CN107006525B - 一种防治白菜菌核病的生物药剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及杀菌剂技术领域，特别涉及一种防治白菜菌核病的生物药剂，包括以下体积份的组分：33.3～66.7份秸秆热解液和66.7～33.3份壳聚糖。或者包括33.3～75体积份秸秆热解液和66.7～25体积份芽孢杆菌发酵液。该生物药剂对白菜菌核病菌具有显著抑菌作用，可有效防治白菜菌核菌以及其引起的病害，是一种无毒无残留的生物药剂。

Description

一种防治白菜菌核病的生物药剂
技术领域
本发明涉及杀菌剂技术领域，特别涉及一种防治白菜菌核病的生物药剂。
背景技术
随着气候的温暖化，北方白菜栽培区遇到高温多湿气候时严重发生病害，白菜菌核病是其中之一。菌核菌感染白菜成株，多在地表的茎、叶柄上出现水浸状淡褐色凹陷病斑，叶片病斑不凹陷，引起叶球或茎基部腐烂，病部密生白色棉毛状菌丝和散生黑色鼠粪状菌核，腐烂处无臭味。幼苗发病，在近地面的茎基部产生水浸状病斑，很快腐烂或猝倒，并不产生明显的白霉。种株发病，种荚表面产生一层白色棉絮状菌丝体，荚内生出白色菌丝和黑色菌核，是种株结荚降低，籽粒不饱满，从而影响种子的产量和品质。茎腐烂后，破裂成乱麻状，中空，有白色丝状物后期生有黑色菌核，菌核鼠粪状，圆形或不规则形，早期白色，以后外部变为黑色，内部白色。如果，商品白菜地受菌核菌侵染，幼苗茎基部腐烂造成缺苗，白菜结球期受害，茎基部腐烂或叶片、叶柄受害，商品性下降，一般减产5～15％。种苗地受菌核菌病害，直接导致菜种株枯死或阻断养分和水的输送，造成籽粒干瘪或无籽，一般减产5～20％，严重地块达50％以上。
目前，为了防治白菜菌核病一般采用农业防治和化学防治。其中，化学防治包括种子处理、土壤处理和药剂防治。药剂防治在发病初期喷洒50％速克灵可湿性粉剂2000倍液，或50％扑海因可湿性粉剂1500倍液，或50％农利灵可湿性粉剂1000倍液，或40％多·硫悬浮剂500-600倍液，或50％甲基硫菌灵500倍液或20％甲基立枯磷乳剂1000倍液。
但是，上述对白菜菌核病的化学防治制剂，虽然低毒，但会在结球白菜中残留，危害人体安全，有待开发无毒、无残留的抗白菜菌核菌制剂。
发明内容
为了解决白菜菌核病防治过程中化学防治带来的农药残留及危害人体健康的问题，本发明选用食品级的原料制备一种无毒无残留的生物药剂，该生物药剂对白菜菌核病菌具有显著抑菌作用，可有效防治白菜菌核菌以及其引起的病害。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种防治白菜菌核病的生物药剂，包括以下体积份的组分：33.3～66.7份秸秆热解液和66.7～33.3份壳聚糖水溶液，所述壳聚糖水溶液的浓度为0.1～20g/L。
优选的，所述秸秆热解液包括以下制备步骤：将秸秆粉碎后在450～550℃进行热解获得生物油；将所述生物油与水搅拌混合静置后，将得到的水相部分进行常压蒸馏，收集95～120℃的蒸馏液，即为秸秆热解液。
更优选的，所述秸秆热解液还包括稀释倍数为10～400倍的秸秆热解液稀释液。
本发明还提供了另外一种防治白菜菌核病的生物药剂，包括以下体积份的组分：33.3～75份秸秆热解液和66.7～25份芽孢杆菌发酵液，所述芽孢杆菌发酵液为芽孢杆菌培养液经离心过滤后得到的无菌滤液。
其中，所述芽孢杆菌为甲基型芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、类芽孢杆菌和地衣形芽孢杆菌中的一种或几种。
其中，所述秸秆热解液包括以下步骤制备而成：将秸秆粉碎后在450～550℃进行热解获得生物油；将所述生物油与水搅拌混合静置后，将得到的水相部分进行常压蒸馏，收集95～120℃的蒸馏液，即为秸秆热解液。
优选的，所述秸秆热解液还包括稀释倍数为10～400倍的秸秆热解液稀释液。
优选的，每升生物药剂中还包括10～500g微量元素。
更优选的，所述微量元素为Zn2+、Mg2+、Cu2+、B3+、Fe2+和Mn2+中的一种或几种。
本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明选用秸秆快速热解液和壳聚糖、芽孢杆菌发酵液，分别以秸秆热解液和壳聚糖、秸秆热解液和芽孢杆菌发酵液按科学配方复配，开发出专治白菜菌核病的生物药剂。经过研究发现，这种生物药剂对菌核菌引起的白菜腐烂病具有显著抑菌、杀菌作用。本发明的生物药剂所采用的原料为食品级，除了对白菜菌核病有较好防治效果外，还能克服白菜菌核病防治过程中化学防治带来的农药残留及危害人体健康的问题，为一种安全有效的生物型药剂。
具体实施方式
本发明提供的防治白菜菌核病的生物药剂，选用秸秆快速热解液和壳聚糖、芽孢杆菌发酵液等食品级的原料，经科学配方复配而成，对白菜菌核病有较好的防治效果，且无农药残留，对人体健康无危害。
本发明中所用的秸秆热解液为秸秆经中温快速热解后，经过精制而成的热解液。具体地，本发明的秸秆热解液包括以下制备步骤：将秸秆粉碎后进行热解获得生物油；本发明对秸秆的种类没有特殊限制，可以采用玉米秸秆、玉米芯、稻草、稻壳、大豆秸秆等农作物秸秆中的一种或几种。本发明对秸秆粉碎的粒度范围是50～120目，优选为60～100目，更优选为70～80目。本发明热解所选用的热解温度为450℃～550℃，优选为495℃～505℃；热解时间优选为1～10s，更优选为3～5s。将秸秆热解后得到的所述生物油进行分离精制后得到秸秆热解液。具体地，将所述生物油与水搅拌混合，优选生物油与水混合的体积比为1～3:1～3，进一步优选为1:1～2。得到的混合物经静置后，将得到的上层水相部分进行常压蒸馏，收集95℃～120℃，优选为100℃～105℃的蒸馏液，即为秸秆热解液。经分析得知，制备得到的秸秆热解液含有有机酸类、酚类、醛类、醇类等物质，对白菜菌核菌有显著的抑制和杀菌效果。
本发明的秸秆热解液还包括将秸秆热解液以一定倍数稀释的稀释液。随热解液稀释倍数的增加，其对白菜菌核菌的抑菌作用逐渐减弱，且各稀释倍数热解液之间抑菌率差异显著(p＜0.05)，稀释倍数为30时，秸秆热解液对白菜菌核病菌抑菌率达100％，病菌不生长；稀释倍数小于70时，秸秆热解液对白菜菌核病菌抑菌率高于0.1％醋酸，且差异显著(p＜0.05)。通过秸秆热解液稀释倍数对数值和对应的抑菌几率值得出秸秆热解液对菌核菌的毒力回归方程为y＝-13.875x2+44.717x-30.119，相关系数R2＝0.9995。通过回归方程计算出秸秆热解液对菌核菌EC50值为稀释70倍。
表1秸秆热解液对白菜菌核菌的抑菌作用
秸秆热解液对白菜菌核病菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度见表2。秸秆热解液稀释33倍以上时，试管内均有菌丝生长，在稀释33倍及以下的试管中，无菌丝生长，以试管内无菌丝生长的最小浓度为MIC，由此确定稀释33倍为秸秆热解液对白菜菌核病菌的最小抑菌浓度。最小抑菌浓度实验后从无菌丝生长的试管(30倍、33倍)中将菌饼取出接种在PDA培养基中培养，进一步确定秸秆热解液对白菜菌核病菌的MFC为稀释30倍。
表2秸秆热解液对白菜菌核病菌MIC及MFC
注：试管内有菌丝生长用“+”表示，无菌丝生长用“-”表示，下同。
本发明的壳聚糖溶液对白菜菌核菌的抑菌作用见表3，壳聚糖溶液浓度由0.1g/L成倍增加到5.0g/L时，其对白菜菌核病菌抑菌率由27.97％增加到86.86％，除5.0g/L和4.0g/L壳聚糖溶液处理组抑菌率无显著差异外，其他各组抑菌率均差异显著(p＜0.05)。根据壳聚糖溶液浓度和对应的抑菌率求得壳聚糖溶液对白菜菌核病菌的毒力回归方程为y＝0.6859x2-10.826x+22.195，R2＝0.9423。通过毒力回归方程求得壳聚糖溶液对白菜菌核病菌的EC50值为1.4g/L。
表3壳聚糖溶液对白菜菌核病菌抑菌作用
从表4可以看出，壳聚糖溶液浓度为5g/L以下时，试管中有菌丝生长，壳聚糖溶液浓度5g/L开始，试管中无菌丝生长，以无菌丝生长的最低浓度作为壳聚糖溶液对白菜菌核病菌的最小抑菌浓度，即壳聚糖溶液对白菜菌核病菌的MIC为5g/L。不同浓度的壳聚糖溶液所对应的平板中均有菌丝生长，说明壳聚糖溶液对白菜菌核病菌仅有抑制作用，无杀菌作用。
表4壳聚糖溶液对白菜菌核病菌的MIC及MFC
本发明将秸秆热解液与壳聚糖溶液进行复配，制备成一种防治白菜菌核病的生物药剂，包括以下体积份的组分：33.3～66.7份秸秆热解液和66.7～33.3份壳聚糖溶液。优选的，所述秸秆热解液为40～60体积份，更优选为45～54体积份。本发明中，壳聚糖溶液的体积份优选为61～38体积份，更优选为52～43体积份。所述壳聚糖溶液的浓度为0.1～20g/L，优选为1～15g/L，更优选为5～10g/L。
壳聚糖的抗菌效果在pH6.5的时候最强，pH在4.5～6.5时，虽然抗菌性较强，但是溶液中存在大量的H+和-NH3+在细菌表面产生竞争性吸附，而pH值在6.5～8.0时，壳聚糖的溶解度差，并且-NH3+上的质子被中和，抗菌效果减弱。秸秆热解液pH值为2.0～3.0，上述复配比例正好适合壳聚糖抗菌较强时pH值范围。而且，本发明的秸秆热解液还富含有烷基、羧基、羧甲基、醛基、羟基、酮基、酰基等有利于壳聚糖的烷基化、羧甲基化、酯化，产生壳聚糖衍生物如烷基壳聚糖衍生物、羧甲基壳聚糖衍生物、壳聚糖的酯衍生物的生成。这些壳聚糖衍生物都具有较强的抗菌、抑菌作用和效果。因此，本发明的秸秆热解液和壳聚糖复配其抑菌效果比两种单独使用的抑菌效果更好，作用更强。
本发明中，秸秆热解液还包括以一定倍数稀释的秸秆热解液稀释液。优选秸秆热解液的稀释倍数为10～400倍，更优选为20～200倍，进一步优选为30～150倍。本发明对壳聚糖的来源没有特殊限定，采用市售产品即可。
本发明还提供了另外一种防治白菜菌核病的生物药剂，将秸秆热解液与芽孢杆菌发酵液进行一定比例的复配，对白菜菌核菌有良好的抑制作用。其中，秸秆热解液为上述制备方法制备得到，在此不再赘述。所述芽孢杆菌发酵液为芽孢杆菌培养液经离心过滤后得到的无菌滤液。其中，芽孢杆菌培养液为含有芽孢杆菌和芽孢杆菌生长发酵所需培养液的混合液。所述培养液为本领域中芽孢杆菌的常规培养液，具体的，所述培养液为LB液体培养基。
本发明的芽孢杆菌发酵液是将芽孢杆菌菌悬液进行发酵培养经离心过滤后得到的无菌滤液。所述芽孢杆菌菌悬液可以采用本领域的常规方法进行培养。具体的，芽孢杆菌菌悬液是用无菌接种环刮取少量已活化的芽孢杆菌菌种于100mL LB液体培养基中，32℃恒温摇床培养24h，制成浓度不少于3.75×107个/mL的菌悬液。取2mL芽孢杆菌菌悬液接种到200mL LB液体培养基中，于32℃、160r/min条件下振荡培养5d，菌液经10000r/min离心15min，取上清液用0.2μm微孔滤膜过滤而得到的无菌滤液。本发明的芽孢杆菌菌悬液中含有芽孢杆菌的浓度为4.0×106～3.0×108，优选为1.0×107～4.0×107个/mL，更优选为3.5×107～4.0×107个/mL。
本发明中所述的芽孢杆菌为从大豆蒸煮、捣碎、造型之后自然发酵而得到的大酱中分离出的对白菜菌核菌具有拮抗作用的菌株。大酱中分离得到的拮抗芽孢杆菌对白菜菌核菌具有抑菌作用，其作用于白菜菌核菌会使白菜菌核菌菌丝的原生质浓缩，部分细胞颜色加深，芽管变短变粗，不易分枝节出现畸形，菌丝体边缘扭曲，部分出现消解的现象，最终死亡。本发明从大酱中分离得到的芽孢杆菌菌株为甲基型芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、类芽孢杆菌和地衣形芽孢杆菌中的一种或几种。
表5 4株芽孢杆菌发酵液对白菜菌核病菌抑菌率的测定
注：CK为对照，即加等量无菌水而不加菌株发酵液的培养基。
本发明芽孢杆菌的抑菌活性受到pH的影响，当pH值在6.0的时候大酱中分离得到的芽孢杆菌菌丝生长最旺盛，且抑菌作用也最强。本发明秸秆热解液的原液pH值在2.0～3.0，将33.3～75体积份秸秆热解液和66.7～25体积份芽孢杆菌发酵液进行复配后，其pH值范围在5.5～6.5，适合于拮抗芽孢杆菌抑菌效果最强时候的pH值范围。因此，本发明防治白菜菌核病的生物药剂，为包括33.3～75体积份秸秆热解液和66.7～25体积份芽孢杆菌发酵液。本发明中，秸秆热解液优选添加25～75体积份，进一步优选为33.3～75体积份。本发明中芽孢杆菌发酵液优选添加75～25体积份，进一步优选为75～33.3体积份。本发明将秸秆热解液和大酱中分离得到的拮抗芽孢杆菌进行复配，其抑菌效果比两种单独使用的抑菌效果更好。
本发明中，秸秆热解液还包括以一定倍数稀释的秸秆热解液稀释液。优选秸秆热解液的稀释倍数为10～400倍，更优选为20～200倍，进一步优选为30～150倍。
本发明含有芽孢杆菌发酵液的生物药剂中，每升优选还含有10～500g的微量元素，所述微量元素为Zn2+、Mg2+、Cu2+、B3+、Fe2+和Mn2+中的一种或几种。
所述微量元素-秸秆热解液混合液制备工艺，包括以下步骤：
(1)将秸秆热解液加热至70～80℃。
(2)将微量元素Zn2+、Mg2+、Cu2+、B3+、Fe2+和Mn2+中的一种或几种化合物按照重量比分别称取10～500g，溶解于1L的秸秆热解液当中，边搅拌制成微量元素-秸秆热解液混合溶液。
(3)将微量元素-秸秆热解液混合溶液冷却至5～25℃，低温偶合处理15～30天。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将稻草粉碎至70目后在500℃进行热解3s获得生物油；将得到的生物油与水按体积比为1:2搅拌混合，静置后，将上层水相部分进行常压蒸馏，收集100℃的蒸馏液，即为秸秆热解液。
将得到的秸秆热解液稀释70倍，与1.4g/L的壳聚糖水溶液按照33.3:66.6(V/V)混合得到防治白菜菌核病的生物药剂。
实施例2
将玉米秸秆粉碎至75目后在550℃进行热解5s获得生物油；将得到的生物油与水按体积比为1:1搅拌混合，静置后，将上层水相部分进行常压蒸馏，收集105℃的蒸馏液，即为秸秆热解液。
将得到的秸秆热解液稀释70倍，与10g/L的壳聚糖水溶液按照50:50(V/V)混合得到防治白菜菌核病的生物药剂。
实施例3
将大豆秸秆粉碎至80目后在450℃进行热解4s获得生物油；将得到的生物油与水按体积比为1:2搅拌混合，静置后，将上层水相部分进行常压蒸馏，收集120℃的蒸馏液，即为秸秆热解液。
将得到的秸秆热解液稀释70倍，与20g/L的壳聚糖水溶液按照66.6:33.3(V/V)混合得到防治白菜菌核病的生物药剂。
表6秸秆热解液和壳聚糖复配剂对白菜菌核病菌的抑菌作用
实施例4
将稻草粉碎至70目后在500℃进行热解3s获得生物油；将得到的生物油与水按体积比为1:2搅拌混合，静置后，将上层水相部分进行常压蒸馏，收集100℃的蒸馏液，即为秸秆热解液。
将从大酱中分离得到的甲基型芽孢杆菌拮抗菌株接种于LB培养液中，在32℃恒温摇床培养箱内培养24h，含有甲基型芽孢杆菌菌落总数为3.75×107个/mL的芽孢杆菌菌悬液。然后取2mL甲基型芽孢杆菌菌悬液接种到200mL LB液体培养基中于32℃、160r/min条件下振荡培养5d，菌液经10000r/min离心15min，取上清液用0.2μm微孔滤膜过滤，得到无菌的甲基型芽孢杆菌发酵液。
将秸秆热解液稀释70倍，与上述芽孢杆菌发酵液以分别以50:50(V/V)混合得到防治白菜菌核病的生物药剂。
表7秸秆热解液和甲基型芽孢杆菌发酵液复配剂对白菜菌核病菌的抑菌作用
实施例5
将玉米秸秆粉碎至85目后在500℃进行热解3s获得生物油；将得到的生物油与水按体积比为1:1搅拌混合，静置后，将上层水相部分进行常压蒸馏，收集100℃的蒸馏液，即为秸秆热解液。
将从大酱中分离得到的类芽孢杆菌拮抗菌株接种于LB培养液中，在32℃恒温摇床培养箱内培养24h，含有类芽孢杆菌菌落总数为3.75×107个/mL的芽孢杆菌菌悬液。然后取2mL类芽孢杆菌菌悬液接种到200mL LB液体培养基中于32℃、160r/min条件下振荡培养5d，菌液经10000r/min离心15min，取上清液用0.2μm微孔滤膜过滤，得到无菌的类芽孢杆菌发酵液。
将秸秆热解液稀释70倍，与上述芽孢杆菌发酵液以30:60(V/V)混合得到防治白菜菌核病的生物药剂。
表8秸秆热解液和类芽孢杆菌发酵液复配剂对白菜菌核病菌的抑菌作用
实施例6
将大豆秸秆粉碎至75目后在550℃进行热解4s获得生物油；将得到的生物油与水按体积比为1:2搅拌混合，静置后，将上层水相部分进行常压蒸馏，收集110℃的蒸馏液，即为秸秆热解液。
将从大酱中分离得到的枯草芽孢杆菌拮抗菌株接种于LB培养液中，在32℃恒温摇床培养箱内培养24h，含有枯草芽孢杆菌菌落总数为3.75×107个/mL的芽孢杆菌菌悬液。然后取2mL枯草芽孢杆菌菌悬液接种到200mL LB液体培养基中于32℃、160r/min条件下振荡培养5d，菌液经10000r/min离心15min，取上清液用0.2μm微孔滤膜过滤，得到无菌的枯草芽孢杆菌发酵液。
将秸秆热解液稀释70倍，与上述芽孢杆菌发酵液以60:30(V/V)混合得到防治白菜菌核病的生物药剂。
表9秸秆热解液和枯草芽孢杆菌发酵液复配剂对白菜菌核病菌的抑菌作用
实施例7
将大豆秸秆粉碎至65目后在550℃进行热解4s获得生物油；将得到的生物油与水按体积比为1:2搅拌混合，静置后，将上层水相部分进行常压蒸馏，收集110℃的蒸馏液，即为秸秆热解液。
将从大酱中分离得到的枯草芽孢杆菌拮抗菌株接种于LB培养液中，在32℃恒温摇床培养箱内培养24h，含有枯草芽孢杆菌菌落总数为3.75×107个/mL的芽孢杆菌菌悬液。然后取2mL枯草芽孢杆菌菌悬液接种到200mL LB液体培养基中于32℃、160r/min条件下振荡培养5d，菌液经10000r/min离心15min，取上清液用0.2μm微孔滤膜过滤，得到无菌的枯草芽孢杆菌发酵液。
将秸秆热解液加热至70～80℃。将微量元素Zn2+、Mg2+、Cu2+、B3+、Fe2+和Mn2+中的化合物按照等比例分别称取50g，溶解于1L的秸秆热解液当中，搅拌后制成微量元素-秸秆热解液混合溶液。将微量元素-秸秆热解液混合溶液冷却至5～25℃，低温偶合处理15～30天。再与上述芽孢杆菌发酵液以60:30(V/V)混合得到防治白菜菌核病的生物药剂。
表10实施例7的复配剂对白菜菌核病菌的抑菌作用
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种生物药剂在防治白菜菌核病中的应用，其特征在于，所述生物药剂的pH值范围在5.5~6.5，包括以下体积份的组分：33.3~75份秸秆热解液和66.7~25份芽孢杆菌发酵液，所述芽孢杆菌发酵液为芽孢杆菌培养液经离心过滤后得到的无菌滤液，所述芽孢杆菌为从大酱中分离出的芽孢杆菌；
所述芽孢杆菌为甲基型芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或类芽孢杆菌；
所述秸秆热解液包括以下步骤制备而成：将秸秆粉碎后在450~550℃进行热解获得生物油；将所述生物油与水搅拌混合静置后，将得到的水相部分进行常压蒸馏，收集95~120℃的蒸馏液，即为秸秆热解液；
所述秸秆为稻草秸秆、玉米秸秆或大豆秸秆。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述秸秆热解液还包括稀释倍数为10~400倍的秸秆热解液稀释液。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，每升生物药剂中还包括10～500g微量元素。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述微量元素为Zn2+、Mg2+、Cu2+、B3+、Fe2+和Mn2+中的一种或几种。
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