CN106999624B - 治疗用具有形态发生活性的非晶形聚磷酸钙纳米颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及由直径大约为约45nm至约0.25μm的非晶形纳米颗粒组成的聚磷酸钙材料,该材料显示出约1.3GPa的相当大的硬度(弹性模量)。在温和条件下于室温产生的本发明的非结晶和生物可降解材料具有形态发生活性,并且优选地诱导骨形成和成骨细胞活性标记基因的表达(碱性磷酸酶)。在优选方面,本发明涉及制备显示出几种意想不到性能并可用于治疗或预防各种皮肤病学病况(包括光老化)的非晶形视黄醇/聚磷酸钙纳米球(视黄醇/aCa‑聚P‑NS)的方法。
Description
本发明涉及由直径约为45nm至0.25μm的非晶形纳米颗粒组成的聚磷酸钙材料,该材料显示出约1.3GPa的相当大的硬度(弹性模量)。在温和条件下于室温产生的本发明的非结晶和生物可降解材料具有形态发生活性,并且优选地诱导骨形成和成骨细胞活性标记基因的表达(碱性磷酸酶)。在优选方面,本发明涉及制备显示出几种意想不到性能并可用于治疗或预防各种皮肤病学病况(包括光老化)的非晶形视黄醇/聚磷酸钙纳米球(视黄醇/aCa-聚P-NS)的方法。
背景技术
无机聚磷酸盐(聚P)是存在于各种各样的生物体中的无毒聚合物(HC,MüllerWEG,编辑(1999)Inorganic Polyphosphates-Biochemistry,Biology,Biotechnology.Prog Mol Subcell Biol 23:45-81;Kulaev IS,Vagabov V,KulakovskayaT(2004)The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates.New York:John Wiley&SonsInc)。它通常由通过高能量的磷酸酐键连接在一起的数十至数百个磷酸盐单元的直链分子组成。活的生物体可以在环境温度下代谢产生这种聚合物,而聚P的化学合成需要数百度的高温。
骨中的聚P
以前的研究表明,不同链长的聚P分子尤其在骨细胞中积聚(Leyhausen G,LorenzB,Zhu H,Geurtsen W,Bohnensack R,Müller WEG,HC.Inorganicpolyphosphate in human osteoblast-like cells.J Bone Mineral Res 1998;13:803-812;HC,Kurz L,Müller WEG,Lorenz B.Polyphosphate in bone.Biochemistry(Moscow)2000;65:296-303)。此外,人类成骨细胞样细胞含有能水解聚P的酶,例如碱性磷酸酶(ALP)(Lorenz B,HC.Mammalian intestinal alkaline phosphatase actsas highly active exopolyphosphatase.Biochim Biophys Acta 2001;1547:254-261)。在血小板中也发现了聚P(Smith SA,Mutch NJ,Baskar D,Rohloff P,Docampo R,Morrissey JH.Polyphosphate modulates blood coagulation and fibrinolysis.ProcNatl Acad Sci USA 2006;103:903-908),可能在启动骨折愈合中发挥作用。
聚P对成骨细胞具有诱导作用,主要作为刺激骨细胞分化和矿化作用的合成代谢聚合物(综述于:Wang XH,HC,Wiens M,Ushijima H,Müller WEG.Bio-silicaand bio-polyphosphate:applications in biomedicine(bone formation).CurrentOpinion Biotechnol 2012;23:570-578;Wang XH,HC and MüllerWEG.Enzymatically synthesized inorganic polymers as morphogenetically activebone scaffolds:application in regenerative medicine.Int Rev Cell Mol Biol2014;313:27-77)。此外,聚P诱导ALP(Müller WEG,Wang XH,Diehl-Seifert B,Kropf K,Schloβmacher U,Lieberwirth I,Glasser G,Wiens M和HC.Inorganicpolymeric phosphate/polyphosphate as an inducer of alkaline phosphatase and amodulator of intracellular Ca2+level in osteoblasts(SaOS-2cells)in vitro.ActaBiomater 2011;7:2661-2671)。
骨移植材料
骨移植材料必须是生物相容性的,并且包含类似于生理骨组织的生物力学性能。有利的是可降解并且允许周围组织迁移至非自体植入物的至少表面区域的替代物,以加强生物制造材料与周围组织的桥接从而避免炎症反应。
除了基于细胞的骨移植替代物,基于陶瓷的材料已证明是可用于植入物的骨支架。在基于磷酸钙的陶瓷中,以下材料特别相关:
羟基磷灰石(HA)。HA是在高温反应中产生的,并且包含磷酸钙的结晶形式(NoshiT,Yoshikawa T,Ikeuchi M,Dohi Y,Ohgushi H,Horiuchi K,Sugimura M,Ichijima K,Yonemasu K.Enhancement of the in vivo osteogenic potential of marrow/hydroxyapatite composites by bovine bone morphogenetic protein.J Biomed MaterRes 2000;52:621-630)。由于HA的组成是钙磷比为1.67的Ca10(PO4)6(OH)2,这种材料在化学上非常类似于生理骨的矿化相。基于该性能,HA显示出合适的生物相容性(Nandi SK,KunduB,Ghosh SK,De DK,Basu D.Efficacy of nano-hydroxyapatite prepared by a aqueoussolution combustion technique in healing bone defects of goat.J Vet Sci 2008;9:183-191)。
β-磷酸三钙(β-TCP)。与HA类似,化学组成Ca3(PO4)2和β-TCP的结晶度与骨的矿物相相符;此外,该材料是生物可吸收的和生物相容的(Daculsi G,LeGeros RZ,HeughebaertM,Barbieux I.Formation of carbonate apatite crystals after implantation ofcalcium phosphate ceramics.Calcif Tissue Int 1990;46:20-27)。TCP植入物已被成功地用作骨科和牙科学中的合成骨空隙填充物(Shigaku S,Katsuyuki F.Beta-tricalciumphosphate as a bone graft substitute.Jikeikai Med J 2005;52:47-54)。
生物活性玻璃。最后,Hench等人最初开发的生物活性玻璃陶瓷(“生物玻璃”)(Hench LL,Splinter RJ,Allen WC,Greenlee TK.Bonding mechanisms at theinterface of ceramic prosthetic materials.J Biomed Mater Res Symp 1971;2:117-141;综述于:Chen Q,Roether JA,Boccaccini AR.Tissue engineering scaffolds frombioactive glass and composite materials.In:Ashammakhi N,Reis R,Chiellini FTopics in Tissue Engineering,Vol 4,pp.1-27,2008),不仅具有生物相容性,而且具有骨传导性,并允许骨结合无任何介入的纤维结缔组织界面(Zhang H,Ye XJ,LiJS.Preparation and biocompatibility evaluation of apatite/wollastonite-derived porous bioactive glass ceramic scaffolds.Biomed Mater 2009;4:45007)。这种矿物玻璃经常单独或与自体或同种异体松质骨移植物(Dorea HC,McLaughlin RM,Cantwell HD,Read R,Armbrust L,Pool R,Roush JK,Boyle C.Evaluation of healingin feline femoral defects filled with cancellous autograft,cancellousallograft or Bioglass.Vet Comp Orthop Traumatol 2005;18:157-168)或与具有形态发生活性的无机聚合物,例如聚磷酸盐[聚P](Wang XH,Tolba E,HC,NeufurthM,Feng Q,Diehl-Seifert B,MüllerWEG。Effect of bioglass on growth andbiomineralization of SaOS-2cells in hydrogel after 3D cell bioprinting.PLoSONE 2014;9:e112497)组合,用作骨缺损的填充材料。
由于所有这些矿物植入物材料是在高于700℃的温度下制造的,而且反过来不是或仅在有限的程度上是如同生物玻璃的骨诱导,本发明人开发了新的潜在的生物材料,同样适合用作骨植入物。
皮肤老化和胶原蛋白
人皮肤表皮由不同增殖和分化状态的角质细胞组成,而真皮由三种主要类型的细胞(成纤维细胞、巨噬细胞和脂肪细胞)组成。皮肤和结缔组织中最丰富的蛋白质,I型胶原蛋白和III型和V型其他纤维状胶原蛋白分泌为前胶原,然后进行酶处理以组装成三螺旋结构。在皮肤老化过程中,胶原蛋白的数量和质量、完整性和生物力学性能降低,往往由于外部因素而加速(Pandel R,B,Godic A,Dahmane R (2013)Skin photoaging andthe role of antioxidants in its prevention.ISRN Dermatol 12;2013:930164)。皮肤老化可以分为:i)年代老化或内在性老化,和ii)日光老化(Solar aging)(光老化)。关注光老化过程,已经确定老化皮肤的特征在于:在上部和中部真皮中胶原蛋白的量减少,异常的弹性纤维积累,以及并行地糖胺聚糖的量增加。细胞外基质纤维网络结构中这种不平衡的主要原因是包括自由基的氧源性物质种类的出现(Gilchrest BA,Bohr VA.Agingprocess,DNA damage,and repair.FASEB J 1997;11:322-330)。
虽然一生中在人体皮肤中I型胶原蛋白的合成几乎保持不变,但III胶原蛋白形成的程度大幅下降了70%。I型胶原蛋白基因表达相对于III型胶原蛋白基因表达的差异调控在一定程度上得到了解。由于胶原蛋白的特别长的半衰期,在形成晚期糖基化终末产物(AGE)的情况下原纤维经历非酶糖基化,由此使得一些信号转导通路和I型胶原蛋白和III型胶原蛋白基因表达受到调控(Tang M,Zhong M,Shang Y,Lin H,Deng J,Jiang H,Lu H,Zhang Y,Zhang W.Differential regulation of collagen types I and IIIexpression in cardiac fibroblasts by AGEs through TRB3/MAPK signalingpathway.Cell Mol Life Sci 2008;65:2924-2932)。
类视黄醇的结构特征在于:具有由包含末端醇基、醛基、羧酸基或酯基的四个类异戊二烯部分组成的多不饱和侧链的β-紫罗兰酮环。已经确定类视黄醇有利于皮肤再生、胶原蛋白网络重建和防止皮肤老化(综述于:Mukherjee S,Date A,Patravale V,KortingHC,Roeder A,Weindl G.Retinoids in the treatment of skin aging:an overview ofclinical efficacy and safety.Clin Interv Aging 2006;1:327-348)。此外,视黄醇已被提出用作生物学活性皮肤防腐剂的稳定剂(Nystrand G,Debois J.Retinol stabilizedcleansing compositions;EP 995433 A1)。
由于盐Na-聚P易溶解事实,聚P作为皮肤防腐剂的应用受到阻碍。制造更高抗性并具有生物活性的含有聚P的生物材料的方法包括煅烧过程。然而,在这些过程中,聚P被分解或被转化成结晶状态,并且由此变得不活跃(Pilliar RM,Filiaggi MJ,Wells JD,GrynpasMD,Kandel RA.Porous calcium polyphosphate scaffolds for bonesubstituteapplications-in vitro characterization.Biomaterials 2001;22:963-972;Ding YL,Chen YW,Qin YJ,Shi GQ,Yu XX,Wan CX.Effect of polymerizationdegree of calcium polyphosphate on its microstructure and in vitrodegradation performance.J Mater Sci Mater Med 2008;19:1291-1295)。
本发明的新材料是基于聚P的。以前,聚P被煅烧后也用作骨植入物的有潜力的支架(Pilliar RM,Filiaggi MJ,Wells JD,Grynpas MD,Kandel RA.Porous calciumpolyphosphate scaffolds for bone substitute applications-in vitrocharacterization.Biomaterials 2001;22:963-972;Qiu K,Wan CX,Zhao CS,Chen X,Tang CW,Chen YW.Fabrication and characterization of porous calciumpolyphosphate scaffolds.J Materials Sci 2006;41:2429-2434;Ding YL,Chen YW,QinYJ,Shi GQ,Yu XX,Wan CX.Effect of polymerization degree of calciumpolyphosphate on its microstructure and in vitro degradation performance.JMater Sci Mater Med 2008;19:1291-1295;Wang D,Wallace AF,De Yoreo JJ,DovePM.Carboxylated molecules regulate magnesium content of amorphous calciumcarbonates during calcification.Proc Natl Acad Sci USA 2009;106:21511-21516)。在所有这些制备物中,聚P必须进行煅烧,结果是聚P链可能被降解并且确切的链长度是不可能确定的。此外,这些聚P支架尚未被描述为以骨诱导的方式起作用。
本发明的材料是硬的、非晶形的、基于聚P的生物材料,其是在存在明显调节的CaCl2浓度的情况下于环境条件(即在约20℃±10℃)制备的。所获得的材料包含由球形非晶形纳米颗粒制成的多孔支架,其是可生物降解的,并保持所述无机聚合物的形态发生活性。
因此,在其第一方面,本发明涉及由聚磷酸钙(Ca-聚P)纳米颗粒组成的新的具有形态发生活性的材料,其是(i)非晶形的和(ii)显示出未在通过现有最先进技术的方法制备的聚磷酸钙材料中发现的不寻常的硬度。本发明人开发了在室温下进行的受控且缓慢的制造工艺,并且意外地导致形成显示这些性能的材料。在CaCl2存在下,以约1或2(磷酸根比钙)的化学计量比形成的聚P材料,是由直径约为45nm至约0.25μm的纳米球组成的非晶形粉末。相比通过常规方法制备的Ca-聚P盐(其在细胞培养实验中,在较长时间内抵抗由存在于培养基中的磷酸酶引起的水解裂解),本发明的材料是可降解的。形成该纳米颗粒材料的聚P纳米颗粒,称为非晶形磷酸钙纳米颗粒[aCa-聚P-NP]。
本发明人还成功地将视黄醇包括在这些纳米颗粒中,从而来制备由包封在Ca-聚P壳内的视黄醇内含物组成的纳米球。这些纳米球称为非晶形聚磷酸钙/视黄醇纳米球[视黄醇/aCa-聚P-NS]。本发明人意外地发现本发明的这种新材料,视黄醇/aCa-聚P-NS在单一成分、视黄醇和aCa-聚P-NP在生物学上无活性的浓度下以意想不到的高程度引起III型胶原蛋白表达。
聚P的以下专利申请被认为是相关的;GB1406840.7。用于生物人造组织的生物打印的具有形态发生活性的水凝胶。发明人:Müller WEG,HC,Wang XH;GB1403899.6。用于治疗骨骼病症的包含槲皮素和聚磷酸盐的协同组合物。发明人:MüllerWEG,HC,Wang XH。
在本发明的第一方面,提供了新的聚磷酸盐(聚P)材料,其特征在于以下性能:a)材料是非晶形的(非结晶的);b)该材料具有不寻常的硬度(例如,本发明的Ca-聚P2生物聚合物的弹性模量相当于大约1.3GPa(在本发明的上下文中,“硬”或“硬度”是指大约1.3GPa的值,诸如在0.8和1.8GPa之间,优选地在1.0和1.6GPa之间),接近人骨周围小梁组织的测量值[6.9GPa]);并且优选地,c)该材料由直径为约45nm至约0.25μm的纳米颗粒(本发明的Ca-聚P2颗粒)组成。有利地,本发明的材料可以在温和的条件下,诸如环境条件,特别是在室温下制备。
可以使用本领域技术人员已知的布氏硬度和维氏硬度测试方法来测量硬度。
令人惊奇地发现,本发明的材料是非晶形的(非结晶的)并具有形态发生活性,它诱导骨碱性磷酸酶活性和新骨形成(羟基磷灰石合成);并且该材料是可生物降解的(例如通过聚磷酸酶,诸如骨碱性磷酸酶)。
相比用于例如骨再生和替代材料(例如,GB1406840.7,用于生物人造组织的生物打印的具有形态发生活性的水凝胶[发明人:Müller WEG,HC,Wang XH];GB1403899.6,用于治疗骨骼病症的包含槲皮素和聚磷酸盐的协同组合物[发明人:MüllerWEG,HC,Wang XH])中的常规聚磷酸盐制剂,本发明材料的性能使它具有优越性,可以根据本发明按照以下方法来制备所述材料:
a)将聚P盐溶解在水中,并将pH调节至碱性值,
b)(缓慢)将钙盐溶液加入到聚P盐(用Na+)溶液中,并将pH调节至碱性值,和
c)收集和干燥由此形成的颗粒,任选地在用乙醇洗涤之后。
该程序在室温下进行。
在另一方面,本发明涉及用于制备纳米球的方法,该纳米球由(i)Ca2+与(ii)聚P一起形成纳米颗粒(aCa-聚P-NP),以及与(iii)由这些纳米颗粒包封以形成纳米球的视黄醇一起组成。
意外地是,本发明人发现用视黄醇和聚(乙二醇)[PEG]处理这些纳米颗粒导致形成纳米球(视黄醇/aCa-聚P-NS),其显示以下意想不到的和有利的性能:
1.本发明的纳米球(视黄醇/aCa-聚P-NS),在尺寸(尺寸~45nm)上是高度均匀的。这种尺寸对于内吞作用的细胞摄取是最佳的(Zhang S,Li J,Lykotrafitis G,Bao G,Suresh S.Size-dependent endocytosis of nanoparticles.Adv Mater 2009;21:419-424)。
2.相比之下,纳米颗粒aCa-聚P-NP是大的(>50μm大小的)砖块样颗粒。
3.纳米球的两种成分视黄醇和聚P协同作用:如果以“非有效”浓度一起给出,则会发生细胞增殖的强烈增加。
4.纳米球的两种成分视黄醇和聚P对I型胶原蛋白和II型胶原蛋白,特别是III型胶原蛋白的表达产生高度协同作用。在如果单独施用则不显示任何生物学效应的视黄醇和aCa-聚P-NP的浓度下,这些效果已经得到观察。尽管将浓度≤1%(36mM)的视黄醇应用评估为安全的化妆品成分,但更高的浓度可能会显示不良作用,例如,抑制对病毒或化学致癌物质的响应(参见:Final report on the safety assessment of retinyl palmitate andretinol.J Americ Coll Toxicol 1987;6:279-319)。因此,本发明的纳米球公开了这种化合物的更安全应用,例如在化妆品中。
本发明的纳米球可以通过在细胞外空间中的酶水解而分解。纳米球内的主要成分聚P,经历外磷酸酶(最有可能是碱性磷酸酶,其参与聚P的细胞外降解)的降解(MüllerWEG,Wang XH,Diehl-Seifert B,Kropf K,Schloβmacher U,Lieberwirth I,Glasser G,Wiens M,HC.Inorganic polymeric phosphate/polyphoshate as an inducerof alkaline phosphatase and a modulator of intracellular Ca2+level inosteoblasts(SaOS-2cells)in vitro.Acta Biomaterialia 2011j;7:2661-2671)。因此,不仅聚P在细胞外释放,而且视黄醇也是在细胞外释放。
根据本发明这个方面的纳米球,具有适当的尺寸以被网格蛋白介导的内吞作用过程所摄取。可以用内吞抑制剂三氟丙嗪来阻断它们的生物活性。在跨膜视黄醇转运蛋白被下调(导致表皮增厚)的条件下,纳米球的这种性能是有利的。
因此,所述纳米球通过细胞外途径(细胞膜结合受体的激活)和通过跨膜/细胞内途径(通过内吞作用),显示两种活性成分(聚P和视黄醇)的双重生物学效应。
本发明的纳米球不是细胞毒性的。
作为优选实施例,可以使用溶液中的聚磷酸钠(Na-聚P)作为聚P盐(链长:50个磷酸盐单元)和溶液中的氯化钙作为钙盐,如下进行该方法。
a)将10g Na-聚P溶解在500ml蒸馏水中,并用1M NaOH(室温)调节pH至10,
b)缓慢逐滴(1ml/min)将14g氯化钙(Ca-聚P1)或28g氯化钙(Ca-聚P2)在250ml盐中的溶液,加入到Na-聚P溶液中并调节pH至10(室温),
c)将由此形成的悬浮液搅拌约4小时,和
d)收集所形成的颗粒,并任选地用乙醇洗涤,同时过滤(0.45μm过滤器,例如Nalgene Rapid-Flow),并在60℃下干燥。
将用14g CaCl2得到的聚磷酸钙(Ca-聚P)材料称为Ca-聚P1(1的磷酸根:钙的化学计量比);将用28g CaCl2得到的Ca-聚P材料称为“Ca-聚P2”(1:2的磷酸根:钙的化学计量比)。
本发明的材料,由非晶形类视黄醇/Ca-聚P纳米球组成,其与单独(类视黄醇和聚P)成分相比是优越的,根据本发明可以制备如下:a)将类视黄醇和钙盐溶解于有机溶剂,b)将类视黄醇钙盐溶液缓慢加入到聚P水溶液中,和c)收集并干燥用水洗涤后形成的纳米球。该程序在室温避光下进行。
例如,可以使用Na-聚P作为聚P盐(链长:30个磷酸盐单元)和氯化钙作为钙盐按如下制备非晶形视黄醇/聚磷酸钙纳米球(视黄醇/aCa-聚P-NS)。A)在50ml无水乙醇中制备含有100mg视黄醇和2.8gCaCl2的溶液(=视黄醇/钙溶液)。B)在100ml水中制备含有1g聚P的聚P溶液;为了避免相分离并稳定乳状液,将2g聚(乙二醇)[PEG]加入Na-聚P溶液(=聚P溶液)中。C)将视黄醇钙溶液逐滴加入聚P溶液中。D)搅拌形成的乳状液6小时。E)通过过滤收集形成的纳米球,并用水洗涤以除去过量的钙离子和未反应的成分。F)在室温下将颗粒干燥过夜。
相比在溶液中或在苛刻的反应条件(例如在高温度[250℃]下在含Ca(OH)2的磷酸酸性溶剂中)下以不同的磷酸盐与钙的比例生成的较大颗粒(Jackson LE,Kariuki BM,Smith ME,Barralet JE,Wright AJ.Synthesis and structure of a calciumpolyphoshate with a unique criss-cross arrangement of helical phosphatechains.Chem Mater 2005;17:4642-4646)或描述的钙-磷酸盐络合物(Müller WEG,WangXH,Diehl-Seifert B,Kropf K,Schloβmacher U,Lieberwirth I,Glasser G,Wiens M,HC.Inorganic polymeric phosphate/polyphoshate is an inducer ofalkaline phosphatase and a modulator of intracellular Ca2+level in osteoblasts(SaOS-2cells)in vitro.Acta Biomater 2011;7:2661-2671),包含本发明的Ca-聚P材料或由其组成的纳米颗粒的特征在于具有高的硬度(约1.3GPa;Ca-聚P2)。
相比通过常规技术制备的Ca-聚P盐,本发明的新的和硬的聚P材料是可生物降解的,并且显示出优越的形态发生活性。
此外,本发明的硬的Ca-聚P纳米颗粒易于细胞摄取(甚至观察到较大的600nm颗粒;Zhao Y,Sun X,Zhang G,Trewyn BG,SlowingII,Lin VS.Interaction of mesoporoussilica nanoparticles with human red blood cell membranes:size and surfaceeffects.ACS Nano 2011;5:1366-1375)和随后的代谢,这一特性对于游离聚阴离子聚P聚合物是不可能的。
聚P分子的链长可以在3至多达1000个磷酸盐单元的范围内。达到的最佳结果是聚P分子具有的平均链长为约200至20个,最佳约30至50个磷酸盐单元。
本发明的另一方面涉及通过上述方法之一获得的材料。
此外,发明人证明本发明的方法可用于制备硬的非晶形并具有形态发生活性的聚P纳米颗粒。
本发明的另一方面涉及通过上述方法之一获得的包含纳米颗粒的材料。
本发明的技术可用于制备纳米颗粒,或用于优选地在骨再生和修复以及牙科学中使用的含有这种纳米颗粒的材料。
本发明的另一方面涉及本发明纳米颗粒在药物递送中的应用,再一次优选地,在骨再生和修复以及牙科学中的应用,类似于例如Kwon等人和Yang等人描述的系统(Kwon S,Singh RK,Perez RA,Abou Neel EA,Kim HW,Chrzanowski W.Silica-based mesoporousnanoparticles for controlled drug delivery.J Tissue Eng.2013Sep 3;4:2041731413503357.eCollection 2013.Yang P,Gai S,Lin J.Functionalizedmesoporous silica materials for controlled drug delivery.Chem Soc Rev.2012May7;41(9):3679-98)。
本发明的另一方面涉及材料,诸如通过上述方法之一获得的含有这种视黄醇/钙聚磷酸盐纳米球(视黄醇/aCa-聚P-NS)的霜剂或软膏。
本发明的技术可用于制备纳米球或含有这些纳米球的材料(如霜剂或软膏),用于治疗或预防皮肤病学病况,诸如炎症性皮肤病、痤疮,增加的细胞更新的病症如银屑病、皮肤癌和光老化。
本发明的另一方面涉及本发明的纳米球在药物递送中的应用。
现在将在以下优选实施例中进一步描述本发明,但不限于此。为了本发明的目的,本文引用的所有参考文献通过引用整体并入。
附图说明
图1显示Na-聚P、Ca-聚P1和Ca-聚P2的FTIR光谱;(A)4000cm-1至600cm-1的波数,和(B)1400cm-1和600cm-1的波数。
图2显示从以下聚P粉末获得的SEM显微照片:(A和B)Na-聚P,(C和D)Ca-聚P1和(E和F)Ca-聚P2。
图3显示本文开发的Ca-聚P材料的生物学特性。(A)SaOS-2细胞保持没有磷酸盐材料(无),或者在激活的混合物OC存在下与10μg/mL的Na-聚P、Ca-聚P1、Ca-聚P2、HA或β-TCP一起孵育7d。然后,将含有细胞的盖玻片用茜素红S染色。(B)响应暴露于磷酸盐材料的SaOS-2细胞中ALP的表达水平。在1或7d的孵育期后,收获细胞,提取RNA并进行qRT-PCR分析。测量ALP转录物的稳态水平,并标准化为GAPDH的表达水平。数据表示为四次独立实验的平均值±SD;每个实验一式两份进行。使用非配对t检验评估组之间的差异。*p<0.05。(C)体外降解聚P,使用16.5%聚丙烯酰胺/7M尿素凝胶电泳技术。在SaOS-2细胞和培养基/血清或PBS[磷酸盐缓冲盐水]存在下,将细胞与50μg/ml的固体Ca-聚P2一起孵育;在1或7d的孵育期后,取样品进行链长测定。并行运行具有80个、40个和3个单元平均链长的合成的聚P标记物。
图4显示视黄醇/aCa-聚P-NS的制备。(A)将视黄醇溶液逐滴加入(B)含有PEG的Na-聚P溶液中。(C)形成含有(D)由Ca2+、聚P和视黄醇组成的视黄醇/aCa-聚P-NS的乳状液。(E)显示缺乏(左)和含有视黄醇(右)的纳米球。更多细节参见下文“方法”部分。
图5显示aCa-聚P-NP相对于Na-聚P对MC3T3细胞生长的影响。该测定由浓度在1至30μg/ml的Na-聚P(交叉阴影柱)或aCa-聚P-NP(填充柱)组成。在终止培养72小时后,将测定进行XTT分析,并测定650nm处的吸光度。数据代表10次独立实验的平均值±SD(*P<0.01)。
图6显示视黄醇和aCa-聚P对增殖倾向的协同作用。在所有测定中,aCa-聚P-NP的浓度保持不变(3μg/ml)。在这种浓度下,对细胞生长没有影响。在0.3至30μM的范围内加入视黄醇同样不影响细胞的生长(左边阴影柱)。共同加入aCa-聚P-NP与视黄醇(右边阴影柱)后,测量到强烈的生长诱导作用。在高于1μg/ml的视黄醇浓度下,该作用是协同的。*P<0.01。
图7显示纳米颗粒和纳米球在470nm激发和525nm发射下的荧光强度。虽然纳米颗粒aCa-聚P-NP(A)仅显示背景荧光(B),但含视黄醇的纳米球(视黄醇/aCa-聚P-NS)(C)以亮绿色荧光照亮。
图8显示在标准孵育试验中,(A)在PBS中或(B)在补充有MC3T3-E1细胞的培养基/血清中,孵育(1至5d)后视黄醇/aCa-聚P-NS纳米球中聚P的稳定性。然后取等份用于链长度测定。并行运行具有80个、40个和3个单元平均链长的合成的聚P标记物。
图9显示在暴露于单独的视黄醇或纳米颗粒aCa-聚P-NP或其组合的MC3T3-E1细胞中不同胶原蛋白类型,I型胶原蛋白(COL-I)、II型胶原蛋白(COL-II)、III型胶原蛋白(COL-III)和V型胶原蛋白(COL-V)的表达水平;测试了一种浓度的aCa-聚P-NP(3μg/ml)和两种浓度的视黄醇(1μM和3μM)。视黄醇的浓度以μM给出;加入浓度为3μg/ml的aCa-聚P-NP。在4d的孵育期后,收获MC3T3-E1细胞,提取其RNA,并使用GAPDH基因为管家基因作为参考通过RT-qPCR来测定稳态水平的胶原蛋白表达。在处理的细胞(视黄醇和/或aCa-聚P-NP)与未处理的细胞(无附加成分)之间,按比例给出来自细胞的RNA中的转录物的表达值。结果是来自5次平行实验的平均值;*P<0.01。
图10显示在MC3T3-E1细胞中不同类型胶原蛋白(COL-I、COL-II、COL-III和COL-V)的表达水平。将稳态表达值标准化为管家基因GAPDG的表达,并以处理的细胞(视黄醇/aCa-聚P-NS)与未处理细胞之间的比例给出。*P<0.01。
图11显示在视黄醇不存在或存在下,暴露于单独的视黄醇、Na-聚P、aCa-聚P-NP1纳米颗粒(磷酸根和Ca2+之间的比例为1:1)和aCa-聚P-NP(磷酸根和Ca2+之间的比例为1:2)的细胞中III型胶原蛋白基因的表达水平。在最后一个系列中,该测定由视黄醇、aCa-聚P-NP和20μM的网格蛋白介导的内吞作用的抑制剂三氟丙嗪(TFP)组成。III型胶原蛋白的表达与管家基因GAPDH相关。*P<0.01。
实施例
在以下实施例中,本发明的方法仅针对链长为30至50个磷酸盐单元的聚P分子进行描述。通过使用具有较低和较高链长(如100至20个单元)的聚P分子可以获得类似的结果。
FTIR分析
通过FTIR表征两种磷酸盐材料Ca-聚P1和Ca-聚P2,并与用Na-聚P获得的光谱进行比较(图1)。波数4000cm-1和600cm-1之间的完整光谱如图1A中所示,在图1B中给出了在1400cm-1和600cm-1之间的部分。1250cm-1附近的带被归属于与PO2偏磷酸酯单元中的磷原子键合的两个非桥接氧原子的不对称拉伸模式νas(PO2)–。在1190cm-1处的弱带是PO2对称拉伸模式νs(PO2)–。接近1083cm-1和999cm-1的吸收带被归属于链终止PO3基团的不对称和对称拉伸模式[νas(PO3)2-和νs(PO3)2-]。864cm-1附近的吸收带归因于P-O-P键的不对称拉伸模式νas(P-O-P),和以763cm-1为中心的部分分离的带归因于这些键的对称拉伸模式νs(P-O-P)。
Na-聚P和Ca-聚P光谱的比较显示,在1300cm-1至1000cm-1区域可以看到聚P特征。在那里,发现聚P链的大部分化学特性。在所有三个样品中可以看到类似的图案,反映了在与Ca2+离子反应过程中聚P链骨架不会分解。然而,如果比较Na-聚P光谱,则峰在Ca-聚P1和Ca-聚P2样品中移位。也可以看到Ca-聚P光谱中其他带的这种移位;通过增加聚P样品(从Ca-聚P1到Ca-聚P2)中的Ca2+含量,它们甚至增加。此外,据报道在1100cm-1至1000cm-1附近的吸附带归因于P-O-基团的离子拉伸模式,Ca-聚P样品的该峰的移位以及增宽归因于P-O··M+(+)(其中M是Ca2+)的形成。总之,IR光谱证实了在Ca2+和聚P之间的相互作用以及Ca-聚P的形成。
用Ca-聚P1和Ca-聚P2进行XRD分析;图案没有显示结晶度的迹象,如Na-聚P(图1C)。
聚P样品的形态
通过SEM分析三个样品Na-聚P、Ca-聚P1和Ca-聚P2(图2)。具有非规则形状的Na-聚P颗粒通常显示出锥形形态(图2A和图2B)。颗粒的尺寸在1μm和300μm之间变化,平均尺寸为≈100μm。同样,非规则形状显示Ca-聚P1颗粒(图2C和图2D)。它们小于平均直径为≈4μm的Na-聚P颗粒。甚至更小的是具有平均直径为≈0.2μm的Ca-聚P2颗粒(图2E和图2F)。
聚P诱导的SaOS-2细胞的矿化
在激活混合物OC存在下,将细胞与10μg/mL的Na-聚P、Ca-聚P1、Ca-聚P2、HA或β-TCP一起孵育7d。然后去除其上已经培养细胞的盖玻片,并用茜素红S染色,如下文的“方法”部分所述。目检显示对于Ca-聚P1和Ca-聚P2,反映样品中存在矿物质程度的显色反应强度是最高的。对于Na-聚P、β-TCP和HA,显色反应程度较低;与对照相比,这些样品的强度仅略高一些(图3A)。
ALP的表达水平
因为与外源添加的颗粒的交叉反应,茜素红S显色反应可能不够敏感,所以通过qRT-PCR定量SaOS-2细胞中ALP的稳态表达水平。本发明人先前确定,该酶的表达水平是聚P诱导的骨细胞活化的可靠标记物(Müller WEG,Wang XH,Diehl-Seifert B,Kropf K,Schloβmacher U,Lieberwirth I,Glasser G,Wiens M and HC.Inorganic polymericphosphate/polyphosphate as an inducer of alkaline phosphatase and a modulatorof intracellular Ca2+level in osteoblasts(SaOS-2cells)in vitro.ActaBiomaterialia 2011j;7:2661-2671)。因此,本发明人在细胞与不同磷酸盐样品一起孵育后,在OC激活混合物存在下,将细胞进行qRT-PCR分析。数据显示,在第1天,所用的不同聚磷酸盐样品之间ALP的表达水平在统计学上没有差异。然而,在7d的孵育期后,暴露于Ca-聚P1和Ca-聚P2的细胞中ALP的稳态表达水平(相比参考GAPDH,≈0.10个表达单位)显著高于针对Na-聚P、β-TCP或HA测量的那些细胞中ALP的稳态表达水平(≈0.055个表达单位)。后三种测定的表达水平,没有显著高于对照测定中观察到的表达水平(未添加磷酸盐样品);图3B。
Ca-聚P2材料的硬度
用套圈-顶部悬臂进行Ca-聚P2生物聚合物的机械性能(弹性模量)测定并发现≈1.3GPa,接近人骨周围小梁组织的测量值6.9GPa(Zysset PK,Guo XE,Hoffler CE,MooreKE,Goldstein SA.Elastic modulus and hardness of cortical and trabecular bonelamellae measured by nanoindentation in the human femur.J Biomech 1999;32:1005-1012)。
体外降解聚P
在一系列实验中,将SaOS-2细胞与50μg/ml的固体Ca-聚P2一起孵育,并在标准试验中在SaOS-2细胞和培养基/血清或在PBS存在下孵育1d或7d。然后取样并测定聚P的链长(Lorenz B,HC.Mammalian intestinal alkaline phosphatase acts ashighly active exopolyphosphatase.Biochim Biophys Acta 2001;1547:254-261)。凝胶用邻甲苯胺蓝染色。结果(图3C)显示,如果溶解在PBS中,加入到该测定中的Ca-聚P2在7d长的孵育期内没有经历水解降解。相比之下,如果聚合物在含有SaOS-2细胞和培养基/血清的测定中孵育,则Ca-聚P2的平均链长从平均链长40降至约3Pi单元。该结果表明,Ca-聚P2易于被ALP(外切聚磷酸酶)水解,而且也易于被存在于血清中其它聚P水解酶(内切聚磷酸酶)水解。
方法
聚磷酸盐
已从Chemische Fabrik Budenheim(Budenheim;德国)获得实施例中使用的聚磷酸钠(平均链40个磷酸盐单元的Na-聚P)。也可以从例如Merck Millipore(#106529;Darmstadt;德国)获得平均链长为30个磷酸盐单元(NaPO3)n的聚磷酸钠(Na-聚P),所有反式视黄醇来自例如Sigma(#95144;≥97.5%,Mr 286.45;Sigma,Taufkirchen;德国)。
聚磷酸钙纳米球的制备
将10g的Na-聚P溶解在500ml蒸馏水中,用1M NaOH将pH调节至10。在室温下缓慢地向Na-聚P溶液中逐滴(1ml/min)加入在250ml中的14g氯化钙二水合物或28g CaCl2的溶液,将pH稳定调节至10。将形成的悬浮液搅拌4小时。然后通过用乙醇洗涤两次同时通过0.45μm过滤器(例如Nalgene Rapid-Flow)过滤来收集形成的颗粒。然后将颗粒在50℃或60℃下干燥。通过加入14g CaCl2获得的Ca-聚P材料称为“Ca-聚P1”,将用28g CaCl2获得的Ca-聚P材料称为“Ca-聚P2”。aCa-聚P-NP含有磷酸盐:Ca2+=2的比例。
通过在避光条件下的方法制备非晶形视黄醇/Ca-聚P纳米球(视黄醇/aCa-聚P-NS)。制备含有2.8g CaCl2(图4A)的视黄醇溶液(100mg/50ml无水乙醇),并逐滴加入至Na-聚P溶液(1g在100ml水中;图4B)中。为了避免相分离和稳定乳状液,将2g聚(乙二醇)[PEG](例如:#P5413;Sigma-Aldrich;平均摩尔重量8,000)加入到Na-聚P溶液中。将形成的乳状液(图4C)搅拌6小时。通过过滤收集形成的颗粒(图4D),并用水洗涤三次以除去过量的钙离子和未反应的成分。然后将颗粒在室温下干燥过夜;与不含视黄醇形成的纳米球相反,含有该成分的纳米球具有浅黄色(图4E)。
已经描述了aCa-聚P-NP的制备(Müller WEG,Tolba E,HC,Wang SF,Glaβer G,R,Link T,Wang XH.A new polyphosphate calcium material withmorphogenetic activity.Materials Lett 2015,印刷中)。通过以1:2的化学计量比,用Ca2+沉淀Na-聚P制备这些纳米颗粒。聚P纳米球同样是非晶形,其由将具有CaCl2的视黄醇乙醇溶液(图4A)加入到具有PEG的Na-聚P溶液中产生(图4B),在此期间形成视黄醇/aCa-聚P-NS悬浮液(图4D)。收集纳米球,并且与缺乏视黄醇的纳米颗粒相反,具有略微的黄色(图4F)。
通过FTIR进行化学表征
使用例如具有Golden Gate ATR辅助(Agilent)的Varian 660-IR光谱仪,进行衰减全反射(ATR)模式中的傅里叶变换红外(FTIR)光谱。记录波数4000cm-1和600cm-1之间的光谱。
扫描电子显微镜和能量色散X射线光谱
对于扫描电子显微镜(SEM)分析,例如,HITACHI SU 8000可以在低电压(<1kV;近表面有机表面的分析)下使用。EDX光谱可以例如用连接到扫描电子显微镜(Nova600Nanolab)上的EDAX Genesis EDX系统进行,在10kV操作,收集时间为30-45秒。通过EDX分析大约10μm2的区域。
XRD分析
X射线衍射(XRD)是使用已建立的方法进行的(Fischer V,Lieberwirth I,JakobG,Landfester K,Material oxide/polymer hybrid nanoparticleswith versatile functional prepared by controlled surface crystallization.AdvFunct Mat 2013;23:451-466)。
细胞和细胞培养条件
将人成骨肉瘤细胞SaOS-2细胞用于实验,并培养在具有胎牛血清[FCS]的McCoy培养基中(Wiens M,Wang XH,Schloβmacher U,Lieberwirth I,Glasser G,Ushijima H,HC,Müller WEG.Osteogenic potential of bio-silica on humanosteoblast-like(SaOS-2)cells.Calcif Tissue Intern 2010;87:513-524)。在24孔板中进行细胞的培养;每孔接种3×104个细胞。在3d的初始孵育期后,用以2:1的化学计量比补充有CaCl2的10μg/mL的固体Na-聚P补充培养物,以补偿所述的聚P的螯合活性(MüllerWEG,Wang XH,Diehl-Seifert B,Kropf K,Schloβmacher U,Lieberwirth I,Glasser G,Wiens M,HC.Inorganic polymeric phosphate/polyphosphate as an inducerof alkaline phosphatase and a modulator of intracellular Ca2+level inosteoblasts(SaOS-2cells)in vitro.Acta Biomaterialia 2011;7;2661-26719),或用本文制备的两种聚P样品,用Ca-聚P1或Ca-聚P2补充培养物。相比之下,纳米羟基磷灰石(HA;例如:677418Sigma-Aldrich)或β-TCP(例如:13204Sigma-Aldrich)也已经包括在试验系列中。作为对照,没有添加那些聚合物。然后,在含有10nM地塞米松、5mMβ-甘油磷酸盐和50mM抗坏血酸的成骨混合物[OC]的存在下,继续孵育细胞。在7天的孵育期后,用茜素红S染色细胞以评估矿化程度(HC,Borejko A,Krasko A,Reiber A,Schwertner H,MüllerWEG.Mineralization of SaOS-2 cells on enzymatically(silicatein)modifiedbioactive osteoblast-stimulating surfaces.J Biomed Mater Res B Appl Biomater2005;75:387-392),或将细胞进行qRT-PCR[定量实时RT-PCR]分析(Wiens M,Wang XH,Schloβmacher U,Lieberwirth I,Glasser G,Ushijima H,HC,MüllerWEG.Osteogenic potential of bio-silica on human osteoblast-like(SaOS-2)cells.Calcif Tissue Intern 2010;87:513-524)。
将小鼠颅盖细胞MC3T3-E1细胞(ATCC-CRL-2593)用于实验,并在含有20%胎牛血清[FCS](Gibco)的a-MEM(Gibco-Invitrogen)中培养。所述培养基含有2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和50μg/ml庆大霉素。将细胞在25cm2长颈瓶或24孔板(Greiner Bio-One)中在37℃和5%CO2的培养箱中孵育。达到80%融合,使用胰蛋白酶/EDTA分离细胞,并以5·103个细胞/ml的密度连续传代培养。将细胞以5·103个细胞/孔的密度接种。每3d更换培养基/血清。
将aCa-聚P-NP以指定浓度加入到培养物中,通常为3μg/ml。并行加入视黄醇,将其以1mg/ml乙醇溶解,然后以指定浓度稀释于DMSO[二甲基亚砜]中。在一系列实验中,并行研究了与Ca2+化学计量络合的Na-聚P(摩尔比为2:1/磷酸盐单体:Ca2+;Müller WEG,Wang XH,Diehl-Seifert B,Kropf K,SchloβmacherU,Lieberwirth I,Glasser G,Wiens M,HC.Inorganic polymeric phosphate /polyphosphoate as an inducer ofalkaline phosphatase and a modulator of intracellular Ca2+level in osteoblasts(SaOS-2cells)in vitro.Acta Biomaterialia 2011;7:2661-2671)。
转录表达
对于qRT-PCR反应,引物对Fwd:5'-TGCAGTACGAGCTGAACAGGAACA-3'(SEQ ID NO:1)[nt1141至nt1164]和Rev:5'-TCCACCAAATGTGAAGACGTGGGA-3'(SEQ ID NO:2)[nt1418至nt1395;PCR产物长度278bp],可用于定量碱性磷酸酶[ALP]转录物(登录号NM_000478.4)。使用引物对Fwd:5'-CCGTCTAGAAAAACCTGCC-3'(SEQ ID NO:3)[nt845至nt863]和Rev:5'-GCCAAATTCGTTGTCATACC-3'(SEQ ID NO:4)[nt1059至nt1078;215bp],可以将ALP的表达水平标准化为参考基因GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶;NM_002046.3)的表达水平。
硬度测定
可以通过例如所述的基于套圈光纤的纳米压痕仪来测定聚磷酸盐材料Ca-聚P2的硬度(Chavan D,Andres D,Iannuzzi D.Ferrule-top atomic forcemicroscope.II.Imaging in tapping mode and at low temperature.Rev Sci Instrum2011;82:046107.doi:10.1063/1.3579496)。
体外降解聚P
在一系列实验中,将SaOS-2细胞与50μg/ml的固体Ca-聚P或Ca-聚P2一起孵育,并在标准试验中孵育4天。然后取样品(50μl)并测定聚P的链长(例如参见:Lorenz B,Mammalian intestinal alkaline phosphatase acts as highly activeexopolyphosphatase.Biochim Biophys Acta 2001;1547:254-261)。用邻甲苯胺蓝给凝胶染色。
aCa-聚P-NP和视黄醇对细胞生长的影响
在第一系列实验中,针对aCa-聚P-NP测试了Na-聚P(与Ca2+络合)(图5)。可以看出,在72h孵育期间,如果与对照试验(不含聚P)相比,在采用Na-聚P的试验中活细胞浓度在1μg/ml至30μg/ml的浓度范围内没有显著变化。相比之下,如果添加aCa-聚P-NP代替,则在10μg/ml观察到活细胞浓度的显著增加,甚至在30μg/ml增加。
在0.3μM和30μM之间的浓度,以及在aCa-聚P-NP不存在的情况下,加入视黄醇没有显著改变MC3T3细胞的生长速率。然而,如果将纳米颗粒以3μg/ml的浓度加入到视黄醇处理的细胞中,则测量到强烈显著增加的增殖倾向(图6)。在该试验中,aCa-聚P-NP的浓度保持恒定的3μg/ml,而将0.3μg/ml至30μg/ml的视黄醇共同加入到细胞中(图6)。在浓度≥1μM的视黄醇中,与对照组(100%;不含视黄醇和加/减3μg/ml的aCa-聚P)相比,观察到在10μM下达到290%的增殖率的显著增加。这些发现意味着,视黄醇和aCa-聚P-NP对细胞增殖能力具有协同作用。
也可以在显微镜下进行这两个试验成分的协同作用效果。在没有任何成分存在的情况下,72h孵育后MC3T3细胞的密度仅为低。单独添加aCa-聚P-NP(3μg/ml),没有明显改变附着于底层的细胞密度。如果添加10μM视黄醇,在塑料表面上的细胞数量同样是低的。然而,如果将两种成分[3μg/ml的aCa-聚P-NP和10μM视黄醇]一起加入,则细胞形成(几乎)融合的细胞单层,支持aCa-聚P-NP和视黄醇的协同作用。
Ca-聚P纳米颗粒和Ca-聚P/视黄醇纳米球的形态和化学元素
Na-聚P颗粒显示砖石形态。构筑用砖块的尺寸>50x50x50μm。EDX光谱显示了(几乎)唯一针对O(氧)、Na(钠)和P(磷)的信号;只发现了对应于C(碳)的小峰。与Na-聚P颗粒的形态相反,aCa-聚P-NP是球体。计数150个颗粒后,纳米颗粒的平均尺寸(直径)为96±28nm。EDX光谱显示,除了O和P的元素之外,还有Ca(在3.7keV的Kα峰和在4.0keV的Kβ峰)。仅观察到Na的弱信号;相比之下,Na-聚P盐中的Na峰几乎与P峰一样高。
由aCa-聚P-NP和视黄醇产生的视黄醇/aCa-聚P-NS,类似于Ca-聚P纳米颗粒球状。然而,它们的尺寸明显更小,直径为45±29nm。在EDX谱中,很明显,对应于C且源于视黄醇的峰显著高于Ca-聚P纳米颗粒的光谱中的峰;在EDX信号中,C元素的高度甚至超过了O的高度。
在视黄醇/aCa-聚P-NS中视黄醇的存在
视黄醇在326nm和520nm(环己烷)处展现最大吸收和发射的荧光特性(Tanumihardjo SA,Howe JA.Twice the amount of α-carotene isolated from carrotsis as effective as β-carotene in maintaining the vitamin A status ofMongolian gerbils.J Nutr 2005;135:2622-2626)。反过来,可以通过荧光显微镜在470nm的激发和525nm的发射下鉴定视黄醇。图像显示,纳米球视黄醇/aCa-聚P-NS(图7C)显示出明亮的绿色荧光(图7D),而缺乏视黄醇的纳米颗粒aCa-聚P-NP(图7A)仅显示轻微的背景荧光(图7B)。
使用基于SbCl3的光谱学技术定量测定视黄醇。用氯仿/甲醇萃取具有100mg视黄醇/aCa-聚P-NS纳米球的悬浮液,并用分光光度法测定释放的视黄醇。应用这种方法,确定视黄醇/aCa-聚P-NS的视黄醇含量为23±7%(6个平行测定)。该图表明,视黄醇经历在以10%视黄醇-聚P起始比(每1克聚P中100mg视黄醇)形成的纳米球内的积聚。
在视黄醇/aCa-聚P-NS纳米球中聚P的敏感性
为了确定视黄醇/aCa-聚P-NS内的聚P是否容易被磷酸酶水解,在标准试验中将纳米球在PBS(图8A,泳道a-c)或在培养基/血清和细胞(图8B,泳道a-c)中孵育1至5d。然后取等分试样,并分析聚P聚合物的完整性。数据显示,在PBS中孵育的样品中30Pi单元的平均链长在5d的孵育期内没有变化(图8A,泳道a-c),而在视黄醇/aCa-聚P-NS内的聚P大小在1d后(图8B,泳道a)从30个单元逐渐降低至3天后的≈20单元(泳道b),甚至在5天后(泳道c)减少至1-3个单元。
在胶原蛋白表达中视黄醇与aCa-聚P-NP共同孵育
在不存在或存在视黄醇的情况下,将MC3T3-E1细胞与3μg/ml的aCa-聚P-NP一起孵育(图9)。孵育5d后,收集细胞并进行RT-qPCR分析。研究的目的是阐明aCa-聚P-NP是否调节I型、II型、III型和V型的不同纤维胶原蛋白基因的表达。不包括IV型基底胶原蛋白的表达,因为即使在与视黄醇一起孵育细胞后,MC3T3-E1细胞中的表达水平也低。
结果如图9所示。不同胶原蛋白基因的表达水平,以在暴露于单独的视黄醇或纳米颗粒或其组合的细胞中的水平和不与这些成分一起孵育的细胞中所测量的水平之间的比例给出。可以看出,如果两种成分视黄醇(1μM或3μM)和纳米颗粒(3μg/ml)是分别加入的,I型、II型、III型或V型胶原蛋白的表达水平仅在0.95倍和1.8倍之间略微变化。这些增加在统计学上不显著。然而,如果将视黄醇与3μg/ml的aCa-聚P-NP一起加入,则可以看到I型胶原蛋白的表达显著增加至III型胶原蛋白的水平;只有V型胶原蛋白的变化不显著。在MC3T3-E1细胞中不同胶原蛋白基因的诱导水平,所述细胞与3μg/ml aCa-聚P-NP和1μM视黄醇孵育的I型胶原蛋白为4.8倍,而与3μM视黄醇孵育的为9.4倍;与1μM视黄醇孵育的II型胶原蛋白为31.7倍,或与3μM视黄醇孵育的II型胶原蛋白为55.8倍;III型胶原蛋白为88.7倍(127.4倍)和V型胶原蛋白为1.3倍(2.1倍)。
视黄醇/aCa-聚P-NS纳米球对胶原蛋白表达的影响
在最后一系列实验中,将MC3T3-E1细胞暴露于不同浓度的含视黄醇的纳米球(视黄醇/aCa-聚P-NS)。表达水平在图10中以处理的细胞(0.3μg/ml至10μg/ml)中胶原蛋白稳态值与未处理的细胞中测定的值的比值给出。结果显示(图10),在浓度高于≥3μg/ml的视黄醇/aCa-聚P-NS时,I型胶原蛋白、II型胶原蛋白和III型胶原蛋白的表达水平显著高于在0.3μg/ml或1μg/ml测定的表达水平。
视黄醇与纳米颗粒和纳米球的比较基因激活作用
以比较的方式测试了3μM视黄醇对Na-聚P和对不同纳米颗粒以及对视黄醇/纳米球的影响。通过RT-qPCR测定III型胶原蛋白的表达水平(图11)。表达值与管家基因GAPDH的表达相关。在没有任何附加成分的情况下,III型胶原蛋白的表达水平为0.17±0.02,而在3μM视黄醇存在下,该表达水平显著增加至0.25±0.03。以磷酸盐单体形式以2:1的摩尔比化学计量地与Ca2+络合的Na-聚P导致0.28±0.04的稳态表达;视黄醇的添加没有显著改变0.20±0.03的水平。由Na-聚P和Ca2+以1:1的摩尔比形成的纳米颗粒aCa-聚P-NP1,在不存在视黄醇的情况下导致0.21±0.04的转录水平,而在存在视黄醇的情况下导致0.31±0.05的转录水平。然而,如果将视黄醇加入到aCa-聚P-NP中,则测定到表达从0.44±0.07增加至8.7±0.93。如果以20μM浓度共同加入网格蛋白介导的内吞作用抑制剂三氟丙嗪,则视黄醇诱导的III型胶原蛋白的表达降低至3.1±0.5。这里提到的是最近我们可以确立,在磷酸盐和Ca2+之间以1:1化学计量比制造的纳米颗粒具有边缘长度为≈4μm的砖块样形态,而aCa-聚P-NP纳米颗粒是具有<100nm尺寸的球状/球形。
细胞增殖-细胞活力试验
可以例如通过基于四唑鎓盐XTT(细胞增殖试剂盒II;Roche)的比色法测定细胞增殖。在650nm处测定吸光度,并从背景值(500nm)中减去。在实施例中描述的实验中,72h后测定活细胞。
鉴定视黄醇
用荧光光学显微镜在470nm的激发和525nm的发射下记录视黄醇的绿色荧光。可以使用比色测定法(Subramanyam GB,Parrish DB.Colorimetric reagents fordetermining vitamin A in feeds and foods.J Assoc Off Anal Chem 1976;59:1125-1130)进行纳米球中视黄醇的定量分析。将100mg视黄醇/aCa-聚P-NS的悬浮液与0.45ml氯仿/甲醇溶剂混合物(2:1;v/v)混合,并以4,200×g离心3分钟。然后将含有萃取的视黄醇的0.15ml等分的有机溶剂层转移到反应管中;逐滴加入1ml 20%SbCl 3溶液。最后,通过使用例如UV-VIS分光光度计Varian Cary 5G UV-Vis-NIR分光光度计立即在620nm处测量溶液的吸光度。
视黄醇/aCa-聚P-NS纳米球中聚P的酶降解
将50μg/ml的视黄醇/aCa-聚P-NS的悬浮液,溶解/悬浮在PBS[磷酸盐缓冲盐水]或在含有MC3T3-E1细胞的培养基/血清中,并在37℃孵育1d、3d或5d。最后取50μl的等分试样,保持在≈pH3,并测定聚P的链长度(例如,参见:Lorenz B,HC.Mammalianintestinal alkaline phosphatase acts as highly activeexopolyphosphatase.Biochim Biophys Acta 2001;1547:254-261)。可以用例如邻甲苯胺蓝给凝胶染色。
逆转录定量实时PCR分析
可应用逆转录定量实时聚合酶链反应(RT-qPCR)技术,来测定MC3T3-E1细胞中不同类型胶原蛋白的基因表达水平。在不存在或存在视黄醇、aCa-聚P-NP或视黄醇/aCa-聚P-NS的情况下,如实施例中所述的相应实验所示,将细胞在培养基/血清中孵育5天。然后收集细胞和将分离的RNA进行RT-qPCR。可以使用与各自的小鼠胶原蛋白类型匹配的以下引物对。I型胶原蛋白α1(Mus Col1a1;NM_007742)Fwd:5'-TACATCAGCCCGAACCCCAAG-3'(SEQ IDNO.5)[nt4003至nt4023],和Rev:5'-GGTGGACATTAGGCGCAGGAAG-3'(SEQ ID NO.6)[nt4146至nt4125;产品大小144bp];II型α2(Mus Col1a2;NM_007743)Fwd:5'-AACACCCCAGCGAAGAACTCATAC-3'(SEQ ID NO.7)[nt3789至nt3812],和Rev:5'-TTCCTTGGAGGACACCCCTTCTAC-3'(SEQ IDNO.8)[nt3908到nt3885;大小120bp];III型,α1(MusCol3a1;NM_009930)Fwd:5'-GCTGTTTCAACCACCCAATACAGG-3'(SEQ ID NO.9)[nt4764至nt4787],和Rev:5'-CTGGTGAATGAGTATGACCGTTGC-3'(SEQ IDNO.10)[nt4941到nt4918;大小178bp];IV型,α1(Mus Col4a1;NM_009931)Fwd:5'-AACGTCTGCAACTTCGCCTCC-3'(SEQ IDNO.11)[nt4752至nt4772],和Rev:5'-TGCTTCACAAACCGCACACC-3'(SEQ ID NO.12)[nt4886至nt4867;大小135bp];和V型α1(Mus Col5a1;NM_015734)Fwd:5'-AGTCCCTTCCTGAAGCCTGTCC-3'(SEQ ID NO.13)[nt7110至nt7131],和Rev:5'-GCACACACACAGAGATTAGCACC-3'(SEQ IDNO.14)[nt7265至nt7243;大小156bp]。作为参考基因,可以使用GAPDH[甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Mus GAPDH;NM_008084)Fwd:5'-TCACGGCAAATTCAACGGCAC-3'(SEQ ID NO.15)[nt200至nt220],和Rev:5'-AGACTCCACGACATACTCAGCAC-3'(SEQ ID NO.16)[nt338至nt316;大小139bp]。可以在例如iCycler(Bio-Rad)中使用各自的iCycler软件进行扩增。在确定Ct值之后,计算各个转录物的表达。
在实施例中,已经确定各胶原蛋白基因的表达水平,并且已经将细胞中未暴露于视黄醇或纳米颗粒/纳米球的细胞中的基因测定值设定为1。然后,已经计算并绘制了暴露于单独的视黄醇或纳米颗粒/纳米球或其组合的细胞中的表达水平之间的比值。
统计分析
可以使用配对Student t检验对结果进行统计学评估。
序列表
<110> 维尔纳·恩斯特·路德维格·格奥尔格·米勒
<120> 治疗用具有形态发生活性的含视黄醇的非晶形聚磷酸钙纳米颗粒
<130> M32732WO01
<150> GB1420363.2
<151> 2014-11-17
<150> GB1502116.5
<151> 2015-02-09
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
tgcagtacga gctgaacagg aaca 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
tccaccaaat gtgaagacgt ggga 24
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
ccgtctagaa aaacctgcc 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
gccaaattcg ttgtcatacc 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 小家鼠(MUS MUSCULUS)
<400> 5
TACATCAGCC CGAACCCCAA G 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 6
GGTGGACATT AGGCGCAGGA AG 22
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 7
AACACCCCAG CGAAGAACTC ATAC 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 8
TTCCTTGGAG GACACCCCTT CTAC 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 9
GCTGTTTCAA CCACCCAATA CAGG 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 10
CTGGTGAATG AGTATGACCG TTGC 24
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 11
AACGTCTGCA ACTTCGCCTC C 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 12
TGCTTCACAA ACCGCACACC 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 13
AGTCCCTTCC TGAAGCCTGT CC 22
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 14
GCACACACAC AGAGATTAGC ACC 23
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 15
TCACGGCAAA TTCAACGGCA C 21
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 16
AGACTCCACG ACATACTCAG CAC 23
Claims (27)
1.制备具有钙抗衡离子的固体的、可降解的非晶形聚磷酸盐材料的方法,其包括以下步骤:
i)将聚磷酸盐溶解在含水溶剂中,并将溶液的pH值调节至碱性值,
ii)向所述聚磷酸盐溶液中加入钙盐溶液,并将pH值调节至碱性值,
iii)任选地,用溶剂洗涤,和
iv)收集形成的颗粒,
其中在环境温度下进行步骤i)至步骤iii)中的所述方法,和
其中所述材料具有在0.8GPa和1.8GPa之间的弹性模量,并且具有形态发生活性。
2.用于制备可降解的非晶形类视黄醇/聚磷酸钙纳米球的方法,其包括权利要求1所述的方法,其中
a)在步骤i)中,将聚(乙二醇)聚合物或另一种润滑涂层材料共溶于所述含水溶剂中,
b)在步骤ii)中,将类视黄醇和钙盐溶解于有机溶剂中,和
c)收集形成的纳米球。
3.如权利要求2所述的方法,其中所述类视黄醇是视黄醇。
4.如权利要求1或2所述的方法,其中所述钙盐是氯化钙。
5.如权利要求1或2所述的方法,其中所述聚磷酸盐是聚磷酸钠。
6.如权利要求1或2所述的方法,其中所述聚磷酸盐的链长范围为3至1000个磷酸盐单元。
7.如权利要求1或2所述的方法,其中将pH调节至10。
8.如权利要求1或2所述的方法,其中所述聚磷酸钙材料是在氯化钙存在下由聚磷酸钠以磷酸根比钙为0.1至10的化学计量比形成的。
9.如权利要求1或2所述的方法,其中所述聚磷酸钙材料是通过将含有14g/L氯化钙或28g/L氯化钙的溶液加入到含有10g/L聚磷酸钠的溶液中获得的。
10.如权利要求1或2所述的方法,其中将乳化剂加入到聚磷酸盐溶液中以避免相分离。
11.如权利要求2所述的方法,其中所述类视黄醇/聚磷酸钙纳米球是通过将一份含有2g/L视黄醇和56g/L氯化钙的无水乙醇溶液加入到两份含有10g/L聚磷酸钠和20g/L聚(乙二醇)的水溶液中得到的。
12.如权利要求2所述的方法,其中所述类视黄醇/聚磷酸钙纳米球是以基本均匀的尺寸获得的,所述尺寸最适合通过网格蛋白介导的胞吞作用进行细胞摄取。
13.如权利要求1所述的方法,其还包括制备硬的非晶形的和具有形态发生活性的聚磷酸盐纳米颗粒和/或含有这种纳米颗粒的材料的步骤。
14.如权利要求1所述的方法,其中步骤i)中所述含水溶剂为水,和/或步骤iii)中所述溶剂为乙醇。
15.如权利要求6所述的方法,其中所述聚磷酸盐的链长范围为3至100个磷酸盐单元。
16.如权利要求6所述的方法,其中所述聚磷酸盐的链长范围为3至50个磷酸盐单元。
17.如权利要求8所述的方法,其中所述聚磷酸钙材料是在氯化钙存在下由聚磷酸钠以磷酸根比钙为1至2的化学计量比形成的。
18.如权利要求10所述的方法,其中所述乳化剂是聚(乙二醇)。
19.如权利要求12所述的方法,其中所述尺寸为直径45nm+/-5nm。
20.根据权利要求13所述的方法制备的纳米颗粒或含有这种纳米颗粒的材料,其用于骨再生和修复中以及用于牙科学中或用于药物递送中。
21.根据权利要求2或3所述的方法制备的可降解的非晶形类视黄醇/聚磷酸钙纳米球。
22.如权利要求21所述的非晶形类视黄醇/聚磷酸钙纳米球,其用于治疗或预防皮肤病学病况。
23.如权利要求22所述的非晶形类视黄醇/聚磷酸钙纳米球,其中所述皮肤病学病况为炎症性皮肤病、痤疮、增加的细胞更新的病症、皮肤癌和光老化。
24.如权利要求23所述的非晶形类视黄醇/聚磷酸钙纳米球,其中所述增加的细胞更新的病症为银屑病。
25.权利要求21所述的非晶形类视黄醇/聚磷酸钙纳米球在化妆组合物或治疗组合物中的用途。
26.权利要求21所述的非晶形类视黄醇/聚磷酸钙纳米球在化妆组合物或治疗组合物中作为霜剂或软膏中的成分的用途。
27.权利要求21所述的非晶形类视黄醇/聚磷酸钙纳米球作为药物递送剂在制备药物中的用途。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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