CN106999549A - 促进组织愈合和修复的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种促进组织修复的方法，所述方法包括向受试者递送治疗有效量的纤调蛋白(FMOD)、FMOD多肽、FMOD肽或其变体或衍生物或类似物以使得损伤的组织形成具有改善病状的修复的组织，其条件为改善病状不包括皮肤瘢痕的改善病状。

Description

促进组织愈合和修复的方法
B.CHIA SOO/B.加璐·苏
KANG TING/丁淦
ZHONG ZHENG/郑重
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年12月9日提交的美国临时申请号62/089,759的权益，所述临时申请的教义以引用的方式整体并入本文。
发明领域
本发明涉及在修复的组织中增加拉伸强度和/或血管化和/或减少炎症的方法和组合物。
背景技术
软组织修复为通常涉及以下若干时期的复杂过程，即出血期、炎症期、增殖期和重塑期(Watson,T,(2003)"Soft Tissue Healing"In Touch 104:2-9)。这些时期中每一个进而涉及生物化学事件的复杂相互作用(Watson，2003，同上)。例如，炎症期尤其涉及血管事件和细胞事件(Watson，2003，同上)。血管事件的结果包括血管化，而细胞事件的结果包括细胞迁移，两者对于组织修复都很重要。
纤调蛋白(FMOD)为小间质蛋白聚糖家族的成员，所述家族还包括饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和光蛋白聚糖。蛋白聚糖与其他基质大分子结合，并且从而有助于稳定基质(Buckwalter等,47Instr.Course Lect 477-86(1998))。认为它们可能影响软骨细胞的功能并且与生长因子结合。蛋白聚糖蛋白核心在结构上为相关的，并且由与二硫化物键合的末端结构域侧接的富含亮氨酸的重复序列的中心区域组成。FMOD在其富含亮氨酸的结构域内具有高达4个硫酸角蛋白链。它具有广泛的组织分布，并且在关节软骨、腱和韧带中最丰富。已经表明，纤调蛋白由于其与I型胶原原纤维和II型胶原原纤维相互作用以及在体外抑制原纤维生成的能力而参与细胞外基质的组装。
因此，需要用于软组织修复的基于纤调蛋白的疗法。
下面描述的实施方案解决了上述需要。
发明内容
在本发明的一个方面中，提供了一种促进组织修复的方法，所述方法包括向受试者递送治疗有效量的纤调蛋白(FMOD)、FMOD多肽、FMOD肽或其变体或衍生物或类似物以使得损伤的组织形成具有改善病状的修复的组织，其条件为改善病状不包括皮肤瘢痕的改善病状。
在一些实施方案中，组织选自脑、肌肉、皮肤、骨、神经、腱、血管、脂肪、筋膜或韧带。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，组织衍生自各种内胚层组织、中胚层组织和外胚层组织。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，组织为结缔组织、肌肉组织、神经组织或上皮组织中的一种。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，FMOD、FMOD多肽、FMOD肽或其变体或衍生物或类似物被包括在递送媒介物中，所述递送媒介物包含治疗有效量的FMOD、FMOD多肽、FMOD肽或其变体或衍生物或类似物。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，递送由植入物实现。此种植入物可为医疗植入物或整形植入物。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，递送由基因构建体实现，所述基因构建体在递送至受试者时表达治疗有效量的FMOD、FMOD多肽、FMOD肽或其变体或衍生物或类似物。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，递送通过具有或不具有递送媒介物或递送设备的全身递送或局部递送来实现。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，局部递送包括递送到局部组织。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，局部递送为递送到上皮内、真皮内、皮下、筋膜内、肌内、骨内、神经内、软骨内、眼内、血管周围-动脉静脉、外淋巴、或列出的所有各种器官-心脏、肝脏、脾脏、肠、肺、脑或眼睛。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，全身递送为通过静脉、动脉、淋巴管、脑脊髓液或腹膜内途径中的一种实现的递送。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，受试者为人患者。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，改善病状包括增强细胞迁移到修复的组织和器官系统中以增加组织愈合。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，改善病状包括改善组织血管化和组织强度。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，改善病状包括修复的组织中炎症的减少。
附图简述
图1示出了通过卵内CAM测定评估的FMOD对血管化的作用。与PBS对照组相比，在30μl 2.0mg/ml的FMOD处理的CAM上，宏观照片(上)和计算机定量(下)示出了显著增加的更多的毛细管生成。由配对t-检验比较的显著差异(P<0.05)用星号标记(N＝5)。比例尺＝500μm。
图2示出了成年小鼠皮肤伤口的vWF染色。定量损伤后第14天PBS处理的WT(上，左)、FMOD处理的WT(上，右)、PBS处理的fmod-/-(中，左)、FMOD处理的fmod-/-(中，右)的受伤小鼠皮肤的部分的伤口毛细血管密度(下)。伤口区域用虚线勾画，并且血管用红色箭头指示。FMOD：0.4mg/ml x 50μl/伤口。由Mann-Whitney分析比较的显著差异(P<0.05)用星号标记：红色星号指示由fmod敲除引起的显著性，并且蓝色星号指示由FMOD施用引起的显著性。比例尺＝200μm。
图3示出了损伤后第14天大鼠皮肤伤口的vWF染色。天狼猩红耦合偏振光显微镜(PSR-PLM)证明了伤口区域(上；由虚线勾画)，而血管通过针对vWF的IHC染色来鉴定(中；红色箭头)并且定量(下)。FMOD：0.4mg/ml x 50μl/伤口。由Mann-Whitney分析比较的显著差异(P<0.05)用星号标记。比例尺＝200μm。
图4示出了成年WT和fmod-/-小鼠皮肤伤口中的基因表达。vegf(左)和angpt1(右)的表达水平通过实时PCR来测量，并且相对于未损伤的成年WT皮肤组织(虚线)进行归一化。FMOD：0.4mg/ml x 50μl/伤口。数据以平均值±SD表示(N＝3个不同的cDNA模板，每个模板从3个不同动物收获的3个伤口的RNA库中进行逆转录，每个处理使用9个动物共9个伤口)。由双样本t-检验比较的显著差异(P<0.05)用星号标记：红色星号指示fmod敲除的显著性，并且蓝色星号指示由外源性FMOD施用引起的显著性。
图5示出了成年大鼠皮肤伤口愈合期间血管生成和抑制血管生成的基因表达的RT2 PCR阵列。示出了在损伤后第7天(上)和第14天(下)的基因表达。血管生成基因包括angpt1、vegf、tgfα、fgf2、pdgfα和csf3；而抑制血管生成基因包括ifnγ、tgfβ1和plg。FMOD：0.4mg/ml x 50μl/伤口。数据以平均值±SD表示(N＝3个不同的cDNA模板，每个模板从3个不同动物收获的3个伤口的RNA库中进行逆转录，每个处理使用9个动物共9个伤口)并且相对于未损伤的大鼠皮肤组织(虚线)进行归一化。由双样本t-检验比较的显著差异(P<0.05)用星号标记。
图6示出了在体外基质上的HUVEC细胞的管状结构(TLS)形成。HUVEC细胞的光学显微镜自发形成TLS(勾画的；上)。对HUVEC TLS网络的尺寸参数和拓扑参数进行定量(下)。由Mann-Whitney分析比较的显著差异(P<0.05)用星号标记(N＝16)。比例尺＝200μm。
图7示出了HUVEC细胞的体外侵袭测定。数据以平均值±SD表示(N＝6)并且相对于未经FMOD经PBS处理的对照组进行归一化。由双样本t-检验比较的显著差异(P<0.05)用星号标记。单因素方差分析显示10、50和250μg/ml FMOD组之间无显著差异。
图8示出了皮下注射到成年129/sv雄性小鼠腹部内的MatrigelTM栓塞。H&E染色(上)与针对vEF的IHC染色(中)一起示出，所述IHC染色用于鉴定和定量血管(下)。血管用红色箭头指示。FMOD：4.0mg/ml x 400μl/栓塞。由Mann-Whitney分析比较的显著差异(P<0.05)用星号标记(N＝5)。比例尺＝200μm。
图9示出了在损伤后第14天描绘成年小鼠皮肤伤口(由虚线勾画)的H&E染色和PSR-PLM。FMOD：0.4mg/ml x 50μl/伤口。比例尺＝200μm。
图10示出了损伤后第14天成年大鼠皮肤伤口的H&E染色。伤口区域由虚线勾画，而IHC染色区域由虚线框勾画。FMOD：0.4mg/ml x 50μl/伤口。比例尺＝400μm。
具体实施方式
在本发明的一个方面中，提供了一种促进组织修复的方法，所述方法包括根据给药方案向受试者递送治疗有效量的纤调蛋白(FMOD)、FMOD多肽、FMOD肽或其变体或衍生物或类似物以使得损伤的组织形成具有改善病状的修复的组织，其条件为改善病状不包括皮肤瘢痕的改善病状。
在一些实施方案中，组织选自脑、肌肉、皮肤、骨、神经、腱、血管、脂肪、筋膜或韧带。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，组织衍生自各种内胚层组织、中胚层组织和外胚层组织。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，组织为结缔组织、肌肉组织、神经组织或上皮组织中的一种。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，包括在药物中的FMOD、FMOD多肽、FMOD肽或其变体或衍生物或类似物被包括在递送媒介物中，所述递送媒介物包含治疗有效量的FMOD、FMOD多肽、FMOD肽或其变体或衍生物或类似物。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，递送由植入物实现。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，递送由基因构建体实现，所述基因构建体在递送至受试者时表达治疗有效量的FMOD、FMOD多肽、FMOD肽或其变体或衍生物或类似物。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，递送通过具有或不具有递送媒介物或递送设备的全身递送或局部递送来实现。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，受试者为人患者。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，改善病状包括增强细胞迁移到修复的组织和器官系统中以增加组织愈合。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，改善病状包括改善组织血管化和组织强度。
在一些实施方案中，任选地与本文公开的各种实施方案中的一种或多种组合，改善病状包括修复的组织中炎症的减少。
定义
如本文所用，术语“纤调蛋白多肽”是指SEQ ID NO.1(Genbank登录号NM 002023)的多肽或其保留如所述术语在本文中所定义的纤调蛋白活性的保守取代变体或片段。应当理解，纤调蛋白的碳水化合物部分可以涉及纤调蛋白促血管生成活性，包括例如N-连接的硫酸角蛋白链。纤调蛋白多肽的C-末端结构域中富含亮氨酸的重复序列参与纤调蛋白与I型胶原的结合，并且可以在纤调蛋白促血管生成活性中发挥作用。参见，例如Kalamaj ski和Oldberg,(2007)J Biol Chem 282:26740-26745，其突出了富含亮氨酸的重复序列在I型胶原结合中的作用。“保留纤调蛋白活性”意味着多肽保留至少50％的SEQ ID NO.1的多肽的纤调蛋白活性。术语“纤调蛋白多肽”还包括人纤调蛋白的哺乳动物同源物以及其保留纤调蛋白活性的保守取代变体或片段。在一个方面中，此类同源物或其保守变体刺激例如如本文所述测量的人内皮细胞生长和/或迁移。在一些实施方案中，术语纤调蛋白多肽还包括美国专利申请公布号20120171253中公开的各种肽，所述申请的教义以引用的方式整体并入本文。
如本文所用，术语“变体”是指与野生型纤调蛋白多肽或多核酸“基本上相似”的多肽或核酸。如果两个分子具有基本上相似的结构(即，如通过在默认参数下设置的BLASTp比对所确定，它们在氨基酸序列上至少50％相似)并且在至少一种相关功能(例如对细胞迁移的作用)上基本上相似，则一个分子被认为与另一个分子“基本上相似”。变体与天然存在的多肽或核酸在一个或多个氨基酸或核酸缺失、添加、取代或侧链修饰上不同，但保留天然存在的分子的一种或多种特定的功能或生物活性。氨基酸取代包括其中氨基酸被替换为不同的天然存在的或非常规的氨基酸残基的改变。一些取代可被分类为“保守的”，在这种情况下，多肽中含有的氨基酸残基被替换为与极性、侧链官能度或大小相关的另一种具有相似性质的天然存在的氨基酸。如本文所述，变体包括的取代也可为“非保守的”，其中肽中存在的氨基酸残基被具有不同特性的氨基酸取代(例如用不带电荷的或亲水的氨基酸取代带电荷的或疏水的氨基酸)，或可替代地，其中天然存在的氨基酸被非常规的氨基酸取代。当参考多核苷酸或多肽使用时，术语“变体”还包括分别与参考多核苷酸或多肽相比(例如，与野生型多核苷酸或多肽相比)的初级结构、次级结构或三级结构的变化。多核苷酸改变可以导致由参考序列编码的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。变体还可以包括通常不在作为变体的基础的肽序列中发生的氨基酸的插入、缺失或取代(包括氨基酸和其他分子的插入和取代)，其包括但不限于通常不在人蛋白质中发生的鸟氨酸的插入。
如本文所用，术语“衍生物”是指已经被化学修饰的肽，所述化学修饰例如通过泛素化、标记、聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)或添加其他分子来实现。当分子含有通常不是所述分子的一部分的另外化学部分时，所述分子也为另一个分子的“衍生物”。此类部分可以改善分子的溶解度、吸收、生物半衰期等。所述部分可以可替代地降低分子的毒性或消除或减弱分子的不期望的副作用等。能够介导此类作用的部分公开在Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版,A.R.Gennaro编,MackPubl.,Easton,Pa.(1990)中。
当与“衍生物”或“变体”关联使用时，术语“官能的”是指拥有与衍生物或变体的实体或分子的生物活性基本上相似的生物活性的多肽。在上下文中，“基本上相似”意味着保留至少50％的对应野生型肽相关或期望的生物活性。在促进血管生成的例子中，例如，保留的活性将促进内皮细胞迁移；优选地，与野生型多肽的可测量活性(即促进或抑制内皮细胞迁移)相比，变体保留至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％或甚至更高(即，变体或衍生物具有比野生型更高的活性)，例如至少110％、至少120％或更高。
如本文所用，术语“治疗有效量”是与没有使用药剂的修复的组织中的病状相比，使用本文公开的药剂足以在修复的组织中产生在统计学上显著的可测量的病状变化的药剂的量。此类有效量可以在临床试验以及动物研究中进行计量。与没有使用药剂的修复的组织中的病状相比，使用本文公开的药剂在修复的组织中的这种在统计学上显著的可测量的阳性病状变化被称为“改善病状”。
如本文所用，术语“药剂”是指纤调蛋白(FMOD)、FMOD多肽、FMOD肽或其变体或衍生物或类似物。在一些实施方案中，所述术语还包括聚乙二醇化FMOD或携带以下的FMOD：例如短烷基链、短聚合物链、短聚(氨基酸)链或酰基(诸如甲基或乙基或乙酰基)。
如本文所用，术语“包含(comprising)”或“包括(comprises)”用于表示本发明必需的组合物、方法及其相应的组分，其仍然为包括未指定的元素的开放式的术语，无论所述元素是否必需。
如本文所用，术语“基本上由...组成”是指给定的实施方案所需的那些元素。所述术语允许存在实质上不会影响本发明的所述实施方案的基本性质和新型性质或功能性质的元素。
术语“由...组成”是指本文所述的组合物、方法及其相应的组分，其不包括任何在本实施方案的描述中未叙述的元素。
如本文所用，术语“血管化”是指在循环受到疾病或创伤损害的组织中新血管的形成。如本文所用，血管化与术语“血管生成”是可区分的，所述血管生成是指新血管通过先前存在的血管形成的生理过程。虽然血管化有时被称为血管生成，但是如本文所用，术语“血管生成”应被解释为血管化。
如本说明书以及随附权利要求中所用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式的“一(个/种)”与“所述”包括复数提及形式。因此，例如“所述方法”的引用包括本文所述的类型的和/或在阅读本公开时对本领域技术人员而言将变得显而易见的一种或多种方法和/或步骤等。
给药方案
如本文所用，术语“给药方案”是指不仅对纤调蛋白具有特异性(例如，关于其化学组成或物理或药理学行为或特性的特异性)也对需要治疗的病状具有特异性的给药方案，其条件为此类病状不包括皮肤瘢痕形成或角膜瘢痕形成。
在一些实施方案中，给药方案可以被设计成通过组合物/制剂设计和构型的给药来进行，例如通过化学修饰、脂质体、任何其他先进的递送媒介物、剂量(量)、频率、施用模式(局部、全身、吸入、鞘内、眼内等)的不同持续递送。
在一些实施方案中，给药方案可以被设计成通过将组合物/制剂局部递送到组织的给药来进行，所述组织可为需要治疗的任何组织并且此类组织可为例如上皮内、真皮内、皮下、筋膜内、肌内、骨内、神经内、软骨内、眼内、血管周围-动脉静脉、外淋巴、或列出的所有各种器官-心脏、肝脏、脾脏、肠、肺、脑、眼睛等。
在一些实施方案中，给药方案可以被设计成通过组合物/制剂的全身递送的给药来进行，所述全身递送通过诸如例如静脉、动脉、淋巴管、脑脊髓液和腹膜内途径中的一种途径。
在一些实施方案中，给药方案可以被设计成通过生物相容性设备的给药来进行。生物相容性设备可为用于通过将设备植入受试者(例如，人患者)可以治疗或缓解病症的任何设备。此类生物相容性设备的实例包括但不限于植入的医疗设备(例如，网状物、抗粘连设备、神经或血管导管、乳房植入物、组织扩张器、起搏器、除颤器、神经刺激器或其他电气设备)、经皮递送的设备(例如，支架)、伤口闭合设备(例如缝合线、缝钉)、伤口管理覆盖物(胶带、引导组织再生的膜)和组织工程化框架，因为必须避免瘢痕形成(例如眶壁重建-骨骼形成必须在软组织没有瘢痕形成的情况下发生)以在使用所有可用方法(例如，开放性手术、内窥镜手术、微创、经皮等)在器官系统(例如脑、心脏、肺、肝脏、肠、血管、神经、肌肉、腱、眼睛、内耳、窦等)上操作的所有组织中避免不期望的手术诱导的纤维化粘连和瘢痕形成或神经胶质增生(中枢神经系统中的瘢痕)。
在一些实施方案中，生物相容性设备具体排除了与皮肤伤口愈合或角膜伤口愈合相关的WO2004053101 A3或WO2009135135 A3中所公开的此类设备。
生物相容性设备的一些其他实例为支架，诸如在胆道重建后吻合伤口愈合的蛋白质洗脱生物可降解聚合物支架，或在手术期间植入狭窄冠状动脉中的冠状动脉支架。
纤调蛋白
纤调蛋白(FMOD)(也称为SLRR2E)为小间质蛋白聚糖家族的成员。所述蛋白质为59kDa，具有与二硫化物键合的末端结构域侧接的富含亮氨酸的重复序列，其拥有高达4个硫酸角蛋白链(Takahashi,T.,Cho,H.I.,Kublin,C.L.&Cintron,C.(1993)J HistochemCytochem 41:1447-57)。纤调蛋白表现出在关节软骨、腱和韧带中发现的具有最高浓度的广泛组织分布。纤调蛋白的亚细胞位置在具有分泌序列但不具有跨膜或细胞外结构域的胞质蛋白内。
虽然不希望指出此种活性对纤调蛋白的促血管生成活性至关重要，但纤调蛋白的若干活性在这里值得注意。此蛋白质的性质特征在于其参与细胞外基质的组装，因为其能够与I型胶原原纤维、II型胶原原纤维和XII型胶原原纤维相互作用以形成胶原原纤维网络(Hedbom,E.&Heinegard,D.(1993)J Biol Chem 268:27307-12；Font,B.,Eichenberger,D.,Goldschmidt,D.,Boutillon,M.M.&Hulmes,D.J.(1998)Eur J Biochem 254:580-7)以及在体外抑制原纤维生成(Antonsson,P.,Heinegard,D.&Oldberg,A.(1991)JBiol Chem266:16859-61；Hedlund,H.,Mengarelli-Widholm,S.,Heinegard,D.,Reinholt,F.P.&Svensson,0.(1994)Matrix Biol 14:227-32；Ezura,Y.,Chakravarti,S.,Oldberg,A.,Chervoneva,I.&Birk,D.E.(2000)J Cell Biol 151:779-88；Gori,F.,Schipani,E.&Demay,M.B.(2001)J Cell Biochem 82:46-57；Ameye,L.等(2002)Faseb J16:673-80；Ameye,L.&Young,M.F.(2002)Glycobiology 12:107R-16R；Chakravarti,S.(2002)Glycoconj J19:287-93)。认为FMOD与转化生长因子(TGF)-β(一种关键的促纤维细胞因子)的相互作用增强了此生长因子在ECM内的保留，因此调控TGF-β局部作用(Burton-Wurster,N.等(2003)Osteoarthritis Cartilage 11:167-76；San Martin,S.等(2003)Reproduction 125:585-95；Fukushima,D.,Butzow,R.,Hildebrand,A.&Ruoslahti,E.(1993)JBiol Chem 268:22710-5；Hildebrand,A.等(1994)Biochem J302(Pt 2):527-34)。所述蛋白质涉及结缔组织的多种粘附过程，并且与免疫球蛋白一起激活补体的经典途径和旁路途径。进一步的研究显示，纤调蛋白直接与Clq的球状头部结合，从而导致Cl的激活。纤调蛋白还结合补体抑制因子H(Sjoberg,A.P.等(2007)JBiol Chem 282:10894-900；Sjoberg,A.,Onnerfjord,P.,Morgelin,M.,Heinegard,D.&Blom,A.M.(2005)J Biol Chem280:32301-8)。
已经发现纤调蛋白基因为B细胞慢性淋巴细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病(CLL)中的过表达基因。它可以充当CLL中潜在的肿瘤相关抗原(TAA)(Mayr,C.等(2005)Blood 105:1566-73；Mayr,C.等(2005)Blood 106:3223-6)。人、牛、大鼠和鼠纤调蛋白的氨基酸序列示出了90％的总体同源性，从而允许人和鼠实验模型之间的紧密转译(Antonsson,P.,Heinegard,D.&Oldberg,A.(1993)Biochim Biophys Acta 1174:204-6)。
纤调蛋白多肽
可以将纤调蛋白多肽(也不时地称为纤调蛋白蛋白质)或其促进血管生成功能的部分施用于有需要的个体。在一种方法中，可以将例如在携带重组纤调蛋白表达载体的培养细胞中产生的可溶性纤调蛋白多肽施用于个体。纤调蛋白多肽或其部分将通常静脉内施用。这种方法可快速将蛋白质递送到整个系统，并且最大化蛋白质在递送时为完整的可能性。可替代地，考虑治疗性蛋白质施用的其他途径，诸如通过吸入。作为气雾剂施用药剂(包括蛋白质药剂)的技术为熟知的并且继续发展。可替代地，可以配制多肽药剂用于局部递送，包括例如脂质体中的制剂。还考虑的是例如经皮施用和经直肠施用或经阴道施用。本文所述的递送纤调蛋白多肽的其他选择在下文“药物组合物”一节中讨论。
用于转导纤调蛋白编码序列的载体为本领域熟知的。虽然可以使用利用强非特异性启动子(诸如CMV启动子)的过表达，但是在表达构建体上包括组织型特异性启动子或细胞型特异性启动子是有帮助的。例如，骨骼肌特异性启动子或其他细胞型特异性启动子的使用可以是有利的，这取决于使用何种细胞类型作为宿主。此外，治疗可以包括施用病毒载体，所述病毒载体在感染的宿主细胞中驱动纤调蛋白多肽的表达。病毒载体为本领域技术人员熟知的。
这些载体容易适用于本发明的方法。通过使用重组DNA/分子生物学技术的适当操作将可操作地连接的纤调蛋白编码核酸片段插入到所选择的表达/递送载体中，可以生成用于实践本文所述方法的许多等效载体。本领域的技术人员将理解，可以容易地操作克隆基因以改变蛋白质的氨基酸序列。
纤调蛋白的克隆基因可以通过多种熟知的用于体外诱变的技术来操作，尤其以便产生天然存在的人蛋白质的变体(本文称为纤调蛋白的突变蛋白或变体或突变体)，其可以根据本文所述的方法和组合物来使用。例如，可用于本发明的纤调蛋白的突变蛋白的一级结构的变化可以包括缺失、添加和取代。取代可为保守性的或非保守性的。天然蛋白和突变蛋白之间的差异通常保存期望的特性，减轻或消除不期望的特性并且添加期望的特性或新的特性。纤调蛋白多肽还可为融合多肽，例如与将产物靶向期望位置的多肽融合，或例如(若如此期望)与有利于其纯化的标签融合。还考虑与增加纤调蛋白多肽的稳定性的多肽序列的融合。例如，与血清蛋白(例如血清白蛋白)的融合可以增加纤调蛋白多肽的循环半衰期。若如此期望，标签和融合配偶体可以设计成可裂解的。具体考虑的另一种修饰为附接(例如共价附接)到聚合物。在一个方面中，聚合物(诸如聚乙二醇(PEG)或甲氧基聚乙二醇(mPEG))可以增加与它们共轭的蛋白质的体内半衰期。多肽药剂的聚乙二醇化的方法为本领域技术人员熟知的，例如考虑使用多大的PEG聚合物。在另一个方面中，生物可降解或可吸收的聚合物可以提供多肽药剂的延长的经常定位的释放。可以在若干周或若干月内释放蛋白质的此类合成的生物吸收的生物相容性聚合物可以包括，例如聚α-羟基酸(例如聚丙交酯、聚乙交酯和它们的共聚物)、聚酐、聚原酸酯、聚乙二醇和聚对苯二甲酸丁二酯的分段嵌段共聚物(PolyactiveTM)、酪氨酸衍生物聚合物或聚酯酰胺)。用于制造药物递送材料和植入物的合适的生物可吸收聚合物在以下文献中讨论：例如，美国专利号4,968,317；5,618,563等和S.W.Shalaby,Carl Hanser Verlag编写的“Biomedical Polymers”Munich,Vienna,New York,1994以及上述出版物中引用的许多参考文献。应选择的特定生物可吸收聚合物将取决于正在治疗的特定患者。
聚合物材料
在一些实施方案中，本文公开的载体可为聚合物材料。这里可以使用的示例性聚合物材料包括但不限于生物相容性聚合物或生物可吸收聚合物，其为以下的一种或多种：聚(DL-丙交酯)、聚(L-丙交酯)、聚(L-丙交酯)、聚(L-丙交酯-共-D,L-丙交酯)、聚苯乙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)、聚(酯酰胺)、聚(原酸酯)、聚(乙醇酸-共-三亚甲基碳酸酯)、聚(D,L-丙交酯-共-三亚甲基碳酸酯)、聚(三亚甲基碳酸酯)、聚(丙交酯-共-己内酯)、聚(乙交酯-共-己内酯)、聚(酪氨酸酯)、聚酐、其衍生物。在一些实施方案中，聚合物材料包含这些聚合物的组合。
在一些实施方案中，聚合物材料包含聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)。在一些实施方案中，聚合物材料包含聚(D,L-丙交酯)。在一些实施方案中，聚合物材料包含聚(L-丙交酯)。另外的示例性聚合物包括但不限于聚(D-丙交酯)(PDLA)、聚苯乙交酯(PM)、聚乙交酯(PGA)、聚(L-丙交酯-共-D,L-丙交酯)(PLDLA)、聚(D,L-丙交酯)(PDLLA)、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚(L-丙交酯-共-乙交酯)(PLLGA)。关于PLLGA，支架框架可由PLLGA制成，其中GA的摩尔％为5-15mol％。PLLGA可以具有85:15(或82:18至88:12的范围)、95:5(或93:7至97:3的范围)的(LA:GA)的摩尔％，或可商购的PLLGA产品鉴定为85:15或95:5的PLLGA。上面提供的实例并非唯一可以使用的聚合物。可以提供许多其他实例，诸如在Severian Dumitriu编写的Polymeric Biomaterials，第二版，第四章中发现的那些聚合物。
在一些实施方案中，也可以使用比上文提到的那些聚合物更有柔性的聚合物或具有更低模量的聚合物。示例性更低模量的生物可吸收聚合物包括聚己内酯(PCL)、聚(三亚甲基碳酸酯)(PTMC)、聚二噁烷酮(PDO)、聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)、聚(4-羟基丁酸酯)(P4HB)、聚(羟基烷酸酯)(PHA)和聚(丁二酸丁二醇酯)以及其共混物和共聚物。
在示例性实施方案中，更高模量聚合物(诸如PLLA或PLLGA)可以与更低模量聚合物或与PLLA或PLGA的共聚物共混。共混的更低模量聚合物导致具有比高模量聚合物更高的断裂韧性的共混物。示例性低模量共聚物包括聚(L-丙交酯)-b-聚己内酯(PLLA-b-PCL)或聚(L-丙交酯)-共-聚己内酯(PLLA-共-PCL)。共混物的组成可以包括1-5重量％的低模量聚合物。
更多示例性聚合物包括但不限于至少部分烷基化的聚乙烯亚胺(PEI)；至少部分烷基化的聚(赖氨酸)；至少部分烷基化的聚鸟氨酸；至少部分烷基化的聚(酰氨基胺)；至少部分烷基化的乙烯胺的均聚物和共聚物；至少部分烷基化的含有氨基的丙烯酸酯、含有氨基的乙烯胺与疏水性单体的共聚物、含有氨基的丙烯酸酯与疏水性单体的共聚物、以及含有氨基的天然的和改性的多糖、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚脲、聚氨酯、聚烯烃、聚卤乙烯、聚偏二卤乙烯、聚乙烯醚、聚乙烯基芳烃、聚乙烯酯、聚丙烯腈、醇酸树脂、聚硅氧烷和环氧树脂以及其混合物。生物相容性可生物降解聚合物的另外的实例包括但不限于聚己内酯、聚(L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PEG)嵌段共聚物、聚(D,L-丙交酯-共-三亚甲基碳酸酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚二噁烷酮(PDS)、聚原酸酯、聚酐、聚(乙醇酸-共-三亚甲基碳酸酯)、聚磷酸酯、聚磷酸酯氨酯、聚(氨基酸)、聚氰基丙烯酸酯、聚(三亚甲基碳酸酯)、聚(亚氨基碳酸酯)、聚碳酸酯、聚氨酯、聚亚烷基草酸酯、聚磷腈、PHA-PEG以及其组合。PHA可以包括聚(α-羟基酸)；聚(β-羟基酸)诸如聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)、聚(3-羟基丁酸酯-共-戊酸酯)(PHBV)、聚(3-羟基丙酸酯)(PHP)、聚(3-羟基己酸酯)(PHH)，或聚(4-羟基酸)诸如聚(4-羟基丁酸酯)、聚(4-羟基戊酸酯)、聚(4-羟基己酸酯)；聚(羟基戊酸酯)；聚(酪氨酸碳酸酯)；聚(酪氨酸芳基化物)；聚(酯酰胺)；聚羟基烷酸酯(PHA)；聚(3-羟基烷酸酯)诸如聚(3-羟基丙酸酯)、聚(3-羟基丁酸酯)、聚(3-羟基戊酸酯)、聚(3-羟基己酸酯)、聚(3-羟基庚酸酯)和聚(3-羟基辛酸酯)；聚(4-羟基烷酸酯)诸如聚(4-羟基丁酸酯)、聚(4-羟基戊酸酯)、聚(4-羟基己酸酯)、聚(4-羟基庚酸酯)、聚(4-羟基辛酸酯)和共聚物(包括本文所述的3-羟基烷酸酯或4-羟基烷酸酯单体或其共混物中的任一种)；聚(D,L-丙交酯)；聚(L-丙交酯)；聚乙交酯；聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)；聚(L-丙交酯-共-乙交酯)；聚己内酯；聚(丙交酯-共-己内酯)；聚(乙交酯-共-己内酯)；聚(二噁烷酮)；聚(原酸酯)；聚(酐)；聚(酪氨酸碳酸酯)及其衍生物；聚(酪氨酸酯)及其衍生物；聚(亚氨基碳酸酯)；聚(乙醇酸-共-三亚甲基碳酸酯)；聚磷酸酯；聚磷酸酯氨酯；聚(氨基酸)；聚氰基丙烯酸酯；聚(三亚甲基碳酸酯)；聚(亚氨基碳酸酯)；聚磷腈；硅酮；聚酯；聚烯烃(polyolefms)；聚异丁烯和乙烯-α烯烃共聚物；丙烯酸聚合物和共聚物；卤化乙烯聚合物和共聚物诸如聚氯乙烯；聚乙烯醚诸如聚乙烯甲醚；聚偏二卤化乙烯诸如聚偏二氯乙烯；聚丙烯腈；聚乙烯基酮；聚乙烯基芳烃诸如聚苯乙烯；聚乙烯基酯诸如聚乙酸乙烯酯；乙烯基单体与彼此和烯烃的共聚物诸如乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物、丙烯腈-苯乙烯共聚物、ABS树脂和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；聚酰胺诸如尼龙66和聚己内酰胺；醇酸树脂；聚碳酸酯；聚甲醛；聚酰亚胺；聚醚；聚(癸二酸甘油酯)；聚丙烯富马酸酯)；聚(甲基丙烯酸正丁酯)；聚甲基丙烯酸仲丁酯)；聚(甲基丙烯酸异丁酯)；聚(甲基丙烯酸叔丁酯)；聚(甲基丙烯酸正丙酯)；聚(甲基丙烯酸异丙酯)；聚(甲基丙烯酸乙酯)，聚(甲基丙烯酸甲酯)；环氧树脂；聚氨酯；人造丝；人造丝-三醋酸酯；醋酸纤维素；丁酸纤维素；乙酸丁酸纤维素；玻璃纸；硝酸纤维素；丙酸纤维素；纤维素醚；羧甲基纤维素；聚醚诸如聚(乙二醇)(PEG)；共聚(醚-酯)(例如聚(环氧乙烷-共-乳酸)(PEO/PLA))；聚环氧烷诸如聚(环氧乙烷)、聚环氧丙烷)；聚(醚酯)；聚亚烷基草酸酯；含磷酰胆碱的聚合物；胆碱；聚(阿司匹林)；携带羟基的单体的聚合物和共聚物诸如甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)、羟丙基甲基丙烯酰胺、PEG丙烯酸酯(PEGA)、PEG甲基丙烯酸酯；含2-甲基丙烯酰氧乙基-磷酰胆碱(MPC)和n-乙烯基吡咯烷酮(VP)的甲基丙烯酸酯聚合物；携带羧酸的单体诸如甲基丙烯酸(MA)、丙烯酸(AA)、烷氧基甲基丙烯酸酯、烷氧基丙烯酸酯和3-三甲基甲硅烷基丙基甲基丙烯酸酯(TMSPMA)；聚(苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯)-PEG(SIS-PEG)、聚苯乙烯-PEG；聚异丁烯-PEG；聚己内酯-PEG(PCL-PEG)；PLA-PEG；聚(甲基丙烯酸甲酯)；MED610；聚甲基丙烯酸甲酯)-PEG(PMMA-PEG)；聚二甲基硅氧烷-共-PEG(PDMS-PEG)；聚(亚乙烯基氟化物)-PEG(PVDF-PEG)、PLEIRONICTM表面活性剂聚环氧丙烷-共-聚乙二醇)；聚(四亚甲基二醇)；羟基官能聚(乙烯基吡咯烷酮)；生物分子诸如胶原蛋白、壳聚糖、藻酸盐、纤维蛋白、纤维蛋白原、纤维素、淀粉、葡聚糖、糊精、透明质酸、透明质酸的片段和衍生物、肝素、肝素的片段和衍生物、糖胺聚糖(GAG)、GAG衍生物、多糖、弹性蛋白、弹性蛋白模拟物或其组合。
在一些实施方案中，聚乙烯被用于构建设备的至少一部分。例如，聚乙烯可以用于表面上的整形外科植入物，其被设计成因此在关节或髋替代中接触另一植入物。当聚乙烯与其他材料接触时，聚乙烯非常耐用。当金属植入物在聚乙烯表面上移动时，如在大多数关节替代中一样，接触为非常平滑的并且磨损量最小。更年轻或更有活力的患者可能受益于具有甚至更强的耐磨损性的聚乙烯。这可以通过称为交联的方法来实现，所述交联在构成聚乙烯的元素之间产生更强的结合。交联的适当的量取决于植入物的类型。例如，髋植入物的表面可能需要与膝盖植入物的表面不同程度的交联。
聚合物材料的其他实例可以在以下专利中发现：例如，Domb的美国专利号6,127,448、Klein和Brazil的美国专利公布号2004/0148016、Burghard等的美国专利公布号2009/0169714、Briquet等的美国专利号6,406,792、Martens等的美国专利公布号2008/0003256，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。
剂量和施用
通常，剂量范围为0.0005mg/kg体重至25g/k体重。在一些实施方案中，剂量范围为0.001mg/kg体重至0.5g/kg体重、0.0005mg/kg体重至0.1g/kg体重、0.001mg/kg体重至0.05g/kg体重。作为另一个替代方案，剂量针对局部递送来选择，并且不一定针对体重或为了实现一定的血清水平来选择，而是为了实现局部作用，例如对于局部注射、植入或其他局部施用于眼睛。
上述剂量的施用可以在有限的时间段内重复。在一些实施方案中，剂量被每天给予一次或每天多次，例如但不限于每天三次。在优选的实施方案中，上述剂量被每天施用持续若干周或若干月。治疗的持续时间取决于受试者的临床进展和对疗法的反应性。在初始较高的治疗剂量之后考虑连续的、相对低的维持剂量。
可用于本文所述的方法和组合物中的药剂可以通过局部、静脉内(通过快速注射或连续输注)、口服、通过吸入、腹膜内、肌内、皮下、腔内施用，并且可以通过蠕动方式(若期望)或通过本领域技术人员已知的其他方式递送。优选将用于本文所述的方法的药剂局部施用于眼睛。对于肿瘤的治疗，药剂可以全身施用，或可替代地，可以直接施用于肿瘤，例如通过瘤内注射或通过注射到肿瘤的初级血液供给中。
含有本文公开的至少一种药剂的治疗组合物可以常规地以单位剂量施用。当关于治疗组合物使用时，术语“单位剂量”是指适于作为单一剂量用于受试者的物理上离散的单位，每个单位含有与所需生理学上可接受的稀释剂(即载体或媒介物)缔合的经计算可产生期望治疗效果的预定量的活性材料。
组合物以治疗有效量、以与剂量制剂相容的方式施用。待施用的量和时间取决于待治疗的受试者、受试者系统利用活性成分的能力以及期望的治疗效果的程度。可以通过靶向部分(诸如像抗体或靶向脂质体技术)来靶向药剂。在一些实施方案中，纤调蛋白活性抑制剂可以通过使用双特异性抗体(例如通过反配体抗体(Ab)和针对特异性靶标的Ab的化学连接产生的抗体)靶向组织特异性靶标或肿瘤特异性靶标。为了避免化学缀合物的限制，抗体的分子缀合物可用于产生位于细胞表面分子处的重组双特异性单链Ab引导配体和/或嵌合抑制剂。向纤调蛋白活性抑制剂中添加抗体允许附着的药剂在期望的靶位点处叠加性地累积。可以采用基于抗体或基于非抗体的靶向部分将配体或抑制剂递送到靶位点。优选地，出于这种目的，使用用于未调节的抗原或疾病相关的抗原的天然结合剂。
需要施用的活性成分的精确量取决于从业者的判断，并且对每个个体都是特定的。然而，本文公开了用于全身施加的合适的剂量范围，并且所述剂量范围取决于施用途径。施用的合适方案也是可变的，但典型的是初始施用、接着通过随后的注射或其他施用在一个或多个间隔处重复剂量。可替代地，考虑足以在血液中将浓度维持在体内疗法指定的范围内的连续静脉内输注。
药剂可以适用于基于导管的递送系统，所述递送系统包括涂覆的球囊、缓释药物洗脱支架或其他药物洗脱形式、微胶囊PEG脂质体或用于使用或不使用辅助技术(诸如超声波)的直接机械干预来递送的纳米珠粒。
药物组合物
本发明涉及可用于实践本文所述的治疗方法的治疗组合物。治疗组合物含有生理上可耐受的载体以及作为活性成分溶解或分散在其中的本文所述的活性剂。在优选的实施方案中，当出于治疗目的施用于哺乳动物或人患者时，治疗组合物不具有免疫原性。如本文所用，术语“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”和其语法变化，它们是指可互换使用的组合物、载体、稀释剂和试剂，并且代表能够施用于哺乳动物或施用在哺乳动物上而不产生不期望的生理作用(诸如恶心、头晕、胃痛等)的材料。药学上可接受的载体不会促进增加对与其混合的药剂的免疫应答，除非如此期望。含有溶解或分散在其中的活性成分的药物组合物的制备在本领域中为熟知的，并且不需要基于制剂来限制。通常，此类组合物被制备成作为液体溶液或混悬液的可注射物；然而，也可以制备成适于在使用之前在液体中溶解或混悬的固体形式。所述制备也可为乳化的或作为脂质体组合物呈现。活性成分可以与药学上可接受的并且与活性成分相容的并且以适用于本文所述治疗方法的量的赋形剂混合。合适赋形剂包括，例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等以及其组合。另外，若期望，组合物可以含有少量辅助物质，诸如，增强活性成分的有效性的润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。本发明的治疗组合物可以包括其中组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括酸加成盐(由多肽的游离氨基形成)，所述酸加成盐由无机酸(诸如像盐酸或磷酸)或有机酸(诸如醋酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。由游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱(诸如像钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物)和这样的有机碱(诸如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等)。生理上可耐受的载体在本领域中为熟知的。示例性液体载体为无菌水溶液，其不含有除了活性成分和水之外的材料，或含有缓冲液，诸如在生理pH值下的磷酸钠、生理盐水或两者(诸如磷酸盐缓冲盐水)。此外，含水载体可以含有多于一种缓冲盐，以及盐(诸如氯化钠和氯化钾)、右旋糖、聚乙二醇和其他溶质。液体组合物还可以含有除了水之外以及排除掉水的液相。示例性此类另外的液相为甘油、植物油(诸如棉籽油)和水-油乳剂。在治疗具体病症或病状中有效的本文所述的方法中使用的活性药剂的量将取决于病症或病状的性质，并且可以通过标准临床技术来确定。
应当理解，先前详述和以下实施例仅是说明性的，并且不应视为对本发明的范围的限制。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的实施方案进行各种改变和修改，这对本领域的技术人员将是显而易见的。此外，所有专利、专利申请和鉴定的出版物都出于描述和公开例如所述出版物中所述的可能结合本发明使用的方法的目的以引用的方式明确并入本文。这些出版物仅因它们的公开内容在本申请的提交日期之前而加以提供。就此而言，任何事物都不应解释为认可由于先前发明或因为任何其他原因而使发明者无权先于所述公开。所有关于日期的陈述或关于这些文档的内容的表述都是基于可为申请人所用的信息且不构成关于这些文档的日期或内容的正确性的任何认可。
以下实施例说明而不是限制本发明的实施方案。
实施例1：纤调蛋白增强皮肤伤口愈合期间的血管化
概述
方法：通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)测定、MatrigelTM栓塞植入物测定和啮齿动物初级闭合伤口模型来评估FMOD在体内的血管生成作用。通过细胞侵袭以及人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的尺寸参数和拓扑参数来记录FMOD在体外的血管生成作用。
结果：我们提供了FMOD显著增强血管化的证据：首先，FMOD在CAM上推进血管形成；其次，FMOD明显地刺激毛细血管浸润到皮下植入在成年小鼠中的MatrigelTM栓塞中；并且最后，FMOD在多种成年啮齿动物皮肤伤口模型中稳健地促进血管生成。而且，FMOD施用还恢复了fmod-/-小鼠伤口的血管分布。为了支持这一点，FMOD不仅通过上调血管生成基因而且通过下调抑制血管生成基因，保证了成年啮齿动物伤口中的血管生成优势微环境。另外，FMOD显著增强了在体外的HUVEC侵袭和管状结构(TLS)形成。
结论：总之，我们证明，除了减少瘢痕形成之外，FMOD还促进血管生成。由于血管组织并且调节伤口愈合，所以FMOD潜在的血管生成特性将进一步扩大FMOD的临床应用以用于不良血管化的伤口的皮肤愈合。
引言
皮肤伤口愈合为涉及细胞事件的复杂级联以产生损伤的皮肤的表面重塑、重建和恢复拉伸强度的自然反应。不幸的是，由于伤口愈合为复杂的多方面的过程(1,2)的事实，因此一些皮肤伤口愈合失败的原因仍然很少被理解。延缓伤口愈合的根本问题为缺乏功能性细胞外基质(ECM)来刺激、引导并且协调愈合。例如，在成年小鼠皮肤伤口模型中，单个ECM分子纤调蛋白(FMOD)的缺乏导致成年小鼠皮肤伤口模型中延迟的真皮成纤维细胞迁移、延迟的肉芽组织形成、延迟的伤口闭合以及随后增加的瘢痕形成(3)。FMOD为广泛分布的小的富含亮氨酸的蛋白聚糖(SLRP)，其通过与胶原结合来调节ECM组装、组织和降解(4-10)。FMOD在细胞命运决定和胎儿无瘢痕伤口愈合中起重要作用(5,11-14)。此外，我们先前的研究已经证明FMOD控制成人皮肤伤口愈合的重要方面。与它们的野生型(WT)对应物相比，FMOD无效(fmod-/-)小鼠具有降低的纤连蛋白沉积、无组织的胶原构造、改变的转化生长因子(Tgf)β信号传导以及减少的真皮成纤维细胞浸润和接着的阻碍血管生成(3,4,16)。另一方面，以腺病毒和蛋白质形式的FMOD施用减少了成人皮肤伤口中的瘢痕形成(17,18)。具体地，我们已经证明FMOD显著促进成纤维细胞迁移到伤口区域，这有助于及时的伤口闭合并且减少瘢痕形成(3,16,19)。因为新生成的血管提供营养以支持活细胞、促进肉芽组织形成并且有利于碎片的清除(20-22)，所以伤口愈合不会在无血管生成(内皮细胞(EC)的新血管形成过程)的情况下发生。我们先前的研究显示，延缓的fmod-/-小鼠伤口愈合明显地与减少的血管再生有关(3)，这表明了FMOD与血管生成之间的直接关系。在本研究中，调查了FMOD在未损伤和受伤的情况下对血管生成的作用。
材料和方法
卵内鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)测定
如先前所述进行卵内CAM测定(23,24)。将受精鸡蛋(Charles River Labs,NorthFranklin,CT)在37℃和60％相对湿度下在鸡蛋孵育器中进行孵育。在第3天，从鸡蛋的尖端取出5ml白蛋白。在壳上切出矩形窗口作为CAM的入口。在第10天，将30μl的l:3稀释的生长因子减少的MatrigelTM(BD Bioscience,Franklin Lakes,NJ)中的2.0mg/ml的FMOD装载在高压灭菌的5x 5mm聚酯网层(网格尺寸：530μm；Component Supply Company,Fort Meade,FL)上，并且在移植到CAM上之前在37℃下孵育45分钟用于凝胶形成。将非FMOD磷酸盐缓冲盐水(PBS)对照以1cm距离移植到相同的CAM上。在第13天，切除CAM并且拍照。通过ImageJ(NIH,Bethesda,MD)直接在网下测量毛细血管区域密度(25)。
MatrigelTM栓塞测定
将含有0或4.0mg/ml FMOD的400μl生长因子减少的MatrigelTM皮下注射到成年129/sv雄性小鼠的腹部，在注射后14天收获覆盖皮肤(26)。
伤口生成
从每只动物中切下4块(每只成年雄性129/sv小鼠)或6块(每只成年雄性Sprague-Dawley大鼠)全部厚度10mm x 3mm的皮肤椭圆与下面的脂膜肌。所有伤口分开至少2cm以最小化相邻伤口的影响。每个开放伤口边缘在初次闭合之前注射25μl PBS或PBS中的0.4mg/ml重组人FMOD(25μl x 2个边缘＝50μl/伤口)。在损伤后第7天除掉缝合线，并且在损伤后第14天收获伤口。组织被中央平分用于组织学或基因表达分析(3,4,14,16)。
组织学和免疫组织化学(IHC)染色
在4％多聚甲醛中固定后，将样品脱水、石蜡包埋并且以5μm的增量切片以用于苏木精和曙红(H&E)染色、天狼猩红(PSR)染色和IHC染色(3,4)。使用PSR耦合偏振光显微镜(PSR-PLM)来鉴定伤口区域(3)。血管由血管假性血友病因子(vWF；(Abeam Inc.,Cambridge,MA)来鉴定和定量。
基因表达测定
使用具有DNA酶处理的迷你试剂盒(Qiagen)分离RNA(3,16)。将1.0μg小鼠RNA用于使用RT-qPCR的iScriptTM逆转录超级混合物(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)的逆转录。使用基因表达测定(Life Technologies)和具有ROX(Bio-Rad Laboratories)的SsoFastTM探针超级混合物(Life Technologies)在7300实时PCR系统(Life Technologies)上进行定量RT-PCR(qRT-PCR)。同时，将从成年大鼠伤口分离的2.5μg RNA注射到RT2第一链试剂盒(Qiagen)中用于逆转录。根据制造商的方案以大鼠伤口愈合RT2PCR阵列(Qiagen)的96孔形式进行qRT-PCR。测试了三种不同的cDNA模板。伴随的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)用作看家基因标准。数据分析由制造商的在线服务实现(http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php).
细胞培养
根据制造商说明书(Life Technologies)，将传代3-6次的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养在增补有低血清生长补充物的培养基200PRF中。
管状结构(TLS)形成分析
使用Life Technologies提供的技术内皮管形成测定方案(http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/angiogenesis-protocols/endothelial-cell-tube-formation-assay.html)在体外测定TLS。简单来说，在用提供有不同剂量的FMOD的培养基200PRF中的2.5x104个HUVEC接种之前，将24孔板用100μl/孔的减少的生长因子基底膜基质在37℃下涂覆持续1小时。4小时后通过使用奥林巴斯荧光显微镜(Center Valley,PA)记录每孔5个图像和每个处理4个孔。通过用Image J记录尺寸分析和拓扑分析来评估图像(http://image.bio.methods.free.fr/IrnageJ/7Angiogenesis-Analyzer-for-ImageJ.html&lang＝en#outil_sommaire_0)。
细胞侵袭测定
使用具有8μm孔径荧光阻断PET径迹蚀刻膜(BD Bioscience)的HTS Fluoroblok插入物在24孔组织培养板中进行细胞侵袭测定。将插入物的上表面用100μl 2mg/ml减少的生长因子基底膜基质(Life Technologies)涂覆，并且置于含有750μl培养基的24孔组织培养板中。在每个插入室中添加在具有不同剂量的FMOD的500μl培养基中的2.5x104个HUVEC，并且使其侵袭膜的下侧24小时。通过用棉签擦拭膜的上侧来除去非侵袭细胞。固定侵袭细胞并且在计数之前用0.4mg/ml的4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)染色(3)。
统计分析
统计显著性由OriginPro 8(Origin Lab Corp.,Northampton,MA)来进行，包括单因素方差分析、配对t-检验、双样本t-检验和Mann-Whitney分析。小于0.05的P值被认为是统计学上显著的。
结果
FMOD在未损伤的情况下促进血管化。施用FMOD的CAM示出比PBS对照高1.5倍比例的大直径血管(图1)，这证实FMOD在发育期间促进血管生成。由于成人的血管生成可能与发育过程中的重要方式不同(27)，所以使用了预先记录的MatrigelTM栓塞测定(26)来证实FMOD在体内的促血管生成作用。FMOD在MatrigelTM栓塞皮下植入的成年小鼠中明显地提高血管生成，这些小鼠的毛细血管密度为非FMOD栓塞的小鼠的4倍(图8)。因此，FMOD为未损伤的情况下的促血管生成因子。
FMOD对于伤口愈合期间的血管生成是很重要的。与我们先前在损伤后第7天的研究(3)一致，在损伤后第14天成年fmod-/-小鼠皮肤伤口的血管生成与年龄匹配的WT伤口相比减少了约50％(图2)。相反，外源性FMOD施用使fmod-/-伤口的血管分布恢复到与FMOD处理的WT伤口相同的水平，这进一步表明FMOD缺乏为造成fmod-/-小鼠伤口中血管生成减少的原因(图2)。另外，FMOD处理的成年WT小鼠皮肤伤口的毛细血管密度比PBS对照组的毛细血管密度高约2.6倍(图2)。这与FMOD施用到建立的成年大鼠皮肤伤口模型导致伤口血管分布的显著增加的发现一致(图3)。因此，这些结果强烈地赞同了我们的假设，即FMOD在未损伤和受伤的情况下都为血管生成性的。
FMOD广泛增强血管生成基因的转录并且阻碍抑制血管生成基因的表达
在皮肤中过表达血管内皮生长因子(Vegf)和血管生成素1(Angpt1)的双转基因小鼠示出更高的血管数量和大小(28)。Vegf在伤口愈合期间由表皮大量产生，并且通过增强微血管通透性以及刺激EC增殖和迁移对血管生成具有强烈的刺激作用(29-33)。成年WT和fmod-/-小鼠未受伤的皮肤组织之间vegf的表达不存在有意义的差异；然而，在损伤后第7天和第14天，WT伤口中的vegf水平显著增加(图4，左)。相比之下，在整个14天伤口愈合时期中fmod-/-伤口中的vegf表达一直保持在低水平(图4，左)。同时，FMOD在WT和fmod-/-成年小鼠伤口中都显著刺激vegf表达(图4，左)。像Vegf一样，Angpt1对血管内皮具有高度特异性。Angpt1由周细胞分泌，是EC生存和增殖以及血管成熟所需要的(28,32,34)。尽管在成年WT和fmod-/-小鼠之间没有观察到未受伤的皮肤组织中angpt1表达的值得考虑的差异，但是在伤口闭合后fmod-/-伤口中angpt1的转录水平显著低于年龄匹配的WT小鼠伤口的angpt1的转录水平(图4，右)。有趣的是，FMOD处理的WT和fmod-/-成年小鼠伤口在损伤后第14天具有相似的vegf和angpt1水平(图4)，这与它们相似的伤口毛细血管密度相关(图2)。考虑到fmod-/-伤口具有减少的血管分布(其可以通过外源性FMOD施用来拯救)的事实，这些数据与肉芽组织形成期间的Vegf的关键的血管生成功能以及Angpt1的重要的对血管重塑和成熟的介导高度相关(28,34-36)。
过去已经鉴别了许多血管生成因子和抑制血管生成因子(37,38)。为了进一步丰富我们对于在伤口愈合期间FMOD如何影响血管生成相关基因的知识，在成年大鼠皮肤伤口模型中采用大鼠伤口愈合的RT2PCR阵列(Qiagen,Valencia,CA)用于高通量基因表达分析。如上示出的成年小鼠数据所见，FMOD施用提高了angpt1和vegf表达(图5)。此外，FMOD不仅上调angpt1和vegf的表达，而且上调其他血管生成基因的表达，诸如tgfα[其刺激Es的趋化反应、增殖和Vegf表达(39-41)]、成纤维细胞生长因子(fgf)2[其诱导EC增殖、迁移和Vegf分泌(32,42)]、血小板衍生的生长因子(pdgf)α[其将结缔组织细胞(诸如成纤维细胞和肥大细胞)护送到伤口区域中以产生血管生成因子，并增强Vegf和Fgf2的血管生成作用(43-46)]以及集落刺激因子(csf)3[其招募单核细胞以触发血管生成细胞因子的合成(33)](图5)。另一方面，FMOD在伤口闭合后降低抑制血管生成的基因的水平，包括干扰素(ifn)γ[其抑制EC生长和Vegf表达(47-49)并且阻断Fgf和Pdgf诱导的毛细血管生长(50)]、tgfβ1[其阻碍分化的EC出芽的激活，并且因此维持内皮静止(51)]以及纤溶酶原[plg；其抑制EC增殖(52)以及EC对Fgf和Vegf(53)的反应](图5)。因此，FMOD在成年啮齿动物伤口模型中保证了血管生成有利的基因表达网络。
FMOD在体外促进EC管状结构(TLS)形成
为了探索FMOD对EC出芽(spouting)(血管生成的初始步骤(21,54))的直接作用，将原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种在含有层粘连蛋白、胶原IV、巢蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖的基质(Life Technologies,Grand Island,NY)中，以便模拟伤口愈合血管生成情况。HUVEC自发获得伸长的形态，并且在接种后3小时在凝胶中形成清晰可见的毛细血管网络(图6，上)。广泛范围的FMOD(10-250μg/ml)明显地增强了HUVEC TLS形成，并且随后建立了称为复杂网的多边形结构(图6，上)。定量分析证明，FMOD显著增加了HUVEC TLS的尺寸参数(每区域的细胞TLS网络的总长度)和拓扑参数(每区域的连接点、分支和网的个数)(图6，下)。与先前显示了EC迁移和多边形结构形成之间的正相关的研究一致(55)，我们发现FMOD在体外通过基质显著刺激HUVEC侵袭(图7)。因此，FMOD通过促进EC迁移/侵袭至少部分地表现出其血管生成功能。
图8示出了皮下注射到成年129/sv雄性小鼠腹部内的MatrigelTM栓塞。H&E染色(上)与针对vWF的IHC染色(中)一起示出，所述IHC染色用于鉴定和定量血管(下)。血管用红色箭头指示。FMOD：4.0mg/ml x 400μl/栓塞。由Mann-Whitney分析比较的显著差异(P<0.05)用星号标记(N＝5)。比例尺＝200μm。
图9示出了在损伤后第14天证明成年小鼠皮肤伤口(由虚线勾画)的H&E染色和PSR-PLM。FMOD：0.4mg/ml x 50μl/伤口。比例尺＝200μm。
图10示出了损伤后第14天成年大鼠皮肤伤口的H&E染色。伤口区域由虚线勾画，而IHC染色区域由虚线框勾画。FMOD：0.4mg/ml x 50μl/伤口。比例尺＝400μm。
讨论
血管生成(通过原始血管网络的出芽、分裂和重塑由先前存在的血液脉管系统形成新血管的过程)由作用于由不同组的生长因子和ECM分子调节的EC的多种信号所引起(32,44,54)。到目前为止，大多数关于血管生成的研究集中于可溶性因子，诸如Vegf和Fgf2(30-33,42)。然而，不断增加的报道显示，细胞-ECM相互作用对于EC生长、分化、凋亡和对可溶性生长因子的反应也是关键性的(10,56,57)。例如，EC-ECM相互作用的阻断抑制了体内的新血管化和体外的TLS形成(58-60)。这些发现指示成功的血管生成需要EC、血管生成因子和周围ECM分子(诸如SLRP)之间的动态时间和空间调节的相互作用(21,22,32)。
SLRP为存在于所有组织的ECM内的蛋白质家族，包括饰胶蛋白聚糖、光蛋白聚糖和FMOD(4-10)。由于最近的研究已经示出，SLRP与多种细胞表面受体、细胞因子、生长因子和其他ECM组分相互作用，这导致细胞-ECM串扰和多种生物过程的调整(10-15)，SLRP的常见功能远远超出其在ECM中的结构功能(10,15,61)。具体地，深入研究提出了饰胶蛋白聚糖在血管生成中的有争议的功能：饰胶蛋白聚糖在发育和正常伤口愈合期间为促进血管生成的，但是在肿瘤血管生成期间为抗血管生成的，这是因为饰胶蛋白聚糖干扰血小板反应蛋白-1、抑制内源性肿瘤Vegf产生并且诱发细胞外周纤维基质的稳定化的能力(10)。另外，Niewiarowska等揭示光蛋白聚糖通过降低EC的蛋白水解活性来抑制血管生成(62)。然而，不同于饰胶蛋白聚糖和光蛋白聚糖，我们当前的研究显示FMOD为血管生成ECM分子。尽管FMOD和光蛋白聚糖呈现密切的同源性并且在I型胶原上共享相同的结合区域(63-65)，但它们对血管生成以及上皮迁移(3,16,66)的不同影响进一步支持了FMOD和光蛋白聚糖似乎没有功能冗余(特别在皮肤伤口愈合期间)的假设。
在本研究中，我们证明了FMOD不仅在发育期间明显地增强血管生成，如在卵内CAM测定中所记录的，而且还显著地刺激血管生成，如MatrigelTM栓塞测定以及成年啮齿动物皮肤伤口模型中的毛细血管密度测量所确认的。另外，fmod-/-小鼠中损害的伤口的血管生成可以通过外源性FMOD施用来恢复。在细胞水平上，我们证实FMOD在体外推进HUVEC迁移/侵袭和TLS形成。我们先前的研究还发现，FMOD在对EC增殖没有值得考虑的影响的情况下，在体外促进EC细胞粘附、扩散和肌动蛋白应力纤维形成以用于血管化(24)。因此，FMOD为直接调整EC行为的血管生成ECM分子。除EC之外，壁细胞(诸如成纤维细胞和周细胞)和炎性细胞(诸如单核细胞和肥大细胞)也有助于伤口血管生成(54,67)。通过刺激各种血管生成因子(包括angpt1、vegf、tgfα、fgf2、pdgfα和csf3)的表达，FMOD还在伤口愈合过程期间在体内激活这些血管生成相关的细胞。相比之下，Ifnγ和Plg为涉及伤口愈合的抑制血管生成的促炎症分子(47-50,52,53,68,69)。另外，Plg特别是在再上皮化中也起重要作用，因为在Plg缺乏的小鼠中伤口上的角质化细胞迁移被延迟(70)。
在本研究中，FMOD施用在成年啮齿动物伤口中降低了ifnγ和plg水平并且增加了血管生成，这与我们先前的观察，即fmod-/-小鼠的皮肤伤口表现出延长的炎症、升高的上皮迁移和不足的血管生成(3,16)高度相关。而且，调节伤口愈合的多能生长因子Tgfβ1，在发育的早期阶段以Vegf非依赖性方式促进内皮细胞分化，但在分化的EC中抑制出芽血管生成(51)。因此，伤口闭合后较低的tgfβ1转录也可有助于在FMOD治疗的伤口中增强血管生成。与先前的研究(24,71)一致，FMOD施用通过刺激血管生成因子并且降低抑制血管生成分子在体内诱导用于伤口愈合的促血管生成微环境。
总之，作为调查SLRP对伤口愈合的影响的先驱组之一，我们阐明了FMOD在受伤情况下的血管生成特性，其至少部分通过促进EC激活和伤口区域的浸润来发挥功能。虽然由于外部因素(诸如细菌抑制)的数量增加从临床前到临床环境的转译可能是很困难的，但总的来说，当前的研究表明，FMOD维持作为伤口管理的有吸引力的治疗候选者的潜力，特别是对于由于异常细胞浸润和血管生成不足而患有伤口愈合受损(诸如在糖尿病性伤口的情况下)的患者(72-74)。
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实施例2.纤调蛋白在啮齿动物和猪皮肤伤口模型中减少瘢痕形成
皮肤瘢痕每年影响超过1亿患者，并且为患有衰弱性医学病状的那些患者的主要关注点。不幸的是，当前的瘢痕治疗和减少的方法为最低效的或具有不期望的副作用。通过使用胎儿啮齿动物皮肤伤口模型，我们证明纤调蛋白(FMOD)对于无瘢痕胎儿型修复是必需的。FMOD还在功能缺失和获得啮齿动物模型中显示出有力的抗瘢痕形成作用，并且在成年啮齿动物模型和模拟正常的和肥大的人皮肤修复的两种猪模型中增加了伤口拉伸强度。FMOD以同种型特异性和信号转导特异性的方式来调控转化生长因子(TGF)-β信号传导，而不是简单地拮抗。因此，FMOD诱导成纤维细胞迁移、分化和收缩，其及时地加速伤口闭合并抑制纤维化细胞外基质表达，这促进了瘢痕形成减少。而且，FMOD刺激白细胞介素1β表达，白细胞介素1β是已知的肌成纤维细胞凋亡和参与病理性瘢痕形成的主要细胞类型的促进剂。总体上，FMOD通过不同的信号传导途径驱动细胞迁移、分化和收缩以及肌成纤维细胞凋亡，以促进最佳修复。这些发现强烈地表明FMOD用于预防和治疗人瘢痕(诸如肥大性瘢痕、瘢痕疙瘩和其他纤维化病状)的潜在的临床效用。
本领域技术人员仅仅使用常规试验将知道或能够确定本文所描述的发明的具体实施方案的很多等效方案。这些和所有其他等效方案意图包含在以下权利要求中。

Claims (17)

1.一种促进组织修复的方法，所述方法包括根据给药方案向受试者递送治疗有效量的纤调蛋白(FMOD)、FMOD多肽、FMOD肽或其变体或衍生物或类似物以使得损伤的组织形成具有改善病状的修复的组织，其条件为所述改善病状并非皮肤瘢痕形成或角膜瘢痕形成的改善病状。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述组织选自脑、肌肉、皮肤、骨、神经、腱、血管、脂肪、筋膜或韧带。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述组织衍生自内胚层、中胚层和外胚层。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述组织为结缔组织、肌肉组织、神经组织或上皮组织中的一种。
5.如权利要求1所述的方法，其中包括在药物中的FMOD、FMOD多肽、FMOD肽或其变体或衍生物或类似物被包括在递送媒介物中，所述递送媒介物包含治疗有效量的FMOD、FMOD多肽、FMOD肽或其变体或衍生物或类似物。
6.如权利要求1所述的方法，其中递送由植入物实现。
7.如权利要求1所述的方法，其中递送由基因构建体实现，所述基因构建体在递送至所述受试者时表达治疗有效量的FMOD、FMOD多肽、FMOD肽或其变体或衍生物或类似物。
8.如权利要求1所述的方法，其中递送通过具有或不具有递送媒介物或递送设备的全身递送或局部递送来实现。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者为人患者。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述改善病状包括增强细胞迁移到修复的组织和器官系统中以增加组织愈合。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述改善病状包括改善组织血管化和组织强度。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述改善病状包括所述修复的组织中炎症的减少。
13.如权利要求6所述的方法，其中所述植入物为医疗植入物。
14.如权利要求6所述的方法，其中所述植入物为整形植入物。
15.如权利要求8所述的方法，其中局部递送包括递送到局部组织。
16.如权利要求15所述的方法，其中局部递送为递送到上皮内、真皮内、皮下、筋膜内、肌内、骨内、神经内、软骨内、眼内、血管周围-动脉静脉、外淋巴、或列出的所有各种器官-心脏、肝脏、脾脏、肠、肺、脑或眼睛。
17.如权利要求15所述的方法，其中全身递送为通过静脉、动脉、淋巴管、脑脊髓液或腹膜内途径中的一种实现的递送。
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