CN107050453A - 磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体及其制备方法和应用 - Google Patents

磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体及其制备方法和应用，其制备方法为以氧化石墨烯、FeCl3·6H2O、醋酸钠和苯胺单体为原料，利用化学共沉淀法以及原位合成法制得；所述氧化石墨烯、FeCl3·6H2O、醋酸钠和苯胺单体的质量比为7～8：23～25：47～49：0.5～1.5。本发明制得的磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO‑Fe3O4‑PANI，是以磁导靶向、载药功能为基础，兼具联合磁疗、热疗、化疗多功能的抗癌新型靶向氧化石墨烯药物载体，具有良好的生物相容性、水溶性及稳定性；具有磁导靶向性；具备有热疗的功效；负载上抗肿瘤药物具备光热疗与靶向化疗等多功能、多维度癌症治疗的功效。

Description

磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药学技术领域，具体涉及一种磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是人类尚未攻克的顽症，预计到2030年全球将有2600万新增癌症病例，死亡例数将跃至1700万，而其中大多数将发生在中低收入的发展中国家，癌症正成为新世纪人类第一杀手并成为全球最大的公共卫生问题，恶性肿瘤造成大量劳动力的损失，社会资源的大量消耗。据世界卫生组织(WHO)报道我国已经成为世界第二大癌症高发区；据我国卫生部发布的数据显示：城乡居民前十位疾病死亡率及死亡原因中恶性肿瘤居于首位。恶性肿瘤已严重威胁人类的生命健康。故我国迫切需要新的更为有效的肿瘤治疗技术和手段。近年来，尽管各学科(手术、放疗、化疗、热疗、基因治疗等)都有长足的发展，但随着研究的深入，单一治疗手段远非治疗肿瘤的最优策略，对患者进行联合治疗已经形成共识，联合治疗可发挥不同治疗手段之间的协同增益效果，从而提高疗效。生物热效应致细胞凋亡的肿瘤热疗是近年来发展较快的一种肿瘤治疗手段。“现代医学之父”希波克拉底曾经说过“药物治愈不了的疾病用手术，手术治愈不了的疾病，可以用热来治疗，用热不能治好的疾病，就无法治愈了”。他对热疗给予了高度的评价。然而在肿瘤的临床治疗方案中，热疗多是作为术后放化疗的辅助手段以提高肿瘤临床治疗的效果和患者的生存质量。结合了热疗和肿瘤纳米技术的双重优势，磁感应纳米热疗将“纳米磁性材料在交变磁场下感应升温”的基本原理应用于肿瘤的临床治疗。随着材料学、生物医学工程和临床医学等学科的综合发展，功能性生物材料应用于肿瘤综合治疗逐渐成为国内外研究热点。迄今为止，无论是基础研究还是临床试验，对于载体磁性纳米复合微粒磁感应热疗用于肿瘤单一治疗模式，抑或是结合该治疗手段与其他治疗方法的肿瘤磁感应综合治疗模式，特别是将化疗药物与温控材料联合用于肿瘤的磁感应热化疗的研究鲜有报道。目前化疗还是治疗肿瘤的重要方法，但是其在杀伤肿瘤细胞的同时也损伤正常细胞，对患者造成严重的毒副作用，具有无毒与生物相容性的磁导靶向石墨烯载药系统可以将化疗药物定向输送到肿瘤部位，提高对肿瘤的治疗效果，降低对人体的毒副作用，而纳米氧化石墨烯在808nm近红外激光照射下的光热转化性能，恰好成就了其作为热疗药源的优势，负载上化疗药物，经过磁导靶向用药后，借助红外线对肿瘤病灶进行局部照射，使特异性摄取纳米药物的肿瘤细胞内部产生过高热，从而诱导肿瘤细胞热损伤及加速肿瘤细胞凋亡，发挥其高光学吸收特性并协同化疗药物杀伤肿瘤细胞，从而实现双重靶向、光热化疗联合治疗癌症的目的。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的上述问题，提供一种磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体及其制备方法和应用，制备出的磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI稳定性优良、溶解性好及生物相容性佳，并用于制备磁性纳米靶向氧化石墨烯抗癌药物。
为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI的制备方法，以氧化石墨烯、FeCl3·6H2O、醋酸钠和苯胺单体为原料，利用化学共沉淀法以及原位合成法制得；所述氧化石墨烯、FeCl3·6H2O、醋酸钠和苯胺单体的质量比为7～8： 23～25：47～49：0.5～1.5。
上述的制备方法包括以下步骤：
(1)将氧化石墨烯在乙二醇中超声分散形成均匀的分散液，然后分别称取FeCl3·6H2O、醋酸钠和聚乙烯吡咯烷酮溶解于乙二醇中，搅拌使之形成澄清溶液；
(2)将上述溶液移入高压反应釜中于180～200℃反应，待反应10～12h后使之冷却至室温，将所得溶液用透析袋透析，得到产物A；
(3)将产物A和苯胺单体加入到预分散有十二烷基苯磺酸钠的蒸馏水中，超声分散形成均一体系B；
(4)将浓度为0.024～0.032g/ml的过硫酸铵缓慢滴加到体系B中，搅拌反应18～24h，然后用透析袋透析后制得磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体 GO-Fe3O4-PANI。
上述步骤(2)和步骤(4)中用透析袋透析的方法具体为用分子截留量为 8000～14000的透析袋透析3～4天，且每12～18h更新一次透析介质。
上述氧化石墨烯的制备方法包括以下步骤：在烧瓶中加入98％H2SO4，并移入冰水浴中搅拌，稳定温度在10℃以下；随即加入鳞片石墨与硝酸钠的混合物，搅拌使其充分混合；接着加入高锰酸钾，在10℃以下反应2～2.5h，然后移入35℃的水浴锅中反应12～13h；反应结束后向其缓慢注入去离子水并搅拌使其溶解，再在98℃中反应15～20min后，将反应液趁热加入30％的H2O2并搅拌，待无气泡产生后加入8％～12％的HCl溶液，搅拌均匀后进行离心洗涤，取下层胶体冷冻干燥后得到氧化石墨烯。
上述鳞片石墨、硝酸钠、高锰酸钾的质量比为1～2：0.5～1.5：5～7；每1g 鳞片石墨加入23～25mL的98％H2SO4。
利用上述的制备方法制得磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体 GO-Fe3O4-PANI。
利用上述的制备方法制得的磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体 GO-Fe3O4-PANI在医药学方面的应用。
上述的磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI在医药学方面的应用具体为联合磁疗、光热疗、化疗法在制备抗癌药物方面的应用。
相比于现有技术，本发明的优势在于：
本发明揭示了一种磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体及其制备方法和应用，通过对Hummers法进行改良，制备氧化石墨烯(GO)，以化学共沉淀方法制备出可增大GO表面积、抑制Fe3O4颗粒团聚、具备磁性及靶向、光热疗法特性的复合物GO-Fe3O4，再以聚苯胺(PANI)对其进行修饰制备出稳定性优良、溶解性好及生物相容性佳的磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI，以该磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体负载抗癌药物(如CDDP)，制备磁性纳米靶向氧化石墨烯抗癌药物，并对该药物进行安全性评价、靶向抗癌活性测定及机制的初步研究。
本发明制得的磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI，是以磁导靶向、载药功能为基础，兼具联合磁疗、热疗、化疗多功能的抗癌新型靶向氧化石墨烯药物载体，具有如下优点：①具有良好的生物相容性；②具有良好的水溶性及稳定性；③具有磁导靶向性(纳米四氧化三铁的磁性)；④具备有热疗的功效；⑤负载上抗肿瘤药物(如顺铂)具备光热疗与靶向化疗等多功能、多维度癌症治疗的功效。
附图说明
图1是红外光谱分析实验的红外吸收光谱图。
图2是GO的扫描电镜图谱。
图3是GO-Fe3O4-PANI的扫描电镜图谱。
图4是GO-Fe3O4-PANI对7702细胞毒性实验结果。
图5是GO-Fe3O4-PANI对7721细胞毒性实验结果。
图6是GO-Fe3O4-PANI对HepG-2细胞毒性实验结果。
图7是GO-Fe3O4-PANI对RAW264.7细胞毒性实验结果。
图8是铁含量测定标准曲线图。
图9是GO-Fe3O4-PANI与7702细胞作用24h的结果。
图10是GO-Fe3O4-PANI与7702细胞作用48h的结果。
图11是GO-Fe3O4-PANI与7702细胞作用72h的结果。
图12是GO-Fe3O4-PANI与HepG-2细胞作用24h的结果。
图13是GO-Fe3O4-PANI与HepG-2细胞作用48h的结果。
图14是GO-Fe3O4-PANI与HepG-2细胞作用72h的结果。
图15是考马斯亮蓝法测定蛋白质含量时用到的BSA标准曲线。
图16是吸附时间对GO-Fe3O4-PANI吸附BSA性能的影响。
图17是初始BSA浓度对吸附的影响。
图18是GO-Fe3O4-PANI在不同pH条件下对BSA吸附的影响。
图19是顺铂的标准曲线。
图20是GO-Fe3O4-PANI负载CDDP的释药实验结果。
附图标记：
A——GO-Fe3O4的红外光谱；
B——GO的红外光谱；
C——GO-Fe3O4-PANI的红外光谱；
1——铁含量为0.000μg/mL的GO-Fe3O4-PANI与7702细胞作用24h的结果；
2——铁含量为3.373μg/mL的GO-Fe3O4-PANI与7702细胞作用24h的结果；
3——铁含量为6.745μg/mL的GO-Fe3O4-PANI与7702细胞作用24h的结果；
4——铁含量为0.000μg/mL的GO-Fe3O4-PANI与7702细胞作用48h的结果；
5——铁含量为3.373μg/mL的GO-Fe3O4-PANI与7702细胞作用48h的结果；
6——铁含量为6.745μg/mL的GO-Fe3O4-PANI与7702细胞作用48h的结果；
7——铁含量为0.000μg/mL的GO-Fe3O4-PANI与7702细胞作用72h的结果；
8——铁含量为3.373μg/mL的GO-Fe3O4-PANI与7702细胞作用72h的结果；
9——铁含量为6.745μg/mL的GO-Fe3O4-PANI与7702细胞作用72h的结果；
10——铁含量为0.000μg/mL的GO-Fe3O4-PANI与HepG-2细胞作用24h的结果；
11——铁含量为3.373μg/mL的GO-Fe3O4-PANI与HepG-2细胞作用24h的结果；
12——铁含量为6.745μg/mL的GO-Fe3O4-PANI与HepG-2细胞作用24h的结果；
13——铁含量为0.000μg/mL的GO-Fe3O4-PANI与HepG-2细胞作用48h的结果；
14——铁含量为3.373μg/mL的GO-Fe3O4-PANI与HepG-2细胞作用48h的结果；
15——铁含量为6.745μg/mL的GO-Fe3O4-PANI与HepG-2细胞作用48h的结果；
16——铁含量为0.000μg/mL的GO-Fe3O4-PANI与HepG-2细胞作用72h的结果；
17——铁含量为3.373μg/mL的GO-Fe3O4-PANI与HepG-2细胞作用72h的结果；
18——铁含量为6.745μg/mL的GO-Fe3O4-PANI与HepG-2细胞作用72h的结果。
具体实施方式
以下结合实施例及其附图对本发明技术方案作进一步非限制性的详细说明。
实施例1
一、氧化石墨烯的制备方法
在烧瓶中加入98％H2SO4，并移入冰水浴中搅拌，稳定温度在10℃以下；随即加入鳞片石墨与硝酸钠的混合物，搅拌使其充分混合；接着加入高锰酸钾，在10℃以下反应2h，然后移入35℃的水浴锅中反应12h；反应结束后向其缓慢注入去离子水并搅拌使其溶解，再在98℃中反应15min后，将反应液趁热加入 30％的H2O2并搅拌，待无气泡产生后加入8％的HCl溶液，搅拌均匀后进行离心洗涤，取下层胶体冷冻干燥后得到氧化石墨烯。其中鳞片石墨、硝酸钠、高锰酸钾的质量比为1:0.5:5；每1g鳞片石墨加入23mL的98％H2SO4。
二、磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI的制备方法
以氧化石墨烯、FeCl3·6H2O、醋酸钠和苯胺单体为原料，利用化学共沉淀法以及原位合成法制得；所述氧化石墨烯、FeCl3·6H2O、醋酸钠和苯胺单体的质量比为7：23：47：0.5。具体包括以下步骤：
(1)将氧化石墨烯在乙二醇中超声分散形成均匀的分散液(乙二醇作为溶剂)，然后分别称取FeCl3·6H2O、醋酸钠和聚乙烯吡咯烷酮溶解于乙二醇中，搅拌使之形成澄清溶液；
(2)将上述溶液移入高压反应釜中于180℃反应，待反应10h后使之冷却至室温，将所得溶液用分子截留量为8000～14000的透析袋透析3天，且每12h 更新一次透析介质，得到产物A；
(3)将产物A和苯胺单体加入到预分散有十二烷基苯磺酸钠的蒸馏水中 (十二烷基苯磺酸钠作为表面活性剂)，超声分散形成均一体系B；
(4)将浓度为0.024g/ml的过硫酸铵缓慢滴加到体系B中，搅拌反应18h，然后用分子截留量为8000～14000的透析袋透析3天，且每12h更新一次透析介质，制得磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI。
实施例2
一、氧化石墨烯的制备方法
在烧瓶中加入98％H2SO4，并移入冰水浴中搅拌，稳定温度在10℃以下；随即加入鳞片石墨与硝酸钠的混合物，搅拌使其充分混合；接着加入高锰酸钾，在10℃以下反应2.5h，然后移入35℃的水浴锅中反应13h；反应结束后向其缓慢注入去离子水并搅拌使其溶解，再在98℃中反应20min后，将反应液趁热加入30％的H2O2并搅拌，待无气泡产生后加入12％的HCl溶液，搅拌均匀后进行离心洗涤，取下层胶体冷冻干燥后得到氧化石墨烯。其中鳞片石墨、硝酸钠、高锰酸钾的质量比为2：1.5：7；每1g鳞片石墨加入25mL的98％H2SO4。
二、磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI的制备方法
以氧化石墨烯、FeCl3·6H2O、醋酸钠和苯胺单体为原料，利用化学共沉淀法以及原位合成法制得；所述氧化石墨烯、FeCl3·6H2O、醋酸钠和苯胺单体的质量比为8：25：49：1.5。具体包括以下步骤：
(1)将氧化石墨烯在乙二醇中超声分散形成均匀的分散液，然后分别称取FeCl3·6H2O、醋酸钠和聚乙烯吡咯烷酮溶解于乙二醇中，搅拌使之形成澄清溶液；
(2)将上述溶液移入高压反应釜中于200℃反应，待反应12h后使之冷却至室温，将所得溶液用分子截留量为8000～14000的透析袋透析4天，且每18h 更新一次透析介质，得到产物A；
(3)将产物A和苯胺单体加入到预分散有十二烷基苯磺酸钠的蒸馏水中，超声分散形成均一体系B；
(4)将浓度为0.032g/ml的过硫酸铵缓慢滴加到体系B中，搅拌反应24h，然后用分子截留量为8000～14000的透析袋透析3天，且每18h更新一次透析介质，制得磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI。
实施例3
一、氧化石墨烯的制备方法
在烧瓶中加入98％H2SO4，并移入冰水浴中搅拌，稳定温度在10℃以下；随即加入鳞片石墨与硝酸钠的混合物，搅拌使其充分混合；接着加入高锰酸钾，在10℃以下反应2.3h，然后移入35℃的水浴锅中反应12.5h；反应结束后向其缓慢注入去离子水并搅拌使其溶解，再在98℃中反应18min后，将反应液趁热加入30％的H2O2并搅拌，待无气泡产生后加入10％的HCl溶液，搅拌均匀后进行离心洗涤，取下层胶体冷冻干燥后得到氧化石墨烯。其中鳞片石墨、硝酸钠、高锰酸钾的质量比为2：1：6；每1g鳞片石墨加入24mL的98％H2SO4。
二、磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI的制备方法
以氧化石墨烯、FeCl3·6H2O、醋酸钠和苯胺单体为原料，利用化学共沉淀法以及原位合成法制得；所述氧化石墨烯、FeCl3·6H2O、醋酸钠和苯胺单体的质量比为7：24：48：1。具体包括以下步骤：
(1)将氧化石墨烯在乙二醇中超声分散形成均匀的分散液(乙二醇作为溶剂)，然后分别称取FeCl3·6H2O、醋酸钠和聚乙烯吡咯烷酮溶解于乙二醇中，搅拌使之形成澄清溶液；
(2)将上述溶液移入高压反应釜中于190℃反应，待反应11h后使之冷却至室温，将所得溶液用分子截留量为8000～14000的透析袋透析3.5天，且每15h 更新一次透析介质，得到产物A；
(3)将产物A和苯胺单体加入到预分散有十二烷基苯磺酸钠的蒸馏水中 (十二烷基苯磺酸钠作为表面活性剂)，超声分散形成均一体系B；
(4)将浓度为0.029g/ml的过硫酸铵缓慢滴加到体系B中，搅拌反应18h，然后用分子截留量为8000～14000的透析袋透析3.5天，且每15h更新一次透析介质，制得磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI。
实施例4
一、氧化石墨烯(GO)的制备方法
在250mL烧瓶中加入11.5mL的98％H2SO4，将烧瓶移入冰水浴中低速搅拌，稳定温度在10℃以下；随即加入0.5g鳞片石墨与0.25g硝酸钠的混合物，中速搅拌30min使其充分混合；接着在1h内分6次加入1.5g高锰酸钾，在10℃以下(低温)反应2.5h后，此时反应液变为墨绿色，将反应瓶移入35℃(中温) 的水浴锅中继续反应13h；反应结束后向其中缓慢注入23mL的去离子水并搅拌，保持温度98℃搅拌20min，接着将反应液倒入500mL的烧杯中，趁热加入20mL 30％H2O2并搅拌，溶液立即变为亮黄色；待无气泡产生后加入10mL HCl(1:10)的稀溶液，搅拌均匀后2000rpm离心10min，获取下层胶体，用预先制备好的10％HCl溶液洗涤3～5遍，再用去离子水反复充分洗涤，直至上层液体pH＝7，将上层液分离，下层胶体冷冻干燥48h后即得氧化石墨烯，密封保存备用。
二、磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体氧化石墨烯-四氧化三铁-聚苯胺 (GO-Fe3O4-PANI)的制备
(1)将0.25g氧化石墨烯在80mL乙二醇中超声3h分散形成均匀的分散液，然后称取0.8g FeCl3·6H2O、1.6g醋酸钠和2.49g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，溶解于70mL乙二醇中，搅拌使之形成澄清溶液；
(2)将所得溶液移入高压反应釜中200℃反应10h，反应完成后使之冷却至室温，将所得墨绿色溶液用分子截留量为8000～14000的透析袋透析3天，每 12h更换一次透析介质，得到产物A；
(3)将10mL产物A和0.5g苯胺单体加入到预分散有2.5g十二烷基苯磺酸钠的20mL蒸馏水中，超声分散60min形成均一体系B；
(4)将0.7g过硫酸铵溶解于25mL蒸馏水中，缓慢滴加到体系B中，搅拌反应12h后用分子截留量为8000～14000的透析袋透析3天，每12h更换一次透析介质，得到水溶性良好的磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体 GO-Fe3O4-PANI，放入4℃冰箱保存备用。
实施例5
一、氧化石墨烯(GO)的制备方法
在250mL烧瓶中加入24mL的98％H2SO4，将烧瓶移入冰水浴中低速搅拌，稳定温度在10℃以下；随即加入1g鳞片石墨与1g硝酸钠的混合物，中速搅拌 25min使其充分混合；接着在1h内分4次加入5g高锰酸钾，在10℃以下(低温)反应2.5h后，此时反应液变为墨绿色，将反应瓶移入35℃(中温)的水浴锅中继续反应12h；反应结束后向其中缓慢注入40mL的去离子水并搅拌，保持温度98℃搅拌20min，接着将反应液倒入500mL的烧杯中，趁热加入30mL30％ H2O2并搅拌，溶液立即变为亮黄色；待无气泡产生后加入10mL HCl(1:10)的稀溶液，搅拌均匀后2000rpm离心12min，获取下层胶体，用预先制备好的12％HCl 溶液洗涤3～5遍，再用去离子水反复充分洗涤，将上层液分离，下层胶体冷冻干燥40h后即得氧化石墨烯，密封保存备用。
二、磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体氧化石墨烯-四氧化三铁-聚苯胺 (GO-Fe3O4-PANI)的制备
(1)将0.5g氧化石墨烯在100mL乙二醇中超声4h分散形成均匀的分散液，然后称取1.7g FeCl3·6H2O、3.3g醋酸钠和5.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，溶解于80mL乙二醇中，搅拌使之形成澄清溶液；
(2)将所得溶液移入高压反应釜中190℃反应11h，反应完成后使之冷却至室温，将所得墨绿色溶液用分子截留量为8000～14000的透析袋透析4天，每 12h更换一次透析介质，得到产物A；
(3)将20mL产物A和1.0g苯胺单体加入到预分散有5.0g十二烷基苯磺酸钠的40mL蒸馏水中，超声分散60min形成均一体系B；
(4)将0.96g过硫酸铵溶解于30mL蒸馏水中，缓慢滴加到体系B中，搅拌反应11h后用分子截留量为8000～14000的透析袋透析4天，每12h更换一次透析介质，得到水溶性良好的磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体 GO-Fe3O4-PANI，放入4℃冰箱保存备用。
利用实施例1至实施例5的制备方法制得的磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI，并将其应用在医药学方面，具体为负载抗癌药物(如 CDDP)，联合磁疗、光热疗、化疗法在制备抗癌药物方面的应用。
利用本发明的制备方法制出的磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体 GO-Fe3O4-PANI分别用于人正常肝细胞株7702、SMMC-7721细胞株、人肝癌 HepG-2及小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7的体外细胞毒性实验和胎牛血清白蛋白BSA吸附实验，实验表明磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体 GO-Fe3O4-PANI具有良好的生物相容性，为氧化石墨烯磁性纳米靶向载药体系及其联合光热疗法在医药学上的应用提供参考依据。
具体实验内容如下：
一、红外光谱分析实验
称取干燥的GO-Fe3O4-PANI 1mg与100mg KBr粉末于玛瑙研钵研磨均匀，压成薄片，放入样品室，以氧化石墨烯、氧化石墨烯-四氧化三铁为对照，通过傅里叶红外变换光谱仪在4000～400cm-1范围内扫描，得到如图1所示的红外吸收光谱图，光谱A为GO-Fe3O4，光谱B为GO，光谱C为GO-Fe3O4-PANI。
由图1可知，光谱A中3436.00cm-1处吸收峰和光谱B中3402.95cm-1处吸收峰归属于OH的伸缩振动峰；光谱A中2925.75cm-1处附近的吸收峰属于CH2的伸缩振动峰；光谱B中1735.59cm-1处吸收峰和1620.36cm-1处吸收峰归属于 GO边缘的C＝O伸缩振动；1487.65cm-1处吸收峰归属于GO表面的C-O-C伸缩振动。结果表明，本发明中的石墨烯被氧化，且至少有OH、COOH、C＝O、C-O-C 这四种官能团，这些极性基团使GO具有良好的亲水性。光谱A比光谱B在 587.52cm-1处多了一个强吸收峰，这是Fe-O-Fe的伸缩振动，说明制得了纯度较高的GO-Fe3O4。光谱C中587.52cm-1处附近的吸收峰相对于光谱A中弱了很多，且光谱C中可以明显的观察到PANI的特征吸收峰(1139.09、1300.44、 1494.87和1579.29cm-1)，证明PANI成功的包覆在GO-Fe3O4表面。
二、扫描电镜分析实验
图2为GO的扫描电镜图谱(SEM图)，图3为GO-Fe3O4-PANI的扫描电镜图谱(SEM图)，从图2中我们可以看出合成了单层氧化石墨烯(GO)，表面上有些许类似波动的褶皱是由于碳的存在；而在图3中清楚地看见单层状的氧化石墨烯表面分布着很过颗粒状的物质，其中类似圆球形的颗粒状物质就是磁性纳米四氧化三铁(Fe3O4)，而另外一些类似椭圆形的颗粒则是吸附上的提高生物相容性的聚苯胺(PANI)颗粒。Fe3O4和PANI吸附分散在氧化石墨烯的表面抑制了其的卷曲和皱缩，增大了表面积。
三、水溶性靶向载体GO-Fe3O4-PANI浓度的确定及稳定性实验
按照《药典(2015年版)》规定利用恒重法计算水溶性靶向载体 GO-Fe3O4-PANI的浓度，准备三个洁净的表面皿在十万分之一天平上精密称取其质量并编号记录，用移液枪精确吸取1mL液体转移入表面皿中平铺，放入烘箱中干燥至恒重，称量，利用减重法计算得出载体浓度。
取100μL的水溶性纳米载体于玻璃离心管中分别加入蒸馏水和DMEM完全培养基稀释至6mL，充分混匀然后静置，每隔一段时间观察其是否有沉淀析出以判断其稳定性。
结果：
靶向载体溶于蒸馏水，放置30天；靶向载体溶于DMEM完全培养基，同样放置30天。根据《药典(2015年版)》中关于溶解度的定义及分类判断，我们所制备的靶向载药水溶性良好，溶液中并没有靶向载体物质析出，说明该载体稳定性良好，为其在医药学上的应用奠定了基础。
四、磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI对细胞毒性及免疫原性的检测
(1)MTT法检测磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI对细胞的毒性：
原理：MTT为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，活细胞中含有脱氢酶，MTT试剂能被脱氢酶还原成不溶于水的蓝紫色MTT-甲瓒结晶沉淀在细胞内，而死细胞没有此功能。DMSO能溶解细胞内沉淀的蓝紫色结晶物质，溶解后溶液的颜色与细胞内沉积德甲瓒量成正比，用酶标仪可测定溶液的OD 值。
实验步骤：
①将处于对数生长的细胞从培养瓶底部消化下来，800r/min离心5min 弃上清液；
②培养基重悬细胞，计数；
③将细胞稀释，配制成密度为1×105个/mL的细胞悬浮液；
④接种到96孔板中，每孔100μL，周围用PBS缓冲溶液填充防止边缘化；
⑤放入培养箱中培养24h使细胞贴壁；
⑥加入纳米粒子，设置对照组，8个浓度(终浓度为0.977、1.953、3.906、 7.813、15.625、31.250、62.500、125.000μg/mL)，每孔加入100μL；
⑦将96孔板放入培养箱中培养24h、48h和72h；
⑧24h、48h和72h后，每孔加入20μL MTT，继续在培养箱中孵育4h；
⑨小心吸掉孔内上清液，每孔加入150μL DMSO溶解细胞内蓝紫色结晶物质，震荡10min是完全溶解；
⑩在免疫酶标仪上测定490nm处的吸光度(A)值。按照公式计算细胞的相对增殖率：
细胞相对增殖率(％)＝(实验组A均值/阴性对照组A均值)×100％
将细胞相对增殖率值转换成6级(如表1所示)，实验结果为0或者1级则为合格，实验结果为2级结合细胞形态综合评价，实验结果为3～5级则为不合格。
表1细胞相对增殖率与毒性分级转换
分级 细胞相对增殖率(％)
0级 ≥100
1级 75～99
2级 50～74
3级 25～49
4级 1～24
5级 0
结果：
实验结果如图4至7所示，在一段时间内，随着纳米载体浓度的增加并没有表现出明显的细胞毒性，经统计学分析P>0.05，不同浓度对细胞的增殖没有明显差异。图4、图6和图7中GO-Fe3O4-PANI在24h、48h、72h时对细胞的增殖率和细胞毒性分级结果显示各组细胞的相对增殖率均在80～140％之间，细胞毒性分级为1或0。图5中GO-Fe3O4-PANI在24h、48h、72h时对细胞的增殖率和细胞毒性分级结果显示各组细胞的相对增殖率均在80～150％之间，细胞毒性分级为1或0。GO-Fe3O4-PANI对7702、7721、HepG-2和RAW264.7细胞的增殖相当。
总之，从总的实验结果来看，GO-Fe3O4-PANI分别与正常肝细胞7702、肝癌细胞7721、肝癌细胞HepG-2及小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW 264.7直接接触未见明显的细胞毒性，细胞毒性分别为0级或1级。并且由GO-Fe3O4-PANI 与小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW 264.7直接接触未见明显的细胞毒性还可以说明该纳米载体无免疫原性。
五、磁性纳米靶氧化石墨烯药物向载体GO-Fe3O4-PANI的体外细胞摄取实验
(1)邻二氮菲法测定铁含量
测定原理：以盐酸羟胺将Fe3+还原为Fe2+，在pH＝2～9的范围内，与邻二氮菲反应生成稳定的橙红色配合物[(C12H8N2)3Fe]2+，最大吸收峰在510nm处。
①100μg/mL标准铁溶液的配制
精密称取0.04305g硫酸铁胺，加1:1的盐酸溶液40.00mL和少量蒸馏水, 转移至50.00mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀即得。
②10％盐酸羟胺溶液的配制
精密称取2.5300g盐酸羟胺至25.00mL容量瓶中,蒸馏水溶解并稀释至刻度, 摇匀即得。
③0.15％邻二氮菲溶液的配制
精密称取0.0751g邻二氮菲在5.00mL乙醇中搅拌溶解后，转移至50.00mL 的容量瓶中加蒸馏水稀释至刻度,摇匀即得。
④1.00mol/LNaAc溶液的配制
精密称取13.7000g NaAc，先用少量蒸馏水溶解，然后转移至100mL容量瓶中稀释至刻度,摇匀即得。
标准曲线的测定：
①在6只50.00mL的具塞比色管中，分别精密移取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL 100μg/mL标准铁溶液；
②加入1.00mL 10％盐酸羟胺溶液，2.00mL0.15％邻二氮菲溶液和5.00 mL1.00mol/LNaAc溶液，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀；
③在510nm波长下，用1cm的石英比色皿以试剂溶液为空白，测定其各溶液的吸光度，以标准铁溶液浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
铁浓度的测定：
①精密移取0.50mL样品溶液，加入7.50mL浓盐酸充分反应10min，转移至50.00mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀；
②精密移取1.00mL①中溶液置于50.00mL的具塞比色管中，加入1.00mL 10％盐酸羟胺溶液，2.00mL 0.15％邻二氮菲溶液和5.00mL 1.00mol/LNaAc溶液，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置10min，待其充分显色后，在510nm波长处测溶液吸光度，代入绘制好的标准曲线中计算样品中铁含量。
结果：
如图8所示，实验得出铁含量标准曲线方程为：y＝0.201x+0.008，R2＝ 0.9994。通过标准方程计算出GO-Fe3O4-PANI中铁含量为：710μg/mL。
(2)普鲁士蓝染色观察比较细胞内铁粒子含量
铁染色的原理：
Fe3+在酸性条件下与亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6)通过普鲁士蓝反应生成蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位，可反映组织细胞内摄取的 GO-Fe3O4-PANI纳米粒子的情况。
反应式为：4Fe3++3K4(Fe(CN)6)→Fe4(Fe(CN)6)3+12K+
实验步骤：
①取生长状态良好的7702细胞和HepG-2细胞消化离心后用DMEM高糖完全培养基制成单细胞悬浮液，调整细胞浓度至3×105/mL，接种于6孔板中，每孔体积1000μL。
②贴壁生长24h后吸弃所有孔内的培养基，分别加入1000μL GO-Fe3O4-PANI培养24h、48h、72h，药物浓度按Fe含量计算依次为0.000、3.373、 6.745μg/mL。
③吸弃全部培养液体，PBS缓冲溶液充分洗涤去除未被摄取的纳米载体。
④每孔加入1000μL4％多聚甲醛溶液室温下固定30min，然后双蒸水充分洗涤，加入200μL普鲁士蓝染液染色，室温下避光作用30min。
⑤双蒸水洗涤后加入200μL中性红作核染对比染色10min，加入双蒸水充分洗涤后，于倒置显微镜下观察并拍照。
结果：
普鲁士蓝染色的图片如图9至14所示，为不同浓度的药物分别与7702细胞和HepG-2细胞作用不同时间的结果，药物浓度按Fe含量计算依次为0.000、 3.373、6.745μg/mL，细胞内的铁均被染为蓝色或者蓝紫色。从实验拍摄的图片中我们可以看出细胞的形态和内部结构没有发生明显的异常，由此表明 GO-Fe3O4-PANI进入了细胞内并且没有影响细胞的正常生长繁殖，而 GO-Fe3O4-PANI是经过何种方式进入细胞内部的还需进一步的实验研究。
六、磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI生物相容性的检测
(1)牛血清白蛋白BSA吸附实验
蛋白标准溶液的配制：精密称取0.0170g牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解并定容稀释至100mL，配成浓度为0.1700mg/mL标准蛋白液。
精密称取0.0100g考马斯亮蓝G-250，用5.00mL无水乙醇充分溶解后，加入10.00mL85％磷酸，随即转移至100mL容量瓶并用蒸馏水定容，即为0.1000 mg/mL考马斯亮蓝G-250溶液。
①BSA标准曲线的制备
分别精密移取蛋白标准溶液0、100、200、300、400、500、600、700、800、 900、1000μL于试管中，再加入蒸馏水补充至1.00mL，加入5.00mL0.1000 mg/mL考马斯亮蓝G-250溶液充分摇匀后静置5min，于595nm波长处测定每管溶液的紫外吸光度，以BSA浓度为横坐标，A595吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
②吸附时间对BSA吸附的影响
用pH＝7.4的PBS缓冲溶液配制纳米载体溶液，浓度为5mg/mL，BSA的初始浓度为0.6mg/mL，纳米载体溶液与BSA溶液以体积1:1的比例充分混匀后 37℃水浴分别超声吸附30、60、90、120、150、180、210、240、270、300min，超声后各取1.0mL并加入5.00mL考马斯亮蓝G-250工作液，室温下显色反应 5min，595nm波长处检测紫外吸收，利用绘制的标准曲线换算得到纳米载体对 BSA的吸附量随时间的变化规律。
③BSA初始浓度对BSA吸附的影响
用上述方法配制纳米载体溶液，浓度为5mg/mL，BSA的初始浓度分别为 0.02、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL，纳米载体溶液与BSA溶液以体积 1:1的比例充分混匀后37℃水浴超声吸附120min，超声后各取1.0mL并加入 5.00mL考马斯亮蓝G-250工作液，室温下显色反应5min，595nm波长处检测紫外吸收，利用绘制的标准曲线换算得到纳米载体对BSA的吸附量随BSA初始浓度的变化规律。
④pH对BSA吸附的影响
用0.2M的磷酸氢二钠与0.2M的磷酸二氢钠不同体积比混合组成不同pH缓冲溶液，其中pH值分别为5.7、6.0、6.8、7.0、7.4和8.0，用不同的缓冲溶液配制纳米载体溶液，浓度均为5mg/mL，BSA的初始浓度为0.6mg/mL，纳米载体溶液与BSA以体积1:1的比例充分混匀后37℃水浴超声吸附120min，超声后各取1.0mL并加入5.00mL考马斯亮蓝G-250工作液，室温下显色反应5min， 595nm波长处检测紫外吸收，利用绘制的标准曲线换算得到纳米载体对BSA的吸附量随pH的变化规律。
结果：
如图15所示，为考马斯亮蓝法测定蛋白质含量时用到的BSA标准曲线，横坐标为BSA浓度，其浓度范围为0～30μg/mL，纵坐标为不同BSA浓度对应的吸光度值，得到线性回归方程：y＝0.0361x+0.1093，R2＝0.9989。
如图16所示，为吸附时间对GO-Fe3O4-PANI吸附BSA性能的影响。图中表明当吸附时间达到120min时，GO-Fe3O4-PANI对BSA的吸附量达到最大值，由于pH＝7.4时，GO-Fe3O4-PANI表面的负电荷量(绝对值)最小，此时BSA 表面带有负电荷，与GO-Fe3O4-PANI的静电斥力最弱，因此对BSA的吸附量最多。
如图17所示，为初始蛋白浓度对BSA吸附的影响。BSA吸附量随其初始浓度的增加而增多，当初始浓度为1.0mg/mL时，GO-Fe3O4-PANI对BSA吸附量最大，综合考虑到吸光度值大小、GO-Fe3O4-PANI量的多少以及线性问题，我们选择了初始浓度为0.6mg/mL作为研究浓度。
如图18所示，为GO-Fe3O4-PANI在不同pH条件下对BSA吸附的影响。一般情况下，牛血清白蛋白(BSA)的等电点pI＝4.8，当pH>pI时，由于pH＝7.4 时，GO-Fe3O4-PANI表面的负电荷量(绝对值)最小，此时BSA表面带有负电荷，与GO-Fe3O4-PANI的静电斥力最弱，因此对BSA的吸附量最多。
七、磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI载药释药性能的研究
(1)顺铂标准曲线的制备
精密称取5mg顺铂置于10.00mL的容量瓶中，加入pH＝6.0的PBS缓冲溶液稀释至刻度，摇匀得浓度为0.5mg/mL储备液，配制浓度为240、160、80、 64、48、32、16、8、0μg/mL的顺铂标准溶液，按体积比1:1加入邻苯二胺的 DMF溶液，然后加热显色703nm波长下测吸光值。绘制标准曲线备用。
结果：
顺铂的标准曲线如图19所示：标准曲线方程为：y＝0.0351x-0.032，R2＝0.9963。
(2)磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI负载顺铂(CDDP)
实验
将GO-Fe3O4-PANI用pH＝6.0的PBS缓冲溶液配制成1mg/mL溶液共10.00 mL，然后加入5mgCDDP避光搅拌24h，反应完全后将反应液转移至分子截留量为8000～14000的透析袋避光透析3d(每12h更换一次透析介质)以除去游离的CDDP，冷冻干燥得到GO-Fe3O4-PANI-CDDP，在十万分之一天平称重计算载药率。载药率计算公式如下：
载药率＝(微球中药物的质量/微球的总质量)×100％
结果：计算得出载药率为82.57％。
(3)GO-Fe3O4-PANI-CDDP释药实验
将GO-Fe3O4-PANI用pH＝6.0的PBS缓冲溶液配制成1mg/mL溶液共10.00 mL，然后加入5mg CDDP避光搅拌24h，反应完全后将反应液转移至分子截留量为8000～14000的透析袋避光透析3d(每12h更换一次透析介质)以除去游离的CDDP，将透析袋连同里面的反应液一起转移至一个干净的100mL烧杯中，透析袋外介质补充40mLpH＝6.0的PBS缓冲溶液使总体积为50mL，然后37℃水浴磁力搅拌，每隔1h用移液枪精密吸取3.00mL透析外液于15mL离心管中并做好标记，再补充相同体积pH＝6.0的缓冲溶液，12h之后搅拌过夜(12h),第二天也是每隔1h取一次出来，连续取12h。取出来的液体按体积比1:1加入邻苯二胺的DMF溶液，然后加热显色703nm波长下测吸光值。
结果:
GO-Fe3O4-PANI负载CDDP的释药实验结果如图20所示，从图中我们可以明显看出，随着释药时间的增加，释药量也在逐渐增加，当释药时间达到10h 左右时，药物的释放量基本趋于稳定，因此可以证明该载体对药物的释放具有一定缓释的作用。
上述实验表明，磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI在医药学上的应用包括以下5个方面的优点：
(1)磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI具有良好的水溶性，便于人体注射或者口服以及吸收利用；
(2)磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI用于人肝癌 HepG-2、SMMC-7721细胞株、人正常肝细胞株7702及小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW 264.7的体外细胞毒性实验表明该载体在0～125μg/mL之间对人体是无毒的，表明载体在0～125μg/mL的浓度范围内应用于人体是安全的；
(3)磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI用于胎牛血清白蛋白BSA吸附实验结果表明该载体具有良好的生物相容性；
(4)磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI用于人肝癌HepG-2 细胞株及人正常肝细胞株7702的体外细胞摄取实验表明该载体是破膜或穿膜通过进入靶细胞的；
(5)磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI通过负载抗癌药物 CDDP及其释放实验表明该载体具有较高的载药率，可达82.57％，载药量及释放量满足杀死肝癌细胞的常规剂量(文献报道顺铂杀死肝癌细胞浓度在20μ g/mL以内，而本发明的释药量稳定时可达40μg/mL)并具有缓释的效果。

Claims (8)

1.磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI的制备方法，其特征在于：以氧化石墨烯、FeCl3·6H2O、醋酸钠和苯胺单体为原料，利用化学共沉淀法以及原位合成法制得；所述氧化石墨烯、FeCl3·6H2O、醋酸钠和苯胺单体的质量比为7～8：23～25：47～49：0.5～1.5。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将氧化石墨烯在乙二醇中超声分散形成均匀的分散液，然后分别称取FeCl3·6H2O、醋酸钠和聚乙烯吡咯烷酮溶解于乙二醇中，搅拌使之形成澄清溶液；
(2)将上述溶液移入高压反应釜中于180～200℃反应，待反应10～12h后使之冷却至室温，将所得溶液用透析袋透析，得到产物A；
(3)将产物A和苯胺单体加入到预分散有十二烷基苯磺酸钠的蒸馏水中，超声分散形成均一体系B；
(4)将浓度为0.024～0.032g/ml的过硫酸铵缓慢滴加到体系B中，搅拌反应18～24h，然后用透析袋透析后制得磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)和步骤(4)中用透析袋透析的方法具体为用分子截留量为8000～14000的透析袋透析3～4天，且每12～18h更新一次透析介质。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述氧化石墨烯的制备方法包括以下步骤：在烧瓶中加入98％H2SO4，并移入冰水浴中搅拌，稳定温度在10℃以下；随即加入鳞片石墨与硝酸钠的混合物，搅拌使其充分混合；接着加入高锰酸钾，在10℃以下反应2～2.5h，然后移入35℃的水浴锅中反应12～13h；反应结束后向其缓慢注入去离子水并搅拌使其溶解，再在98℃中反应15～20min后，将反应液趁热加入30％的H2O2并搅拌，待无气泡产生后加入8％～12％的HCl溶液，搅拌均匀后进行离心洗涤，取下层胶体冷冻干燥后得到氧化石墨烯。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述鳞片石墨、硝酸钠、高锰酸钾的质量比为1～2：0.5～1.5：5～7；每1g鳞片石墨加入23～25mL的98％H2SO4。
6.利用权利要求1至3任意一项所述的制备方法制得磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI。
7.利用权利要求1至3任意一项所述的制备方法制得的磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI在医药学方面的应用。
8.根据权利要求7所述的磁性纳米靶向氧化石墨烯药物载体GO-Fe3O4-PANI在医药学方面的应用具体为联合磁疗、光热疗、化疗法在制备抗癌药物方面的应用。
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