CN106999613B - 作为造影剂的抗坏血酸制剂和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了作为造影剂的抗坏血酸制剂和使用方法。适合用作MRI造影剂的无菌水性组合物包含100‑600 mM抗坏血酸；和100‑600 mM钠、葡甲胺或其组合。所述组合物优选地具有200‑1400 mOsm/L的摩尔渗透压浓度。

Description

作为造影剂的抗坏血酸制剂和使用方法
相关申请
本申请要求2015年9月30日提交的美国临时专利申请序号62/234,986；和2016年2月4日提交的序号62/291,138的权益，这两者的公开内容通过引用以其整体结合到本文中。
发明领域
本发明涉及用于胃肠外给予抗坏血酸的组合物和其放射学用途。
发明背景
磁共振成像(MRI)以高空间分辨率产生人解剖学和病理学的细腻描述。为了增加MRI的诊断灵敏性和特异性，例如对于癌症、感染、神经学和心血管疾病的成像，在成像之前和/或期间经常静脉内给予造影剂以改进信号。
最常见的MRI造影剂基于含有顺磁金属钆(Gd)的分子络合物。Gd是仅以组合(盐)形式天然存在的重金属。在水溶性盐中其是高度毒性的，但螯合的Gd的毒性减少。在美国，食品和药品管理局(FDA)批准的所有九种MRI造影剂均是基于Gd的。Gd具有强"顺磁性"，其导致T1-加权的图像上MRI信号的局部增加。然而，基于Gd的造影剂可导致罕见但严重虚弱的病况，称为肾原性系统纤维化(NSF)，其为涉及皮肤、关节、眼睛和内部器官的广泛纤维化的综合征。世界卫生组织和FDA已经公布了在患有肾机能不全/衰竭的患者中对使用这些Gd试剂的限制，其中FDA要求在所有市售的含Gd造影介质上的"黑箱"警告。结果，在美国数百万患者，和世界范围内的更多患者，不再能够接受用于MRI的造影材料，严重限制了数种疾病的检测和表征。另外，在2015年，FDA公布了药物安全性信息，指示该管理局正在研究在重复使用用于MRI的基于Gd的造影剂后脑沉积的风险，这是由于最近在人和动物中的研究证实，Gd可保留在脑中，甚至在具有正常肾功能的个体中。
较少见地作为调查研究或“无标签(off-label)”使用的其它顺磁络合物，通常基于作为静脉内铁代替疗法开发和上市的大的氧化铁基纳米颗粒(例如，FERAHEME®(ferumoxytol)注射液)。然而，因为它们大的分子尺寸(这限制这些试剂在受试者的血库中直至它们最终被网状内皮系统(即，巨噬细胞、肝、脾)清除)，这些络合物用于MRI受到限制。
Van Zijl等的美国专利申请公开2014/0154185论述了使用胃肠外葡萄糖增强MRI。亦参见Yadav NN, Xu J, Bar-Shir A, Qin Q, Chan KW, Grgac K, Li W, McMahonMT, van Zijl PC, Natural D-glucose as a biodegradable MRI contrast agent fordetecting cancer. Magn Reson Med. 2012 Dec;68(6):1764-73; Yadav NN, Xu J,Bar-Shir A, Qin Q, Chan KW, Grgac K, Li W, McMahon MT, van Zijl PC, NaturalD-glucose as a biodegradable MRI relaxation agent. Magn Reson Med. 2014 Sept;72(3):823-28。
仍需要可用于MRI扫描技术的备选/另外的造影剂组合物。
发明概述
本文提供了可用于进行磁共振成像(MRI)的组合物，其包含抗坏血酸(维生素C)作为造影剂，用于在人和非人组织中检测和表征灌注、代谢和氧化应激，而不需要放射性或化学标记。
在一些实施方案中，提供无菌水性组合物，其可适合用作MRI造影剂，所述组合物包含：100-600 mM抗坏血酸；和100-600 mM钠、葡甲胺或其组合(例如，作为抗坏血酸葡甲胺、抗坏血酸钠或其组合提供) (例如，100-300 mM抗坏血酸) (例如，其中所述组合物包含摩尔或毫摩尔(mM)比为从10:90、20:80、30:70或40:60直至90:10、80:20、70:30或60:40(抗坏血酸葡甲胺 : 抗坏血酸钠)的抗坏血酸葡甲胺和抗坏血酸钠)。
在一些实施方案中，组合物具有200-1400 mOsm/L (例如，200-1200 mOsm/L)的摩尔渗透压浓度。
在一些实施方案中，组合物进一步包含碳酸盐和/或磷酸盐。
在一些实施方案中，组合物进一步包含还原糖和/或非还原糖。
在一些实施方案中，组合物进一步包含稳定剂(例如，螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA))。
在一些实施方案中，以单位剂型提供组合物。
还提供了粉末组合物，包含：抗坏血酸；钠、葡甲胺或其组合(例如，抗坏血酸钠、抗坏血酸葡甲胺或其组合)；任选地，碳酸盐和/或磷酸盐；和任选地，还原糖或非还原糖。在一些实施方案中，组合物呈单位剂型。在一些实施方案中，粉末组合物，在加入无菌液体载体(例如，水、生理盐水、乳酸盐Ringers或适合于胃肠外药物递送的其它水性溶媒)时，适合用于增强受试者的身体或身体区域例如器官或器官区域的磁共振成像(MRI)图像。
在胃肠外给予时，在其中吸收抗坏血酸和/或抗坏血酸通过的组织和/或流体中检测时间依赖性磁共振(MR)信号变化。这些MRI信号变化可使用基于常规自旋回波或梯度回波的T2-加权的MRI序列检测，和可用T2映射定量。对自旋-自旋弛豫敏感的其它较不常见的采集技术也可用于编码MR信号。
本文还提供了增强受试者的身体或身体区域例如器官或器官区域的MRI图像的方法，所述方法包括以MRI图像增强量胃肠外给予(例如，静脉内、腹膜内、动脉内、骨内或鞘内给予)所述受试者胃肠外抗坏血酸制剂；和然后通过受试者的MRI产生所述身体或身体区域的图像，从而抗坏血酸或其药学上可接受的盐增强MRI图像。
在一些实施方案中，MRI图像在胃肠外给予胃肠外抗坏血酸制剂期间，或其后至多5、10、30、40、60、90或120分钟，或其后至多1、2、3或4小时产生。
还提供了如本文所教导的抗坏血酸制剂用于进行如本文所教导的方法，或用于制备进行如本文所教导的方法的药物或成像剂的用途。
在本文的附图和下文所示的说明书中更详细地解释本发明。本文引用的所有美国专利参考文献的公开内容通过引用以其整体结合到本文中。
附图简述
图1. 抗坏血酸和抗坏血酸基团的歧化。A, 抗坏血酸是一种二酸，然而在生理pH7.4时，99%的抗坏血酸作为其单价阴离子(AscH-)存在。抗坏血酸基团(Asc.-)在平衡时(而且在低得多的浓度下)以抗坏血酸的氧化和还原形式存在。B, Asc.-的歧化是其主要的转化途径，其中速率常数(k obs)落入NMR时间量程的"中间"质子交换速率内。在存在质子交换催化剂例如磷酸盐的情况下该速率常数可增加10倍(Bors W, Buettner GR. (1997) TheVitamin C radical and its reactions in Vitamin C in Health and Disease, L.Packer和J. Fuchs编辑, Marcel Dekker, Inc., New York,第4章, 第75-94页)。
图2. 糖、糖醇和抗坏血酸的T2弛豫性(r2 = mM-1sec-1)。比较包括单糖和二糖两者。如文中所述，注意在较高浓度下减少对比效果，认为其续发于类似部分的自缔合和质子交换减少。
图3. 抗坏血酸自旋-自旋弛豫(T2-加权的)MRI对比的体外("仿体(phantom)")实验。A, 显示在抗坏血酸浓度逐渐增加的5个仿体中的定量T2映射。与常规快速自旋回波(FSE)采集的对照(磷酸盐缓冲盐水)相比，低至1-5 mM见到统计学显著的"负T2对比"(信号丢失)。因此，在高吸收组织中药理学剂量的抗坏血酸后(例如，肿瘤和脑，10-30 mM)，灵敏性在预期组织/细胞浓度的较低端。该结果也未考虑来自组织氧化底物或生理交换催化剂的任何协同效果。B, 显示H2O2对抗坏血酸T2增强的协同效果。H2O2，其在胃肠外抗坏血酸后在脑和肿瘤中体内升高至100-200微摩尔，对来自抗坏血酸的T2对比效果产生显著的协同作用。如所示，在30 min内在仿体中，该协同效果随时间缓慢减少，但在体内持续，只要在抗坏血酸给予后产生H2O2。C, 证实了pH对抗坏血酸的T2效果的影响，其在中性/生理pH (7.0-7.4)达到最大。该结果与关于在平衡时以其基团形式和氧化形式的抗坏血酸歧化作用(disproportionation)的速率动力学的现有研究一致(图1)。D, 显示当抗坏血酸与葡甲胺(N-甲基-D-葡糖胺)成盐(盐化)时显著的协同效果，葡甲胺为山梨糖醇(sorbital)的胺糖衍生物，山梨糖醇通常用作数种FDA-批准的药物和造影制剂的赋形剂。
图4. 抗坏血酸作为Na或葡甲胺盐的比较。用生理浓度的PO4 (2 mM )和HCO3 - (25mM)缓冲液制备溶液。
图5. 抗坏血酸钠+ 生理交换催化剂。各溶液在去离子水中设定为中性(pH =7.0)。生理交换催化剂的浓度与体内在血清和细胞外空间中的相同：PO4 = 2 mM，葡萄糖 =5 mM，和HCO3 -为25 mM。
图6. 在抗坏血酸钠/葡甲胺和葡萄糖之间的交换协同作用。溶液在生理缓冲液PO4 (2 mM)和HCO3 - (25 mM)的情况下进行比较，所述生理缓冲液还作为交换催化剂。
图7. Na Asc/葡甲胺与糖醇、单糖和二糖的交换协同作用。在2 mM PO4和25 mMHCO3 -的共存下制备所有溶液。
图8. 对于Na Asc/葡甲胺与糖醇、单糖和二糖的交换协同作用，在没有对照的情况下重标数据。所有溶液用2 mM PO4和25 mM HCO3 -制备。
图9. 在高剂量胃肠外抗坏血酸(2g/kg, 右IJ iv注射)后体内抗坏血酸T2对比变化。A, 显示通过正常C57黑小鼠的中脑的常规单切片轴FSE T2WI图像，和右侧的两个图像证实在抗坏血酸静脉内给予期间和之后对比变化的“第一遍(first pass)”提取。在抗坏血酸给予后立即，和其之后10分钟，获得在脑组织中的T2信号，然后从在抗坏血酸给予之前获得的T2脑信号中减去。因为抗坏血酸产生信号强度降低，从投配前扫描的较高信号减去导致通过脑组织的流通灌注(血流)的净正“映射”。在10分钟时，灌注效果已几乎消退(resolved)，和开始观察到与组织吸收相关的早期信号强度变化。B, 显示由于组织吸收高剂量抗坏血酸导致的信号变化。信号强度的颜色封泥(color-lute)映射未从投配前扫描中减去，因此显示T2信号随时间的预期降低，在正常C57小鼠中在30-60 min之间达到最大。
图10. 在新皮质扩散性抑制(SD)的啮齿动物模型中的抗坏血酸T2增强。在图示的实验中，下排图像显示用在高浓度的氯化钾(KCl)中浸湿的明胶海绵(红色箭头)的微型颅骨切除术，所述明胶海绵局部扩散至附近的顶叶皮层。颅骨切除术部位是前囱后1 mm，前囱是代表下面大脑后的三分之一的颅骨界标。上两排表示在啮齿动物脑中在前囱前3和4 mm(即是说远离SD诱导部位)的T2图像和信号变化的定量颜色封泥T2映射。前切片的T2信号变化显示与左侧相比，在右侧大脑皮层中清楚的T2不对称性(再次，SD仍被限制在右半球)。这些显著的皮层信号变化与SD发生的已知代谢增进活性一致，如用18F-FDG PET，以及用直接微量渗析和代谢组学测定也观察到的。注意到，在颅骨切除术部位本身下直接观察到相反的观察结果(病灶T2信号增加) (第三排)，这与在KCl灌注部位的局部浮肿(游离水增加)一致。
图11A-11B. 用胃肠外抗坏血酸的灌注和存活性心脏成像。图11A描述对于在7T下大鼠心脏成像的两个主要的成像面，冠和轴。图11B显示初始推注静脉内注射的抗坏血酸的整个左心室的T2信号强度的短暂降低。
图12. 静脉内给予三种不同的抗坏血酸制剂后豚鼠中的T2对比变化。图12A, 60min缓慢灌注抗坏血酸之前和之后的快速自旋回波(FSE) T2图像显示整个脑实质中明显的信号强度差异。图12B-C显示和C, 显示在给予三种不同的抗坏血酸制剂后，对于豚鼠大脑皮层(Cx)和基底神经节(BG)两者的标准化信号强度变化和定量的弛豫性测量。
优选实施方案的详细描述
现在参考附图，在下文中更全面地描述本发明，附图中显示了本发明的实施方案。然而，本发明可以不同的形式体现，和不应解释为限制本文所示的实施方案；而是，提供这些实施方案，使得本公开内容是全面和完整的，和将向本领域技术人员充分传递本发明的范围。
如本文所用的，单数形式"一个/种"和"该"意图也包括复数形式，除非上下文另外明确表示。应进一步理解，术语"包含"或"包括"规定存在所述的特征、整数、步骤、操作、要素、组分和/或组别或其组合，但不排除存在或加入一个或多个其它特征、整数、步骤、操作、要素、组分和/或组别或其组合。
如本文所用的，术语"和/或"包括任何和所有可能的组合，或相关的所列项的一项或多项，以及当以可选方案("或")解释时，缺少组合。
除非另外限定，本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。应进一步理解，术语，例如通常使用的字典中限定的那些，应解释为具有与它们在说明书和权利要求书的上下文中的含义一致的含义，和不应以理想化或过度形式的意义解释，除非本文明确如此限定。
抗坏血酸。抗坏血酸("抗坏血酸"、"L-抗坏血酸"或"维生素C")是天然存在的有机化合物和必需营养素，具有作为抗氧化剂和在至少8种酶促反应中的辅助因子的重要性质，所述酶促反应包括几种胶原合成反应，当其功能异常时，导致最显著的坏血病症状。大部分哺乳动物在肝中合成抗坏血酸，其中酶L-古洛糖酸内酯氧化酶将葡萄糖转化为抗坏血酸。然而，在人、高等灵长类、豚鼠和大部分蝙蝠中，突变导致低或缺少的L-古洛糖酸内酯氧化酶表达，使得抗坏血酸必须在饮食中补充(Lachapelle, M. Y.; Drouin, G. (2010). "Inactivation dates of the human and guinea pig vitamin C genes". Genetica139(2): 199–207)。在所有动物种类中，L-抗坏血酸/抗坏血酸是最丰富的细胞内抗氧化剂，在肿瘤、脑细胞和一些其它组织中其细胞内浓度能够达到10-30 mM。积聚超过100倍血浆中维生素C水平的那些组织包括肾上腺、脑垂体、胸腺、黄体和视网膜。具有10-50倍浓度的那些包括脑、脾、肺、睾丸、淋巴结、肝、甲状腺、小肠粘膜、白细胞、胰腺、肾和唾液腺(Hediger MA(May 2002). "New view at C". Nat. Med.8 (5): 445–6)。
饮食过量的维生素C不被吸收，和血液中的过量维生素C被快速排泄在尿中。维生素C显示显著低的毒性，在大鼠中公认的LD50为约11.9克/千克体重。这样的剂量(体重的1.2%，或对于70 kg人而言为0.84 kg)的死亡机制是未知的，但可能是机械性的，而非化学性的("Safety (MSDS) data for ascorbic acid". Oxford University. October 9,2005. Retrieved February 21, 2007)。鉴于缺少任何意外或有意的中毒死亡数据，在人中的LD50是不确定的。因此，大鼠LD50用作人毒性的指导。
在生理pH下，99%的抗坏血酸作为单价阴离子存在(图1A)。维生素C的化学性质，和因此成像性质，受该部分支配。作为供体抗氧化剂，单价阴离子提供氢原子(H.或H++ e-)至氧化基团，以产生共振稳定的三羰基抗坏血酸自由基Asc.- (图1B)。回到还原或氧化抗坏血酸的Asc.-的歧化反应(图1C)是主要体外清除途径。该过程在体内通过有助于抗坏血酸再循环的酶进行补充(May JM, Qu ZC, Neel DR, Li X (May 2003). "Recycling of vitaminC from its oxidized forms by human endothelial cells". Biochim. Biophys. Acta1640 (2–3): 153–61)。该基团歧化为抗坏血酸或脱氢抗坏血酸通过丢失或获得氢发生，所述氢作为电子载体或较常规的阳离子。此外，抗坏血酸基团歧化的速率常数为105-106M-1s-1，使得伴随歧化的氢交换也以相同速率发生。在NMR时间量程上，这些"中间"交换速率对于改变1H自旋-自旋弛豫是最佳的。
抗坏血酸的胃肠外制剂。用于胃肠外给予的抗坏血酸可在药学上可接受的载体中(例如，无菌水、无内毒素水或无热原水；无菌、无热毒素或无热原的盐水等)作为适合胃肠外给予的制剂提供。如本文所用的术语"药学上可接受的"意指根据疾病的严重性和治疗的必要性，化合物或组合物适合给予受试者以实现本文所述的治疗，没有过度有害副作用。
制剂可在单位剂量或多剂量容器中提供，例如密封的安瓿和小瓶，和可在干燥的/粉末的/冷冻干燥(冻干)条件下贮存，仅需要在临用前加入无菌液体载体，例如盐水或注射用水。临时的注射溶液和悬浮液可自无菌粉末、颗粒剂和片剂制备。例如在本发明的一个方面，提供在密封容器中的单位剂型的包含抗坏血酸的可注射的、稳定的无菌组合物。抗坏血酸可以冻干物的形式提供，其能够用合适的药学上可接受的载体重组，以形成适合用于将其注射至受试者的液体组合物。
合适的制剂的实例包括但不限于，抗坏血酸在注射用水中的无菌水溶液，含有10、20、30、40,或50至80、90、100、150或200 mg/mL抗坏血酸或其盐(例如，钠盐、葡甲胺(N-甲基-D-葡糖胺)盐、其组合等)。在一些实施方案中，制剂可包括10、20、30、40、50、60、70、80、90或100 mM，至150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750或800 mM抗坏血酸或其盐(例如，钠盐、葡甲胺(N-甲基-D-葡糖胺)盐，其组合等)。例如，制剂可包括100-700 mM，或200-650 mM，或300-600 mM，或400-550 mM抗坏血酸或其盐。抗坏血酸浓度可按需要调节，取决于给予途径(例如，静脉内给予对比直接给予至局部的身体区域或区室)。
在一些实施方案中，pH调节至大约7 (例如，6.5-7.5的pH) (例如，用碳酸氢钠和/或氢氧化钠)。
适合胃肠外给予的制剂可包括稳定剂。示例性的稳定剂包括螯合剂，例如EDTA(例如，EDTA二钠)。制剂还可包括pH缓冲液，例如碳酸氢盐(HCO3 -)和/或磷酸盐(PO4)。
根据一些实施方案的制剂可包括糖，例如还原糖或非还原糖。"还原糖"是开链的糖，具有游离的醛基或游离的酮基，其包括所有单糖和一些二糖、寡糖和多糖。示例性的还原糖包括但不限于，葡萄糖、半乳糖、甘油醛、果糖、核糖、木糖、乳糖、麦芽糖等。"非还原糖"是没有游离的醛基或游离的酮基的糖。示例性的非还原糖糖包括但不限于蔗糖、海藻糖等。
可用于如本文所教导的抗坏血酸制剂的自旋-自旋交换催化剂可包括但不限于，葡甲胺(N-甲基-D-葡糖胺)、还原糖(例如，葡萄糖、半乳糖、甘油醛、果糖、核糖、木糖、乳糖、麦芽糖、其组合等)和非还原糖(例如，蔗糖、海藻糖、其组合等)。
适合胃肠外给予的制剂可具有范围为200-1200或1400 mOsm/L的摩尔渗透压浓度。在一些实施方案中，制剂具有从200、300、400、500或600至700、800、900、1000、1100、1200、1300或1400 mOsm/L的摩尔渗透压浓度。
在一些实施方案中，制剂适合注射至动脉或静脉，和/或身体区域，例如器官或器官区域。在一些实施方案中，制剂适合静脉内灌注。在一些实施方案中，制剂适合动脉内灌注。在一些实施方案中，制剂适合鞘内灌注。
在一些实施方案中，制剂是去氧的。水性组合物的去氧的方法是已知的，例如，在惰性气体例如氮气下或用其净化，制备制剂。参见例如，Bodemann的美国专利申请公开2014/0048290。
在一些实施方案中，制剂作为干燥的/粉末的/冻干的抗坏血酸葡甲胺、抗坏血酸钠或这些盐的组合的组合物提供，含或不含交换催化剂、螯合剂等，其可在护理点正好在给予前在无菌水性介质(例如，水、生理盐水、乳酸盐Ringers或用于胃肠外药物递送的其它可接受的水性溶媒)中重组。合适的干燥制剂可包括但不限于5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100克抗坏血酸或其盐。
在一些实施方案中，制剂在适合光敏感液体组合物的容器中提供，例如不透明的塑料或玻璃容器(例如，高密度聚乙烯容器、涂覆有黑色聚氯乙烯的塑料或玻璃容器等)、琥珀色玻璃等。参见例如，Wang等的美国专利号8,309,191；Miyake等的美国专利申请公开2004/0048206。
在一些实施方案中，制剂以适合胃肠外给予用于MRI成像的单位剂型提供。作为非限制性实例，适合静脉内给予的单位剂型可以是：1) 0.25 g/min，至多60 min，至多15克；2) 0.5 g/min，至多60 min，至多30克；3) 1.0 g/min，至多60 min，至多60克；或4) 1.5 g/min，至多60 min，至多90克。
使用方法。如上所述，如本文所教导的胃肠外抗坏血酸组合物可用于磁共振成像(MRI)，以提供用于在人和非人组织中检测和表征灌注、代谢和/或氧化应激的造影剂，不需要放射性或化学标记。
抗坏血酸，特别是在自旋-自旋交换催化剂(例如，简单糖、糖醇或氨基酸)的存在下并与其共配制，是一种安全和可生物降解的MRI造影剂，其不需要使用基于金属(例如，钆或铁)的造影材料，也不需要电离辐射。该技术能够评估组织灌注以及高分辨率分子表征组织存活性和代谢，这类似于18F-FDG PET。后者可以通过吸收18F-FDG的相同葡萄糖运输机制(即，GLUT 1和3转运体)，借助抗坏血酸的吸收(通过脱氢抗坏血酸)进入细胞(Rumsey SC,Kwon O, Xu GW, Burant CF, Simpson I, Levine M (July 1997). "Glucosetransporter isoforms GLUT1 and GLUT3 transport dehydroascorbic acid". J. Biol. Chem.272 (30): 18982–9)。
如本文所用的"胃肠外给予"包括，但不限于，静脉内、皮下、肌内、腹膜内、动脉内、骨内、鞘内或心室内给予，例如，通过注射或灌注。作为非限制性实例，在静脉内(i.v.)途径对于受试者而言是困难(例如，低血压)的情况下，可使用腹膜内或其它胃肠外给予，或该给予途径另外可产生合适的MRI图像。
在一些实施方案中，在胃肠外给予抗坏血酸组合物期间，或其后至多5、10、30、40、60、90或120分钟，或其后至多1、2、3或4小时，进行MRI。
为诊断、治疗、研究或兽医目的，自本发明受益的受试者通常是哺乳动物受试者两者，包括人受试者和动物受试者(例如，狗、猫、兔、牛、马等)。受试者可以是雄性或雌性的，和可以是任何年龄，包括新生儿、婴儿、少年、青年、成年和老年受试者。
MRI是已知的，和可通过市售可得的设备，和通过本领域已知的技术进行。参见例如，S. Bushong和G. Clarke, Magnetic Resonance Imaging: Physical and Biological Principles(Mosby, 第4版. 2014)。在一些实施方案中，MRI是灌注(例如，血流)成像。在一些实施方案中，MRI是代谢成像。代谢成像可用作类似于18F FDG PET的诊断生物标记，包括但不限于，证实代谢增进或代谢减退的肿瘤或功能异常的组织的鉴定/表征。
如本文所教导的，可用MRI成像的"身体或身体区域"包括受试者的身体或身体的任何区域，例如器官或器官系统、软组织、骨等，或其任何部分。身体区域的实例包括但不限于，头、颈、胸、腹、骨盆、肢、肌肉、脂肪、其它软组织、骨等。器官的实例包括但不限于，肾上腺、脑垂体、胸腺、黄体、视网膜、脑、脾、肺、睾丸、淋巴结、肝、甲状腺、小肠粘膜、白细胞、胰腺、肾、唾液腺组织、心脏等。
如本文所用的，"增强"MRI图像包括通过增强在MRI信号中结构、组织或流体的对比，促进MRI显像。
"MRI造影剂"是在MRI扫描期间可增强身体内的结构、组织或流体的对比的物质。实例包括但不限于，顺磁造影剂，例如含Gd的试剂或锰螯合剂，和超顺磁试剂，例如铁铂颗粒。亦参见Axelsson等的美国专利申请公开号2014/0350193；和Lin等的2014/0234210。
抗坏血酸MRI的可能应用包括若干临床情况，其中当前的医疗实践经常使用PET扫描，但其中使用作为备选扫描技术的MRI的方法的改进将可能得到进一步的临床益处。这些情况包括用于癌症、神经学疾病(例如，痴呆、TBI和癫痫)和心血管成像的诊断研究。使用Tc99m-标记的试剂(例如，Tc-99m sestimibi或"Cardiolite")的心脏研究代表了一种特别值得注意的诊断应用，鉴于Tc-99m供应的计划收缩而需要备选方法。用Tc-99m-相关试剂的心肌灌注和存活性成像是一种必需和广泛进行的程序，迄今尚未开发经济可行的方案来代替这些Tc-99m-依赖性试剂。
造影介质的MR成像和临床应用。临床磁共振成像(MRI)通过从组织中的水和大分子获得质子(1H)核磁共振(NMR)信号，产生身体的高分辨率图像。对于"T1-加权的" MR图像，信号强度在其中纵向弛豫率(自旋晶格弛豫率，1/T1)增加的区域中增加。以"T2-加权的"MRI，当横向弛豫率(自旋-自旋弛豫率，1/T2)增加时，信号强度减少。事实上在所有临床MRI研究中，常规地获得T1和T2加权的图像二者。
在MRI中常规给予静脉内造影剂以进一步增加1/T1或1/T2，试图更好地描绘患病组织与正常组织，改进解剖学清晰度(definition)，和增强生理或病理功能的表征。几乎所有目前批准的MRI造影剂基于镧系元素金属钆(Gd)的螯合剂，其中较小亚组的血管造影和灌注研究使用无标签的氧化铁材料(例如，Feraheme)在患有肾机能不全/衰竭的患者中进行。最通常使用市售的基于Gd的材料以增加疾病组织的1/T1，其中造影材料倾向于积聚。
对于用MRI进行组织灌注测定，可使用基于Gd的试剂或氧化铁纳米颗粒，其中采集策略基于1/T1或1/T2对比，尽管越来越偏爱1/T2对比方法。灌注成像目前在临床上用于表征肿瘤侵袭性、肿瘤对疗法的反应，和在心脏、脑和其它器官中的组织存活性。
不希望受理论的束缚，在没有顺磁性的情况下抗坏血酸信号变化的机制，其也称为"T2-加权的对比"，基于水质子(1H)自旋-自旋弛豫率1/T2 (或倒数地，自旋-自旋弛豫时间，T2)的增强，因为溶剂水质子与在抗坏血酸分子上的羟基质子交换。质子交换对T2对比的影响通过在生理pH下抗坏血酸基团的歧化反应被进一步放大。抗坏血酸氧化和抗坏血酸基团歧化继而受氧化底物例如过氧化氢(H2O2)和/或氢("质子")交换催化剂的共存驱动。
抗坏血酸运输和排泄。抗坏血酸在体内通过主动运输和简单扩散二者被吸收。两种主要的主动运输途径是抗坏血酸钠协同转运体(SVCT)和己糖转运体(GLUT)。SVCT1和SVCT2跨质膜输入还原形式的抗坏血酸(Savini I, Rossi A, Pierro C, Avigliano L,Catani MV (April 2008). "SVCT1和SVCT2: key proteins for vitamin C uptake".Amino Acids 34 (3): 347–55)，而GLUT1和GLUT3葡萄糖运载体传递氧化形式，脱氢抗坏血酸(Rumsey SC, Kwon O, Xu GW, Burant CF, Simpson I, Levine M (July 1997). "Glucose transporter isoforms GLUT1 and GLUT3 transport dehydroascorbic acid".J. Biol. Chem.272 (30): 18982–9)。尽管脱氢抗坏血酸浓度在正常条件下在血浆中低，但与还原形式经过SVCT相比，氧化的分子以更高的多的速率经过GLUT1和GLUT3被吸收。当抗坏血酸浓度在药理学上升高时，脱氢抗坏血酸浓度也增加，在GLUT运载体以高拷贝存在于例如脑(和血脑屏障)和肿瘤细胞中的情况下使显著吸收成为可能。一旦运输，脱氢抗坏血酸被快速还原回到抗坏血酸。
超过肾再吸收阈值的抗坏血酸浓度自由进入尿中，和以约30分钟的半衰期排泄。在高饮食剂量下(在人中对应于数百mg/天)，肾再吸收阈值在男性中是1.5 mg/dL和在女性中是1.3 mg/dL(Oreopoulos DG, Lindeman RD, VanderJagt DJ, Tzamaloukas AH,Bhagavan HN, Garry PJ (October 1993). "Renal excretion of ascorbic acid:effect of age and sex". J Am Coll Nutr12 (5): 537–42)。不直接排泄在尿中或被其它身体代谢破坏的抗坏血酸被L-抗坏血酸氧化酶氧化和除去。
认为抗坏血酸具有类似于万古霉素的药代动力学特征。口服抗坏血酸的生物分布在严密控制下，血浆浓度很少超过200μM，甚至口服剂量超过100倍的建议每日容许量时(Levine M, Conry-Cantilena C, Wang Y, Welch RW, Washko PW, Dhariwal KR, ParkJB, Lazarev A, Graumlich JF, King J, Cantilena LR (April 1996). "Vitamin Cpharmacokinetics in healthy volunteers: evidence for a recommended dietaryallowance". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.93 (8): 3704–9)。然而，抗坏血酸静脉内给予绕过这些严密控制系统，可实现10 mM或更高的血浆浓度。高于10 mM的血浆浓度在人中安全持续至多4小时，具有显著低的毒性(Hoffer LJ., Levine M., Assouline S.,Melnychuk D., Padayatty SJ., Rosadiuk K., Rousseau C., Robitaille L.,和MillerWH., Jr., Phase I clinical trial of i.v. ascorbic acid in advancedmalignancy. Ann Oncol 19: 1969–1974, 2008)。
在以下非限制性实施例中更详细地解释本发明。
体外实施例
自旋-自旋弛豫率1/T2的抗坏血酸增强
之前的研究报道了自主体水质子与低分子量溶质和大分子的可移动质子(例如，-NH2, -OH, -SH, -NH)的交换产生的T2-加权的NMR/MRI对比影响。来自这种质子交换的1/T2的对比影响描述如下：
Figure 900845DEST_PATH_IMAGE001
主体水与a有关和可交换质子(例如，来自抗坏血酸OH基团)与b有关。fCR是具有5个参数的封闭函数，自Carver和Richards推导，和由Hill等精修(Carver, J. P.; Richards,R. E. J. General 2-Site Solution For Chemical Exchange Produced Dependence OfT2 Upon Carr-Purcell Pulse Separation J. Magn. Reson. 1972, 6, 89– 105;Hills, B. P.; Wright, K. M.; Belton, P. S. N.M.R. studies of water protonrelaxation in Sephadex bead suspensions Mol. Phys. 1989, 67, 1309–1326)。对于抗坏血酸的羟基质子，
Figure 503471DEST_PATH_IMAGE002
是可交换质子的分数，
Figure 220891DEST_PATH_IMAGE003
是可交换质子和水质子之间的交换速率，δωb是羟基和主体水质子之间的化学位移，和
Figure 616101DEST_PATH_IMAGE004
是羟基质子的局部自旋-自旋弛豫时间。τ是T2-加权的采集序列的脉冲间(90o-180o)间隔。
影响T2对比的质子交换的必需但经常被忽视的参数是交换催化的作用(LiepinshE和Otting, G Proton exchange rates from amino acid side chains – implicationsfor image contrast. Magn Reson Med. 1996 35(1): 30-42)。OH或NH基团和水之间的质子交换的速率常数k可描述如下：
Figure 617423DEST_PATH_IMAGE005
K a 、K b 和K c 分别表示由于H+、OH-和其它交换催化剂的催化导致的交换速率常数。指数y是1或2，取决于给定的交换催化剂的机制。速率常数K a 和K b 可继而计算如下：
Figure 439886DEST_PATH_IMAGE006
其中K D 是质子供体和受体的扩散控制碰撞的速率常数(~ 1010 mol-1s-1)，和pK D 和pK A 是质子供体和受体的pK值。尽管pK H3O+和pK OH- = 15.7，但K c 对于预测是更有挑战性的，因为质子传递对催化剂浓度的非线性依赖。然而，以在pK D - pK A 之间的至少中等差异和在生理pH下显著浓度的催化活性的酸或碱形式的交换催化剂，达到在中性pH下有效的交换催化。
因此H2O，尽管其高浓度，是相对差的质子供体，因此在生理pH下是无效的交换催化剂，这是因为主要物质(H3O+和OH-)的pKA是15.7。另一方面，在生理条件下公认的交换催化剂包括有机磷酸盐、碳酸盐(例如，碳酸氢盐、HCO3 -)，和具有羧基和氨基的分子(LiepinshE和Otting, G Proton exchange rates from amino acid side chains – implicationsfor image contrast. Magn Reson Med. 1996 35(1): 30-42)。
如下所示，之前未公认的另一种有效的催化剂是抗坏血酸，其在4处具有一个羟基，具有有利的pKA = 6.75，以及pKA = 7.0的平衡歧化反应。因此，抗坏血酸具有不仅“自催化”的潜力，而且是一种对于糖和其它大分子上的碱性羟基的有效的质子交换催化剂。
图2显示pH 7时数种糖、糖醇和抗坏血酸在去离子水中的纯溶液的T2增强的比较。在7T时使用至少6个不同的回波时间的RARE FSE方案，自定量的T2映射提供数据，溶质浓度为10和20 mM。如所示的，T2弛豫性大致是各分子上可获得的可交换的OH质子数的函数，其中如预测的，二糖产生比单糖按比例更大的对比效果。应注意的是对溶质浓度的非线性依赖，其中弛豫性增强随浓度增加而降低，该现象可能涉及在纯溶液中糖的自缔合。后者特别与下文所述的观察结果有关，其中当抗坏血酸和糖以较高的总溶质浓度组合在一起时，总体T2效果反而协同增强。组合抗坏血酸与单糖或二糖的制剂提供递送较高浓度的两种物质的方法以增加MR成像的T2 对比效果。
图3A描述了在中性pH下不同浓度的纯的抗坏血酸溶液的T2效果的更详细的论证。图3B显示，当抗坏血酸在存在仅μM (即，生理)浓度的过氧化氢(H2O2)的情况下T2效果显著增强，所述浓度的过氧化氢驱动氧化成脱氢抗坏血酸的反应以及抗坏血酸基团歧化。尽管H2O2也被认为本身是交换催化剂，但当H2O2以抗坏血酸浓度的1/100存在时对抗坏血酸-介导的1/T2增强观察到的显著效果，表明自H2O2驱动的抗坏血酸氧化/歧化的质子交换，而不是自OH抗坏血酸质子的直接交换，是负责T2变化的重要的贡献机制。自脱氢抗坏血酸氧化/歧化对质子交换的贡献的进一步的证据描述于图3C，表明1/T2增强效果在中性pH下是最显著的，其中抗坏血酸-脱氢抗坏血酸歧化的反应速率也是最大的。
图3D的数据首次表明，具有合适的pK的在抗坏血酸和受体/供体分子之间的交换催化可显著驱动1/T2增强变化。此处的数据比较了抗坏血酸(10 mM)作为钠盐和葡甲胺(氨基糖)盐的溶液。此处，在水中在中性pH下，与单独的葡甲胺或抗坏血酸相比，抗坏血酸葡甲胺的T2对比效果(T2弛豫，ms)大约为4倍。
接着研究了葡甲胺与抗坏血酸的显著协同效果是否取决于与作为成盐阳离子的抗坏血酸的化学缔合(即使在理论上，这两个部分应该在水中完全缔合)。图4显示，当通过Na+阳离子实现“成盐功能”时，质子交换实际上是协同的，假定除了葡甲胺的碱性OH基团之外，还留下胺基团以参加与抗坏血酸的交换催化。注意，此处对照T2弛豫(ms)值(T2 = 840ms)未显示，以更好地说明各实验组之间的差异。
图5概述了来自一系列实验的T2弛豫数据，其研究各种生理交换催化剂对来自抗坏血酸的对比效果的影响。使用已知的血清和细胞外浓度PO4 = 2 mM, 葡萄糖 = 5 mM和HCO3 -为25 mM，其中抗坏血酸为10 mM，单独和组合检查这些部分各自的T2弛豫。如所示的，抗坏血酸单独或与水中的PO4一起的T2弛豫效果是适度的，但在存在生理浓度的葡萄糖或HCO3 -时显著增加，其中10 mM抗坏血酸(以胃肠外给予容易和安全实现的血浆浓度)产生显著的50%的T2弛豫变化。在体内存在已知的浓度的葡萄糖、HCO3 -和PO4一起的情况下，用抗坏血酸见到最大增强。因此，通过仅静脉内给予抗坏血酸，抗坏血酸的体内T2增强效果明显大于在仿体研究中没有存在生理交换催化剂的情况下在仅研究单独的抗坏血酸后可预期的。
自上述实验还预测抗坏血酸与体内通常不存在的其它糖的制剂可进一步催化抗坏血酸对比效果的可能性。例如，图6证实了当以当量浓度(20 mM)加入葡甲胺至抗坏血酸钠的溶液和加入到2 mM PO4, 25 mM HCO3 -的背景时额外的协同作用。数据显示存在或不存在生理浓度(5 mM)的葡萄糖的比较，以及单独葡甲胺加入到生理催化剂的效果。如所见的，当组合所有部分时观察到最大对比效果。因此，一个暗示是通过组合彼此不同的交换催化剂，因此限制任何一种外源给予的物质的浓度，可实现较高的对比效果。
图7概述了扩展此概念的数据，测试了当抗坏血酸钠和葡甲胺与其它单糖和二糖和糖醇一起配制时潜在的协同作用。如所示的，每一种潜在的制剂的对比效果是显著的。在图8中，对照溶液(2 mM PO4和25 mM HCO3 -)更好地说明在各组之间的对比变化的差异。由此观察到的最强效果是当抗坏血酸和葡甲胺与常见的二糖蔗糖组合时，因此建议仅使用可全都经安全地胃肠外给予的部分，用于MRI的有前景的候选制剂(即，抗坏血酸/葡甲胺/蔗糖)。
体内实施例1
正常脑灌注和代谢变化
图9. 在高剂量胃肠外抗坏血酸(2g/kg, 右IJ iv注射)后体内抗坏血酸T2对比变化。A, 显示通过正常C57黑小鼠的中脑的常规单切片轴FSE T2WI图像，和右侧的两个图像证实在抗坏血酸静脉内给予期间和之后，对比变化的“第一遍”提取。获得紧接抗坏血酸给予和其之后10分钟的脑组织中的T2信号，然后从抗坏血酸给予前采集的T2脑信号减去。因此抗坏血酸产生信号强度降低，从投配前扫描的较高信号减去，可导致通过脑组织的流通灌注(血流)的净正“映射”。在10分钟，灌注效果已经几乎消退，和与组织吸收相关的早期信号强度变化开始观察到。B, 显示由于高剂量抗坏血酸的组织吸收导致的信号变化。信号强度的颜色封泥映射未从投配前扫描中减去，因此显示T2信号随时间的预期降低，在正常C57小鼠中在30-60 min之间达到最大值。
体内实施例2
与新皮质扩散性抑制有关的病灶性大脑代谢增进
图10. 在新皮质扩散性抑制的啮齿动物模型中的抗坏血酸T2增强。扩散性抑制(SD)是CNS组织的一种实验上重现的病理生理现象，最初在60年前由Loao描述。在皮质的病灶区域达到离子干扰的临界阈值后，细胞去极化的大量扩展波可开始和通过灰质组织传播，但仍限制在它所诱导的灰质区，没有跨越白质途径。如果诱导机制(例如，施用局部高浓度的氯化钾)对相同区域是连续的，SD的这些波将每8-10分钟重现一次，和持续2-3小时的时间。脑代谢的显著变化伴随SD，和因为在SD后不存在组织学可检测的神经损伤，这些代谢变化伴有在非缺血性的高刺激性脑组织例如致癫痫病灶中的代谢流出。
在上述实验中，下排图像显示用在高浓度的KCl中浸湿的明胶海绵(红色箭头)的微型颅骨切除术，所述明胶海绵局部扩散至附近的顶叶皮层。颅骨切除术部位是前囱后1mm，前囱是代表下面脑后三分之一的颅骨界标。上两排表示在啮齿动物脑中在前囱前3和4mm (即是说远离SD诱导部位)的T2图像和信号变化的定量颜色封泥T2映射。前切片的T2信号变化显示与左侧相比，在右侧大脑皮层中清楚的T2不对称性(再次，SD仍被限制在右半球)。这些显著的皮层信号变化与SD发生的已知代谢增进活性一致，如用18F-FDG PET，以及用直接微量渗析和代谢测定也观察到的。注意到，在颅骨切除术部位本身下直接观察到相反的观察结果(病灶T2信号增加) (第三排)，这与在KCl灌注部位的局部浮肿(游离水增加)一致。
体内实施例3
心脏灌注和代谢成像
图11. 用胃肠外抗坏血酸的灌注和存活性心脏成像。A描述对于在7T下大鼠心脏成像的两个主要的成像面，冠和轴。使用呼吸偶联的回顾性门控，在7T下采集图像。采集序列适度地经T2-加权，和可进一步优化增强对比效果。B显示初始推注抗坏血酸静脉内注射的整个左心室的T2信号强度的短暂降低。在初始推注首次通过后，使用可变倒转角的流或“灌注成像”定量的T2映射显示在心脏组织中逐渐的T2对比变化，反映了抗坏血酸吸收。仅存活的、代谢活性细胞将吸收抗坏血酸。
实施例4
表1：可用于MRI成像的示例性胃肠外制剂
Figure 644602DEST_PATH_IMAGE007
实施例5
可用于MRI成像的胃肠外制剂的示例性制备
上文制剂II按以下方式制备：向500 mL无菌水中加入50 g的抗坏血酸(568 mM)和55.4 g N-甲基-D-葡糖胺(568 mM)。搅拌直到溶液澄清。mOsm/L ~ 1100、pH ~ 7.0。为促进长期稳定性，加入0.025% EDTA二钠，在氮气覆盖下和在光敏感条件下在脱氧溶液中制备。
体内实施例6
静脉内给予三种不同的抗坏血酸制剂后豚鼠中的T2对比变化
在7T下我们检查了在轻度麻醉的豚鼠的整个脑中的T2对比变化。因为豚鼠享有人内源合成抗坏血酸的失能，在该模型中MRI效果可更加预测患者的MRI变化。通过股静脉或颈静脉途径，使用经60分钟受控灌注总剂量2g/kg，胃肠外给予抗坏血酸。进行MRI 90分钟。
图12A显示60 min缓慢灌注抗坏血酸之前和之后的快速自旋回波(FSE) T2图像显示整个脑实质中明显的信号强度差异。
在图12B和图12C中，显示在给予三种不同的抗坏血酸制剂后，对于豚鼠大脑皮层(Cx)和基底神经节(BG)两者的标准化信号强度变化和定量的弛豫性测量：(1) 100%抗坏血酸钠；(2) 50%抗坏血酸钠和50%抗坏血酸葡甲胺；和3) 100%抗坏血酸葡甲胺。在图12B中，在给予由50% Na AA: 50% Meg AA组成的第二种制剂(2)期间和之后，信号强度变化在各时间点最大，观察到的皮层FSE T2强度降低超过40%。在图12C中计算的T2弛豫性值还显示，用制剂(2)自基线大于10%，最大值在统计学上大于制剂(1)或(3)。在常规的FSE T2加权图像上，还注意到在几乎每一个时间点，用Meg AA (3)的信号强度变化大于用抗坏血酸钠(1)观察到的那些，然而T2弛豫性计算未显示在这些后两种制剂之间的统计学差异。
前文说明了本发明，和不应解释为对其限制。本发明由以下权利要求限定，其中权利要求的等同方案包括在其中。

Claims (26)

1.适合用作MRI造影剂的无菌水性组合物，所述组合物包含：
100-600 mM抗坏血酸；和
100-600 mM钠、葡甲胺或其组合，
其中所述组合物包含葡甲胺、葡萄糖、半乳糖、果糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖和/或海藻糖，和
其中所述组合物具有200-1400 mOsm/L的摩尔渗透压浓度。
2.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含葡甲胺。
3.权利要求2的组合物，其中所述组合物包含摩尔或毫摩尔(mM)比为从10:90、20:80、30:70或40:60直至90:10、80:20、70:30或60:40的抗坏血酸葡甲胺和抗坏血酸钠。
4.权利要求1的组合物，其中所述组合物进一步包含碳酸盐和/或磷酸盐。
5.权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述组合物包含葡萄糖、半乳糖、果糖、乳糖和/或麦芽糖。
6.权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述组合物包含蔗糖和/或海藻糖。
7.权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述组合物具有200-1200 mOsm/L的摩尔渗透压浓度。
8.权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述组合物具有6.5-7.5的pH。
9.权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述组合物进一步包含稳定剂。
10.权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述组合物以单位剂型提供。
11.权利要求10的组合物，其中所述单位剂型包含10-100克抗坏血酸。
12.粉末组合物，其包含：
抗坏血酸；和
葡甲胺，或钠和葡甲胺的组合，
所述组合物在加入无菌液体载体时，适合用于增强受试者的身体或身体区域的磁共振成像(MRI)图像。
13.权利要求12的组合物，其中所述组合物包含摩尔或毫摩尔(mM)比为从10:90、20:80、30:70或40:60直至90:10、80:20、70:30或60:40的抗坏血酸葡甲胺和抗坏血酸钠。
14.权利要求1-4中任一项的无菌水性组合物在制备用于实施增强受试者的身体或身体区域的磁共振成像(MRI)图像的方法的药物或显像剂中的应用，所述方法包括：
以MRI图像-增强量胃肠外给予所述受试者无菌水性组合物；和然后
通过受试者的MRI产生所述身体或身体区域的图像，
从而所述MRI图像得到增强。
15.权利要求14的应用，其中所述身体区域是头、颈、胸、腹、骨盆、肢、肌肉、脂肪或骨。
16.权利要求14的应用，其中所述身体区域包含肾上腺、脑垂体、胸腺、黄体、视网膜、脑、脾、肺、睾丸、淋巴结、肝、甲状腺、小肠粘膜、白细胞、胰腺、肾或唾液腺组织。
17.权利要求14的应用，其中所述身体区域是脑。
18.权利要求14的应用，其中所述身体区域是心脏。
19.权利要求14的应用，其中所述给予步骤通过静脉内给予进行。
20.权利要求14的应用，其中所述给予步骤通过腹膜内给予进行。
21.权利要求14的应用，其中所述图像包含T2加权的图像。
22.权利要求14的应用，其中所述图像包含代谢图像。
23.权利要求14的应用，其中所述图像包含灌注图像。
24.权利要求14的应用，其中在胃肠外给予所述无菌水性组合物期间，或其后至多5、10、30、40、60、90或120分钟，或其后至多3或4小时，进行所述产生。
25.权利要求14的应用，其中所述给予步骤通过静脉内注射进行。
26.权利要求14的应用，其中所述给予步骤通过腹膜内注射进行。
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