEQ ID NO:2的序列具有至少70％同一性的序列。

在另一个实施方案中，miRNA172包含下表1中列出、以及在序列表中示出的miRNA172序列的序列。

在另一个实施方案中，miRNA172包含SEQ ID NO:2的序列。

MicroRNA172基因

在一个实施方案中，miRNA172基因编码如上所定义的miRNA172。

在另一个实施方案中，miRNA172基因包含与下表1中列出以及在序列表中示出的miRNA172基因序列中的任一者具有至少70％同一性的序列。

在另一个实施方案中，miRNA172基因包含与SEQ ID NO:41的序列具有至少70％同一性的序列。

在另一个实施方案中，miRNA172基因包含下表1中列出的以及显示在序列表中的任一miRNA172基因序列的序列。

在另一个实施方案中，miRNA172基因包含SEQ ID NO:41的序列。

表1：miRNA172序列

克隆的miRNA172序列当然可以用作探针或引物，以使用本领域技术人员公知的和本文描述的方法鉴定来自其他物种的其他miRNA172、miRNA172基因和启动子。

基因

本文使用的术语“基因”可以是减少或消除miRNA172或miRNA172基因表达的靶标。

术语基因包括编码蛋白质的序列，其可以是分离的外显子、任何调节序列(包括启动子和终止子序列)、5'和3'非翻译序列和内含子。

本领域技术人员已知基因的任何这种特征可以在沉默方法例如反义、正义抑制和RNA干扰(RNAi)中被靶向。

改变的microRNA活性

术语减少的表达、减少表达和其语法等价物是指相对于以下至少一者的表达的表达减少/降低：

-野生型植物

-非转化植物

-用对照构建体转化的植物

-非选择的植物

对照构建体可以是例如空载体构建体。

增加miRNA172表达的方法

用于增加miRNA172的表达的方法对于本领域技术人员将是显而易见的。例如，编码miRNA172(例如pri-miRNA172)的序列可以被克隆成有效连接到合适的启动子上，以驱动pri-miRNA172的表达，导致功能加工以在植物中产生成熟miRNA172。

这样的克隆和表达方法是本领域技术人员公知的，并且在本文中进行了描述并在实施例中进行了说明。

抑制microRNA活性的方法

抑制microRNA活性的方法也是本领域技术人员熟知的，并且在例如文献Eamensand Wang(Plant Signaling&Behaviour 6:3,349-359,2001)中有所描述。

根据本发明的抑制miRNA172活性的方法包括但不限于转录基因沉默、miRNA靶模拟和人工miRNA-定向抗miRNA技术，所有这些在文献Eamens and Wang(Plant Signaling&Behaviour 6:3,349-359,2011)有所描述。

因此可以通过任何方式降低miRNA172的表达或活性。

转录基因沉默

在一个实施方案中，通过转录基因沉默而降低miRNA172的表达或活性。

在一个实施方案中，编码miRNA172的内源基因的表达被抑制。

在一个实施方案中，内源基因通过RNAi沉默所抑制。

在另一个实施方案中，RNAi沉默受到引入靶向内源基因的RNAi构建体的影响。

在一个实施方案中，RNAi构建体靶向内源基因的启动子。

这种方法可用于沉默发现miRNA172序列家族的物种中的该家族的个体成员。

miRNA靶模拟

在另一个实施方案中，通过miRNA靶模拟而降低miRNA172的表达或活性。

这种方法可用于沉默发现miRNA172序列家族的物种中的该家族的多个成员。

人工miRNA定向的抗miRNA技术

在另一个实施方案中，通过人工miRNA定向的抗miRNA技术降低miRNA172的表达或活性。

表达构建体或沉默构建体的靶向表达

当在上述讨论的方法中表达序列时，使用组织或发育阶段特异性启动子可能是有用的。这可以用于例如靶向特定组织或发育阶段以表达miRNA172。或者，该方法可用于靶向仅在特定组织中或特定发育阶段表达的miRNA172或miRNA172的沉默。

组织特异性启动子

组织特异性启动子是本领域技术人员已知的。

合适的组织特异性启动子包括花器官特异性启动子和果实特异性启动子。

合适的花器官特异性启动子包括但不限于：子房特异性启动子，例如用于番茄脯氨酸富集蛋白基因的TPRP-F1启动子(文献“Carmiet et al，Induction of parthenocarpyin tomato via specific expression of the rolB gene in the ovary.Planta,2003.217(5):p.726-735”)，其用于改变miRNA172的表达或活性以调节从子房组织发育的果实的大小；和萼片特异性启动子，例如MdMADS5/MdAP1基因的启动子(文献“Mimidaet etal，Expression patterns of several floral genes during flower initiation inthe apical buds of apple(Malus x domestica Borkh)revealed by in situhybridization.Plant Cell Reports,2011.30(8):p.1485-1492”)，其用于改变miRNA172表达或活性以调节从萼筒组织发育的果实的尺寸。

合适的果实特异性启动子包括但不限于：MdMADS6、7、8和9基因的启动子(文献“Yao et al.,Seven MADS-box genes in apple are expressed in different parts ofthe fruit.Journal of the American Society for Horticultural Science,1999.124(1):p.8-13”)，其驱动来自果实发育早期阶段的基因表达并响应于授粉诱导的基因表达。

检测miRNA172表达改变的方法

用于检测miRNA172表达改变的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可以使用定量RT-PCR分析(文献“Drummond,R.S.M.et al，Plant Physiology 151,1867-1877,2009”)来确定miRNA前体的相对水平。此外，茎-环RT-PCR miRNA检验(文献“Varkonyi-Gasic,E.,Wu,R.,Wood,M.,Walton,E.F.&Hellens,R.P.Protocol:a highly sensitive RT-PCRmethod for detection and quantification of microRNAs.Plant Methods 3,2007”)可以用于确定成熟miRNA的相对水平。

标记辅助选择

标记辅助选择(MAS)是通常用于使用与特定性状相关的单个遗传标记或多个遗传标记来鉴定具有该性状的植物的方法。MAS可以允许育种者在植物未成熟时对其进行鉴定和选择，并且对于在未成熟阶段难以测量的果实性状特别有价值。MAS的最佳标记是因果突变(causal mutation)，但是当这些突变不可用时，也可以使用与因果突变具有强连锁不平衡(strong linkage disequilibrium)的标记。这样的信息可以用于加速遗传获得量或降低性状测量成本，因此在商业育种程序中是有用的。

用于标记辅助选择的方法是本领域技术人员熟知的，例如：(文献“Collard,B.C.Y.和D.J.Mackill，Marker-assisted selection:an approach for precision plantbreeding in the twenty-first century.Philosophical Transactions of the RoyalSociety B-Biological Sciences,2008.363(1491):p.557-572”)。

标记

用于本发明方法的标记可以包括核酸标记，例如单核苷酸多态性(SNP)、简单序列重复(SSR或微卫星)、插入，置换、插入缺失(indel)和缺失。

优选地，标记与性状是连锁不平衡(LD)的。

优选地，标记与性状的LD的D’值为至少0.1、更优选至少0.2、更优选至少0.3、更优选至少0.4、更优选至少0.5。

优选地，标记与性状的LD的R²值为至少0.05、更优选至少0.075、更优选至少0.1、更优选至少0.2、更优选至少0.3、更优选至少0.4、更优选至少0.5。

本文使用的术语“连锁不平衡”或LD是指两种独立的遗传标记的相关或同现的强度的衍生统计度量。可以使用各种统计方法来概括两种标记之间的连锁不平衡(LD)，但是在实践中，仅广泛使用称为D'和R²的这两种方法。

与性状连锁(link)和/或LD的标记可以是任意类型，包括但不限于SNP、取代、插入、缺失、插入缺失、简单序列重复(SSR)。

在本发明中，标记与miRNA172的表达改变相关。

申请人所鉴定的一种这样的标记存在转座因子(TE)。在SEQ ID NO:43中示出了TE的序列。

为了对miRNA172p基因座进行基因分型，可以使用位于TE插入的上游和下游的引物进行PCR扩增。扩增产生miRNA172p的不含TE插入的CAFS等位基因的小片段，并产生含有TE的cafs等位基因的大片段。cafs等位基因(包含TE)降低miRNA172表达并增加果实尺寸，而CAFS等位基因(不含TE)减小果实尺寸。这在实施例1中进一步进行了解释。在图6中示出了引物和TE的合适引物序列。

因此，在一个实施方案中，标记包含SEQ ID NO:43所示的序列。

与miRNA172连锁的其他标记

当选择大果实时，最理想的是确定存在上述讨论的TE。然而，根据本申请人的公开内容，本领域技术人员将知道，也可以通过鉴定存在与TE连锁的标记来选择大果实。利用这种连锁标记的选择方法也构成本发明的一部分。用于鉴定此类连锁标记的方法是本领域技术人员已知的，并在本实施例中示出。此外，作为实例，还在图2b中示出了与TE连锁的几种标记。

因此，在另一个实施方案中，标记包括图2b中所示的任何一种标记。

多核苷酸和片段

本文中所用术语“多核苷酸”是指，任何长度但优选至少15个核苷酸的单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，包括以下非限制性实例：基因的编码及非编码序列、有义及反义互补序列、外显子、内含子、基因组DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酸酶、重组多肽、分离和纯化的天然存在的DNA或RNA序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探针、引物和片段。

优选地，术语“多核苷酸”包括特定序列及其互补序列。

本文提供的多核苷酸序列的“片段”是连续核苷酸的子序列，例如至少长度为15个核苷酸的序列。本发明所述的片段包含本发明所述的多核苷酸的连续核苷酸中的15个核苷酸，优选至少20个核苷酸，更优选至少30个核苷酸，更优选至少50个核苷酸，更优选至少50个核苷酸，最优选至少60个核苷酸。用于沉默(特别是RNA干扰(RNAi))方法的多核苷酸片段的长度优选为至少21个核苷酸。

术语“引物”是指通常有游离的3’OH的短的多核苷酸，其与模板杂交并用于启动与靶体互补的多核苷酸的聚合。

本发明用于多核苷酸序列的术语“分离的”是指从它们的天然细胞环境中提取出来的序列。在一个实施方案中，所述序列从其自然界发现的侧翼序列中分离出来。分离的分子可通过任何方法或方法的组合获得，包括生物化学的、重组的及合成的技术。

术语“重组体”是指在其天然环境中合成产生或从围绕它的序列中除去的多核苷酸序列。重组序列可以与在其天然环境中不存在的序列重组。

就源自特定属或种的多核苷酸而言，术语“源自”是指，所述多核苷酸或多肽具有与在该属或种中天然发现的多核苷酸或多肽相同的序列。因此，源自特定属或种的多核苷酸或多肽可以合成地或重组地产生。

变体

本文中所用术语“变体”是指，多核苷酸序列不同于具体鉴别出的序列，其中缺失、置换或添加了一个或多个核苷酸或氨基酸残基。变体可为天然存在的等位基因变体或非天然存在的变体。变体可来自同一物种或来自其它物种，且可包括同系物、旁系同源物及直系同源物。在某些实施方案中，本文公开的多核苷酸的变体具有与公开的多核苷酸相同或相似的生物活性。与多肽和多核苷酸有关的术语“变体”涵盖如本文定义的所有形式的多肽和多核苷酸。

多核苷酸变体

变体多核苷酸序列优选地与本发明的序列表现出至少50％、更优选至少51％、更优选至少52％、更优选至少53％、更优选至少54％、更优选至少55％、更优选至少56％、更优选至少57％、更优选至少58％、更优选至少59％、更优选至少60％、更优选至少61％、更优选至少62％、更优选至少63％、更优选至少64％、更优选至少65％、更优选至少66％、更优选至少67％、更优选至少68％、更优选至少69％、更优选至少70％、更优选至少71％、更优选至少72％、更优选至少73％、更优选至少74％、更优选至少75％、更优选至少76％、更优选至少77％、更优选至少78％、更优选至少79％、更优选至少80％、更优选至少81％、更优选至少82％、更优选至少83％、更优选至少84％、更优选至少85％、更优选至少86％、更优选至少87％、更优选至少88％、更优选至少89％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％和最优选至少99％的同一性。同一性存在于本发明的多核苷酸的至少20个核苷酸位置的比较窗口、优选至少50个核苷酸位置的比较窗口、更优选至少100个核苷酸位置的比较窗口、最优选本发明多核苷酸的整个长度的比较窗口。

可以按如下方式测定多核苷酸序列同一性。在bl2seq(文献“TatianaA.Tatusova,Thomas L.Madden(1999),“Blast 2sequences-a new tool for comparingprotein and nucleotide sequences”,FEMS Microbiol Lett.174:247-250”)中，使用BLASTN(来自BLAST程序套件，2.2.5版[2002年11月])，将主题多核苷酸序列与候选多核苷酸序列进行比较，所述bl2seq可从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公开获得。在一个实施方案中，利用bl2seq的默认参数。在另一个实施方案中，除了应关闭对低复杂性部分的过滤以外，利用bl2seq的默认参数。

也可以使用总体序列比对程序(例如Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)，在候选序列与主题多核苷酸序列之间的重叠部分的整个长度上计算多核苷酸序列同一性。Needleman-Wunsch总体比对算法的一个完整实现，参见EMBOSS包中的needle程序(Rice,P.Longden,I.and Bleasby,A.EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite,Trends in Genetics June 2000,第16卷，第6期，第276-277页)。该EMBOSS包可从http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/得到。欧洲生物信息协会(European Bioinformatics Institute)服务器也在http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/上在线提供进行两个序列之间的EMBOSS-needle总体比对的工具。

或者，可使用GAP程序，其计算两个序列在无处罚末端空隙的情况下的最佳总体比对。GAP描述在以下论文中：Huang,X.(1994)On Global Sequence Alignment.ComputerApplications in the Biosciences 10,227-235。

计算多核苷酸％序列同一性的优选方法基于使用Clustal X(Jeanmougin et al,1998,Trends Biochem.Sci.23,403-5.)来对比待比较的序列。

本发明的多核苷酸变体也涵盖这样的变体：所述变体表现出与可能保留那些序列的功能等效性的一个或多个特定鉴别的序列的相似性，以及不能合理预期会发生随机改变。关多肽的这种序列相似性可以使用从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)的BLAST程序套件(2.2.5版[2002年11月])可公开获得的bl2seq程序进行测定。

或者，本发明的变体多核苷酸在严谨条件下与指定的多核苷酸序列或其互补序列杂交。

术语“在严谨条件下杂交”及其语法等效描述是指，多核苷酸分子在限定的温度及盐浓度条件下与靶多核苷酸分子(诸如固定于DNA或RNA印迹(诸如Southern印迹或Northern印迹)上的靶多核苷酸分子)杂交的能力。可以通过最初在较低严谨性条件下杂交，随后将严谨性增加至希望的严谨性，确定在严谨杂交条件下杂交的能力。关于长度大于约100个碱基的多核苷酸分子，典型的严谨杂交条件为，比天然双链体的解链温度(Tm)低不超过25至30℃(例如10℃)(一般参见，Sambrook等人编,1987,分子克隆,实验室手册,第2版.冷泉港出版社；Ausubel等人,1987,分子生物学现代方法,Greene出版社)。大于约100个碱基的多核苷酸分子的Tm可通过下式来计算：Tm＝81.5+0.41％(G+C-log(Na+).(Sambrook等人,Eds,1987,分子克隆,实验室手册,第2版.冷泉港出版社；Bolton和McCarthy,1962,PNAS 84:1390)。长度大于100个碱基的多核苷酸的典型严谨条件是这样的杂交条件，例如，在6×SSC、0.2％SDS的溶液中预洗涤；在65℃，在6×SSC、0.2％SDS中杂交过夜；随后在1×SSC、0.1％SDS中在65℃下进行两次各30分钟的洗涤，并在0.2×SSC、0.1％SDS中在65℃下进行两次各30分钟的洗涤。

关于长度小于100个碱基的多核苷酸分子，示例性的严谨杂交条件是，比Tm低5至10℃。平均而言，长度小于100碱基对的多核苷酸分子的Tm降低大约(500/寡核苷酸长度)℃。

关于称为肽核酸(PNA)的DNA模拟物(Nielsen et al.,Science.1991 Dec 6；254(5037):1497-500)，Tm值高于DNA-DNA或DNA-RNA杂交物的Tm值，且可使用Giesen et al.,Nucleic Acids Res.1998 Nov 1；26(21):5004-6中所述的公式来计算。长度小于100个碱基的DNA-PNA杂交物的示例性的严谨杂交条件为，比Tm低5至10℃。

构建体、载体及其组分

术语“遗传构建体”是指多核苷酸分子，通常为双链DNA，其中可能已插入另一个多核苷酸分子(插入多核苷酸分子)，其诸如但不限于，cDNA分子或miRNA编码分子。遗传构建体可含有允许转录插入多核苷酸分子的必需元件。所述插入多核苷酸分子可源自宿主细胞，或可源自不同细胞或有机体，和/或可为重组多核苷酸。一旦在宿主细胞内，遗传构建体则可整合进宿主染色体DNA中。所述遗传构建体可连接至载体上。

术语“载体”是指多核苷酸分子，通常为双链DNA，其用于将遗传构建体转运至宿主细胞中。所述载体可以能够在至少一个其他的宿主系统(诸如大肠杆菌)中复制。

术语“表达构建体”是指这样的遗传构建体：其包括允许转录所述插入多核苷酸分子且任选地将转录物翻译为多肽的必需元件。表达构建体通常在5’至3’方向包含：

a)在宿主细胞(构建体将转化进其中)中具有功能的启动子，

b)待表达的多核苷酸，和

c)在宿主细胞(构建体将转化进其中)中具有功能的终止子。

在一个实施方案中，启动子和终止子中的至少一个相对于待表达的多核苷酸是异源的。在一个实施方案中，启动子相对于待表达的多核苷酸是异源的。在另一个实施方案中，终止子相对于待表达的多核苷酸是异源的。术语“异源”是指在自然界中发现不在一起的彼此异源的序列。优选地，所述序列在天然状态下不有效连接。在一个实施方案中，异源序列存在于不同物种中。然而，一个或多个异源序列也可以是合成产生的，并且根本不存在于自然界中。

“有效连接”是指，将目的序列，如待表达的序列放置在含有调控元件的另一序列的控制下，并且通常与所述的另一序列连接，所述调控元件可包括启动子、组织特异性调控元件、瞬时调控元件、增强子、抑制子及终止子、5'-UTR序列、包含uORF的5'-UTR序列以及uORF。

术语“非编码区”是指，在翻译起始位点的上游以及在翻译终止位点的下游的非翻译序列。这些序列也分别称为5’UTR和3’UTR。这些区域包括转录起始及终止、以及调节翻译效率所需的元件。

5'-UTR序列位于转录起始位点以及翻译起始位点之间。

5'-UTR序列是由基因组DNA编码的mRNA序列。然而，如本文所用，术语5'-UTR序列包括编码5'-UTR序列的基因组序列、以及该基因组序列的互补序列、以及5'-UTR mRNA序列。

终止子为终止转录的序列，且见于所翻译的序列的下游基因的3’不翻译端。终止子为mRNA稳定性的重要决定因素，且在有些情况下，已发现具有空间调节功能。

术语“启动子”是指，在调节基因转录的编码区上游的顺式调控元件。启动子包含指定转录起始位点的顺式引发元件及保守盒(诸如TATA盒)，以及被转录因子结合的基序。

“转基因”是这样的多核苷酸：通过转化引入有机体中。转基因可源自与引入该转基因的有机体物种相同的物种或不同的物种。转基因可以是合成的，并且在自然界中不存在于任何物种中。

“转基因植物”是指，经遗传操纵或转化而得到的含有新遗传物质的植物。所述新遗传物质可源自与所得转基因植物相同的物种或不同物种的植物，或者可以是合成的。

优选地，由于转基因的存在，“转基因”不同于在自然界中发现的任何植物。

“反向重复序列”是存在重复的序列，其中重复序列的另一半是在互补链中，例如

(5’)GATCTA…….TAGATC(3’)

(3’)CTAGAT…….ATCTAG(5’)

通读转录将产生这样的转录物：其经历互补碱基配对，以形成发夹结构，条件是，在重复区之间存在3-5bp的间隔物。

涉及本发明的多核苷酸的术语“改变...的表达”和“表达改变”旨在包括这种情况：与本发明的多核苷酸对应的基因组DNA被修饰，从而改变本发明的多核苷酸或多肽的表达。基因组DNA的修饰可通过遗传转化或本领域已知的引入突变的其它方法实现。“表达改变”可与信使RNA和/或所产生的多肽的量的增加或减少相关，且还可以由于改变多核苷酸和所产生的多肽的序列而导致多肽活性改变。

分离或制备多核苷酸的方法

使用本领域普通技术人员已知的多种技术，可以分离本发明的多核苷酸分子。作为实例，可以使用在Mullis等人编，1994版，The Polymerase Chain Reaction,Birkhauser(通过引用并入本文)中所述的聚合酶链式反应(PCR)，分离这样的多核苷酸。使用源自本发明的多核苷酸序列的如本文所定义的引物，可以扩增本发明的多核苷酸或用于本发明方法中的多核苷酸。

用于分离多核苷酸的其它方法包括：使用具有本文所述的序列的所有或部分多肽作为杂交探针。使标记的多核苷酸探针与固定在固体支持物(诸如硝化纤维素滤膜或尼龙膜)上的多核苷酸杂交的技术，可以用于筛选基因组或cDNA文库。示例性的杂交及洗涤条件为：在65℃，在5.0X SSC、0.5％十二烷基硫酸钠、1X登哈特(Denhardt)溶液中杂交20小时；在1.0X SSC、1％(w/v)十二烷基硫酸钠中洗涤(在55℃进行三次各20分钟的洗涤)，和任选地在60℃、在0.5×SSC、1％(w/v)十二烷基硫酸钠中洗涤一次(20分钟)。可选的进一步洗涤(20分钟)可在60℃、在0.1×SSC、1％(w/v)十二烷基硫酸钠的条件下进行。

通过本领域中熟知的技术，诸如限制性核酸内切酶消化、寡核苷酸合成及PCR扩增，可以生产多核苷酸片段。

可在本领域熟知的方法中使用部分多核苷酸序列来鉴别相应的全长多核苷酸序列。这样的方法包括基于PCR的方法、5’RACE(Frohman MA,1993,Methods Enzymol.218:340-56)及基于杂交的方法、基于计算机/数据库的方法。此外，作为实例，反向PCR允许获取未知序列，所述序列侧接于本文中所公开的多核苷酸序列，从基于已知区域的引物起始(Triglia等人,1998,Nucleic Acids Res 16,8186,通过引用并入本文)。该方法使用若干限制酶，以产生在基因的已知区域中的合适片段。随后通过分子内连接环化该片段，且将其用作PCR模板。从已知区域设计不同引物。为了以物理方式装配全长克隆，可利用标准分子生物学方法(Sambrook等，分子克隆:实验室手册,第2版,冷泉港出版社,1987)。

当从特定物种生产转基因植物时，有益地用源自该物种的一个或多个序列转化这样的植物。所述益处可以是，减少公众对于生产转基因有机体中的跨物种转化的担忧。另外，当下调基因是希望的结果时，可能必须利用与需要减少其表达的植物中的序列相同(或至少高度相似)的序列。尤其出于这些原因，希望能够在若干不同植物物种中鉴别及分离特定基因的直系同源物。

变体(包括直系同源物)可通过所述方法来鉴别。

鉴别变体的方法

物理方法

变体多肽可使用基于PCR的方法来鉴别(Mullis等人编,1994The PolymeraseChain Reaction,Birkhauser)。通常，引物的多核苷酸序列用于通过PCR扩增本发明的多核苷酸分子的变体，所述引物的多核苷酸序列可以基于编码相应氨基酸序列的保守区的序列。

或者，可使用本领域技术人员熟知的文库筛选法(Sambrook等人,分子克隆:实验室手册,第2版,冷泉港出版社,1987)。当鉴别探针序列的变体时，通常相对地降低杂交和/或洗涤严谨性，直至找到确切序列匹配。

也可通过物理方法鉴别多肽变体，例如使用针对本发明多肽的抗体产生的筛选表达文库(Sambrook等人,分子克隆:实验室手册,第2版,冷泉港出版社,1987)，或者借助这样的抗体鉴别来自天然来源的多肽。

基于计算机的方法

通过本领域技术人员熟知的基于计算机的方法，使用公共域序列比对算法及用于搜寻序列数据库的序列相似性搜寻工具(公共域数据库包括Genbank、EMBL、Swiss-Prot、PIR和其它)，也可以鉴别本发明的变体序列(包括多核苷酸及多肽变体)。关于在线资源的实例，参见，例如，Nucleic Acids Res.29:1-10和11-16,2001。相似性搜寻会检索及比对目标序列，以供与待分析的序列(即，查询序列)进行比较。序列比较算法使用计分矩阵来为每一比对指派总分。

可用于鉴别序列数据库中的变体的程序的一个示例性家族为BLAST程序套件(2.2.5版[2002年11月])，包括BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN和tBLASTX，它们可从(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)或国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)、国立医学图书馆(National Library of Medicine,Building 38A,Room 8N805,Bethesda,MD 20894USA)公开获得。NCBI服务器也提供了使用程序来筛选许多可公开获得的序列数据库的工具。BLASTN对照核苷酸序列数据库比较核苷酸查询序列。BLASTP对照蛋白序列数据库比较氨基酸查询序列。BLASTX对照蛋白序列数据库比较在所有阅读框中翻译的核苷酸查询序列。tBLASTN对照核苷酸序列数据库比较在所有阅读框中动态翻译的蛋白查询序列。tBLASTX对照核苷酸序列数据库的六-框架翻译物比较核苷酸查询序列的六-框架翻译物。BLAST程序可以以默认参数来使用，或可视需要改变参数以精细筛选。

BLAST家族算法(包括BLASTN、BLASTP及BLASTX)的应用描述于Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997的出版物中。

通过BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN、tBLASTX或相似算法产生的查询序列对一个或多个数据库序列的“命中”，会比对和鉴别序列的相似部分。以相似性程度及序列重叠部分的长度的顺序来排列命中。命中一个数据库序列，一般表示仅在查询序列的一部分序列长度上具有重叠。

BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN及tBLASTX算法也产生比对的“预期”值。预期值(E)指示，当搜寻含有随机连续序列的相同尺寸的数据库时，可“预期”偶然见到的命中数目。预期值是用作判定命中数据库是否表明真正相似性的有效阈值。例如，指派给多核苷酸命中的0.1的E值被解释为是指，在所筛选数据库的尺寸的数据库中，可以预期在具有相似分数的序列的比对部分上仅偶然见到0.1匹配。对于在比对及匹配部分上具有0.01或小于0.01的E值的序列而言，使用BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN或tBLASTX算法在数据库中发现偶然匹配的机率为1％或1％以下。

可以用CLUSTALW(文献“Thompson,J.D.,Higgins,D.G.and Gibson,T.J.(1994)CLUSTALW:improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignmentthrough sequence weighting,positions-specific gap penalties and weight matrixchoice.Nucleic Acids Research,22:4673-4680”,http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html)或T-COFFEE(文献“Cedric Notredame,Desmond G.Higgins,Jaap Heringa,T-Coffee:A novel method for fast and accurate multiple sequencealignment,J.Mol.Biol.(2000)302:205-217)”)，或使用渐进成对比对的PILEUP，进行一组相关序列的多重序列比对。(Feng and Doolittle,1987,J.Mol.Evol.25,351)

可利用图样识别软件应用来找到基序或标签序列。例如，MEME(用于基序引出的多重Em)在一组序列中找到基序及标签序列，MAST(基序比对及搜寻工具)使用这些基序在查询序列中鉴别相似或相同基序。提供MAST结果作为适当统计资料及所找到基序的目视全览的一系列比对结果。在圣地亚哥的加利福尼亚大学(University of California,SanDiego)开发出MEME和MAST。

PROSITE(Bairoch and Bucher,1994,Nucleic Acids Res.22,3583；Hofmann etal,1999,Nucleic Acids Res.27,215)是鉴别从基因组或cDNA序列翻译的未表征蛋白的功能的方法。PROSITE数据库(www.expasy.org/prosite)含有生物学显著图样及特性，且被设计成使得其可与适当计算工具一起使用，以向已知蛋白家族指派新序列或判定哪个已知结构域存在于该序列中(Falquet et al,2002,Nucleic Acids Res.30,235)。Prosearch是可以用给定序列图样或标签来搜寻SWISS-PROT及EMBL数据库的工具。

修饰序列的方法

对蛋白质序列、或编码所述蛋白质序列的多核苷酸序列进行修饰的方法是本领域技术人员熟知的。可以通过改变/修饰编码蛋白质的序列并表达经修饰的蛋白质来方便地修饰蛋白质序列。诸如定点突变等方法也可以用于修饰现有的多核苷酸序列。或者，可使用限制性内切酶来切割现有序列的部分。改变的多核苷酸序列也可以方便地以修饰的形式表达。

制备构建体及载体的方法

本发明的遗传构建体包含一个或多个本发明的多核苷酸序列和/或编码本发明的多肽的多核苷酸，且可用于转化例如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物有机体。本发明的遗传构建体意欲包括如本文中所定义的表达构建体。生产及使用遗传构建体及载体的方法是本领域中熟知的，且一般描述于：Sambrook等人,分子克隆:实验手册,第2版,冷泉港出版社,1987；Ausube1等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing,1987。

生产包含多核苷酸、构建体或载体的宿主细胞的方法

本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的遗传构建体或载体。宿主细胞可以来源于例如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物有机体。

包含本发明的遗传构建体(诸如表达构建体)的宿主细胞可用于本领域熟知的方法中(例如Sambrook等人,分子克隆:实验手册,第2版,冷泉港出版社,1987；Ausubel等人,分子生物学现代方法,Greene出版社,1987)，用于重组生产本发明的多肽。这样的方法可包括，在适用于或有助于表达本发明的多肽的条件下，在适当介质中培养宿主细胞。随后，通过本领域熟知的方法(例如Deutscher编,1990,Methods in Enzymology,第182卷,Guideto Protein Purification)，可以将表达的重组多肽(其可以任选地分泌至培养物中)与介质、宿主细胞或培养基分离。

生产包含构建体及载体的植物细胞及植物的方法

本发明另外提供了包含本发明的遗传构建体的植物细胞，及经修饰以改变本发明多核苷酸或多肽的表达的植物细胞。包含这样的细胞的植物也形成本发明的一个方面。

用多肽转化植物细胞、植物及其部分的方法，参见：Draper等人,1988,植物遗传转化及基因表达.实验室手册.Blackwell Sci.Pub.Oxford,第365页；Potrykus和Spangenburg,1995,Gene Transfer to Plants.Springer-Verlag,Berlin.；和Gelvin等人,1993,植物分子生物学.手册.Kluwer Acad.Pub.Dordrecht。对转基因植物(包括转化技术)的综述，参见：Galun和Breiman,1997,转基因植物.Imperial College出版社,伦敦。

植物的遗传操纵方法

可利用许多植物转化策略(例如，Birch,1997,Ann Rev Plant Phys Plant MolBiol,48,297,Hellens RP,et al(2000)Plant Mol Biol 42:819-32,Hellens R et alPlant Meth 1:13)。例如，策略可设计成增加多核苷酸/多肽在通常表达所述多核苷酸/多肽的植物细胞、器官中和/或在特定发育阶段的表达，或者在通常不表达所述多核苷酸/多肽的细胞、组织、器官中和/或在特定发育阶段异常表达所述多核苷酸/多肽。表达的多核苷酸/多肽可源自待转化的植物物种，或可源自不同植物物种。转化策略可设计成降低或消除多核苷酸/多肽在通常表达所述多核苷酸/多肽的植物细胞、组织、器官中或在特定发育阶段的表达。这样的策略称为基因沉默策略。

用于在转基因植物中表达基因的遗传构建体通常包括：用于驱动一个或多个克隆的多核苷酸的表达的启动子，终止子，及用于检测遗传构建体在转化植物中的存在的选择标记序列。

适用于本发明的构建体中的启动子在单子叶植物或双子叶植物的细胞、组织或器官中具有功能，且包括细胞特异性的、组织特异性的及器官特异性的启动子、细胞周期特异性的启动子、瞬时启动子、诱导型启动子、在大多数植物组织中具有活性的组成型启动子、及重组启动子。在必要时，启动子的选择将取决于克隆的多核苷酸的时间及空间表达。启动子可为通常与目标转基因有关的启动子，或源自其它植物、病毒及植物病原性细菌及真菌的基因的启动子。本领域技术人员无需过多试验就能够选出适用于使用包含本发明的多核苷酸序列的遗传构建体来改变及调节植物特性的启动子。组成型植物启动子的实例包括：CaMV 35S启动子、胭脂碱合酶启动子及章鱼碱合酶启动子、及来自玉蜀黍的Ubi 1启动子。在特定组织中具有活性的植物启动子会对内部发育信号或外部非生物的或生物的应激做出响应，这描述于科学文献中。示例性的启动子描述于例如WO 02/00894中，该文献通过引用并入本文中。常用于植物转化遗传构建体中的示例性的终止子包括，例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S终止子、根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合酶或章鱼碱合酶终止子、玉蜀黍(Zea mays)zein基因终止子、水稻(Oryza sativa)ADP-葡萄糖焦磷酸化酶终止子及马铃薯(Solanum tuberosum)PI-II终止子。

常用于植物转化中的选择标记包括：赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II基因(NPT II)、赋予壮观霉素及链霉素抗性的aadA基因、赋予Ignite(AgrEvo)及Basta(Hoechst)抗性的草铵膦乙酰转移酶(bar基因)及赋予潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)。

也预见到这样的遗传构建体的应用，所述遗传构建体包含可用于植物及植物组织中的启动子表达分析的报告基因(表达对于宿主而言通常为酶活性和/或可见信号(例如荧光素酶、GUS、GFP)等外来活性的编码序列)。报告基因文献论述于Herrera-Estrella etal.,1993,Nature 303,209,and Schrott,1995,见:Gene Transfer to Plants(Potrykus,T.,Spangenberg编)Springer Verlag.Berline,第325-336页。

基因沉默

如上所述，将设计为减少或消除多核苷酸/多肽在植物细胞、组织、器官中或在其正常表达的特定发育阶段表达的策略称为基因沉默策略。

关于基因沉默策略，可以关注基因本身或影响转录物表达的调节元件。本文所用的“调节元件”具有最广泛的可能的含义，并且包括与目标基因相互作用的其它基因。

被设计为减少或沉默本发明所述的多核苷酸的表达的遗传构建体可包含本发明所述全部或部分多核苷酸的反义拷贝。在这种构建体内，多核苷酸被置于与启动子和终止子反义的方向上。

“反义”多核苷酸通过使多核苷酸或多核苷酸的片段反向而获得，从而使产生的转录本与该基因的mRNA转录本互补，例如

5’GATCTA 3’(编码链)3’CTAGAT 5’(反义链)

3’CUAGAU 5’mRNA 5’GAUCUCG 3’反义RNA

设计用于基因沉默的遗传构建体还可包含反向重复序列。“反向重复序列”是重复序列的第二半部分在互补链中的重复序列，例如：

5’-GATCTA………TAGATC-3’

3’-CTAGAT………ATCTAG-5’

形成的转录本可进行互补性碱基配对以形成发卡结构。通常，需要位于重复区域之间的至少3-5bp的间隔物来形成发卡。

这样的构建体用于RNA干扰(RNAi)方法中。

另一种沉默方法包括使用靶向等同于miRNA的转录本的小反义RNA(Llave et al，2002,Science 297,2053)。显然包括使用这种与本发明的多核苷酸对应的小反义RNA。

以本文所定义的表达构建体进行转化也会通过称之为正义抑制的过程导致基因沉默(例如，Napoli et al，1990,Plant Cell 2,279；de Carvalho Niebel et al，1995,Plant Cell,7,347)。在某些情况下，正义抑制可包括完整或部分编码序列过表达，还可包括基因的非编码区的表达，基因的非编码区例如为内含子或5’或3’非翻译区(UTR)。嵌合的部分正义构建体能够用于协同使多个基因沉默(Abbott et al，2002,Plant Physiol.128(3):844-53；Jones et al，1998,Planta 204:499-505)。使用这种正义抑制策略来使本发明的靶多核苷酸/基因的表达沉默也包括在本文中。

插在设计用于基因沉默的遗传构建体中的多核苷酸可对应于编码序列和/或非编码序列，如启动子和/或内含子和/或5’或3’-UTR序列、或对应的基因。

优选地，用于在沉默靶基因的构建体(例如反义、正义抑制或RNAi构建体)中使用的插入序列包含对应于或互补于靶基因的长度为至少21个核苷酸的插入序列。

其他基因沉默的策略包括显性抑制(dominant negative)方法和使用核糖酶构建体(McIntyre,1996,Transgenic Res,5,257)。转录前沉默可通过基因本身的突变或其调节元件的突变而实现。这种突变可包括点突变、移码、插入、缺失或置换。

本领域已知的几种其他方法可用于改变、减少或消除根据本发明的多核苷酸和/或多肽的表达。这些方法包括但不限于Tilling(Till et al，2003,Methods Mol Biol,2％,205)，所谓的“Deletagene”技术(Li et al，2001,Plant Journal 27(3),235)、以及使用人工转录因子如合成的锌指转录因子(例如，Jouvenot et al，2003,Gene Therapy10,513)。另外，靶向特定多肽的抗体或其片段也可在植物中表达来调节该多肽的活性(Jobling et al，2003,Nat.Biotechnol.,21(1),35)。还可使用转座子示踪(Transposontagging)法。此外，与本发明的多肽相互作用的肽可通过如相显示(phase-display)(Dyax公司)等技术来鉴定。这种相互作用的肽可在植物中表达或应用于植物以影响本发明的多肽的活性。改变本发明的核苷酸和/或多肽表达的上述方法中的每一种方法的使用也特别地包含在本文中。

在植物中修饰内源DNA序列的方法

在植物中修饰内源基因组DNA序列的方法是本领域人员已知的。这些方法可包括使用序列特异性核酸酶，其在目标基因中产生靶向双链DNA断裂。用于植物的这些方法的例子包括：锌指核酸酶(Curtin et al，2011.Plant Physiol.156:466–473.；Sander,et al，2011.Nat.Methods 8:67–69.)、转录激活子样效应因子核酸酶或“TALENs”(Cermak et al，2011,Nucleic Acids Res.39:e82；Mahfouz et al，2011 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108:2623–2628；Li et al，2012Nat.Biotechnol.30:390–392)、以及LAGLIDADG归巢核酸内切酶，也称为“巨核酶”(Tzfira et al，2012.Plant Biotechnol.J.10:373–389)。

在本发明的某些实施方案中，这些技术之一(例如TALEN或锌指核酸酶)可用于修饰靶基因中的一个或多个碱基对以使其失活，从而使其不再是可转录的和/或可翻译的。

因此，本领域技术人员将理解，存在多种可以减少或消除靶基因/多核苷酸/多肽的表达的方法。任何这样的方法都包括在本发明的范围内。

转化方案

下面是公开了可用于遗传转化以下植物物种的遗传转化方案的代表性出版物：稻米(Alam et al，1999,Plant Cell Rep.18,572)；苹果(Yao et al，1995,Plant CellReports 14,407-412)；玉蜀黍(美国专利第5,177,010号及第5,981,840号)；小麦(Ortizet al，1996,Plant Cell Rep.15,1996,877)；西红柿(美国专利第5,159,135号)、马铃薯(Kumar et al人,1996Plant J.9,：821)；木薯(Li et al，1996Nat.Biotechnology 14,736)；莴苣(Michelmore et al，1987,Plant Cell Rep.6,439)；烟草(Horsch et al，1985,Science 227,1229)；棉花(美国专利第5,846,797号及第5,004,863号)、草类(美国专利第5,187,073号及第6.020,539号)；胡椒薄荷(Niu et al人,1998,Plant Cell Rep.17,165)；柑橘类植物(Pena et al，1995,Plant Sci.104,183)；香菜(Krens et al，1997,PlantCell Rep,17,39)；香蕉(美国专利第5,792,935号)；大豆(美国专利第5,416,011号、第5,569,834号、第5,824,877号、第5,563,04455号及第5,968,830)；菠萝(美国专利第5,952,543号)；杨树(美国专利第4,795,855号)；一般单子叶植物(美国专利第5,591,616号及第6,037,522号)；芸苔(美国专利第5,188,958号、第5,463,174号及第5,750,871号)；谷类(美国专利第6,074,877号)；梨(Matsuda et al，2005,Plant Cell Rep.24(1):45-51)；李属(Ramesh et al，2006 Plant Cell Rep.25(8):821-8；Song and Sink 2005 Plant CellRep.2006；25(2):117-23；Gonzalez Padilla et al，2003 Plant Cell Rep.22(1):38-45)；草莓(Oosumi et al，2006Planta.223(6):1219-30；Folta et al，2006 Planta Apr14；PMID:16614818)、玫瑰(Li et al，2003)、悬钩子属(Graham et al，1995Methods MolBiol.1995；44:129-33)、西红柿(Dan et al，2006,Plant Cell Reports V25:432-441)、苹果(Yao et al，1995,Plant Cell Rep.14,407–412)及毛花猕猴桃(Actinidia eriantha)(Wang et al，2006,Plant Cell Rep.25,5:425-31)。本发明也涵盖其它物种的转化。合适的其他方法及方案可获自科学文献中。

植物

术语“植物”意欲包括整个植物、植物的任何部分、植物的繁殖体及子代。

术语“繁殖体”是指植物中可用于繁殖或增殖的任何部分，其为有性或无性的，包括种子及插枝。

可培养本发明的植物，并自交或与不同植物品系杂交，且由两代或更多代得到的后代也构成了本发明的方面。优选地，所述后代保留根据本发明的构建体、转基因或修饰。

一般说明

在本说明书中引用专利说明书、其他外部文件或其他来源的信息，通常是为了提供讨论本发明的特征的背景。除非另外特别说明，否则对这类外部文献的参考不应解释为以任何权限承认这类文献、或这类信息来源是现有技术、或形成本领域的一般公知常识的一部分。

本说明书中所使用的术语“包含”意味着“至少部分由...组成”。当在本说明书中解释每个包括术语“包含”的陈述时，其他特征或者那些以该术语开始的特征也可存在。相关术语如“包括”和“含有”以相同方式解释。

在某些实施方案中，术语“包含”及其相关术语(如“包括”和“含有”)可以用“由...构成”及其相关术语(“由...形成”、“由...组成”)替代。

附图说明

参考附图将更好地理解本发明，其中：

图1示出了miRNA172p的过表达减小了转基因“皇家节日(Royal Gala)”(RG)植物TRG3中的果实、种子和果实细胞的尺寸。照片从左到右示出了RG、TRG3和野苹果三叶海棠(M.sieboldii)“Aotea”的成熟果实(a)、成熟种子(b)和成熟果实皮层组织(c)的薄(10μm)切片。最右边的图的图示示出了来自三种植物的果实的平均果实重量(n＝20)、10个种子的平均重量(n＝10)和平均果实皮层细胞面积(n＝20)。图中的误差条表示标准偏差。

图2示出了miRNA172p的cafs等位基因和苹果属(Malus)果实尺寸之间的关系的确定。a，苹果(M.x domestica)(Dom)、新疆野苹果(M.sieversii)(Sie)、东方苹果(M.orientalis)(Ori)、塞威氏苹果(M.sylvestris)(Syl)和山荆子(M.baccata)(Bac)的果实。b，将对于山荆子12份种质(accession)的2kb启动子区域和2kb pri-miRNA具有特异性的序列定义为CAFS等位基因，其以黑色示出，将对于苹果、新疆野苹果、东方苹果和塞威氏苹果的64份种质的2kb启动子区域和2kb pri-miRNA具有特异性的序列定义为cafs等位基因，其以红色示出，ins：插入，del：缺失，TE ins：转座元件插入，NS：未测序。标示出成熟miRNA172p的位置。c，RG X A689-24的91个cafs/cafs和68个CAFS/cafs子代植物的果实尺寸分布的框图。须子(Whisker)从下四分位数和上四分位数分别延伸到最小值和最大值。从下四分位数到中位数，从中位数到上四分位数由不同的颜色填充。d，与两个CAFS/cafs植物相比，在四个cafs/cafs植物中pri-miRNA172p表达水平降低(相对水平，误差条代表三个PCR反应的标准偏差)。

图3示出了过表达miRNA172p的转基因“皇家节日”的改变的表型。a、b、c、d分别为野生型“皇家节日”的花(a)，转基因“皇家节日”TRG3的花(b)和TRG5的花(c，d)。除去了一些花瓣以显示部分萼片向花瓣的转化(b)，并除去了叶子以显示子房(d)。e、f、g示出了在相同条件下生长的野生型“皇家节日”(e)、TRG5(f)和TRG6(g)的相同年龄(两岁)的树。

图4示出了miRNA172p的过表达降低了萼筒和果实皮层的宽度和果实细胞尺寸。照片a、b、c示出了野生型“皇家节日”(RG)、转基因“皇家节日”TRG3和野苹果三叶海棠“Aotea”的盛花期萼筒的薄(10μm)切片(a)、及其授粉后2周(b)和5周(c)的果实皮层的薄(10μm)切片。右手一侧的图显示了萼筒和皮质组织的平均宽度和平均细胞面积(n＝20)。图中的误差条表示标准偏差。

图5示出了miRNA172p的4kb基因组区域的系统发育分析。使用来自山荆子(Malusbaccata)(Bac)的12份种质和来自苹果(M.x domestica)(Dom)、新疆野苹果(M.sieversii)(Sie)、东方苹果(M.orientalis)(Ori)、塞威氏苹果(M.sylvestris)(Syl)的64份种质的miRNA172p的基因组序列来构建有根邻接系统发育树(Rooted Neighbour-joiningphylogenetic tree)。每个序列的编号对应于补充表1中给出的序列编号。来自两个梨物种(西洋梨(Pyrus communis)(Pc)和白梨(P.bretschneideri)(Pb))的序列用作外群(outgroup)。

图6示出了含有转座元件(TE)的pri-miRNA172p序列的3'区域。TE以红色示出，其18bp不完全反向末端重复序列由箭头指示，其靶位点复制的同向重复序列以蓝色标出。还指出了本研究中使用的miRNA172和PCR引物的位置。该序列来自GenBank登录号EG999280，以SEQ ID NO：47示出。

图7示出了pri-miRNA172p中的属于MITE型转座子家族的TE。将来自六种苹果基因的TE序列和其靶位点重复序列进行比对。重复的靶位点序列加下划线，不完全反向末端重复序列用箭头表示。GenBank登录号：MdmiRNA172p＝EG999280(SEQ ID NO:48)；MdOmt2＝DQ886019(SEQ ID NO:49)；MdACS1＝U89156(SEQ ID NO:50)；MdAGL-1＝GU56825(SEQ IDNO:51)；MsS46-RNase＝EU419860(SEQ ID NO:52)；MdRfa2＝AB073704(SEQ ID NO:53)。

图8示出了“皇家节日”×A689-24分离群体中的果实重量数量性状基因座(QTL)分析。a，一并示出了A689-24的连锁群(LG)11上的CAFS等位基因的位置和连续三年(2006至2008年)的果实重量QTL的间隔。B，LOD得分，由QTL解释的表型变异的位置和百分比。

图9示出了本研究中测试的在CAFS基因座处进行测序和等位基因分型的36种苹果属物种的153份种质的描述。

图10示出了来自七种植物物种的成熟miRNA172序列的比对。ath，拟南芥(Arabidopsis thaliana)；mdm，苹果(Malus x domestica)；ppe，碧桃(Prunus persica)；csi，甜橙(Citrus sinensis)；sly，番茄(Solanum lycopersicum)；vvi，葡萄(Vitisvinifera)；cpa，番木瓜(Carica papaya)。这些序列为：ath-miR172b＝SEQ ID NO:54；ath-miR172c＝SEQ ID NO:55；ath-miR172d＝SEQ ID NO:56；ath-miR172a＝SEQ ID NO:57；ath-miR172e＝SEQ ID NO:58；mdm-miR172d＝SEQ ID NO:59；mdm-miR172e＝SEQ ID NO:60；mdm-miR172j＝SEQ ID NO:61；mdm-miR172g＝SEQ ID NO:62；mdm-miR172a＝SEQ IDNO:63；mdm-miR172k＝SEQ ID NO:64；mdm-miR172f＝SEQ ID NO:65；mdm-miR172o＝SEQ IDNO:66；mdm-miR172l＝SEQ ID NO:67；mdm-miR172n＝SEQ ID NO:68；mdm-miR172b＝SEQ IDNO:69；mdm-miR172c＝SEQ ID NO:71；mdm-miR172i＝SEQ ID NO:72；mdm-miR172h＝SEQ IDNO:73；ppe-miR172d＝SEQ ID NO:74；ppe-miR172a-3p＝SEQ ID NO:75；ppe-miR172b＝SEQID NO:76；ppe-miR172c＝SEQ ID NO:77；csi-miR172a-3p＝SEQ ID NO:78；csi-miR172c＝SEQ ID NO:79；csi-miR172b＝SEQ ID NO:80；sly-miR172b＝SEQ ID NO:81；sly-miR172a＝SEQ ID NO:82；vvi-miR172a＝SEQ ID NO:83；vvi-miR172c＝SEQ ID NO:84；vvi-miR172b＝SEQ ID NO:85；cpa-miR172a＝SEQ ID NO:86；cpa-miR172b＝SEQ ID NO:87；序列SEQ ID NO:54～87的共有序列＝SEQ ID NO:88。

具体实施方式

现在将参考以下非限制性实施例对本发明进行说明。

不意图将本发明的范围仅下于以下实施例。如本领域技术人员将理解的，在不脱离本发明的范围的情况下，可以进行许多改变。

实施例1：改变苹果果实尺寸

概要

对驯化性状的遗传控制的分子基础的理解的发展可以指导现代育种程序。在一年生作物中，已表征了超过20种驯化性状基因，揭示出影响这些性状的特定遗传突变已在驯化期间被选择，直到它们被固定。然而，对多年生木本作物的驯化的遗传信息很少⁽¹⁾。

在此，申请人示出了miRNA172基因中的转座子插入突变(其降低miRNA172的表达)与分离后代中的大的苹果果实尺寸密切相关，并且miRNA172的过表达导致转基因“皇家节日”的果实重量降低了超过60倍，同时伴随有果实组织中的细胞分裂和扩增减少。

引言

果实作物驯化通常与果实尺寸的显著增加相关。尽管其基础和应用重要性，人们对隐藏在该重要的农艺学性状之下的分子遗传学仍然知之甚少，特别是对多年生物种了解更少。

栽培苹果(Malus x domestica)具有文化和经济意义，是全球产量第二的果树作物。虽然大多数野生苹果物种具有苦涩小果实(直径<1cm)，被称为野苹果，然而一些物种产生相对大的果实(>1厘米)，这些物种(新疆野苹果、塞威氏苹果和东方苹果)已经贡献于栽培苹果的基因组。特别是栽培苹果的最初祖先新疆野苹果，虽然其具有直径达8厘米的果实，但是仍然没有栽培苹果那么大。

结果

申请人鉴定出microRNA172(miRNA172)作为苹果果实尺寸调节的可能候选物。miRNA172抑制拟南芥中控制花器官发育⁽¹⁷⁾和花器官尺寸⁽¹⁸⁾的Apetalla2(AP2)基因⁽¹⁶⁾亚家族的翻译。由栽培苹果的基因组序列⁽²⁾和EST序列⁽³⁾中的一个基因(miRNA172p)预测了15个miRNA172基因(a-o)，但迄今仅确认了miRNA172p的表达⁽¹⁹⁾。

申请人惊奇地发现，除了在转基因“皇家节日”(RG)苹果植物中导致其他改变的表型之外，miRNA172p过表达还导致栽培苹果果实返回到野苹果的尺寸(表2)。

表2.使用CaMV35S-pri-miRNA172p基因构建体开发的"皇家节日"苹果转基因植物的描述

^a使用与NPTII基因结合的引物进行PCR分析

^b使用结合CaMV35S启动子和pri-miRNA172p的引物的PCR分析

^c两个叶和两个花的生物学样品的茎环RT-PCR miRNA测定，平均值和标准偏差(SD)。对于TRG6，仅使用两个叶片样品，因为没有产生花。

^d20个果实的平均值和SD。

miRNA172p过表达15倍的转基因植物TRG3表现出比RG对照显著更小的果实和种子(图1a、b)，并且有一些花具有萼片转变为花瓣特性的部分(图3)。植物TRG4和TRG5的miRNA172p分别过表达20和23倍，表现出更大的表型变化，包括花完全由心皮组织组成，没有萼片、花瓣或雄蕊(图3c、d)，并且在人工授粉后不能产生任何果实。这些改变的花器官发育的表型类似于所报道的在其他物种^(4,5)中miRNA172过表达后的那些表型。TRG5是半矮化植物(图2f)。miRNA172过表达24倍的TRG6表现出最严重的表型改变，不仅矮化(图2g)，而且不产生花或果实(表2)。

据报道，驯化苹果的大果实和较小野苹果之间的关键发育差异是后者的果实细胞数量和细胞尺寸降低⁽⁶⁾。与RG相比，TRG3的萼筒和两周龄果实具有更少的细胞，因为它在盛花期展示出比RG显著更薄的萼筒，并且在两周龄时具有比RG更薄的果实皮层组织，但是表现出相似的细胞尺寸(图4)。从第五周开始直至成熟，TRG3果实皮层组织显示出比RG减小的细胞尺寸。这个发展的数据表明，miRNA172p的表达提高分别抑制了果实发育的早期和晚期阶段的细胞分裂和细胞扩增。野苹果三叶海棠“Aotea”表现出与TRG3相似的果实细胞数量和尺寸的降低(图1c和图4b、c)。鉴于TRG3和野苹果之间的果实尺寸、果实细胞数量和尺寸的相似性，申请人假定，表达降低的miRNA172p的突变等位基因可能是驯化苹果的果实尺寸增加的原因。

为了验证该假设，申请人对来自产生较大果实的四个苹果种(苹果(M.xdomestica)、新疆野苹果、东方苹果和塞威氏苹果)的64份种质和具有非常小的果实的野苹果种(山荆子)的12份种质的miRNA172p的DNA扩增子(高达3957bp)进行了测序(图2a、图9和表3)。

表3.苹果属中CAFS和cafs等位基因的分布

^a由Phipps等人分类⁽⁷⁾

^b.果径的参考。FOC：中国植物志http://foc.eflora.cn/，NA：无可用数据；HR：园艺学综述，中亚野生苹果和果树，RHS：皇家园艺学会，http://apps.rhs.org.uk/ plantselector/plant？plantid＝1259，USDA：https://plants.usda.gov/java/

衍生自这些序列的系统发育树表明，所有12份山荆子种质聚簇在一起，并且其他四个物种的种质形成单独的进化枝，没有物种的进一步的系统发育结构(图5)。二进化枝结构是由于山荆子和四种大果实物种之间的六个小indel(1至5bp)和38个单SNP(图2b)而导致的。另外，四种大果实物种表现出在pri-miRNA172p的3'末端有转座元件(TE)插入(图2b和图6)，这在来自山荆子的序列中是不存在的。154bp长的TE属于MITE型转座子家族(图7)。由于TE可形成茎环结构并改变基因表达²⁵，所以申请人假设TE的存在可降低miRNA172p的表达水平。申请人将miRNA172p基因座命名为CrabApple Fruit Size，并将其野生型等位基因和转座子插入等位基因分别命名为CAFS和cafs。

为了证实cafs等位基因在苹果果实尺寸进化中的作用，申请人使用PCR分析进一步将两个野苹果种(多花海棠(M.floribunda)和三叶海棠(M.sieboldii))的miRNA172p基因座进行了等位基因分型(图9)。这两种物种是CAFS纯合的(表3)。连同以上示出的DNA测序数据，显而易见的是，cafs等位基因与大果实相关，并且CAFS等位基因与小果实相关。

通过分析RG(cafs/cafs)×A689-24(CAFS/cafs))杂交的分离子代证实了cafs等位基因和大果实尺寸之间的关联(表4)。

表4.本研究中测试的RG X A689-24的159个子代植物的描述

91个cafs/cafs和68个CAFS/cafs植物展示出了显著不同(P＝4.3×10^-6)的三年平均果实重量，分别为206.97g和176.20g，CAFS基因座解释了21％的果实重量变化(表5和图2c)。

表5.RG(cafs/cafs)×A689-24(CAFS/cafs))子代中cafs等位基因和果实重量的关联分析

^a单因素ANOVA分析

^b以V_{Between_gentyotes}/(V_{Between_gentyotes}+V_Within)计算

^c如使用卡方检验所证明，观察到的基因型计数拟合1:1分离比。

在这种分离群体中，在A689-24的连锁群11的连续三年的果实尺寸QTL的95％置信区间内对CAFS等位基因作图(图8)。对来两个CAFS/cafs植物和四个cafs/cafs植物的RNA的cDNA的定量PCR分析表明，pri-miRNA172p水平在cafs/caf植物中降低了约两倍(图2d)。申请人的数据显示，CAFS为苹果果实尺寸的主要QTL的基础，并且由于miRNA172p转录物的积累减少，存在纯合的cafs等位基因导致出现大果实。然而，CAFS不是所有的果实尺寸变化的原因，并且必须与苹果(M.x domestica)中的其他果实尺寸QTL联合作用⁽⁸⁾。

申请人的结果表明，在驯化前cafs等位基因被选择。苹果(M.x domestica)和三种最接近的野生物种(新疆野苹果、东方苹果和塞威氏苹果)的cafs等位基因的核苷酸多样性(π值)显著低于山荆子中CAFS等位基因和苹果(M.x domestica)、新疆野苹果和塞威氏苹果中的23个中性基因(10kb)的核苷酸多样性(表6)，这表明在cafs等位基因上存在强选择。

表6.苹果种在miRNA172p和23个中性基因处的核苷酸多态性。

^aN：测序的种质数(补充表1和3)

^bS：多态性位点的数目

^cπ：序列之间每个位点的平均核苷酸差异数⁽²⁶⁾，值为πx 10²。

^d：miRNA172p的cafs或CAFS等位基因的4kb序列

^e：23个中性基因的10kb连接序列^(27)f：四个cafs组与CAFS和中性基因序列组之间的Wilcoxon秩和检验。

在具有大果实的四个物种中，所有测试的种质都是cafs纯合的(表3)，并且cafs等位基因固定于这些物种中表明选择发生在苹果(M.x domestica)与其他三种物种分离之前。根据核DNA分析⁽²⁸⁾，估计四种大果实之间的分离时间在2万至8万年前，或者，基于叶绿体DNA序列信息⁽⁹⁾，甚至超过100万年前，这远远早于所估计的苹果驯化的开始时间，该估计开始时间大约为5000年前⁽²⁹⁾。用于分析驯化位点的标准中性模型检验对于CAFS基因座不具有显著性(表7)，这也表明有益变体cafs在驯化之前作为普通中性多态性预先存在，从而消除了阳性选择足迹。

表7.标准中性模型检验^a

^a使用5个苹果物种的4kb cafs/CAFS区域进行Tajima’s D⁽²¹⁾、Fu和Li’s D*及F*⁽²²⁾检验。没有一项检验是显著的，P>0.05。

结论，申请人已经证明miRNA172调节苹果的果实尺寸。miRNA172p中的TE插入与大型哺乳动物所选择出的其表达减少和果实尺寸增加密切相关，这在通过人类选择而进一步加强之前发生。申请人的发现对于以下是重要的：增加对多年生果实驯化过程的理解、在育种程序中能够在苗期选择果实尺寸，从而使农艺学上重要的基因由野苹果种群渗入到大的驯化苹果中。

方法

苹果转基因植物的生产和分子分析。

为了在苹果中过表达miRNA172，按照以下方式构建植物转化载体：将BluescriptSK中的miRNA172p(pri-miRNA172p)⁽³⁾(GenBank登录号EG999280)的初级转录物的cDNA以正义反向转到pART7⁽¹⁰⁾中的CaMV35S启动子和ocs终止子之间的BamH1/XhoI位点，然后将来自pART7的CaMV35S-启动子-miRNA172-cDNA-ocs-终止子片段转入pART27⁽¹⁰⁾中的NotI位点，所述pART27还含有赋予卡那霉素抗性的植物选择标记基因NPTII。使用该载体，如前所述使用农杆菌(Agrobacterium)介导的植物转化和卡那霉素选择来产生RG苹果转基因植物^(11,12)。使转基因植物与非转基因RG植物一起在密闭温室中生长。花用“Granny Smith”花粉进行授粉。

使用与NPTII基因结合的两个引物，进行基因组DNA PCR分析。从而确认植物的转基因状态⁽¹¹⁾。使用与CaMV35S启动子结合的引物35SF2(5’-GCACAGTTGCTCCTCTCAGA-3’–SEQID NO：45)和与miRNA172cDNA结合的引物R4(图6)，通过PCR确定是否存在miRNA172p的转基因拷贝。

使用NucleoSpin miRNA试剂盒(Macherey-Nagel)从嫩展叶和开放的花中提取小RNA。该方法包括使用DNase在柱上去除基因组DNA。使用Nanodrop ND-1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific)对小RNA进行定量。如先前所述，利用针对miRNA172和两个参考对照基因miRNA156和miRNA159所设计的引物⁽¹²⁾，采用茎环RT-PCR miRNA检验⁽¹³⁾，分析miRNA172的相对水平。使用的引物检测所有miRNA172基因表达的miRNA172。

组织制备、染色和图像分析。

为了分析萼筒和果实皮层组织宽度和细胞尺寸，使用前述方法，由RG、TRG3和“Aotea”制备盛花期的子房、授粉后第2周和第5周的果实以及成熟阶段的果实的组织切片(10μm厚度)⁽¹⁵⁾。将切片在二甲苯中脱蜡，在0.05％(w/v)甲苯胺蓝(pH4.5)中染色并使用Vanox AHT3光学显微镜(Olympus，Tokyo)拍照。使用ImageJ软件(http://imagej.nih.gov/ ij/)测量萼筒和皮层组织宽度和细胞面积。

DNA序列分析。

为了确定miRNA172p基因座处的DNA序列多样性，使用位于miRNA172的启动子中的引物F1(5’-GTACGCAGTAGAAAGGCCACATGA-3’-SEQ ID NO：46)和位于来自五个苹果物种的76份种质(图9)的pri-miRNA172的3'末端的引物R3(图6)来PCR扩增DNA片段(高达3957bp)。引物设计基于“Gold Delicious”苹果基因组序列⁽²⁷⁾。这些苹果(Malus)种质从世界不同地区收集，以确保每个物种的良好代表性，并且这些苹果(Malus)种质在以前的研究中用于确定野生物种对栽培苹果的遗传贡献⁽²⁸⁾。来自3种苹果(Malus)种的42份种质的23个中性遗传基因座的序列多样性数据获取自先前的出版物⁽²⁷⁾，并用于与cafs等位基因序列多样性进行比较，以确定cafs等位基因是否处于选择下(表6)。

在PCR中使用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen)以使DNA合成的错误最小化。扩增子用外切核酸酶I和虾碱性磷酸酶(New England BioLabs)处理，然后发送到Macrogen(Korea)用于测序。使用Geneious v6.1.6(www.geneious.com/)进行序列组装和比对，并构建遗传树。使用DnaSP v5.10.01(http://www.ub.edu/dnasp/)进行DNA核苷酸多样性和选择测试。

Malus种质的miRNA172p基因座的等位基因分型。

为了对miRNA172p基因座进行基因分型，使用分别位于TE插入子上游和下游的引物F6和R4(图6)进行PCR扩增。扩增产生来自miRNA172p的不含TE插入子的CAFS等位基因的331bp DNA片段和来自含有154bp TE和9bp插入位点重复的cafs等位基因的494bp DNA片段。

cafs等位基因与苹果果实尺寸的关联分析。

使用RG和A689-24之间杂交的159个子代分析miRNA172p等位基因和果实重量之间的关联(表4)。A689-24是M.x domestica和M.zumi之间杂交的第四代后代。

定量性状基因座(QTL)绘图。

miRNA272p的遗传标记包括在用于使用173个幼苗构建“皇家节日”×A689-24遗传图谱⁽¹⁹⁾的数据集中。使用Joinmap v3.0来构建LOD得分为5的遗传图谱以用于分组，并使用Kosambi作图函数来计算遗传图谱距离。使用来自2006、2007和2008的平均果实重量数据，并使用包含CAFS标记的LG11用A689-24遗传图谱进行QTL分析。进行间隔绘图，95％和99％的QTL间隔分别表示为最大LOD得分之上和之下的具有两个和一个LOD单位滴(unit drop)的遗传图谱区。

定量RT-PCR。

为了确定与CAFS等位基因相比，cafs等位基因是否诱导较低的miRNA172p表达，使用特异性结合pri-miRNA172p的引物F5b和R7(图6)进行定量RT-PCR分析，从而避免任何可能的来自miR172a-o的干扰。使用开发用于松树RNA提取的方法⁽³⁰⁾，从两份CAFS/cafs种质和四份cafs/cafs种质合并的1周龄果实(n>5)中分离总RNA，并使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Co，Ltd，USA)进行分析以确定RNA浓度和完整性，然后用DNase进行处理。对于每个RNA样品，使用逆转录试剂盒(Qiagen)，根据制造商的说明书使用1μg RNA用于cDNA合成。按照先前所述的方法程序⁽²³⁾，使用cDNA作为模板，并使用肌动蛋白和EF-1α作为参照对照基因，在480(Roche Diagnostics)中进行qRT-PCR反应。

实施例概要

上述实施例中呈现的数据清楚地证明了申请人的发明的可应用性，表明当miRNA172表达降低时，果实尺寸增加。或者，当miRNA172表达增加时，果实尺寸减小。

因此，申请人的发明提供了有价值的新的且具有创造性的方法和材料，它们对于生产(通过遗传修饰或传统的育种方法)具有所需的尺寸改变的果实而言是有用的。

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SEQUENCE LISTING

<110> 新西兰植物和食品研究院有限公司

<120> 能改变果实大小的方法和材料

<130> 788469 HCF/mjw

<150> NZ630787

<151> 2014-09-10

<160> 88

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 构建体

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> N = A, G or U

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> N = G or U

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> N = A or G

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> N = A, C, G or U

<400> 1

ngaaucuuga ugaugcnnca n 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 2

agaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 白梨（Pyrus bretschneideri）

<400> 3

agaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 西洋梨（Pyrus communis）

<400> 4

agaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 碧桃（Prunus persica）

<400> 5

agaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 6

<211> 20

<212> RNA

<213> 甜橙（Citrus sinensis）

<400> 6

agaaucuuga ugaugcugca 20

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 葡萄（Vitis vinifera）

<400> 7

ugaaucuuga ugaugcuaca u 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 番木瓜（Carica papaya）

<400> 8

gggaaucuug augaugcugc a 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 9

agaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 10

<211> 112

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 10

ggucacuuuu ugcgggugga gcaucaucay gauucacaau cuuacuuggu ucuaguuuaa 60

ccccauuuga ugauaugaga aucuugauga ugcugcagca gcaauaauga cu 112

<210> 11

<211> 115

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 11

agucacuuuu ugcgggugga gcaucuucaa gauucacaau cuuauuuggg cuccaauuuu 60

agccccauuu gaugauauga gaaucuugau gaugcugcag cggcaauaaa ugacu 115

<210> 12

<211> 115

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 12

ggucacuuuu ugcgggugga gcaucaucaa gauucacaau cuuacuuggg uucuaguuuu 60

aaccccauuu gaugauauga gaaucuugau gaugcugcag cagcaauaaa ugacu 115

<210> 13

<211> 133

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 13

agucauuguu ugcgggugca gcaucaucaa gauucacaag ugaguagugu gacaugauuu 60

aaucgauuua gucaugucga uugaacucga ggaguugaga aucuugauga ugcugcauca 120

gcaauagcug acu 133

<210> 14

<211> 132

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 14

agucauuguu ugcgggugcc gcaucaccaa gauucuuaag ugaguagugu gacaugauuu 60

aauugauuua guuaugccga ucggcucacg gaguugagaa ucuugaugau gcugcaucag 120

cgauggauga cu 132

<210> 15

<211> 133

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 15

agucauuguu ugcgggugca gcaucaucaa gauucacaag ugaguagugu gacaugauuu 60

aaucgauuua gucaugucga uugaacucga ggaguugaga aucuugauga ugcugcauca 120

gcaauagcug acu 133

<210> 16

<211> 105

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 16

gucguuguuu gcgggugugg caucaucaag auucacacau gcaauuaacu gauaaaguug 60

uuugaaagug agaaucuuga ugaugcugca ucggcaauaa accac 105

<210> 17

<211> 105

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 17

gucguuguuu gcgggugugg caucaucaag auucacacau gcaauuaacu gauaaaguug 60

uuugaaagug agaaucuuga ugaugcugca ucggcaauaa accac 105

<210> 18

<211> 181

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 18

agucaguauu cgcgggugca gcaucaucaa gauucacaua caggcaaggg ggcuaccuuu 60

aucgaucgag uaaauuguua ccgcaccaau aagaauauuu ccuucaacuu ccuuuuguac 120

uugaaaggua guuccuucga agugggaauc uugaugaugc ugcaucagcu gguacaugac 180

u 181

<210> 19

<211> 181

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 19

agucaguauu cgcgggugca gcaucaucaa gauucacaua caggcaaggg ggcuaccuuu 60

aucgaucgag uaaauuguua ccgcaccaau aagaauauuu ccuucaacuu ccuuuuguac 120

uugaaaggua guuccuucga agugggaauc uugaugaugc ugcaucagcu gguacaugac 180

u 181

<210> 20

<211> 181

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 20

agucaguauu cgcgggugca gcaucaucaa gauucacaua caggcaaggg ggcuaccuuu 60

aucgaucgag uaaauuguua ccgcaccaau aagaauauuu ccuucaacuu ccuuuuguac 120

uugaaaggua guuccuucga agugggaauc uugaugaugc ugcaucagcu gguacaugac 180

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<210> 21

<211> 182

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 21

agucaguauu cgcgggugca gcaucaucaa gauucacaua ccuuagcaag ggggcuaccu 60

uuagcgaucg aguaaauugg uaccacacca auaugaauau uccuucaacu uccuuuugua 120

cuugaaaggu aguuycuucg aagugggaau cuugaugaug cugcagcagc ugguacauga 180

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<210> 22

<211> 112

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 22

ggucacuuuu ugcgggugga gcaucaucay gauucacaau cuuacuuggu ucuaguuuaa 60

ccccauuuga ugauaugaga aucuugauga ugcugcagca gcaauaauga cu 112

<210> 23

<211> 115

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 23

ggucacuuuu ugcgggugga gcaucaucaa gauucacaau cuuacuuggg uucuaguuuu 60

aaccccauuu gaugauauga gaaucuugau gaugcugcag cagcaauaaa ugacu 115

<210> 24

<211> 115

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 24

agucacuuuu ugcgggugga gcaucuucaa gauucacaau cuuauuuggg cuccaauuuu 60

agccccauuu gaugauauga gaaucuugau gaugcugcag cggcaauaaa ugacu 115

<210> 25

<211> 105

<212> DNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 25

gtcgttgttt gtgggcgtgg catcatcaag attcacacat gcaagtaact gctaaagttc 60

tttgaaagtg agaatcttga tgatgctgca tctgcaataa accac 105

<210> 26

<211> 127

<212> RNA

<213> 碧桃（Prunus persica）

<400> 26

agucguuguu ugcgggcgua gcaucaucaa gauucacgca caugcaauua acuugaaagu 60

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<210> 27

<211> 141

<212> RNA

<213> 碧桃（Prunus persica）

<400> 27

agucauuguu ugcgggugca gcaucaccaa gauucacaac ugaucaaggg cacagugaca 60

ucaugauguu augauuuuau uaugacuaug ugucuccuaa guuugagaau cuugaugaug 120

cugcaucagc aauagacgac u 141

<210> 28

<211> 168

<212> RNA

<213> 碧桃（Prunus persica）

<400> 28

ggugcggcau caucaagauu cacauacuuu agugaggggu cuaccuuuau cgaucgaguu 60

aauugguacu acuaacacca ccaauugauu uuuguacucg aacuuccuuu aguacucgaa 120

agguaguucc uuugaacuuu gaagugggaa ucuugaugau gcugcauc 168

<210> 29

<211> 119

<212> RNA

<213> 碧桃（Prunus persica）

<400> 29

agucauuguu ugcggaugga gcaucaucaa gauucacaau uucuuggggc uagcugcuuu 60

gcuauuggcc cuuugaugau augggaaucu ugaugaugcu gcagcggcaa uaaauggcu 119

<210> 30

<211> 162

<212> RNA

<213> 甜橙（Citrus sinensis）

<400> 30

gucaccuuaa aacagucguu gcucgcugua gcagcguccu caagauucac auccagucua 60

aaggcaaaag cagcaauuuu ucuucauuuu ugcuugccuu gguuuuuguc agugagaauc 120

uugaugaugc ugcaacggcg auuaaugacu agcuaccaac aa 162

<210> 31

<211> 127

<212> RNA

<213> 甜橙（Citrus sinensis）

<400> 31

uugcucgcug uagcagcgac gucaagauuc acauccaguc uaaaggcaaa agcagcaauu 60

uuucuucagu uuggcuugcc uggguuuuug ucagugagaa ucuugaugau gcggcaacgg 120

cgaugaa 127

<210> 32

<211> 163

<212> RNA

<213> 甜橙（Citrus sinensis）

<400> 32

acuguuugca guuggagcac caucaagauu cacaaacuau uaggguuagu gaguggagau 60

aaugguggcu auuuuauuuu uuuuggcccc uugcuucacu ucaaauugcu cuuuguuuug 120

gaaucuugau gaugcugcag cagcgauaag uggcuaaauu aua 163

<210> 33

<211> 110

<212> RNA

<213> 葡萄（Vitis vinifera）

<400> 33

uauugccgau gcagcaucau caagauucuc auccuugaaa aguuuggcag agauaacauc 60

accaccgugc auuugcaugu gaaucuugau gaugcuacau gcgcaaacaa 110

<210> 34

<211> 118

<212> RNA

<213> 葡萄（Vitis vinifera）

<400> 34

uauugccgau gcagcaucau caagauucuc aaccccaaaa cuugaggcag cgaagauggc 60

aucgcugccg cgccgggcuu ucgcauguga aucuugauga ugcuacaccu gcaaacaa 118

<210> 35

<211> 138

<212> RNA

<213> 葡萄（Vitis vinifera）

<400> 35

guuugcggau ggagcaucau caagauucac aaguauugag acucagugcg ugguggugau 60

ggugacuuuu guggucccuu ccuacacucc gauggcucuu ugauguggga aucuugauga 120

ugcugcagcg gcaauaaa 138

<210> 36

<211> 109

<212> RNA

<213> 葡萄（Vitis vinifera）

<400> 36

guuagcugau gcagcaucau caagauucac acccaaugga agggcaguga ugcaaucucu 60

gccaaagauu uugagaugag aaucuugaug augcugcauu cgcagugaa 109

<210> 37

<211> 177

<212> RNA

<213> 番木瓜（Carica papaya）

<400> 37

gagcaucauc aagauucaca aaauuaaaca cauuagggcu aguagugugg gguuuguggu 60

ggugggugac ggugauggcc ccuucugcuc uuuuuuuuuu cagugguccc guugcuuauu 120

ucacugcaac acccuuggcu cucucucuuu gauuauggga aucuugauga ugcugca 177

<210> 38

<211> 107

<212> RNA

<213> 番木瓜（Carica papaya）

<400> 38

cggcaucauc aagauucaca acaaaacuuu ugugaugaua agcucuuuuu aaucgaucga 60

cuugaucaaa agcuucucuc cgaaauggga aucuugauga ugcugca 107

<210> 39

<211> 106

<212> RNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 39

auguggcaua aucaagauuc acgugaaaag uugcaaauug guuauauaau ugaugaaauu 60

aauggcuggc uauuugaaac ucacgagaau cuugaugaug cugcau 106

<210> 40

<211> 135

<212> RNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 40

auguagcauc aucaagauuc auacaugaaa auuaagaggc aagguuaaau auguagcuuu 60

aauuugaaau gaaaaauaua auauaucaug accaugucua uuuauuucaa agugagaauc 120

uugaugaugc ugcau 135

<210> 41

<211> 1978

<212> DNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 41

ctcgaggatt ggttttattc ctccactatt ttcctttctg aatgtcctca aatttttctt 60

tctaaatata tgtattctgc gtatcatttt cttgttagaa tttacagtat ttgactcaaa 120

tgcatggagg aaatgaatag attgacagtc gttgtttgtg ggcgtggcat catcaagatt 180

cacacatgca agtaactgct aaagttcttt gaaagtgaga atcttgatga tgctgcatct 240

gcaataaacc actatataca acagagagga gactccacag tccacagttt tacctttttc 300

acttcaatga tttaattggt atgctttcta tctactgttt caggtaaggg tatttttttt 360

ttttaaatta ttcttcttct tagttttaga aattttttta tttttgttaa cagatggagc 420

ccatatatat ccatcagtag tgttttcagg tgttatattt atggcctcat tgacttggca 480

ctgctgactg ttggtagatc tgtgattatt cttctgagaa aagcttgact ggggtacaag 540

ggttacctga gcaagtctgt ttatgcatag agagagagag atgagacatt gtctatggta 600

ctgggatgag aaagatgagt gttgatcaac cttgacgatg ctgcaaagct ttaaagcatt 660

ttgaaaaagg taaatatttt caaaccattt atatattttt aattttccta atttgtttgg 720

ttggttttca gatccagcca tggactgtaa tccaaaaaac tgatttctaa tcttttccaa 780

aaatagggaa tacattccaa taacaaagtt gtttggtaga atggttacta aaaacaacaa 840

tcttaaaaat gctaaaagga gtccatcatt agaactcaca atcaatattt ttaaagggaa 900

ttgattatca aactttgttt tgatcatgat tatcattaat tttacactcc tttgcttaat 960

tgtctcttaa ctgtctttta atttattcaa ttcagtcgtt tagaaaacag agaggagtat 1020

aaatcactcc ccctttggaa atacgaagca aatattgtta gatttcaaag ttgggttaag 1080

gtctcttcaa tataaagatg tttgttttca aacatgaaaa tagtttctca aatttgttac 1140

taaacaaatt ttaaaacttt aaaagttctg aatgcaatta aaatcttcaa attgtatcct 1200

cttattactt ttgaatcgtt aaccaaataa caagcttggt ttttttcctt tctattgctg 1260

agaaatagaa atgtgtgaaa gaagttttag attgtctata tgtgtgttgt tttttttttc 1320

ccacctgttt tgggtggtgg gttgatgcaa tttgattcaa agatttgtta attgcttttt 1380

gaacaatatt tcaagtggtt tcgatctctt gctgttgagt atatcattga aaattggaat 1440

cggattgctt cggtattcaa aatcttggtg ggaacttgtc tcactttgtc acattctcac 1500

tgccattctt gtctttgcct ttacacttat ttgtggacca accaaaaagt gagtcgtcct 1560

ccaacttgaa cctttgagat gtaattagaa taatactaca cttatcacct atttgtatca 1620

ttatttatat catctttcta ataaaggaag aacccgctaa cacatatggg tctcattaga 1680

aaaatgatat aaataggtag taagagtagt attttttagg gaactttaac gaaaagcacc 1740

cggtactgtt cactttaacg aaaaaccaca ttttttcact aaaaagtcaa tcctggtact 1800

attcacttta ccctttattt tgtccttatc attaaaactc aaaattttca agcccttttc 1860

attagttttc cttatttttt atgtataatt aacctcactc ccctctcatt catcactcct 1920

ctcaaggaaa taatattcag tactccaact attttctcac ttcttcaata acagtaac 1978

<210> 42

<211> 1963

<212> DNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 42

gctagaacta tacagtactc ttaccataca tgagacttta agcttcacac tcttctgttt 60

tttatacgaa atctcaattt cattggtttt aaagcaggtt atgtatgagt ctcaaccggc 120

catgtgcttt acgcagttaa gtttaaacta tccacatagg ttaggctcta aaggttgtga 180

cacataagtg ggtgtgcgag gatgaaaaaa aaaatgtcta acgtcacatt agactattaa 240

aaaaatttcc ataaacttaa gggcatattt acttagcata aatgggaagt aaggaaaagg 300

aatcagatca actaaacact cccctccccc cactagttta tttggtccat gatttgaggt 360

atttgatcaa agatttcata tatactaaaa acctagaagg agaagaagaa actggaaaaa 420

gaagatgata tagtgaggca caaagaagaa gattccgcaa ggcaaatatt aaatcctaac 480

taagaaaaag gtttatgaag aaaatgaaga ataaaggaag aggcataacc taacttggag 540

atacatagga aataatttga ttccaacaat tatcctgcta gttaaggcaa tttttttaag 600

ggtgggatta gcctcacaat ggactagcaa taatgtggtt caaattcgtc tttagtgaga 660

atcgaaccta aaacctctca cttacaagtg aagatgaata tcattagacc gtagtattaa 720

gtggtagcaa ttttattctt taaacctcaa atagtcaaaa ctcatcacaa atcttaatct 780

taaaatcaag gaataatagt cacttagtac tacgtatgga ctggtagtat tcctctttac 840

tagtaagtga gaggtcttag gttcgattct tgccaaagca aaatttgaac cacattatta 900

ctaacacatt atgagactta gcccactctt tcacccctta gtatatagac aatatggttc 960

ggaaaaaaat aaagggataa tagggcttac ttataagtaa ttatagaggt aaattgggtt 1020

tgaaagtggg tcacaaaatt agattcatat caagtttctc cttttttaat aaacacaaaa 1080

gaactcaaaa atcaaaacga tttcaagctt gattctttgg aagcaacctc aacttctttc 1140

agttaacatg atttcgttta gcgtaagtac tttgagaccc ttcaattaat gtaatcaacc 1200

aaagaaattg acaatgatat aaaaagactg ataatgagtg gtgcattaga cgataccctc 1260

atctcccaac acccaaaata aagttagggt ttttagtgaa gatggcgatg tgtaactgcg 1320

gccccattgg ctcagtactg tacactcagc atctaccaag caaaatgcaa aaattgtaaa 1380

aacttggaga aaagtctagg ctcaccaatg ttccttatat gtaactccaa caaaccgtac 1440

tttcgtttta caatccgtgg ttcatgagct tcctaactct gataaatctc acgcgcacac 1500

acagggggcc aaacgcatgg gtcttctcta tagtgttaga tctcaagcat atatgagctc 1560

tttttctgtt tttattctct gctttatcac gaatttcgta ttctattcct tttctctcta 1620

atctcaaggt attagttcta attttctcct ccttttcaac cttattttct actttacaca 1680

ctggatacca actggatttt cttctgaata tgactatgtc tgtggcatct gaaatggatt 1740

tttcttttta tataaaaaaa ttaattaata aaattgtgtt tttgtgggaa tggatcgatc 1800

ctttgtaaaa acctgagctg catatcaaat ctgtgaatta tatacaaaat attgtatcag 1860

tactcattgt tattattaaa tagtacctta aaagaagaat agggttttgt tttgtgcttg 1920

ggttagattc ttctcgggta ccactcttca cgttagcata ttg 1963

<210> 43

<211> 172

<212> DNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 43

tattttttag ggaactttaa cgaaaagcac ccggtactgt tcactttaac gaaaaaccac 60

attttttcac taaaaagtca atcctggtac tattcacttt accctttatt ttgtccttat 120

cattaaaact caaaattttc aagccctttt cattagtttt ccttattttt ta 172

<210> 44

<211> 15

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 构建体

<400> 44

gaaucuugau gaugc 15

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

gcacagttgc tcctctcaga 20

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

gtacgcagta gaaaggccac atga 24

<210> 47

<211> 2550

<212> DNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 47

ctcgaggatt ggttttattc ctccattatt ttcctttctg aatgtcctca aatttttctt 60

tctaagtata tgtattctgc gtatcatttt cttgttagaa tttacagtat ttgactcaaa 120

tgcatggagg aaatgaatag attgacagtc gttgtttgtg ggcgtggcat catcaagatt 180

cacacatgca agtaactgct aaagttcttt gaaagtgaga atcttgatga tgctgcatct 240

gcaataaacc actatataca acagagagga gactccacag tccacagttt tacctttttc 300

acttcaatga tttaattggt atgctttcta tctactgttt caggtaaggg tatttttttt 360

tttttaaatt attcttcttc ttagttttag aatttttttt atttttgtta acagatggag 420

cccatatata tccatcagta gtgttttcag gtgttatatt tatggcctca ttgacttggc 480

actgctgact gttggtagat ctgtgattat tcttctgaga aaagcttgac tggggtacaa 540

gggttacctg agcaagtctg tttatgcata gagagagaga gatgagacat tgtctatggt 600

actgggatga gaaagatgag tgttgatcaa ccttgacgat gctgcaaagc tttaaagcat 660

tttgaaaaag gtaaatattt tcaaaccatt tatatatttt taattttcct aatttgtttg 720

gttggttttc agatccagcc atggactgta atccaaaaaa ctgatttcta atcttttcca 780

aaatagggaa tacattccaa taacaaagtt gtttggtaga atggttacta aaaacaacaa 840

tcttaaaaat gctaaaagga gtccatcatt agaactcaca atcaatattt ttaaagggaa 900

ttgattatca aactttgttt tgatcatgat tatcattaat tttacactcc tttgcttaat 960

tgtctcttaa ctgtctttta atttattcaa ttcagtcgtt tagaaaacag agaggagtat 1020

aaatcactcc ccctttggaa atacgaagca aatattgtta gatttcaaag ttgggttaag 1080

atctcttcaa tataaagatg tttgttttca aacatgaaaa tagtttctca aatttgttac 1140

taaacaaatt ttaaaacttt aaaagttctg aatgcaatta aaatcttcaa attgtatcct 1200

cttattactt ttgaatcgtt aaccaaataa caagcttggt ttttttcctt tctattgctg 1260

agaaatagaa atgtgtgaaa gaagttttag attgtctata tgtgtgttgt ttttttttgc 1320

ccacctgttt tgggtggtgg gttgatgcaa tttgattcaa agatttgtta attgcttttt 1380

gaacaatatt tcaagtggtt tcgatctctt gctgttgagt atatcattga aaattggaat 1440

cggattgctt cggtattcaa aatcttggtg ggaacttgtc tcactttgtc acattctcac 1500

tgccattctt gtctttgcct ttacacttat ttgtggacca accaaaaagt gagtcgtcct 1560

ccaacttgaa cctttgagat gtaattagaa taatactaca cttatcacct atttgtatca 1620

ttatttatat catctttcta ataaaggaag aacccgctaa cacatatgtg tctcattaga 1680

aaaatgatat aaataggtag taagagtagt attttttagg gaactttaac gaaaagcatc 1740

cggtactgtt cactttaacg aaaaaccaca tttttacact aaaaagtcaa tcctggtact 1800

attcacttta ccctttattt tgtccttatc attaaaactc aaaattttca agcccttttc 1860

attagttttc cttatttttt atgtataatt aacctcactc ccctctcatt catcactcct 1920

ctcaaggaaa taatattcag tactccaact attttctcac ttcttcaata acagtaacat 1980

ccggtgcttc acctttgatt cacatattat tggatctcaa ttaggctatg caataagtac 2040

tataagaaca tgaagatata tctttagtca tatgcaagta tcttctcttc gacggcaata 2100

cctatttgta ggaatttttt attttctgat aatgaagaaa agcttatgaa tcacctctat 2160

catcaggtac aacatttagg gttaattatg catacatgtc gatatcaata ttcatacatg 2220

tatcgaataa attcgagtaa tccgaactta agatttccag ttgcaatgat atgacaactt 2280

gtttataaag cagtgaacta taatgctagg accactgatg tccaattctc actgttgagg 2340

taggagttga tcttccctta atgccgagat ctttaaacta ttttagacag atcaccaaac 2400

cgtaagaatt cggaataaaa atgtacttaa accaaaccaa tcttatagct aaatatattt 2460

gtgtatgagt tagataaaaa gtatatatga agtataacta cctcactctg gcttatttag 2520

agaacttgca tataaaacta atgttaatgc 2550

<210> 48

<211> 172

<212> DNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 48

tattttttag ggaactttaa cgaaaagcat ccggtactgt tcactttaac gaaaaaccac 60

atttttacac taaaaagtca atcctggtac tattcacttt accctttatt ttgtccttat 120

cattaaaact caaaattttc aagccctttt cattagtttt ccttattttt ta 172

<210> 49

<211> 171

<212> DNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 49

tattttttag ggaactttaa caaaaagctc ctgatacagt tcactttaat gaaaaaccac 60

atttttacac taaaaagtca attctagtac tattcacttt accctttatt ttgacatttt 120

cgttaaaact caaagttttc aagccccttt cattagtttt ccctattttt a 171

<210> 50

<211> 173

<212> DNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 50

ttaacaaaaa gtaaacttta acgcaaaact ctcggtactg ttcactttaa tgaaaaatca 60

tatttttaca ttaaaaagtc aatcttgtta ctattcactt taccctttat tttatcctta 120

tcgttaaaat tcaaagtttt caaacccttt tcattagttt tccttaacaa aat 173

<210> 51

<211> 174

<212> DNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 51

ttaattaaaa gggaacttta acgaaaagct ttcggtactg ttcattttaa caaaaaatca 60

catttttaca ctaaaaagtt aatcctgata ctattcactt taccctttat tttgtcctta 120

tatttaaaac tcaaagtttt caagcctttt tcattagttt ttcttaatta aaat 174

<210> 52

<211> 170

<212> DNA

<213> 塞威氏苹果（Malus sylvestris）

<400> 52

tttaatttag ggaactttaa cgaaaatacc tggtactgtt caattaaacg aaaaaccaca 60

tttttacact aaaaagtcaa tcctggtact atcactttac catttatttt gtccttatca 120

ttaaaactca aagttttcaa gcccttttca ttagttttcc ttttaattta 170

<210> 53

<211> 173

<212> DNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 53

ttaaaataat gggaacttta acgaaaagaa gccggtactg ttcactttaa cgaaaaatca 60

tatttttaca ctaaaaagtc aatcatggta ctattcactt taccctttat tttgtactta 120

tcattaaaac tcaaagtttt caagccattt tcactagttt tccttaaaat aat 173

<210> 54

<211> 21

<212> RNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 54

agaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 55

<211> 21

<212> RNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 55

agaaucuuga ugaugcugca g 21

<210> 56

<211> 21

<212> RNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 56

agaaucuuga ugaugcugca g 21

<210> 57

<211> 21

<212> RNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 57

agaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 58

<211> 21

<212> RNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 58

ggaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 59

<211> 21

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 59

agaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 60

<211> 21

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 60

agaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 61

<211> 21

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 61

ggaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 62

<211> 21

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 62

agaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 63

<211> 20

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 63

agaaucuuga ugaugcugca 20

<210> 64

<211> 21

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 64

ggaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 65

<211> 21

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 65

agaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 66

<211> 21

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 66

agaaucuuga ugaugcugca g 21

<210> 67

<211> 21

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 67

ggaaucuuga ugaugcugca g 21

<210> 68

<211> 21

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 68

agaaucuuga ugaugcugca g 21

<210> 69

<211> 20

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 69

agaaucuuga ugaugcugca 20

<210> 70

<211> 21

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 70

agaaucuuga ugaugcugca g 21

<210> 71

<211> 20

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 71

agaaucuuga ugaugcugca 20

<210> 72

<211> 21

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 72

ggaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 73

<211> 21

<212> RNA

<213> 苹果（Malus domestica）

<400> 73

agaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 74

<211> 21

<212> RNA

<213> 碧桃（Prunus persica）

<400> 74

ggaaucuuga ugaugcugca g 21

<210> 75

<211> 21

<212> RNA

<213> 碧桃（Prunus persica）

<400> 75

agaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 76

<211> 21

<212> RNA

<213> 碧桃（Prunus persica）

<400> 76

agaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 77

<211> 21

<212> RNA

<213> 碧桃（Prunus persica）

<400> 77

ggaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 78

<211> 20

<212> RNA

<213> 甜橙（Citrus sinensis）

<400> 78

agaaucuuga ugaugcugca 20

<210> 79

<211> 22

<212> RNA

<213> 甜橙（Citrus sinensis）

<400> 79

uggaaucuug augaugcugc ag 22

<210> 80

<211> 21

<212> RNA

<213> 甜橙（Citrus sinensis）

<400> 80

agaaucuuga ugaugcggca a 21

<210> 81

<211> 21

<212> RNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 81

agaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 82

<211> 21

<212> RNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 82

agaaucuuga ugaugcugca u 21

<210> 83

<211> 21

<212> RNA

<213> 葡萄（Vitis vinifera）

<400> 83

ugaaucuuga ugaugcuaca u 21

<210> 84

<211> 21

<212> RNA

<213> 葡萄（Vitis vinifera）

<400> 84

ggaaucuuga ugaugcugca g 21

<210> 85

<211> 21

<212> RNA

<213> 葡萄（Vitis vinifera）

<400> 85

ugaaucuuga ugaugcuaca c 21

<210> 86

<211> 21

<212> RNA

<213> 番木瓜（Carica papaya）

<400> 86

gggaaucuug augaugcugc a 21

<210> 87

<211> 21

<212> RNA

<213> 番木瓜（Carica papaya）

<400> 87

gggaaucuug augaugcugc a 21

<210> 88

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 构建体

<400> 88

gagaaucuug augaugcugc au 22

Claims (31)

1.一种用于以下中的至少一者的方法：

a)改变由植物产生的果实的尺寸，

a)产生改变尺寸的果实，和

b)产生具有改变尺寸的果实的植物，

所述方法包括改变产生所述果实的植物中miRNA172的表达或活性。

2.权利要求1所述的方法，其中改变包括增大或减小果实的尺寸。

3.权利要求1所述的方法，其中改变包括增加或降低miRNA172的表达或活性。

4.权利要求1所述的方法，其中通过利用编码miRNA172的多核苷酸转化所述植物来增加miRNA172的表达或活性。

5.权利要求4所述的方法，其中所述编码miRNA172的多核苷酸有效连接于启动子序列。

6.权利要求5所述的方法，其中所述启动子相对于编码miRNA172的多核苷酸是异源的。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述植物来自于其中果肉源自萼筒组织的物种，并且其中所述miRNA172的表达或活性增加，并且所述果实的尺寸减小。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述植物来自于其中果肉源自萼筒组织的物种，并且其中所述miRNA172的表达或活性降低，并且所述果实的尺寸增大。

9.一种鉴定具有表现出产生改变尺寸的果实的基因型的植物的方法，所述方法包括对植物测试以下中的至少一者：

a)至少一种miRNA172的表达改变，

b)至少一种miRNA172基因的表达改变，

c)存在与至少一种miRNA172的表达改变相关的标记，

d)存在与至少一种miRNA172基因的表达改变相关的标记。

10.权利要求9所述的方法，其中a)至d)中的任一者表明所述植物将产生改变尺寸的果实。

11.权利要求9所述的方法，其包括培养所鉴定的植物的额外步骤。

12.权利要求9所述的方法，其包括由所鉴定的植物进行育种的额外步骤。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述植物来自于其中果肉源自萼筒组织的物种，并且其中所述miRNA172的表达增加，并且所述果实的尺寸减小。

14.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述植物来自于其中果肉源自萼筒组织的物种，并且其中所述miRNA172的表达降低，并且所述果实的尺寸增大。

15.一种用于增加植物中至少一种miRNA172或miRNA172基因的表达的构建体。

16.权利要求15所述的构建体，其包含与编码miRNA172的序列有效连接的启动子序列。

17.权利要求16所述的构建体，其中所述构建体中的所述启动子相对于编码miRNA172的序列是异源的。

18.一种用于降低或消除植物中至少一种miRNA172或miRNA172基因的表达的构建体。

19.权利要求18所述的构建体，其包含有效连接至miRNA172基因的至少一部分的启动子序列。

20.权利要求19所述的构建体，其中所述基因的所述部分相对于所述启动子序列处于反义方向，并且形成用于RNAi沉默的发夹结构的一部分。

21.权利要求18所述的构建体，其包含与编码miRNA172的突变靶位点(靶模拟物)的序列连接的启动子。

22.权利要求21所述的构建体，其中所述靶模拟物包含相对于目标内源性miRNA172的至少一个错配。

23.权利要求18所述的构建体，其是人工的miRNA-定向的抗miRNA构建体。

24.通过权利要求1至8中任一项所述的方法产生的尺寸改变的植物或果实。

25.权利要求24所述的植物或果实，其具有至少一种miRNA172的改变的表达。

26.包含权利要求15至23中任一项所述的构建体的植物或果实。

27.权利要求24至26中任一项所述的植物或果实，其来自于其中果肉源自萼筒组织的物种，并且其中所述miRNA172的表达增加，并且所述果实的尺寸减小。

28.权利要求24至26中任一项所述的植物或果实，其来自于其中果肉源自萼筒组织的物种，并且其中所述miRNA172的表达降低，并且所述果实的尺寸增大。

29.一种用于产生能产生至少一个尺寸改变的果实的植物的方法，所述方法包括使以下任一者与另一种植物杂交：

a)权利要求24至28中任一项所述的植物，

b)通过权利要求1至8中任一项所述的方法产生的植物

c)通过权利要求9至14中任一项所述的方法选择的植物，

其中通过所述杂交产生的子代是产生至少一个尺寸改变的果实的植物。

30.权利要求29所述的方法，其中所述植物来自于其中果肉源自萼筒组织的物种，并且其中所述miRNA172的表达增加，并且所述果实的尺寸减小。

31.权利要求29所述的方法，其中所述植物来自于其中果肉源自萼筒组织的物种，并且其中所述miRNA172的表达降低，并且所述果实的尺寸增大。