CN107037014B - 一种锌离子的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于氟硼二吡咯(BODIPY)染料小分子自组装纳米粒子的锌离子检测方法，氟硼二吡咯(BODIPY)染料小分子在水溶液介质中发生聚集，自组装为纳米粒子而导致荧光淬灭，通过加入锌离子，荧光恢复，在一定时间内混合后得到的产物在600nm波长处的荧光强度变化与加入的锌离子浓度成正比关系，从而实现锌离子的定量测定。该方法灵敏度高、选择性好、操作简单，可用于人头发样品中锌离子的测定。

Description

一种锌离子的检测方法
技术领域
本发明涉及一种纳米荧光探针，具体是一种利用BODIPY染料小分子自组装的纳米粒子对锌离子进行检测的方法。
背景技术
锌是人体含量最丰富的微量元素之一，大部分与蛋白质结合，作为辅因子或者结构单元，在细胞分裂、免疫调节、信号传输、基因转录等方面发挥着至关重要的作用。人体严重的锌缺乏很少见，但少量或者中等程度的锌缺乏在世界范围内普遍存在。流行病学研究表明，锌缺乏与特异性皮肤紊乱、乳腺癌和卵巢癌、阿尔茨海默病等疾病的发生密切相关。因此，实现对人体中锌离子的高灵敏检测，具有重要意义。
传统的锌离子检测方法有原子吸收光谱法、原子发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法、离子色谱法等，这些方法虽早已成熟并准确可靠，但实际应用中存在着仪器昂贵、操作复杂、维护困难、不方便携带等缺点，难以满足大规模应用以及实时原位检测的需要。荧光检测法因为操作简单、灵敏度高、选择性好等优点而成为研究的热点，并且被广泛应用。
大量有机小分子荧光探针已被报导用于锌离子的检测，他们大都是通过改变荧光团或者锌离子识别单元而被巧妙地设计而成，主要根据光致电子转移、分子内电荷转移、共振能量转移等机理进行锌离子的识别。但是，这些探针普遍存在合成步骤繁琐，机理复杂等问题。与反复利用这些成熟的机理来设计新的探针相比，对新的识别机理的探索和研究相对少很多，也显得非常重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种锌离子的检测方法，另一个目的是提供一种锌离子的定量检测方法，本发明还提供了一种人类头发样品中锌离子的定量检测方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
BODIPY染料小分子在水溶液介质中发生聚集，自组装为纳米粒子而导致荧光淬灭，通过加入锌离子，荧光恢复，在一定时间内混合后得到的产物在600nm波长处的荧光强度变化与加入的锌离子浓度成正比关系，从而实现锌离子的定量测定。
所述BODIPY染料小分子，其结构式为：
所述方法具体包括以下步骤：
步骤1.制备自组装纳米粒子：BODIPY染料小分子溶于有机溶剂中得到染料溶液A，BODIPY染料小分子在有机溶剂中的物质的量浓度为0.01-1mM，往浓度为1-50mM、pH＝7.4的HEPES缓冲溶液中注入染料溶液A，HEPES缓冲溶液与染料溶液A中的有机溶剂的体积比为9∶1-99∶1，优选体积比范围为25∶2-50∶1，充分混匀得到溶液B，备用；
步骤2.标准曲线的绘制：取不少于5个不同浓度的已知锌离子标准溶液，与步骤1中制备的溶液B混合，使得混合后的溶液C中锌离子浓度为0.1-300μM，室温下孵育0.5-50分钟后，用荧光分光光度计进行发射光谱扫描并记录荧光强度，以590-620nm任意一处波长的荧光强度为纵坐标，锌离子浓度为横坐标作图绘制标准曲线；
步骤3.得到锌离子线性方程：锌离子浓度范围在0-10μM时，600nm波长处的线性方程为I＝153.11C+288.06，所述I表示600nm处的荧光强度，C表示锌离子浓度。
步骤4.利用该方法对人类头发样品中锌离子的检测：对人类头发样品进行清洗、烘干处理，取样品于微波消解罐中，加入消解液，按固定消解过程进行消解，消解后得到的液体转移至烧杯中，于电炉上加热至液体刚好蒸干，往烧杯中加入0.5-5mL去离子水，在超声清洗器振荡后，加入1-50mL浓度为1-50mM、pH＝7.4的HEPES缓冲溶液，加入PbS粉末振荡，进行离心后取上清液，加入溶于有机溶剂中浓度为0.01-1mM的BODIPY溶液，充分混匀后，室温下孵育0.5-50min后，用荧光分光光度计进行发射光谱扫描，得到荧光强度，将荧光强度作为纵坐标，代入步骤3所述的锌离子线性方程式中，得到锌离子的浓度。
所述有机溶剂包括乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、甲苯、环己烷、乙腈、三氯甲烷、四氢呋喃、四氯化碳、乙醚、乙酸乙酯、异丙醇、吡啶、二甲亚砜中的一种或几种。
所述光谱扫描所采用的激发光和发射光狭缝均为5nm，激发波长为573nm，测定的波长范围为580-630nm，获得其荧光光谱。
所述消解液的组成为65％的硝酸和30％的双氧水体积比范围为5∶1-10∶1，人类头发样品与消解液的质量比范围为1∶2000-1∶500，HEPES缓冲溶液和有机溶剂的体积比范围为9∶1-99∶1，PbS的加入量与待测溶液的质量比范围为1∶1000-1∶40。
所述人类头发样品进行清洗、烘干处理步骤为将人类头发样品用洗发水、丙酮、去离子水洗涤之后，烘至恒重，剪成小于1cm的发段于干燥器中保存。
所述固定消解过程包括：预消解8-20h后，将消解罐安装到微波消解仪上，按照130℃，10-50min；150℃，5-30min；180℃，10-80min的程序进行消解。
本发明具有如下优点：
1.本发明方法简单、选择性好，适用于复杂样品人头发中锌离子的测定，具有良好的应用前景。
2.本发明利用的是染料小分子自组装的纳米粒子实现对锌离子的定量测定，属于“off-on”类型的荧光探针。当检测对象中不存在锌离子时，染料小分子处于聚集自组装为纳米粒子的状态，荧光被淬灭；而当检测对象中有锌离子存在时，染料小分子聚集的纳米粒子与锌离子作用，使得荧光恢复，并且荧光强度随着锌离子含量的增加而增强，通过比较荧光强度，即可实现锌离子的检测。
附图说明
图1为不同浓度的锌离子加入到自组装纳米粒子溶液之后荧光光谱变化图。
图2a为600nm处的荧光强度与不同的锌离子浓度的关系示意图，图2b为600nm处荧光强度与锌离子浓度的线性关系。
图3为向自组装纳米粒子溶液中加入锌离子和干扰离子后600nm处荧光强度的变化。
具体实施方式
以下对本发明的实施例做详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
本实施例包括以下步骤：
1.自组装纳米粒子的制备：往0.95mL浓度为5mM、pH＝7.4的HEPES缓冲溶液中注入50μL溶于DMF中的浓度为0.1mM的BODIPY小分子溶液，充分混匀后得到自组装的纳米粒子，备用。
2.绘制标准曲线：取150μL步骤1中得到的溶液，分别加入1.5μL的不同浓度的锌离子标准液，使混合溶液中锌离子的浓度分别为2、5、8、10、20、30、40、50μM，孵育10min后，留作测定用。另取150μL步骤1中得到的溶液，加入1.5μL去离子水作为空白对照体系溶液。将标准溶液和空白对照溶液置于光程为1cm的荧光比色皿中，进行发射光谱扫描，获得荧光光谱，如图1所示，随着加入锌离子浓度的增加，荧光强度逐渐增强。
如图2a、图2b所示，取其中600nm处的荧光强度作为纵坐标，溶液中锌离子浓度作为横坐标作图，绘制标准曲线，用于对未知浓度锌离子溶液的分析，其中，锌离子浓度在0-10μM范围内时，荧光强度与锌离子浓度呈线性关系，线性关系方程式为I＝153.11C+288.06，所述I表示600nm处的荧光强度，C表示锌离子浓度，检测限为61.3nM。当锌离子浓度大于10μM，600nm处荧光强度与锌离子浓度不再具有线性关系。
3.选择性试验：取150μL步骤1中得到的溶液，分别加入1.5μL Zn2+和干扰离子Ca2 +，Mg2+，Na+，K+，Fe3+，Cu2+，Mn2+，Pb2+，Al3+的标准液，使溶液中离子的浓度均为10μM，孵育10min后，进行发射光谱扫描。计算600nm处各离子存在时荧光强度与空白溶液荧光强度的差值，如图3所示。只有当锌离子存在时，纳米粒子的荧光才会明显增强，同时，铜离子存在时，荧光信号会减弱，表明此检测体系对锌离子具有很好的选择性。
4.浓度测定：取142.5μL溶于HEPES缓冲溶液(5mM、pH＝7.4)中的浓度为5μM的锌离子标准溶液，加入7.5μL溶于DMF中的浓度为0.1mM的BODIPY小分子溶液，充分混匀后，至于室温下10min后，用荧光分光光度计进行发射光谱扫描，得到荧光强度，将600nm处的荧光强度作为纵坐标，代入标准曲线中，得到锌离子的浓度为5.2μM，与实际浓度非常接近。
步骤2，3，4中发射光谱具体的扫描条件为：激发光狭缝5cm，发射光狭缝：5cm，激发光波长573nm，扫描波长范围：580-630nm。
实施例2：
1.人头发样品中锌离子的测定：收集人头发样品，用洗发水清洗一遍之后，用去离子水洗涤10次，然后浸入在丙酮溶液中2小时，再用去离子水洗涤10次，于烘箱下80℃烘至恒重，用不锈钢剪刀剪成小于1cm的发段，放置干燥器中保存。称取9.84g发段至微波消解罐中，加入8mL 65％的硝酸以及1mL 30％的双氧水，室温下放置10h，将消解罐安装到微波消解仪上，按程序“130℃，10min；150℃，5min；180℃，40min”在480W的功率下进行消解，消解后得到的液体转移至50mL的烧杯中，于电炉上加热至液体刚好蒸干，往烧杯中加入1mL去离子水，在超声清洗器中振荡2min，加入9mL浓度为5mM、pH＝7.4的HEPES缓冲溶液，取1.8mL溶液至2mL的塑料离心管中，加入10mg PbS粉末振荡2min后，于4,000g，20℃下离心5min，取142.5μL上清液，加入7.5μL溶于DMF中的浓度为0.1mM的BODIPY小分子溶液，充分混匀后，至于室温下10min后，用荧光分光光度计进行光谱扫描，得到荧光强度，将600nm处的荧光强度作为纵坐标，代入标准曲线中，I＝153.11C+288.06中，所述I表示600nm处的荧光强度，C表示锌离子浓度，得到锌离子的浓度为3.64μM。发射光谱具体的扫描条件为：激发光狭缝5cm，发射光狭缝：5cm，激发光波长573nm，扫描波长范围：580-630nm。
2.准确性验证：本实验测定了5份人头发样品，均进行了加标回收试验，加标回收率在83.8％-112.6％之间。并且，用该方法检测出的锌离子浓度与电感耦合等离子体发射光谱仪检测出的浓度一致，说明该方法准确可靠。

Claims (9)

1.一种锌离子的检测方法，其特征在于：基于氟硼二吡咯（BODIPY）染料小分子的自组装纳米粒子，具体方法为：溶于有机溶剂的BODIPY染料小分子在水溶液介质中发生聚集自组装为纳米粒子而导致荧光淬灭，向水溶液介质中加入锌离子，则荧光恢复，通过荧光分光光度计进行检测实现锌离子的测定；
所述BODIPY染料小分子，其结构式为：
。
2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：使用该方法进行锌离子的定量检测，具体方法为：溶于有机溶剂的BODIPY染料小分子在水溶液介质中发生聚集自组装为纳米粒子而导致荧光淬灭，向水溶液介质中加入锌离子进行混合，则荧光恢复，通过荧光分光光度计确定在590-620 nm波长任意一处波长的荧光强度变化与加入的锌离子浓度成正比关系，实现锌离子的定量测定，其中，成正比的线性关系的浓度范围和方程式为：锌离子浓度范围在0-10 µM时,600 nm波长处的线性方程为I=153.11C+288.06,所述I表示600nm处的荧光强度，C表示锌离子浓度。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述有机溶剂包括乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺（DMF）、甲苯、环己烷、乙腈、三氯甲烷、四氢呋喃、四氯化碳、乙醚、乙酸乙酯、异丙醇、吡啶、二甲亚砜中的一种或几种；水溶液介质为HEPES缓冲溶液。
4. 根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述光谱扫描所采用的激发光和发射光狭缝均为5 nm，激发波长为573 nm，测定的波长范围为580-630 nm，获得其荧光光谱，得到荧光强度。
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述方法具体包括以下步骤：
步骤1. 制备自组装纳米粒子: BODIPY染料小分子溶于有机溶剂中得到染料溶液A，BODIPY染料小分子在有机溶剂中的物质的量浓度为0.01-1 mM，往浓度为1‒50 mM、pH=7.4的HEPES缓冲溶液中注入染料溶液A，HEPES缓冲溶液与染料溶液A中的有机溶剂的体积比为9:1‒99:1，充分混匀得到溶液B，备用；
步骤2. 标准曲线的绘制：取不少于5个不同浓度的已知锌离子标准溶液，与步骤1中制备的溶液B混合，使得混合后的溶液C中锌离子浓度为0.1‒300 µM，室温下孵育0.5‒50分钟后，用荧光分光光度计进行发射光谱扫描并记录荧光强度，以590-620 nm任意一处波长的荧光强度为纵坐标，锌离子浓度为横坐标作图绘制标准曲线；
步骤3.得到锌离子线性方程：锌离子浓度范围在0-10 µM时,600 nm波长处的线性方程为I=153.11C+288.06,所述I表示600nm处的荧光强度，C表示锌离子浓度。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤1.中，HEPES缓冲溶液与染料溶液A中的有机溶剂的体积比为25:2-50:1。
7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：利用该方法对人类头发样品中锌离子的检测：
1）按照权利要求2或5的方法得到锌离子线性方程式；
2）对人类头发样品进行清洗、烘干处理，取样品于微波消解罐中，加入消解液，按固定消解过程进行消解，消解后得到的液体转移至烧杯中，于电炉上加热至液体刚好蒸干，往烧杯中加入0.5-5 mL去离子水，在超声清洗器振荡后，加入1‒50 mL 浓度为1‒50 mM、pH=7.4的HEPES缓冲溶液，加入PbS 粉末振荡，进行离心后取上清液，加入溶于有机溶剂中浓度为0.01-1 mM的BODIPY溶液，充分混匀后，室温下孵育0.5-50 min后，用荧光分光光度计进行发射光谱扫描，得到荧光强度，代入锌离子线性方程式中，得到锌离子的浓度。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特性在于：所述消解液的组成为65%的硝酸和30%的双氧水体积比范围为5:1-10:1，人类头发样品与消解液的质量比范围为1:2000-1:500，HEPES缓冲溶液和有机溶剂的体积比范围为9:1‒99:1，PbS的加入量与待测溶液的质量比范围为1:1000-1:40。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特性在于：所述人类头发样品进行清洗、烘干处理步骤为将人类头发样品用洗发水、丙酮、去离子水洗涤之后，烘至恒重，剪成小于1 cm的发段于干燥器中保存；所述固定消解过程包括：预消解8-20 h后，将消解罐安装到微波消解仪上，按照130℃，10-50 min；150℃，5-30 min；180℃，10-80 min的程序进行消解。
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