CN114642603B - 一种酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装及其制备方法和矿化应用 - Google Patents
一种酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装及其制备方法和矿化应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装及其制备方法和矿化应用,可用于I型胶原、脱矿牙本质和骨的矿化。本发明的酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装成分是分开放置的两部分,即包括含聚磷酸和/或聚磷酸酯、钙离子的试剂A和包含碱性水解酶的试剂B。本发明的酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装的制备时需要调节试剂A和试剂B的pH值为7‑10。本发明的酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装必须先后应用于胶原、牙本质和骨胶原基质。此方法制备的酶促磷酸钙仿生矿化试剂是一种稳定的矿化体系,试剂A中的无定形聚磷酸钙作为矿化源无需添加聚电解质等稳定剂,试剂B中的碱性磷酸酶组分可以调控胶原纤维内矿化,具有良好的生物相容性和应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物材料领域,具体涉及一种酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装及其制备方法和矿化应用。
背景技术
牙本质和骨组织均为矿化的I型胶原纤维分级组装成的有机无机复合体。龋病和骨缺损都是临床常见的硬组织缺损难题。仿生矿化是一种具有良好应用前景的硬组织修复手段。目前的仿生矿化体系大多基于模拟非胶原蛋白(non-collagenous proteins,NCPs)的聚电解质稳定无定形磷酸钙(amorphous calcium phosphate,ACP)诱导I型胶原纤维内矿化,但是由于ACP溶解度低、容易相变、矿化速度慢,极大程度地限制其应用。本申请人在专利CN110693724B中发明了先后使用高浓度的聚电解质钙和磷酸根处理胶原,依次将钙、磷矿化源运输进入胶原,实现了胶原和脱矿牙本质的快速矿化。这种矿化方法可以解决ACP矿化源的缺陷,但是需要先后提供矿化源,且仿生矿化程度难以调控。
目前认为碱性磷酸酶可以分解生物体内的焦磷酸和聚磷酸,在非胶原蛋白的作用下与钙离子形成无定形磷酸钙,用于生物矿化。所以,现有的生物矿化理论中均认为非胶原蛋白在生物矿化中发挥了重要的调控作用,忽略了碱性磷酸酶的作用。当聚磷酸和钙离子与碱性磷酸酶同时存在的时候,必须有非胶原蛋白或其类似物发挥稳定作用,而且其钙磷浓度仍保持在较低水平,矿化速度十分有限,碱性磷酸酶也仅仅起到分解聚磷酸提供磷酸根的作用,并不存在调控作用。
发明内容
本发明的目的在于避免无定形磷酸钙浓度低、矿化速度慢、易相变的缺点和克服矿化体系难以调控等问题,提供一种酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装材料及其制备方法和应用。
本发明提供了一种酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装材料,包括试剂A和试剂B;
所述的试剂A为包含聚磷酸和/或聚磷酸酯的钙盐溶液;所述聚磷酸为三偏磷酸钠、三聚磷酸钠、腺嘌呤核苷三磷酸、多聚磷酸钠(聚合度大于3)等中的一种或多种,聚磷酸酯为磷酸甘油酯、三聚氰胺多聚磷酸酯、聚乙二醇磷酸酯等一种或多种;所述的钙盐为氯化钙和/或其水合物、硝酸钙和/或其水合物、醋酸钙和/或其水合物等中的一种或多种;试剂A中形成的聚磷酸钙或聚磷酸酯钙盐是本发明中的钙磷矿化源。
所述的试剂B为磷酸水解酶溶液;所述磷酸水解酶为碱性磷酸酶,试剂B的溶剂为去离子水、PBS缓冲液、Hepes缓冲液或Tris缓冲液;磷酸水解酶可以分解试剂A中的聚磷酸钙和聚磷酸酯钙盐后释放磷酸根和钙离子。
所述的试剂A和试剂B的使用剂量体积比为0.1-10,优选为0.5-2;所述试剂A中的钙与磷(聚磷酸和/或聚磷酸酯的磷酸根、磷酸一氢根及磷酸二氢根)的总摩尔浓度比为0.1-10,优选为0.5-2;试剂A和试剂B必须分开储存,使用顺序必须为先用试剂A再用试剂B,不能将试剂A与试剂B混合后使用,将会失去本发明材料的矿化活性。
所述的酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装,其特征在于所述的试剂A中聚磷酸和/或聚磷酸酯含量为0.001-20g/L,优选为1-10g/L;钙离子浓度为0.2-5mol/L,优选为0.01-1mol/L。
所述的酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装,其特征在于所述的试剂B中,磷酸水解酶溶液中的碱性磷酸酶的浓度为0.1-100U/mL,优选为10-50U/mL。
所述的酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装,其特征在于所述的试剂A中的溶剂为去离子水、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液中的一种。
所述的酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装,其特征在于所述的试剂A和B的pH为7-10,优选为8-9。
本发明还提供了上述的酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装的制备方法,将配方量的钙盐与聚磷酸/聚磷酸酯溶于去离子水、PBS缓冲液、HEPES缓冲液或Tris缓冲液中,并调节pH值至7-10,反应得到试剂A;将配方量的碱性磷酸酶溶于去离子水、PBS缓冲液、HEPES缓冲液或Tris缓冲液中,并调节pH值至7-10,得到试剂B。试剂A和试剂B的剂量体积比为0.1-10,所述试剂A中的钙与磷的总浓度摩尔比为0.1-10;配制后试剂A和试剂B分开储存,使用时必须先使用试剂A,充分反应后再使用试剂B。
本发明还提供了一种所述的酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装的矿化方法,其包括以下步骤:
先用试剂A作用于I型胶原网、I型胶原凝胶、脱矿牙本质或骨胶原组织5分钟-1天,吸掉多余的试剂,然后将试剂A处理后的胶原组织用试剂B处理10分钟-1天,根据需要选择继续浸泡在模拟体液或人工唾液中继续孵育,根据选用不同的处理时间和试剂配方获得不同矿化程度的胶原和再矿化修复的牙本质或骨组织。
本发明还提供了一种所述酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装用于制备口腔护理产品的应用,产品形式可以表现为溶液、膏剂、凝胶等,先后将含有试剂A和试剂B成分的护理产品作用与牙齿表面,可应用于牙齿脱矿和龋病的预防,实现牙齿的仿生矿化,所述产品用途包括但不限于牙齿矿化、龋病预防以及口腔护理。
本发明相对于现有技术而言,具有以下有益效果:
本发明的酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装不同于现有的仿生矿化体系,不需要借助于无定形磷酸钙(ACP)矿化前驱体,也无需添加聚电解质等非胶原蛋白类似物来稳定ACP的活性。本发明通过试剂A的无定形聚磷酸钙作为矿化前驱体,可以为胶原提供稳定的钙磷矿化源,避免了ACP容易相变、难以储存以及矿化速率慢的缺点。值得强调的是,本发明中试剂A的无定形聚磷酸钙是进入胶原纤维内后,由试剂B调控分解后在胶原内形成磷酸钙晶体,并不是简单将聚磷酸钙作为磷源,在酶的作用下释放磷酸根,并在聚电解质的作用下与钙离子形成ACP后实现胶原矿化。所以,本发明提出的酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装中的试剂A和试剂B必须分开保存,并先后使用。
本发明的酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装通过试剂A为胶原提供了聚磷酸钙矿化源后,根据不同的需要使用试剂B对胶原内的聚磷酸钙进行分解,调控胶原的矿化速度和程度,这种酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装使胶原矿化变得更加精确和可控,同时聚磷酸钙相比ACP具有更好的生物相容性,在牙和骨修复中也具有广大的应用前景。
附图说明
图1为实施案例1方法制备的酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装的矿化胶原透射电镜图,比例尺:1μm;
图2为实施案例2方法制备的酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装的矿化胶原透射电镜图,比例尺:500nm。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下,均可进行相应组合。
实施案例1
称取1g的氯化钙、0.5g三偏磷酸钠,将氯化钙和三偏磷酸钠溶解在去离子水中,再搅拌充分反应后调节pH至7.4,获得试剂A。称取牛来源的非特异性碱性磷酸酶,溶解在Hepes缓冲液中,制备20U/mL的碱性磷酸酶溶液,调节pH至8.5,获得试剂B。然后通过使用试剂A处理鼠尾重组I型胶原浸泡1h,取出后浸泡在试剂B中1h,酒精梯度脱水干燥后通过透射电镜观察(图1),可见胶原内充满了大量的钙磷矿化源,且出现了明暗相间的条纹状结构,此时的胶原矿化程度较低,具有更好的矿化活性和可塑性。
实施案例2
称取5g的氯化钙、2g聚磷酸(分子量为8kDa),将氯化钙和聚磷酸溶解在Tris缓冲液中,再搅拌充分反应后调节pH至8.5,获得试剂A。称取牛来源的非特异性碱性磷酸酶,溶解在PBS缓冲液中,制备50U/mL的碱性磷酸酶溶液,调节pH至9,获得试剂B。然后通过使用试剂A处理鼠尾重组I型胶原浸泡2h,取出后浸泡在试剂B中12h,酒精梯度脱水干燥后通过透射电镜观察(图2),可见胶原明暗相间的条纹状结构变得模糊,但是可以看到胶原内出现大量的羟基磷灰石微晶颗粒,此时的胶原矿化程度较高,具有更强的机械性能。
实施案例3
称取0.5g的氯化钙、1g聚磷酸(分子量为3kDa),将氯化钙和聚磷酸钠溶解在Hepes缓冲液中,再搅拌充分反应后调节pH至9,获得试剂A。称取牛来源的非特异性碱性磷酸酶,溶解在PBS缓冲液中,制备5U/mL的碱性磷酸酶溶液,调节pH至9,获得试剂B。然后通过使用试剂A处理脱矿牙本质胶原浸泡1d,取出后浸泡在试剂B中3d,可以实现脱矿牙本质的再矿化修复。
以上所述的实施例只是本发明的两种较佳的方案,然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案,均落在本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装,其特征在于,包括试剂A和试剂B;
所述的试剂A为包含聚磷酸和/或聚磷酸酯的钙盐溶液;所述聚磷酸为三偏磷酸钠、三聚磷酸钠、腺嘌呤核苷三磷酸、多聚磷酸钠中的一种或多种,聚磷酸酯为磷酸甘油酯、三聚氰胺多聚磷酸酯、聚乙二醇磷酸酯中的一种或多种;所述的钙盐为氯化钙、硝酸钙、醋酸钙中的一种或多种;
所述的试剂B为磷酸水解酶溶液;所述磷酸水解酶为碱性磷酸酶,试剂B中的溶剂为去离子水、PBS缓冲液、Hepes缓冲液或Tris缓冲液中的一种;
所述的试剂A和试剂B的剂量体积比为0.1-10;试剂A和试剂B分开储存;所述的试剂A中,聚磷酸和/或聚磷酸酯含量为1-10g/L,钙离子浓度为0.01-1mol/L,聚磷酸和/或聚磷酸酯的磷酸根、磷酸一氢根及磷酸二氢根的总摩尔浓度与钙离子的摩尔浓度之比为0.5-2,试剂A和B的pH均为8-9;试剂B中,磷酸水解酶溶液中的碱性磷酸酶的浓度为0.1-100U/mL;
所述酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装的矿化方法包括以下步骤:
1)先用试剂A作用于I型胶原网、I型胶原凝胶、脱矿牙本质或骨胶原组织5分钟-1天;
2)然后将步骤1)处理后的产物置于试剂B中处理10分钟到1天,根据处理时间和处理试剂的配方即可获得不同矿化程度的胶原材料、牙齿或骨组织材料。
2.如权利要求1所述的酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装,其特征在于所述的试剂A中的溶剂为去离子水、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液中的一种。
3.一种如权利要求1所述的酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
将配方量的钙盐与聚磷酸/聚磷酸酯溶于去离子水、PBS缓冲液、HEPES缓冲液或Tris缓冲液中,并调节pH值至7-10,得到试剂A;将配方量的碱性磷酸酶溶于去离子水、PBS缓冲液、HEPES缓冲液或Tris缓冲液中,并调节pH值至7-10,得到试剂B。
4.一种如权利要求1所述的所述酶促磷酸钙仿生矿化试剂套装用于制备口腔护理产品的应用,其特征在于,所述产品包括:用于牙齿矿化、预防牙齿脱矿以及牙齿或牙周护理的口腔护理产品。
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