CN107058326B - 一种大黄鱼干扰素调节因子irf3启动子、核酸构建体、细胞及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大黄鱼干扰素调节因子IRF3启动子、核酸构建体、载体，细胞及其制备方法和用途。所述大黄鱼干扰素调节因子IRF3启动子的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，或者为与Seq ID No.1互补的核苷酸序列。本发明还保护了所述的启动子或核酸构建体或载体或重组细胞或含有启动子或核酸构建体或载体或重组细胞的鱼类或哺乳动物在调控目的基因表达或转基因鱼中的用途。

Description

一种大黄鱼干扰素调节因子IRF3启动子、核酸构建体、细胞及 其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种大黄鱼干扰素调节因子IRF3启动子、核酸构建体、细胞及其制备方法和用途。
背景技术
干扰素调节因子(Interferon regulatory factor,IRF)家族是一类重要的转录因子，具有多种生物学作用，包括对机体免疫应答、细胞凋亡等信号转导通路的调节等(Taniquchi T,Oqasawara K,Takaoka A,et al.,IRF family of transcription factorsas regulators of host defense[J].Annu Rev Immunol,2001；19:623–55)。IRF3属于干扰素调节因子家族成员，其蛋白分子二级结构由氨基端的DNA结合结构域(DNA bindingdomain,DBD)和羧基端的IRF相关结构域(IRF associated domain,IAD)构成(Lohoff M,Mak TW,Roles of interferon-regulatory factors in T-helper-celldifferentiation[J].Nat Rev Immunol,2005；5:125–35)。哺乳动物中的研究表明，当细胞受病毒侵袭时，细胞可通过模式识别受体如Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)中的TLR3、RIG样受体(RIG-I-like receptors,RLRs)中的RIG-I/MDA5等识别病毒的RNA结构，并通过其介导的细胞信号通路，诱导IRF3发生磷酸化并活化，活化的IRF3分子可以自身形成同源二聚体复合物，或与IRF7形成异源二聚体复合物，并进入细胞核，结合到I型干扰素如IFN-β或者其他干扰素调节基因如ISG54(interferon stimulated gene 54)基因启动子区域，调节基因的表达，从而在受病毒感染的宿主细胞以及相邻细胞中诱导抗病毒状态的形成，在宿主的抗病毒免疫反应中发挥重要作用(Matsumiya T and Stafforini DM,Function and regulation of retinoic acid-inducible gene-I[J].Crit RevImmunol,2010；30:489–513)。鉴于干扰素调节因子IRF3功能的重要性，研究其基因的表达调控机制对于揭示宿主的抗病免疫反应及细胞信号转导通路具有重要意义。哺乳动物中的研究中，已有通过构建干扰素调节因子IRF3启动子的荧光素酶报告系统，研究目标基因的功能及其介导的细胞信号转导通路的相关报道(Sabbah A,Chang TH,Harnack R,et al.,Activation of innate immune antiviral responses by Nod2[J].Nat Immunol,2009；10:1073–80)。
目前，干扰素调节因子IRF3基因已从多种硬骨鱼类中得到克隆，如斑马鱼(Daniorerio)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、鲫鱼(Carassius auratus)、鲤鱼(Cyprinuscarpio)、草鱼(Ctenopharyngodon idella)、大西洋鲑(Salmo salar)、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、罗非鱼(Oreochromis niloticus)、石斑鱼(Epinephelus coioides)、欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)等。一些鱼类干扰素调节因子IRF3基因在不同组织中的表达水平以及在病原或病原相关类似物刺激下的表达调控已较明确，然而，目前对鱼类干扰素调节因子IRF3基因的表达调控机制，尤其是有关干扰素调节因子IRF3所涉及的细胞信号转导通路调控网络的相关研究依然较匮乏。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大黄鱼干扰素调节因子IRF3启动子。
为实现上述目的，本发明提供一种大黄鱼干扰素调节因子IRF3启动子，其特征在于，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示，或者为与Seq ID No.1互补的核苷酸序列。
本发明提供一种核酸构建体，包含所述的IRF3启动子，与IRF3启动子可操作连接的基因序列，其中所述IRF3启动子与所述基因序列来源相同或者不同。
本发明提供一种载体，其特征在于：所述载体含有所述的IRF3启动子或权利要求2所述的核酸构建体。
进一步，所述载体为所述的IRF3启动子或所述的核酸构建体与真核表达载体经重组得到的重组载体；优选的，真核表达载体为pGL4.17质粒。
本发明提供一种重组细胞，其特征在于：所述细胞含有所述的IRF3启动子或所述的核酸构建体或所述的载体，所述重组细胞为鱼类细胞或哺乳动物细胞；优选的，鱼类细胞为EPC细胞。
本发明提供一组引物对，所述引物对用于扩增得到所述的IRF3启动子，其特征在于：所述引物对的两条引物为Seq ID No：4和Seq ID No：5所示的序列；优选的，所述引物对的两条引物在Seq ID No：4和Seq ID No：5所示序列的5’端还分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基；优选的，所述引物对的两条引物分别为Seq ID No：2和Seq ID No：3所示的序列。
本发明提供一种制备所述的IRF3启动子的方法，包括：以大黄鱼基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQ ID NO：1在大黄鱼基因组DNA中的序列分别针对首尾进行设计。
进一步，所述扩增引物为所述的引物对。
本发明提供一种调控鱼类或哺乳动物中高效表达外源基因的方法，所述方法包括，将所述的启动子或所述的核酸构建体或所述的载体或所述的重组细胞导入鱼类或哺乳动物；优选的，所述鱼类为大黄鱼。
本发明还提供所述的启动子、所述的核酸构建体、或者所述的载体、或所述的重组细胞、或含有所述启动子或所述的核酸构建体或所述的载体或所述的重组细胞的鱼类或哺乳动物在调控目的基因表达或转基因鱼中的用途；优选的，所述鱼类为大黄鱼。
本发明的申请人以大黄鱼干扰素调节因子IRF3的基因序列(Yao CL,Huang XN,Fan ZJ,et al.,Cloning and expression analysis of interferon regulatory factor(IRF)3and 7in large yellow croaker,Larimichthys crocea[J].Fish ShellfishImmunol,2012；32:869–78)为基础设计引物克隆了一种大黄鱼干扰素调节因子IRF3基因启动子区序列，构建了该启动子序列的荧光素酶报告基因系统，并经过荧光素酶分析实验证实了该大黄鱼干扰素调节因子IRF3基因启动子具有较强的启动子活性。该大黄鱼干扰素调节因子IRF3基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因系统的成功构建，在理论上将为研究大黄鱼干扰素调节因子IRF3基因的表达调控机制及细胞信号转导调控网络提供良好的实验系统，在应用方面为利用该启动子构建表达载体高效表达外源基因、转基因鱼的培育以及免疫增强剂或抗病药物的筛选创造了条件，具有重要的理论和实际意义。
本发明所述的一种大黄鱼干扰素调节因子IRF3基因启动子序列为：
TGTCGTGGTTCCAACTTCTCAAAGGTTTGCTTTGCTGTCTTTTCTTGTAATTATTTTAATAAACTGAATTTATTGTATTTTTAGTAGTTTTGAGCTTTGGTTGGACAAAACAAGCATGTGATGTCACTTTGGTAACTGAGATGTCACGTCTCGAGATTTTTTACAAACATTGATTACACAATCGATTAAATTAAAAGAAAAATAATCCTTAATTTATTAAGGATTCTTTTTTAATTTATTATTATTTAAAATAATAATAATAAAATGAGCTCAACCTAATCTACTTGTACTAGTAAAATCCTGCTTTTAAATGAATGCATGAATAATAATTTTAATAATAATTTAAATAACTTTTTTAAACTTTAGGTACATTTCATGGTTATACTTGAGCTTCAGGGGTTGCATCATGTCAACAAACGTCATAAATATAAGTGTGTGTGTGAAGTGTGCGCATGCGCATGCGCGTGTTTGACCCCACCTAGCGGGCCCGGGCTGGGATGAAACGTGATGACGTCACATTTGAAAAACGAAACTGAGTCCTCGGAGTTTCCCGAGAAAACCGAAAACCCCTCCGTGAGCGTGTCAGACAGCTCTGTGACAGGGAGCCACCGTGCTGGTATTTAAAAGCATGAGCAGCTGAGATTGAATGACACTTTGTCACGAAGCTTCAGGAGGAACAAACGAGCCATTATCTCCGACTTTCTGGCCCTGCACCTGAACTCAACACTCACCTACACCAACTGGAAGCTCGTGACTGCAGGTAGGAGAGTTTGCAATGCTGTGAAATATGATTAATAATGTATTCATTTATAGCACATCTGCAGACTGAGTAACGAAATATACCTTGTGTACTATGTATGAAATTTCACACTTGAGTTGTTGTACTCGAGTATTTCCACATTACGTAACTTTATAGCCTGTTTCACTTCTATTTTAAGTTACAATAAAAAAATACAAATTGAATCTGTTATTGTACACTAATATTCATATCTGACACCTGAATGAATAAAATGCATGAATATGTACTTTTACCTTTCATGCTTAAATACATGAACTGTAACAGTTACAGTGTTTTTAAGTTTTGTTTTACTCATATTTAGTATTTTTGGAATTGAAGGCTGAACCAAACCTGGCCTCATATTTGCCTGCTTCCTCTTTTTGGTTATTCAGAAATTGTAAATATAAGTTAACTTCCAGCAGCTGCATCATAGCAATGCACACATCAGGTTGTTGATGCTCAGATGTGTGTACCTATTCCTGATTCCTGTGTAAGTGAGTCCTTGCCTTGACATATTTTGCCAATAAATCTGATTTAGTAGTAGTGAGAAATGTCATCCCTCACTTGCATGAGGATCTTTTAAAAATAGATTTTCTCATTTTAAATTAATATCAAACATGCAAAAGTGAACTTACTTTTTTTTTTACTAATTCCAGGCAGGACGTGATGATTACATTTCTTTCTGCATGTATCTGGTTGTAAAGTGACTAAATAGTGCCATCTACAGGGCCTGAACATTCTAATCATTAATATAAACCTATAAATACATATGAATAATTGTGGTGATTAAACATTCAGCCTGGCTCAGCTTGTTTTATTTACATAAAGTGAATCATCAACAATTATTTCTGTTTCACTGTTGGATTCAGGGCAAACTGCTCTGGATACTGAGAGCTACAAGACAAGAAATATATATATATATTTTTAATCATAGATGATCTGACACCGTTGATGTGACTTTTTTTTTTTTTTTTGCTCCTGCAGGAATGTCTCATTCTAAACCTCTGCTCATCCCCTGGCTTCGGGCCCACATTGACAGCACCAGGTATCCTGGTGTCCAATGGACAAACCTGGAACGAACCGAGTTCTCCGTCCCGTGGAAACA SEQ IDNO:1。
本发明所述的一种利用双荧光素酶报告基因系统检测大黄鱼干扰素调节因子IRF3启动子活性的分析方法，包括以下步骤：
1)采用PCR方法从大黄鱼基因组中扩增出大黄鱼IRF3启动子区序列，将扩增的PCR产物连接到TaKaRa公司pMD19-T载体并测序鉴定；
2)将大黄鱼IRF3基因启动子区序列插入到Promega公司荧光素酶报告基因载体pGL4.17中，使萤火虫荧光素酶基因位于该启动子的控制之下，构建得到重组载体pGL4-IRF3-pro并测序鉴定；
3)采用双荧光素酶报告基因系统分析启动子活性：将经过测序鉴定的pGL4-IRF3-pro重组载体和海肾荧光素酶对照报告基因载体pRL-TK共转染EPC细胞系，转染48小时后收集细胞，并通过Promega公司的双荧光素酶报告基因系统分别检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的酶活性值，计算二者的比值得出转染细胞的荧光素酶相对活性；同时，以共转染pGL4.17空载体和pRL-TK载体EPC细胞的荧光素酶相对活性为对照，计算出大黄鱼IRF3启动子的相对活性；
4)使用不同浓度的LPS和poly I:C分别刺激pGL4-IRF3-pro重组载体和pRL-TK共转染的EPC细胞，刺激24小时后收集细胞，检测并计算IRF3启动子的相对活性，通过比较刺激前后的大黄鱼IRF3启动子相对活性的变化，确定大黄鱼IRF3基因启动子在LPS和poly I:C免疫刺激下的活性变化。
5)将大黄鱼线粒体抗病毒信号蛋白MAVS真核表达重组载体p3xFLAG-MAVS与pGL4-IRF3-pro、pRL-TK共转染的EPC细胞，以共转染空载体p3xFLAG-CMV-14、pGL4-IRF3-pro、pRL-TK的EPC细胞为对照，转染48小时后收集细胞，检测并计算IRF3启动子的相对活性，通过比较共转染MAVS真核表达重组载体p3xFLAG-MAVS与共转染空载体p3xFALG-CMV-14的大黄鱼IRF3启动子相对活性的变化，确定大黄鱼IRF3基因启动子活性是否可被大黄鱼线粒体抗病毒信号蛋白MAVS所诱导。
本发明所述的大黄鱼干扰素调节因子IRF3基因启动子的应用如下：
1)所述的大黄鱼干扰素调节因子IRF3基因启动子的克隆及启动子活性验证，为研究大黄鱼干扰素调节因子IRF3基因的表达调控及细胞信号转导调控网络提供良好的实验系统；
2)所述的大黄鱼干扰素调节因子IRF3基因启动子可用于构建真核表达载体在鱼类细胞或哺乳动物细胞中高效表达外源基因以及转基因鱼的培育；
3)所述的大黄鱼干扰素调节因子IRF3基因启动子可用于免疫增强剂或抗病药物的筛选。
附图说明
图1为pGL4-IRF3-pro重组载体的构建过程示意图。
图2为pGL4-IRF3-pro重组载体与pRL-TK共转染EPC细胞的普通光学显微镜观察图(100倍)。可以观察到细胞生长状态良好。
图3为采用双荧光素酶报告基因检测系统分析大黄鱼干扰素调节因子IRF3基因启动子的活性图。
图4为采用双荧光素酶报告基因检测系统分析大黄鱼干扰素调节因子IRF3基因启动子在不同浓度poly I:C和LPS刺激下的活性图。
图5为采用双荧光素酶报告基因检测系统分析大黄鱼线粒体抗病毒信号蛋白MAVS对大黄鱼干扰素调节因子IRF3基因启动子的诱导作用图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
EPC细胞，可购买于中国典型培养物保存中心，也可购买于其他商业机构。
实施例1：大黄鱼干扰素调节因子IRF3基因启动子的克隆
以下依据图1的流程步骤进行。
以大黄鱼基因组(将市面上的大黄鱼按照正常的基因组提取工艺，提取其大黄鱼基因组DNA)为模板，设计引物，引物序列如下；
正向引物：SEQ ID NO:2；其中下划直线为KpnI酶切位点，下划虚线为SEQ ID NO:4；
反向引物：SEQ ID NO:3；其中下划直线为Bgl II酶切位点，下划虚线为SEQ ID NO:5。
采用TaKaRa ExTaq酶，PCR扩增大黄鱼干扰素调节因子IRF3基因启动子，PCR反应体系如下：
PCR反应条件如下：
将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，使用Omega公司胶回收试剂盒进行PCR产物回收；
将PCR产物连接到pMD19-T克隆载体，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，筛选阳性克隆并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序鉴定，测序正确的克隆称为pMD19-T-IRF3-pro重组载体。
实施例2：大黄鱼干扰素调节因子IRF3基因启动子重组载体pGL4-IRF3-pro的构建
1)将上述pMD19-T-IRF3-pro重组载体的Top10菌株扩大培养，抽提质粒，并将该重组质粒使用Kpn I/Bgl II双酶切，经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收酶切后的IRF3 promoter；
2)将pGL4.17荧光素酶报告载体(promega公司)使用Kpn I/Bgl II双酶切并用胶回收试剂盒回收酶切后的载体；
3)使用TaKaRa公司的T4 DNA连接酶连接经双酶切的IRF3启动子序列片段和载体pGL4.17，构建重组载体pGL4-IRF3-pro，连接体系如下：
反应条件：16℃孵育过夜；
4)将上述连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，筛选阳性克隆并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序鉴定；
5)将经过测序鉴定的含有重组载体pGL4-IRF3-pro的大肠杆菌Top10细胞扩大培养，抽提质粒，检测质粒浓度与纯度备用。
实施例3：双荧光素酶报告基因检测系统分析大黄鱼干扰素调节因子IRF3基因启动子的活性
1.接种EPC细胞于24孔细胞培养板，每孔2×105个细胞，加500μl MEM培养基，于25℃生化培养箱培养过夜；
2.每孔EPC细胞使用Invitrogen公司的LipofectamineTM3000转染试剂共转染100ng实施例2所得的重组载体pGL4-IRF3-pro和10ng海肾荧光素酶对照报告基因载体pRL-TK；同时，以共转染100ng空载体pGL4.17和10ng海肾荧光素酶对照报告基因载体pRL-TK的EPC细胞为对照；每个处理设置3个重复。细胞转染具体步骤如下：
a)将待转染的载体(100ng pGL4-IRF3-pro+10ng pRL-TK或者100ng pGL4.17+10ng pRL-TK)分别用25μl Opti-MEM培养基(购自GIBCO)混匀；
b)取0.75μl LipofectamineTM 3000脂质体加入25μl Opti-MEM培养基混匀；
c)将上述被Opti-MEM培养基稀释好的待转染的载体和脂质体混匀，室温孵育5分钟；
d)将上述混匀的50μl混合物小心加入到24孔细胞培养板的培养孔中，轻轻摇晃细胞板混匀，置于25℃生化培养箱中培养。
pGL4-IRF3-pro重组载体与海肾荧光素酶对照报告基因载体pRL-TK共转染EPC细胞结果见图2，可以观察到细胞生长状态良好。
3.转染48小时后收集转染细胞，用双荧光素酶报告基因检测系统分别读取萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的酶活性值，通过计算二者酶活性值的比值得出转染细胞中荧光素酶的相对活性；同时，以空载体pGL4.17和海肾荧光素酶对照报告基因载体pRL-TK共转染的EPC细胞中荧光素酶的相对活性作为对照，结果见图3。图3为采用双荧光素酶报告基因检测系统分析大黄鱼干扰素调节因子IRF3基因启动子的活性图。图中pGL4.17表示空载体pGL4.17转染细胞的荧光素酶相对活性(即为对照)；IRF3-pro为重组载体pGL4-IRF3-pro转染细胞的荧光素酶相对活性；*表示显著性差异P<0.05。从图中可以看出，重组载体pGL4-IRF3-pro转染细胞的荧光素酶相对活性与对照相比，具有显著差异；也就是说，含有IRF3启动子基因的重组载体与不含IRF3启动子基因的空载体相比，具有明显的启动荧光素酶的作用。
荧光素酶酶活性测定方法参考Promega公司双荧光素酶报告基因检测系统说明书进行，具体步骤为：
a)转染EPC细胞48小时后，用磷酸缓冲液洗涤一次；
b)每孔加入100μl PLB裂解液(Passive Lysis Buffer，Promega试剂盒提供)并在室温下裂解细胞15分钟，晃动培养板，使其裂解完全，短暂离心收集细胞裂解液上清；
c)在检测管中将100μl荧光素酶检测试剂II(LAR II)和20μl上述细胞裂解液上清混合，萤火虫荧光素酶活性立即用化学发光检测仪(Promega GloMax 20/20)检测；
d)向检测管中加入100μl Stop&Glo试剂，将上述反应淬灭，同时启动海肾荧光素酶反应，检测海肾荧光素酶活性；
e)分别读取萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的酶活性值，计算二者酶活性值的比值得出转染细胞中荧光素酶的相对活性，同时，以转染空载体pGL4.17和海肾荧光素酶对照报告基因载体pRL-TK共转染的EPC细胞中荧光素酶的相对活性作为对照。
4.对于免疫刺激实验，在上述重组载体pGL4-IRF3-pro和海肾荧光素酶对照报告基因载体pRL-TK共转染EPC细胞24小时后，分别在培养基中加入终浓度为100ng/ml polyI:C、1000ng/ml poly I:C、及100ng/ml LPS、1000ng/ml LPS继续培养24小时，收集细胞，用上述荧光素酶报告基因检测系统分别计算在不同浓度LPS和poly I:C刺激条件下转染细胞中的荧光素酶相对活性，并与未经刺激的转染细胞中荧光素酶相对活性进行比较，实验结果为3次独立实验结果的平均值，结果见图4。图4为采用双荧光素酶报告基因检测系统分析大黄鱼干扰素调节因子IRF3基因启动子在不同浓度poly I:C和LPS刺激下的活性。图中表示空载体pGL4.17转染细胞(对照)和重组载体pGL4-IRF3-pro转染细胞分别在无刺激或100ng/ml poly I:C、1000ng/ml poly I:C、100ng/ml LPS、1000ng/ml LPS刺激下的荧光素酶相对活性；*表示显著性差异P<0.05。从图4中的结果可以发现，不同浓度的LPS刺激不能明显改变转染细胞中荧光素酶的相对活性，而1000ng/ml poly I:C刺激下转染细胞中荧光素酶相对活性显著上调，说明大黄鱼IRF3启动子活性可被poly I:C免疫刺激所诱导。
对于检测其他分子是否有激活大黄鱼IRF3启动子活性的实验，可将构建好的其他分子的真核表达重组载体与上述所得重组载体pGL4-IRF3-pro及pRL-TK共转染EPC细胞，检测其他分子的表达是否可激活大黄鱼IRF3启动子。本实验中以大黄鱼线粒体抗病毒信号蛋白MAVS的重组载体p3xFLAG-MAVS为例进行检测，其中重组载体p3xFLAG-MAVS的构建步骤如下：
以大黄鱼cDNA(将市面上的大黄鱼按照标准的TRIZOL法提取总RNA，取1μg总RNA使用ThermoFisher公司的cDNA合成试剂盒逆转录为cDNA)为模板，设计引物，引物序列如下；
正向引物：SEQ ID NO:6；其中下划直线为Hind III酶切位点，下划虚线为SEQ ID NO:8；
反向引物：SEQ ID NO:7；其中下划直线为BamH I酶切位点，下划虚线为SEQ ID NO:9。
1)采用TaKaRa ExTaq酶，PCR扩增大黄鱼线粒体抗病毒信号蛋白MAVS的完整开放阅读框，PCR反应体系如下：
PCR反应条件如下：
将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，使用Omega公司胶回收试剂盒进行PCR产物回收；
2)将上述所得PCR产物使用Hind III/BamH I双酶切，将p3xFLAG-CMV-14载体使用Hind III/BamH I双酶切，并分别经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收酶切后的PCR产物与载体；
3)使用TaKaRa公司的T4DNA连接酶连接经双酶切的MAVS完整开放阅读框片段和载体p3xFLAG-CMV-14，构建重组载体p3xFLAG-MAVS，连接体系如下：
反应条件：16℃孵育过夜；
4)将上述连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，筛选阳性克隆并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序鉴定；
5)将上述经过测序鉴定的含有重组载体p3xFLAG-MAVS的大肠杆菌Top10细胞扩大培养，抽提质粒，检测质粒浓度与纯度备用。
将上述构建好的大黄鱼线粒体抗病毒信号蛋白MAVS重组载体p3xFLAG-MAVS100ng与100ng上述所得重组载体pGL4-IRF3-pro及10ng海肾荧光素酶对照报告基因载体pRL-TK共转染EPC细胞系，同时以共转染空载体p3xFLAG-CMV-14100ng与100ng重组载体pGL4-IRF3-pro及10ng pRL-TK的EPC细胞为对照，转染后48小时，收集细胞，用上述荧光素酶报告基因检测系统检测共转染p3xFLAG-MAVS重组质粒细胞中的荧光素酶相对活性，并与转染空载体p3xFLAG-CMV-14细胞中的荧光素酶相对活性进行比较，实验结果为3次独立实验结果的平均值,结果见图5。图5为采用双荧光素酶报告基因检测系统分析大黄鱼线粒体抗病毒信号蛋白MAVS对大黄鱼干扰素调节因子IRF3基因启动子的诱导作用。其中p3xFLAG-CMV-14表示空载体p3xFLAG-CMV-14与重组载体pGL4-IRF3-pro共转染细胞后的荧光素酶相对活性(对照)；FLAG-MAVS表示重组载体p3xFLAG-MAVS与重组载体pGL4-IRF3-pro共转染细胞后的荧光素酶相对活性；*表示显著性差异P<0.05。从图5中的结果可以发现，p3xFLAG-MAVS与pGL4-IRF3-pro共转染细胞中的荧光素酶相对活性显著高于p3xFLAG-CMV-14空载体与pGL4-IRF3-pro共转染细胞中的荧光素酶相对活性，说明大黄鱼MAVS可以诱导IRF3启动子的活化，同时证明构建的pGL4-IRF3-pro重组质粒可用于基因功能研究与信号通路分析。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 集美大学
厦门大学嘉庚学院
<120> 一种大黄鱼干扰素调节因子IRF3启动子、核酸构建体、细胞及其制备方法和
用途
<130> JMDX-17005-CNI
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1883
<212> DNA
<213> 大黄鱼
<400> 1
tgtcgtggtt ccaacttctc aaaggtttgc tttgctgtct tttcttgtaa ttattttaat 60
aaactgaatt tattgtattt ttagtagttt tgagctttgg ttggacaaaa caagcatgtg 120
atgtcacttt ggtaactgag atgtcacgtc tcgagatttt ttacaaacat tgattacaca 180
atcgattaaa ttaaaagaaa aataatcctt aatttattaa ggattctttt ttaatttatt 240
attatttaaa ataataataa taaaatgagc tcaacctaat ctacttgtac tagtaaaatc 300
ctgcttttaa atgaatgcat gaataataat tttaataata atttaaataa cttttttaaa 360
ctttaggtac atttcatggt tatacttgag cttcaggggt tgcatcatgt caacaaacgt 420
cataaatata agtgtgtgtg tgaagtgtgc gcatgcgcat gcgcgtgttt gaccccacct 480
agcgggcccg ggctgggatg aaacgtgatg acgtcacatt tgaaaaacga aactgagtcc 540
tcggagtttc ccgagaaaac cgaaaacccc tccgtgagcg tgtcagacag ctctgtgaca 600
gggagccacc gtgctggtat ttaaaagcat gagcagctga gattgaatga cactttgtca 660
cgaagcttca ggaggaacaa acgagccatt atctccgact ttctggccct gcacctgaac 720
tcaacactca cctacaccaa ctggaagctc gtgactgcag gtaggagagt ttgcaatgct 780
gtgaaatatg attaataatg tattcattta tagcacatct gcagactgag taacgaaata 840
taccttgtgt actatgtatg aaatttcaca cttgagttgt tgtactcgag tatttccaca 900
ttacgtaact ttatagcctg tttcacttct attttaagtt acaataaaaa aatacaaatt 960
gaatctgtta ttgtacacta atattcatat ctgacacctg aatgaataaa atgcatgaat 1020
atgtactttt acctttcatg cttaaataca tgaactgtaa cagttacagt gtttttaagt 1080
tttgttttac tcatatttag tatttttgga attgaaggct gaaccaaacc tggcctcata 1140
tttgcctgct tcctcttttt ggttattcag aaattgtaaa tataagttaa cttccagcag 1200
ctgcatcata gcaatgcaca catcaggttg ttgatgctca gatgtgtgta cctattcctg 1260
attcctgtgt aagtgagtcc ttgccttgac atattttgcc aataaatctg atttagtagt 1320
agtgagaaat gtcatccctc acttgcatga ggatctttta aaaatagatt ttctcatttt 1380
aaattaatat caaacatgca aaagtgaact tacttttttt tttactaatt ccaggcagga 1440
cgtgatgatt acatttcttt ctgcatgtat ctggttgtaa agtgactaaa tagtgccatc 1500
tacagggcct gaacattcta atcattaata taaacctata aatacatatg aataattgtg 1560
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ttatttctgt ttcactgttg gattcagggc aaactgctct ggatactgag agctacaaga 1680
caagaaatat atatatatat ttttaatcat agatgatctg acaccgttga tgtgactttt 1740
tttttttttt ttgctcctgc aggaatgtct cattctaaac ctctgctcat cccctggctt 1800
cgggcccaca ttgacagcac caggtatcct ggtgtccaat ggacaaacct ggaacgaacc 1860
gagttctccg tcccgtggaa aca 1883
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cggggtacct gtcgtggttc caacttctc 29
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gaagatcttg tttccacggg acggagaac 29
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tgtcgtggtt ccaacttctc 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
tgtttccacg ggacggagaa c 21
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
cccaagctta tggcttcgtt tgccagagac ag 32
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
cgcggatccg ttcttaaact tccacg 26
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
atggcttcgt ttgccagaga cag 23
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
gttcttaaac ttccacg 17

Claims (14)

1.一种大黄鱼干扰素调节因子IRF3启动子，其特征在于，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示，或者为与Seq ID No.1互补的核苷酸序列。
2.一种核酸构建体，包含权利要求1所述的IRF3启动子，与IRF3启动子可操作连接的基因序列，其中所述IRF3启动子与所述基因序列来源相同或者不同。
3.一种载体，其特征在于：所述载体含有权利要求1所述的IRF3启动子或权利要求2所述的核酸构建体。
4.权利要求3的载体，其特征在于：所述载体为权利要求1所述的IRF3启动子或权利要求2所述的核酸构建体与真核表达载体经重组得到的重组载体。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述真核表达载体为pGL4.17质粒。
6.一种重组细胞，其特征在于：所述细胞含有权利要求1所述的IRF3启动子或权利要求2所述的核酸构建体或权利要求3或4所述的载体，所述重组细胞为鱼类细胞。
7.根据权利要求6所述重组细胞，其特征在于，所述鱼类细胞为EPC细胞。
8.一组引物对，所述引物对用于扩增得到权利要求1所述的IRF3启动子，其特征在于：所述引物对的两条引物为Seq ID No：4和Seq ID No：5所示的序列。
9.根据权利要求8所述引物对，其特征在于，所述引物对的两条引物在Seq ID No：4和Seq ID No：5所示序列的5’端还分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基。
10.根据权利要求9所述引物对，其特征在于，所述引物对的两条引物分别为Seq IDNo：2和Seq ID No：3所示的序列。
11.一种制备SEQ ID NO：1所述的IRF3启动子的方法，包括
以大黄鱼基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQ IDNO：1在大黄鱼基因组DNA中的序列分别针对首尾进行设计。
12.权利要求11的方法，其特征在于，所述扩增引物为权利要求8-10任一所述的引物对。
13.一种调控大黄鱼类中高效表达外源基因的方法，所述方法包括，将权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体或权利要求3-5任一所述的载体或权利要求6或7所述的重组细胞导入大黄鱼。
14.权利要求1所述的启动子、或权利要求2所述的核酸构建体、或者权利要求3-5任一所述的载体在调控目的基因表达或制备转基因鱼中的用途，所述鱼类为大黄鱼。
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Cloning and expression analysis of interferon regulatory factor (IRF) 3 and 7 in large yellow croaker, Larimichthys crocea;Cui-Luan Yao等;《Fish & Shellfish Immunology》;20120219;第32卷(第5期);第869-878页 *
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登录号：KX148469;Ding Y等;《GenBank》;20161008;第1-1349位 *

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