CN107075477A - 通过用于植入的离体成骨细胞培养诱导骨形成的方法 - Google Patents

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Abstract

用于植入的成骨细胞的离体培养方法，所述方法包括培养成体活成骨细胞作为离体程序。离体培养导致形成活性物质，其还包括以下步骤：分离骨祖细胞，使骨祖细胞分化为成骨细胞，扩增培养，收集细胞培养物和洗涤，随后填充并包装。本方法可以作为加速骨形成过程的手段。

Description

通过用于植入的离体成骨细胞培养诱导骨形成的方法
发明领域：
本发明涉及诱导骨形成的方法，特别是通过成骨细胞植入诱导骨形成的方法。
发明背景：
已知成骨细胞是控制骨形成的合成和矿化及其随后的重塑的大细胞。由成骨细胞形成骨的过程被称为骨生成，其包括3个基本步骤：(a)细胞外有机基质(类骨质)的合成；(b)导致骨形成的基质矿化；(c)通过再吸收和再形成过程的骨重塑。骨重塑是连续的合成和破坏过程，其赋予骨其成熟结构并维持骨的正常结构。目前，骨的破坏或再吸收借助于被称为破骨细胞的大细胞发生。
在骨相关病症中或在归因于断裂或损伤的新骨形成的情况期间，用于替代缺损骨的常规方法有很多。根据情况，某些情形可以证明有挑战性，尤其是骨的重新排列。
可利用多种类型的自体骨移植，其提供良好的机械性能和生物学性能，但例如供区并发症、塑型挑战、收集移植物的操作时间有限和可用量体积有限的因素是巨大的顾虑。
此外，涉及组织移植的同种异体移植是其中供体具有不同遗传组成的一种。虽然同种异体移植由于没有供区并发症且没有量限制从而减轻了与自体骨移植相关的一些问题，但其涉及少数其它问题，所述问题可以是减弱归因于不同遗传组成的骨排斥反应的消毒过程或者移植物可传播感染(例如肝炎和HIV/AIDS)。
借助于生长因子例如BMP(骨形态发生蛋白)的骨生成是另一种方法，其中缺损骨的定量替换对于提供可预测的结果而言相当少。
因此，需要减轻与替换缺损骨的现有方法相关的上述问题。
发明目标：
1.本发明的一个目标是使用成骨细胞诱导骨形成。
2.本发明的另一个目标是提供模拟天然骨形成的方法，与已经存在的方法相比，其提供高度加速的方法。
3.本发明的另一个目标是提供与以前已知的方法不同的微创方法和省时方法。
4.本发明的另一个目标是预防供区并发症并为骨形成提供相当大量的成骨细胞。
发明概述：
本发明解决了与诱导骨形成的方法相关的现有问题，并提供了包括离体成骨细胞培养的植入方法。此外，离体培养可被定义为在外部环境中培养而不改变天然条件和参数。离体培养导致形成待注射在骨形成部位的活性物质，其还包括以下步骤：分离骨祖细胞，使骨祖细胞分化为成骨细胞，扩增培养，收集细胞培养物，洗涤和填充以及包装。本发明除了是微创方法之外，还特别加速了骨形成过程。
发明详述：
本发明涉及在有此需要的病症或缺损区域中通过成骨细胞植入诱导骨形成的方法。
本发明的方法是成骨细胞植入方法，其以该方法包括用于诱导骨形成的步骤的方式被广泛构建。
因此，成骨细胞植入所涉及的广泛步骤是活成骨细胞的离体培养。此外，在下面的说明中详细描述了所述步骤：
离体培养是在从受试者收集骨髓细胞之后进行的。顾名思义，收集包括从受试者的后上髂嵴或胸骨收集骨髓。此外，此处的受试者是诱导的骨形成的接受者。
为了进行离体培养，需要将活检试剂盒运出进行收集的地方。活检试剂盒在装运之前进行预处理，然后在运输期间在2-8℃范围内的严格温度监控下运输。另外，必须确保收集的骨髓无菌转移到无菌活检收集介质中。
离体成骨细胞培养涉及活性物质的形成。活性物质可被定义为注射在诱导骨形成部位的物质。导致活性物质形成的方法还包括以下步骤：
分离骨祖细胞，使骨祖细胞分化为成骨细胞，扩增培养，收集细胞培养物，洗涤和填充。
如上所述，离体培养从分离骨祖细胞开始。骨祖细胞是间充质细胞，其分化为成骨细胞，在该过程中胶原被分泌以硬化骨结构。骨髓细胞分化为骨祖细胞的速率可借助于内皮细胞来控制。理想地，骨祖细胞应在诱导骨形成的部位保持在成骨前阶段，从而避免血管内的矿物沉积。从血管转移到诱导部位后，应该发生成熟成骨细胞的快速分化。
根据本发明，第一天的分离程序涉及利用活检收集介质在离心管中收集骨髓。根据标准流程检查含有活检物的活检收集介质的无菌性、细胞活力、细胞计数、细胞表征、透明度(clarity)和颜色。在无菌条件下用洗涤介质洗涤收集的样品几次。以1700rpm持续离心7分钟后，通过吸取移除不想要的碎片和脂肪(油脂)层。使红细胞裂解，并分离成核的骨髓细胞。
之后，用DMEM培养基(Dulbecco's改进的Eagle's培养基)洗涤分离的成核骨髓细胞，并通过40-μ滤器过滤以除去碎片。使用血细胞计数器对细胞进行计数。将同源细胞悬液与培养基一起接种在组织培养瓶中。
骨祖细胞分化为成骨细胞(其是3-5天的过程)是接下来的过程。在理想条件下，培养两天后，移除使用过的培养基并加入新鲜的分化培养基以使骨祖细胞分化为成骨细胞。成骨细胞起着诱导枝状骨(trabecular bone)形成的重要作用，枝状骨是继而形成骨骼的一类骨组织。
分化程序之后的第三个子步骤是使成骨细胞扩增为成骨细胞生长培养物，从分离起算日开始需要大约多于40天。
在该步骤中，将培养瓶转移到调节至特定条件的CO2培养箱中，温度范围为37-38℃。其它条件保持为5％CO2和80％湿润气氛。此外，以定期间隔向培养瓶补充新鲜培养基。在这种情况下，平均间隔为2-3天。确保定期检查培养瓶。
当培养物达到汇合时，使细胞脱离瓶表面并在新鲜组织培养瓶中继代培养直至达到适当数目(不少于4800万个细胞)的扩增细胞，由此重复该过程直至培养物扩增至所需的细胞数目。
质量控制检查是实验室方法中的基本实践，因此从每个瓶合并使用过的培养基并取样用于无菌性和支原体试验。使用PCR方法进行支原体试验。如下进行细胞表征：通过流式细胞术试验检查骨碱性磷酸酶和I型胶原分子标志物，其是研究细胞表面表达的基本标准。此处，CD 44+和151+是成骨细胞标志物，其被用于表征在各个阶段获得的培养细胞。该试验之后是茜素红染色试验，进行该试验用于检查由这些细胞诱导的钙沉积以确认它们本质上是成骨细胞。
在期望地完成扩增为成骨细胞生长培养物之后，分离并收集细胞。将收集的细胞在22-28℃的环境温度下以1400rpm离心约5-6分钟，并用DMEM(Dulbecco's改进的Eagle's培养基)充分洗涤。在该阶段结束时获得的细胞被视为活性物质，其是待注射在骨诱导部位的物质。
为了将活性物质运输到需要诱导骨的部位，将收集的细胞填充在无菌小瓶中并在无菌条件下有效密封。运输活性物质时要保持的温度应该在2-8℃的范围内。
活性物质应在自其生产日期起的72小时内使用。此外，在伤口缝合之前，应使活性物质沉降并固化7-8分钟，以有效地再生缺损骨。
有利地，已观察到：90天结束时，存在约90％骨再生，而常规骨移植能够实现65％骨再生。
因此，通过上文提到的实例，本发明相对于常规骨移植物具有重要的优点并解决了现有技术中存在的问题。

Claims (11)

1.一种通过离体培养用于植入的成骨细胞诱导骨形成的方法，所述方法包括：
-从受试者的收集物中分离骨祖细胞；
-使所述骨祖细胞分化为成骨细胞；
-使所述成骨细胞扩增以增殖为成骨细胞培养物；和
-收集并洗涤成骨细胞生长培养物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者的收集物来自后上髂嵴或胸骨。
3.根据权利要求1所述的方法，其中分离骨祖细胞包括分开有核骨髓细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中分开有核骨髓细胞之后用DMEM培养基洗涤所述有核骨髓细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中分化步骤包括在培养瓶中定期补充分化培养基。
6.根据权利要求1所述的方法，其中扩增步骤还包括将培养瓶转移到处于37-38℃温度范围内的CO2培养箱中。
7.根据权利要求6所述的方法，其中将所述CO2培养箱调节为5％CO2含量的范围。
8.根据权利要求6所述的方法，其中将所述CO2培养箱加湿至80％。
9.根据权利要求1所述的方法，其中成骨细胞培养物收集步骤还包括在1300-1500rpm范围内离心收集的成骨细胞培养物5-6分钟。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述离心之后用DMEM(Dulbecco's改进的Eagle's培养基)洗涤所述成骨细胞培养物。
11.通过权利要求1所述的用于植入的成骨细胞离体培养形成的活性物质。
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