CN111587127B - 药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及一种基于聚丙烯腈(PANi)的药物组合物，其提供用于治疗脊髓创伤和/或脊髓损伤的多孔植入物。本公开内容特别涉及一种药物组合物，其包含聚丙烯腈(PANi)和/或弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)，以形成PANi‑E和/或PANi‑C和/或PANi‑E‑C聚合物网络。具体地说，本公开内容涉及一种药物组合物，其包含聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)，该聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)一起形成聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)、胶原蛋白(C)聚合物网络(PANi‑E‑C)，其中聚丙烯腈(PANi)可以交联以形成交联的互穿的聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)聚合物网络(xpi‑PANi‑E‑C)，并且其中弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的二级蛋白质结构重新定向。本公开内容扩展到药物组合物在治疗脊髓创伤和/或脊髓损伤中的用途。

Description

药物组合物
技术领域
本公开内容涉及一种药物组合物，通常是用于治疗人或动物身体内的脊髓创伤和/或脊髓损伤的药物组合物，及其制备方法。具体地说，本公开内容涉及一种基于聚丙烯腈(PANi)的药物组合物，其提供用于治疗脊髓创伤和/或脊髓损伤的多孔植入物。进一步具体地说，本公开内容涉及一种药物组合物，其包含聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)，该聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)一起形成聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)、胶原蛋白(C)聚合物网络(PANi-E-C)，其中聚丙烯腈(PANi)可以交联，以形成交联的互穿的聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)聚合物网络(xpi-PANi-E-C)，并且其中弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的二级蛋白质结构重新定向。本发明扩展到药物组合物在治疗脊髓创伤和/或脊髓损伤中的用途，并且进一步扩展到治疗脊髓创伤和/或脊髓损伤的方法。
背景技术
脊髓损伤(SCI)以及特别是创伤性脊髓损伤(TSCI)通常对人或动物是毁灭性的，导致瘫痪或部分瘫痪。SCI和TSCI提供了许多复杂的干预挑战，包括例如，广泛的炎症、轴突束缚、疤痕形成、神经元退化和功能丧失，这些都需要在甚至可实现边缘神经元恢复之前解决。
据说，在人群中每百万人中有223至755之间的人患有SCI和/或TSCI的后遗症，每年每百万人中约有10.4至83人患有SCI和/或TSCI。进一步值得注意的是，患有SCI/TSCI的普通人的寿命几乎与未患有SCI/TSCI的人一样长。因此，迫切需要改善患有SCI/TSCI的人的治疗和/或修复和/或恢复结果。
脊髓损伤触发并涉及若干生物分子和生化事件，包括例如巨噬细胞、小神经胶质细胞突起、少突胶质细胞前体和星形胶质细胞向损伤部位的迁移。此类分子渗透到脊髓病变部位，进而产生生物分子，诸如髓鞘相关糖蛋白和硫酸软骨素蛋白聚糖。这些是促进病变部位处疤痕组织形成的抑制性分子，并且通常包括星状胶质细胞结构。疤痕组织标志着随后的病变轴突再生失败。
目前，即使在SCI/TSCI几个小时后应用，可用的神经治疗策略仍然不足够。为了有效地再生神经元组织，受损的轴突必须超过囊性腔，以修复长期受损的脊髓，从而恢复神经功能，从而需要重新整合损伤间隙。SCI的修复需要弥合损伤间隙。已有研究致力于采用生物材料作为神经导管以允许定向的轴突生长，然而，在提供有效的修复手段方面几乎没有成功。
可促进神经修复的药物组合物和/或植入物将需要提供化学和/或物理提示，以便允许神经元、神经元组织和/或轴突在所述药物组合物和/或植入物的人工环境内再生和/或增殖。
在提供用于治疗脊髓损伤的有效药物组合物和/或植入物方面的一些挑战包括，例如：(i)产生生物相容性且伴随可生物降解的组合物，该组合物使炎症减少到最低并限制神经元死亡；(ii)提供一种组合物，该组合物通过限制手术干预的数量来符合患者要求；(iii)提供一种组合物，该组合物限制对周围健康组织的手术干预的量；(iv)提供一种组合物，该组合物将在手术期间保护血-脊屏障；(v)提供一种组合物，该组合物促进胶质疤痕组织形成的减少；(vi)提供具有物理化学性质的组合物，该组合物将促进神经元生长和/或修复的粘附和/或增殖位点，从而促进神经元突起扩展到病变部位；以及(vii)提供具有模拟人或动物脊髓的物理化学性质的组合物，以减少炎症和/或排斥并促进神经元组织的生长和修复。
仍然迫切需要开发用于治疗脊髓损伤的药物组合物和/或植入物，该药物组合物和/或植入物可至少改善或部分解决上述挑战之一或现有技术中已知的其它挑战。
发明内容
广义地，并且根据本公开内容的第一方面，提供了一种药物组合物，其包含聚丙烯腈(PANi)和/或弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)，它们一起分别形成呈PANi-E和/或PANi-C和/或PANi-E-C形式的聚丙烯腈(PANi)和/或弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)聚合物网络。
药物组合物，其中聚丙烯腈(PANi)可经由交联剂而交联，使得PANi-E和/或PANi-C和/或PANi-E-C可形成交联的、多孔、半互穿的(或互穿的)聚合物网络(xpi)，其中交联的聚丙烯腈(PANi)与弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)缔合和/或键合和/或连接，从而促进蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的二级结构的重新定向。
聚丙烯腈(PANi)和/或弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)之间的缔合和/或键形成和/或连接可经由共价和/或非共价和/或非键合相互作用。共价相互作用可包括例如：σ键和/或π键。非共价相互作用可包括例如：离子的、离子-偶极、氢键、偶极-偶极、范德华、偶极-诱导的偶极、伦敦分散、π-π相互作用、π-堆积、阳离子-π相互作用和阴离子-π相互作用。非键合相互作用可能源于蛋白质弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)附近的PANi分子经历的拉伸、弯曲和扭转应变，反之亦然。
申请人出乎意料且令人惊讶地发现，在PANi-E内的蛋白质弹性蛋白(E)的二级结构的重新定向导致蛋白质弹性蛋白(E)的浓度依赖性二级结构使得无规卷曲的浓度>β-片层>α-螺旋>β-转角。在整个本说明书中，符号“＞”表示术语“大于”。
申请人出乎意料且令人惊讶地发现，在PANi-C内的蛋白质胶原蛋白(C)的二级结构的重新定向导致蛋白质胶原蛋白(C)的浓度依赖性二级结构使得α-螺旋的浓度>无规卷曲>β-转角>β-片层。
申请人出乎意料且令人惊讶地发现，在PANi-E-C内的蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的二级结构的重新定向导致蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的浓度依赖性二级结构使得无规卷曲的浓度>α-螺旋>β-片层>β-转角。
在重新定向之前，单独的弹性蛋白(E)的浓度依赖性二级结构使得β-片层的浓度>无规卷曲>α-螺旋>β-转角。
在重新定向之前，单独的胶原蛋白(C)的浓度依赖性二级结构使得β-片层的浓度>α-螺旋>无规卷曲>β-转角。
弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)的重新定向提供了蛋白质弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)的重新定向的二级结构以接近或处于其自然存在于人或动物的细胞外基质(ECM)中的天然或自然形式，从而提供了模拟脊髓的性质(即，模拟人或动物的脊髓)。
自组装可进一步促进重新定向。
重新定向赋予药物组合物独特和/或有利的化学-物理性质，包括但不限于提供模拟人或动物脊髓组织的弹性和/或机械强度和/或变形能和/或刚度和/或硬度和/或坚固度和/或回弹性，并且在其中提供了一种模拟脊髓的药物组合物。
药物组合物可具有向其赋予海绵状特性的通道和/或隧道的网络。海绵状药物组合物可为一种神经海绵。术语“神经海绵”在适当的情况下可缩写为“NS”。
当在使用中将药物组合物在人或动物体的脊髓处、附近、邻近或以与所述人或动物体的脊髓相连接的方式植入人或动物体内时，通道和/或隧道为神经组织和/或轴突生长和/或修复提供通路和/或路径和/或导管。
通道和/或隧道可包括沿其内表面凸起的构造或突起。凸起的构造或突起为神经组织或神经元组织，特别是轴突提供了锚定装置，从而促进生长和/或修复。通道和/或隧道内的突起促进提供模拟人或动物脊髓的纤维通道和/或隧道聚合物架构。
根据本公开内容的第一方面的优选实施方案，提供了一种药物组合物，其包含聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)，它们一起形成聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)、胶原蛋白(C)聚合物网络(PANi-E-C)。
药物组合物，其中聚丙烯腈(PANi)可经由交联剂而交联，以形成交联的、多孔的、半互穿的(或互穿的)聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)聚合物网络(xpi-PANi-E-C)，其中交联的聚丙烯腈(PANi)与弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)缔合和/或键合和/或连接，从而促进蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的二级结构的重新定向。
聚丙烯腈(PANi)与弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)之间的缔合和/或键形成和/或连接可经由共价和/或非共价和/或非键合相互作用。共价相互作用可包括例如：σ键和/或π键。非共价相互作用可包括例如：离子的、离子-偶极、氢键、偶极-偶极、范德华、偶极-诱导的偶极、伦敦分散、π-π相互作用、π-堆积、阳离子-π相互作用和阴离子-π相互作用。非键合相互作用可能源于蛋白质弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)附近的PANi分子经历的拉伸、弯曲和扭转应变，反之亦然。
申请人出乎意料且令人惊讶地发现，在xpi-PANi-E-C内的蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的二级结构的重新定向导致蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的浓度依赖性二级结构使得无规卷曲的浓度>α-螺旋>β-片层>β-转角。
在形成xpi-PANi-E-C的部分之前，单独的弹性蛋白(E)的浓度依赖性二级结构使得β-片层的浓度>无规卷曲>α-螺旋>β-转角。
在形成xpi-PANi-E-C的部分之前，单独的胶原蛋白(C)的浓度依赖性二级结构使得β-片层的浓度>α-螺旋>无规卷曲>β-转角。
弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)两者的重新定向提供了蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的重新定向的二级结构以接近或处于其自然存在于人或动物的细胞外基质(ECM)中的天然或自然形式。
自组装可进一步促进重新定向。
重新定向赋予xpi-PANi-E-C独特和/或有利的化学物理性质，包括但不限于提供模拟人或动物脊髓组织的弹性和/或机械强度和/或变形能和/或刚度和/或硬度和/或坚固度和/或回弹性，并且在其中提供了一种模拟脊髓的药物组合物。
令申请人惊讶的是，化学中性的聚丙烯腈(PANi)与弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)之间的缔合和/或键形成和/或连接，以及弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的随后重新定向，将导致xpi-PANi-E-C具有模拟脊髓的性质。
交联剂可为但不限于亚甲基双丙烯酰胺(MBAAm)。
xpi-PANi-E-C药物组合物可具有赋予xpi-PANi-E-C海绵状特性的通道和/或隧道的网络。海绵状xpi-PANi-E-C可为神经海绵。术语“神经海绵”在适当的情况下可缩写为“NS”。
当在使用中将xpi-PANi-E-C-NS/药物组合物在所述人或动物体的脊髓处、附近、邻近或以与所述人或动物体的脊髓相连接的方式植入人或动物体内时，通道和/或隧道为神经组织和/或轴突生长和/或修复提供通路和/或路径和/或导管。
通道和/或隧道可沿其内表面包括凸起的构造或突起。凸起的构造或突起为神经组织或神经元组织，特别是轴突提供了锚定装置，从而促进生长和/或修复。通道和/或隧道内的突起促进提供模拟人或动物脊髓的纤维通道和/或隧道聚合物架构。
根据本公开内容的第二方面，提供了一种用于治疗脊髓损伤的药物组合物，该药物组合物用于在所述人或动物体的脊髓处、附近、邻近或以与所述人或动物体的脊髓相连接的方式植入人或动物体内，所述药物组合物根据本公开内容的第一方面。
根据本公开内容的第三方面，提供了一种植入物，该植入物用于在所述人或动物体的脊髓处、附近、邻近或以与所述人或动物体的脊髓相连接的方式植入人或动物体内，所述植入物包含根据本公开内容的第一方面的药物组合物。
植入物可进一步包括载体和/或赋形剂。
根据本公开内容的第四方面，提供了一种用于治疗脊髓损伤的植入物，该植入物用于在所述人或动物体的脊髓处、附近、邻近或以与所述人或动物体的脊髓相连接的方式植入人或动物体内，所述植入物包含根据本公开内容的第一方面的药物组合物。
植入物可进一步包括载体和/或赋形剂。
根据本公开内容的第五方面，提供了聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)在制备用于治疗人和/或动物的脊髓损伤的药物组合物中的用途。
药物组合物可根据本公开内容的第一方面。
根据本公开内容的第六方面，提供了一种生产根据本公开内容的第一方面的药物组合物的方法，该方法包括以下步骤：
(i)将弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)溶解在酸性水性介质中，以形成第一溶液；
(ii)将丙烯腈添加到第一溶液中并混合，以形成第二溶液，可将第二溶液搅拌/混合直至均匀；以及
(iii)允许发生聚合和/或交联，以形成交联的、多孔、互穿的聚丙烯腈(PANi)和/或弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)聚合物网络。
根据本公开内容的第六方面的优选实施方案，提供了一种生产根据本公开内容的优选第一方面的药物组合物的方法，该方法包括以下步骤：
(i)将弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)溶解在酸性水性介质中，以形成第一溶液；
(ii)将丙烯腈添加到第一溶液中并混合，以形成第二溶液，可将第二溶液搅拌/混合直至均匀；
(iii)将引发剂，例如但不限于过硫酸铵(APS)，添加到均匀的第二溶液中，
其中引发剂引发丙烯腈的自由基聚合，以形成互穿的聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)聚合物网络(iPANi-E-C)；以及
(iv)添加交联剂，例如但不限于亚甲基双丙烯酰胺(MBAAm)，
其中交联剂使聚丙烯腈(PANi)交联，以形成交联的、多孔、互穿的聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)聚合物网络(xpi-PANi-E-C)。
步骤(i)至(iv)可按以步骤(i)开始并以步骤(iv)结束的顺序进行。
在该顺序内，步骤(iii)和(iv)可同时进行。
该方法可进一步包括步骤(v)：添加促进剂，例如四甲基乙二胺(TEMED)，其中步骤(v)在步骤(iv)之后进行。
步骤(i)的酸性水性介质可为乙酸酸性水性介质。步骤(i)可包括添加过量的冰乙酸以防止弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)从第一溶液中沉淀。
该方法可进一步包括步骤(vi)：将xpi-PANi-E-C倒入模具中，优选聚乙烯模具，并且使其凝固(其中发生进一步聚合)，形成多孔xpi-PANi-E-C海绵。优选地，使xpi-PANi-E-C凝固过夜，进一步优选在室温条件下。
该方法可进一步包括步骤(vii)：优选用双蒸馏水洗涤多孔xpi-PANi-E-C海绵。
该方法可进一步包括步骤(viii)：将洗涤过的xpi-PANi-E-C海绵在约-80℃与-60℃之间冷冻，优选持续在约8至12小时之间的时间段。
该方法可进一步包括步骤(ix)：将xpi-PANi-E-C海绵冻干，优选在约25mmtorr下持续约24小时。
提供了本公开内容的第一至第六方面中的任一方面，基本上如本文参考附图和/或示例中的任一个所描述、图示和/或例示的。
附图说明
下面将仅通过非限制性示例的方式并参考附图来描述本公开内容的实施方案，在附图中：
图1示出了典型的力-距离特征曲线，其表示在模拟脊髓的支架上进行的压缩机械测试。a)锚定件1与2之间的区域(图中阴影部分)表示了变形能，而梯度对应于刚度梯度。曲线中的最高点对应于样品在施加的应变下经受的最大载荷。b)区域2(锚定件2与3之间)和区域1(区域1与2之间)的比率表示支架的基质回弹性。
图2示出了照片(a)至(d)，其显示出根据本公开内容的水合xpi-PANi-E-C神经海绵的易于处理、负重能力和柔韧性。
图3示出了冻干的大鼠脊髓的扫描电子显微照片(a)至(d)。
图4示出了扫描电子显微照片(a)至(f)，其示出了根据本公开内容的xpi-PANi-E-C神经海绵的模拟脊髓的架构的表面。
图5示出了扫描电子显微照片(a)至(f)，其示出了xpi-PANi-E-C神经海绵的模拟脊髓的架构内的通道或隧道(所谓的“神经隧道”)。
图6示出了扫描电子显微照片(a)至(f)，其示出了xpi-PANi-E-C神经海绵的模拟脊髓的架构的纤维性质。
图7示出了扫描电子显微照片，其比较并证实了xpi-PANi-E-C神经海绵的模拟脊髓的架构，(a)示出了大鼠脊髓且(b)示出了xpi-PANi-E-C神经海绵。
图8示出了根据本公开内容的a)PANi-E神经海绵；b)PANi-C神经海绵；以及xpi-PANi-E-C神经海绵的线性等温图。
图9示出了根据本公开内容的PANi、弹性蛋白(E)、胶原蛋白(C)、PANi神经海绵、PANi-E神经海绵、PANI-C神经海绵和xpi-PANi-E-C神经海绵的FTIR光谱。
图10示出了对应于原始聚合物(a)弹性蛋白(E)、(b)胶原蛋白(C)和(c)PANi-E神经海绵、(d)PANi-C神经海绵以及(e)xpi-PANi-E-C神经海绵的酰胺I峰的傅里叶去卷积傅里叶变换/红外(FT/IR)衰减全反射(ATR)光谱。
图11示出了原始(a)胶原蛋白和(b)弹性蛋白的差示扫描量热法(DSC)热分析图。
图12示出了根据本公开内容的PANi、弹性蛋白(E)、胶原蛋白(C)、PANi神经海绵、PANi-E神经海绵、PANi-C神经海绵和xpi-PANi-E-C神经海绵的DSC热分析图。
图13示出了根据本公开内容的PANi神经海绵、PANi-E神经海绵、PANi-C神经海绵和xpi-PANi-E-C神经海绵(标记为PANi-EC)在部分施加应变值为10％-25％下的物理机械性质(SD(ML)≤0.04；SD(DE)≤0.05；SD(RG)≤0.08；SD(MR)≤9.2；n＝3)，其中(a)示出了最大载荷，(b)示出了变形能，(c)示出了刚度梯度且(d)示出了基质回弹性。
图14示出了条形图，其描绘了PANi-E神经海绵、PANi-C神经海绵和xpi-PANi-E-C神经海绵(标记为PANi-EC)的基质水合和降解特征曲线(SD(WR)≤202；SD(MH)≤118；SD(MD)≤6；n＝3)，其中(a)示出了持水性，(b)示出了基质水合且(c)示出了基质降解。
图15示出了PANi-E神经海绵、PANi-C神经海绵和xpi-PANi-E-C神经海绵(标记为PANi-EC)的药物释放特征曲线(SD(DEX)≤6.6；SD(CURC)≤4.3；n＝3)，其中(a)示出了地塞米松(dexamethasone)释放且(b)示出了姜黄素(curcumin)释放。
图16通过分子力学模拟指示了肽分子附近PANi的惯性轴线的可视化，其示出了PANi(左上)、PANi-E(右上)、PANi-C(左下)、xpi-PANi-E-C(左下)(标记为PANi-EC)。
图17指示了在真空中能量最小化后的a)胶原蛋白-弹性蛋白；和b)PANi-胶原蛋白-弹性蛋白分子复合物的几何偏好的可视化。PANi以球棒渲染示出。
图18示出了3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)测定法的表示，其示出了增殖性研究(SD≤14；n＝3)。
图19线形图示出了两个治疗组在治疗后的Basso、Beattie、Bresnahan(BBB)运动评分的变化(SD≤1；n≥3)。
图20示出了在对照组(第0组)中在脊髓损伤后28天持续时间内功能恢复程度的顺序呈现(A)至(H)
图21示出了在xpi-PANi-E-C组中在脊髓损伤后28天持续时间内功能恢复程度的顺序呈现(A)至(I)。
图22示出了苏木精(hematoxylin)和曙红(eosin)(H&E)标本基线；L2。5X物镜：NAD，突出形态学上不明显的脊髓标本。
图23示出了H&E标本-xpi-PANi-E-C-B；L2。30X物镜：2级，突出了许多退化的神经纤维(箭头)。
图24示出了H&E标本-对照；L3。8X物镜：4级。注意神经全部横向横断，其中有许多退化的神经纤维，全部结构破坏/丧失的区域(星形)，并由空泡化的格子细胞替代(箭头)。
图25示出了H&E标本xpi-PANi-E-C-A；L3。3X物镜：5级。注意神经全部横向横断，并由大量(假定)再生神经母细胞替代(粗箭头)。
图26示出了H&E标本xpi-PANi-E-C-A；L3。16X物镜：5级。注意神经全部横向横断，其中有许多退化的神经纤维，全部架构破坏/丧失的区域(星形)，并由嗜酸性细胞外基质(箭头)和多核(假定)再生神经母细胞替代(大箭头)。
图27示出了EDI标本基线；L2。40X物镜：0级。注意分散的阳性胶质细胞数量少(箭头)。
图28示出了EDI标本xpi-PANi-E-C-B；L1。40X物镜：2级。注意阳性胶质细胞(箭头)和内皮细胞(粗箭头)。
图29示出了EDI标本xpi-PANi-E-C-A；L1。40X物镜：4级。除了存在阳性多核细胞(星形)外，注意无数且常有的退化/退化的阳性胶质细胞(箭头)，指示在多核格子细胞和/或原始神经母细胞内存在组织细胞标记物表达。
图30示出了诱导型一氧化氮合酶(iNOS)标本基线；L2。5X物镜：0级。注意在白质(箭头)和灰质(星形)的整个细胞内和细胞外组分中的基线染色水平。
图31示出了iNOS标本xpi-PANi-E-C-C；L2。5X物镜：2级。注意完整的和病变外白质内的染色强度增加(箭头)。
图32示出了钙活化的非溶酶体中性蛋白酶(钙蛋白酶)标本xpi-PANi-E-C-A；L1。10X物镜：1级。注意多核巨细胞(箭头)内细胞内染色(红色)的最小程度的存在。
图33示出了钙蛋白酶标本对照；L。15X物镜：1级。注意受损的脊髓(箭头)内细胞内/细胞外染色(红色)的最小程度的存在。
图34示出了胶质纤维性酸性蛋白/神经丝-200(GFAP/NF-200)标本基线；L1。60X物镜：0级。注意弥漫性和细网状GFAP阳性结构网络(红色)和大小可变的线性NF-200阳性管状网络(绿色)。注意-细胞核染成蓝色。
图35示出了GFAP/NF-200标本xpi-PANi-E-C-A；L1。60X物镜：4级。注意细网状GFAP阳性结构网络的全部丧失，并由弥散且均质的GFAP阳性蛋白沉积物(星形)替代。残留的少量NF-200阳性物质由凝结的球状沉积物表示(箭头)。
图36示出了GFAP/NF-200标本xpi-PANi-E-C-A；L1。60X物镜：4级；边缘区。注意在修复性病变边缘的GFAP阳性蛋白的边缘变圆和增厚(箭头)。
具体实施方式
现在将描述本公开内容的具体但非限制性的实施方案。上面的发明内容的内容在下文中通过引用的方式重复，以避免冗长的重复。
通常，并且根据本公开内容的第一方面，提供了一种药物组合物，其包含聚丙烯腈(PANi)和/或弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)，它们一起形成呈PANi-E和/或PANi-C和/或PANi-E-C形式的聚丙烯腈(PANi)和/或弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)聚合物网络。通常，聚丙烯腈(PANi)经由交联剂交联，使得PANi-E和/或PANi-C和/或PANi-E-C可形成交联的、多孔、半互穿的(或互穿的)聚合物网络(xpi)。交联的聚丙烯腈(PANi)与弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)缔合和/或键合和/或连接，从而促进蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的二级结构的重新定向。
聚丙烯腈(PANi)和/或弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)之间的缔合和/或键形成和/或连接可经由共价和/或非共价和/或非键合相互作用。共价相互作用可包括例如：σ键和/或π键。非共价相互作用可包括例如：离子的、离子-偶极、氢键、偶极-偶极、范德华、偶极-诱导的偶极、伦敦分散、π-π相互作用、π-堆积、阳离子-π相互作用和阴离子-π相互作用。非键合相互作用可能源于蛋白质弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)附近的PANi分子经历的拉伸、弯曲和扭转应变，反之亦然。
申请人出乎意料且令人惊讶地发现，蛋白质弹性蛋白(E)的二级结构在PANi-E内的重新定向导致蛋白质弹性蛋白(E)的浓度依赖性二级结构使得无规卷曲的浓度>β-片层>α-螺旋>β-转角。
申请人出乎意料且令人惊讶地发现，蛋白质胶原蛋白(C)的二级结构在PANi-C内的重新定向导致蛋白质胶原蛋白(C)的浓度依赖性二级结构使得α-螺旋的浓度>无规卷曲>β-转角>β-片层。
申请人出乎意料且令人惊讶地发现，在xpi-PANi-E-C内的蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的二级结构的重新定向导致蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的浓度依赖性二级结构使得无规卷曲的浓度>α-螺旋>β-片层>β-转角。
在重新定向之前，单独的弹性蛋白(E)的浓度依赖性二级结构使得β-片层的浓度>无规卷曲>α-螺旋>β-转角。在重新定向之前，单独的胶原蛋白(C)的浓度依赖性二级结构使得β-片层的浓度>α-螺旋>无规卷曲>β-转角。弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)的重新定向提供了蛋白质弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)的重新定向的二级结构以接近或处于其自然存在于人或动物的细胞外基质(ECM)中的天然或自然形式，从而提供了模拟脊髓的性质。自组装进一步促进了重新定向。
药物组合物包括向其赋予海绵状特性的通道和/或隧道的网络。海绵状药物组合物被称为神经海绵。术语“神经海绵”在适当的情况下缩写为“NS”。
当在使用中将药物组合物在人或动物体的脊髓处、附近、邻近或以与所述人或动物体的脊髓相连接的方式植入人或动物体内时，通道和/或隧道为神经组织和/或轴突生长和/或修复提供通路和/或路径和/或导管。
通道和/或隧道包括沿其表面(其内表面)凸起的构造或突起。凸起的构造或突起为神经组织或神经元组织，特别是轴突提供了锚定装置，从而促进生长和/或修复。通道和/或隧道内的突起促进提供模拟人或动物脊髓的纤维通道和/或隧道聚合物架构。
根据本公开内容的第一方面的优选实施方案，提供了一种药物组合物，其包含聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)。PANi、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)一起形成聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)、胶原蛋白(C)聚合物网络(PANi-E-C)。
聚丙烯腈(PANi)通常经由交联剂交联，以形成交联的、多孔的、互穿的聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)聚合物网络(xpi-PANi-E-C)。交联的聚丙烯腈(PANi)与弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)缔合和/或键合和/或连接，从而促进蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的二级结构的重新定向。重新定向是针对二级结构形式，其更接近地模拟了它们在人或动物身体的细胞外基质(ECM)中的天然或自然存在的形式。
聚丙烯腈(PANi)与弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)之间的缔合和/或键形成和/或连接可经由共价和/或非共价和/或非键合相互作用。共价相互作用可包括例如：σ键和/或π键。非共价相互作用可包括例如：离子的、离子-偶极、氢键、偶极-偶极、范德华、偶极-诱导的偶极、伦敦分散、π-π相互作用、π-堆积、阳离子-π相互作用和阴离子-π相互作用。非键合相互作用可能源于弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)附近的PANi分子经历的拉伸、弯曲和扭转应变，反之亦然。在不限于理论的情况下，诸如氢键的非共价相互作用和非键合相互作用是对弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)二级蛋白质结构的有效重新定向的最大贡献因素。
可在交联的聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)中的两个原子或原子组之间形成化学键，使得它们之间作用的力达到这样的程度以致导致形成具有足够稳定性的聚集体，从而将所得互穿的聚合物网络定义为独立的分子物种。
申请人出乎意料且令人惊讶地发现，蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的二级结构在xpi-PANi-E-C-NS内的重新定向导致蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的浓度依赖性二级结构使得无规卷曲的浓度>α-螺旋>β-片层>β-转角。在整个本说明书中，符号“＞”表示术语“大于”。
在形成xpi-PANi-E-C-NS的部分之前，单独的弹性蛋白(E)的浓度依赖性二级结构使得β-片层的浓度>无规卷曲>α-螺旋>β-转角。在形成xpi-PANi-E-C-NS的部分之前，单独的胶原蛋白(C)的浓度依赖性二级结构使得β-片层的浓度>α-螺旋>无规卷曲>β-转角。弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)两者的重新定向提供了蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的重新定向的二级结构接近或处于其自然存在于人或动物的细胞外基质(ECM)中的天然或自然形式。自组装进一步促进重新定向。
重新定向赋予xpi-PANi-E-C药物组合物/NS独特和/或有利的化学物理性质，包括但不限于提供模拟人或动物脊髓组织的弹性和/或机械强度和/或变形能和/或刚度和/或硬度和/或坚固度和/或回弹性，并且在其中提供了一种模拟脊髓的药物组合物。
令申请人惊讶的是，化学中性聚丙烯腈(PANi)与弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)之间的缔合和/或键形成和/或连接，以及弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的随后重新定向，将导致xpi-PANi-E-C具有模拟脊髓的性质。
交联剂通常为亚甲基双丙烯酰胺(MBAAm)。
xpi-PANi-E-C药物组合物被生产为具有赋予xpi-PANi-E-C海绵状特性的通道和/或隧道的网络。海绵状xpi-PANi-E-C可为神经海绵(NS)。
当在使用中将xpi-PANi-E-C药物组合物/NS植入人或动物身体内在所述人或动物身体的脊髓处、附近、邻近或与所述人或动物身体的脊髓连接时，通道和/或隧道为神经组织和/或轴突生长和/或修复提供通路和/或路径和/或导管。
通道和/或隧道包括沿其表面凸起的构造或突起。凸起的构造或突起为神经组织或神经元组织，特别是轴突提供了锚定装置，从而促进生长和/或修复。通道和/或隧道内的突起促进提供模拟人或动物脊髓的纤维通道和/或隧道聚合物架构。基于药物组合物的组分化合物预测所述通道和/或隧道的存在并进一步预测凸起的构造的存在是不可能的。
根据以上发明内容，在本文中重复第二至第五方面。
下面在示例中进一步提供了根据本公开内容的广泛的第一方面的生产PANi-E、PANi-C和/或PANi-E-C药物组合物的一般方法。
根据本公开内容第六方面的优选实施方案，提供了一种生产根据本公开内容第一方面的药物组合物的方法，该方法包括以下步骤：
(i)将弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)溶解在酸性水性介质中，以形成第一溶液；
(ii)将丙烯腈添加到第一溶液中并混合，以形成第二溶液，可将第二溶液搅拌/混合直至均匀；
(iii)将引发剂，例如但不限于过硫酸铵(APS)，添加到均匀的第二溶液中，
其中引发剂引发丙烯腈的自由基聚合，以形成互穿的聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)聚合物网络(iPANi-E-C)；以及
(iv)添加交联剂，例如但不限于亚甲基双丙烯酰胺(MBAAm)，
其中交联剂使聚丙烯腈(PANi)交联，以形成交联的、多孔、互穿的聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)聚合物网络(xpi-PANi-E-C)。
步骤(i)至(iv)可按以步骤(i)开始并以步骤(iv)结束的顺序进行。在该顺序内，步骤(iii)和(iv)同时进行。
该方法进一步包括步骤(v)：添加促进剂，例如四甲基乙二胺(TEMED)，其中步骤(v)在步骤(iv)之后进行。
步骤(i)的酸性水性介质为乙酸酸性水性介质。步骤(i)可包括添加过量的冰乙酸以防止弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)从第一溶液中沉淀。
该方法进一步包括步骤(vi)：将xpi-PANi-E-C倒入模具中，优选聚乙烯模具，并且使其凝固(其中发生进一步聚合)，从而形成多孔xpi-PANi-E-C海绵。优选地，使xpi-PANi-E-C凝固过夜，进一步优选在室温条件下。
该方法进一步包括步骤(vii)：优选用双蒸馏水洗涤多孔xpi-PANi-E-C-NS。该方法进一步包括步骤(viii)：将洗涤过的xpi-PANi-E-C-NS在约-80℃与-60℃之间冷冻，优选持续在约8至12小时之间的时间段。该方法进一步包括步骤(ix)：将xpi-PANi-E-C-NS冻干，优选在约25mmtorr下持续约24小时。冻干过程可进一步有助于通道和/或隧道形成，并且在其中可促进赋予孔隙率。
申请人出乎意料且令人惊讶地发现，根据本公开内容的xpi-PANi-E-C药物组合物或神经海绵提供了独特的物理化学性质，从而允许其有效且成功地用于治疗人或动物的脊髓损伤。
例如，xpi-PANi-E-C药物组合物/神经海绵可解决现有技术中突出的若干挑战。xpi-PANi-E-C药物组合物/神经海绵通过在其中模拟人或动物脊髓而提供了生物相容性和/或可生物降解的组合物，从而使炎症和/或神经元死亡减少到最低。
xpi-PANi-E-C药物组合物/神经海绵提供了一种限制手术干预量的组合物，因为已看到(见下面的动物研究)，一次手术干预就足够了。xpi-PANi-E-C药物组合物/神经海绵还允许保留血脊屏障，促进胶质疤痕组织形成的减少，推动和促进神经元组织的粘附和增殖，并且模拟人或动物脊髓。xpi-PANi-E-C药物组合物/神经海绵在4周时段内提供了几乎线性的降解特征曲线(R2＝0.9802)，其中在第28天基质降解为≈50％，这对于在脊髓损伤治疗方案中用作手术植入物特别有利。
申请人出乎意料且令人惊讶地发现，在xpi-PANi-E-C-NS内的蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的二级结构的重新定向导致蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的浓度依赖性二级结构使得无规卷曲的浓度>α-螺旋>β-片层>β-转角。
在形成xpi-PANi-E-C的部分之前，单独的弹性蛋白(E)的浓度依赖性二级结构使得β-片层的浓度>无规卷曲>α-螺旋>β-转角。在形成xpi-PANi-E-C-NS的部分之前，单独的胶原蛋白(C)的浓度依赖性二级结构使得β-片层的浓度>α-螺旋>无规卷曲>β-转角。
弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)两者的重新定向提供了蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的重新定向的二级结构处于其自然存在于人或动物的细胞外基质(ECM)中的天然或自然形式。重新定向赋予xpi-PANi-E-C独特和/或有利的化学物理性质，包括但不限于提供模拟人或动物脊髓组织的弹性和/或机械强度和/或变形能和/或刚度和/或硬度和/或坚固度和/或回弹性，并且在其中提供了一种模拟脊髓的药物组合物。
在不限于理论的情况下，生产药物组合物的方法提供和/或促进弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的重新定向，并且进一步提供和/或促进通道/隧道和突起的形成，这是有助于在使用时提供优势的所有重要的方面。
本公开内容的药物组合物至少改善了现有技术的一些缺点。
虽然已相对于特定实施方案和/或示例详细描述了本公开内容(进一步见下文)，但是应当理解，本领域技术人员在获得对前述内容的理解之后，可容易地想到对这些实施方案的变更、变化和等同物。因此，本发明的范围应被评估为所附权利要求书的范围，该权利要求书附于本文。
示例-制备与表征
下面提供本公开内容的非限制性示例。上文发明内容的内容在下文中通过引用的方式重复，并且避免冗长的重复。
材料和方法
材料
丙烯酰胺(AAm)和丙烯腈(ANi)单体、过硫酸钾(KPS)、过硫酸铵(APS)、亚甲基双丙烯酰胺(MBAAm)、四甲基乙二胺(TEMED)、IV型胶原蛋白。弹性蛋白肽获自美国密苏里州欧文斯维尔的弹性蛋白产品公司(Elastin Products Company,Inc.,Owensville,Missouri,USA)。生物活性物质姜黄素和地塞米松二钠盐获自美国密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louise,MO,USA)。所用的所有其它试剂均为分析级的，并按原样使用。
xpi-PANi-E-C药物组合物/神经海绵的制备
通过同时交联和聚合聚丙烯腈并在水性乙酸介质中与胶原蛋白和/或弹性蛋白且在胶原蛋白和/或弹性蛋白的存在下形成互穿的聚合物网络，获得交联的、互穿的聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)聚合物网络(xpi-PANi-E-C)药物组合物(表1)。xpi-PANi-E-C药物组合物在本文中也称为xpi-PANi-E-C模拟脊髓的神经海绵或xpi-PANi-E-C神经海绵。术语“神经海绵”在适当的情况下缩写为“NS”。在与本文的实验工作有关的附图中，xpi-PANi-E-C的标记可示出为PANi-EC。
简而言之，将胶原蛋白和弹性蛋白以指定量溶解在乙酸酸性水性介质中，并且向其中添加丙烯腈。然后观察溶液的肽含量的沉淀，如果有的话。在肽沉淀的情况下，将过量的冰乙酸添加到以上混合物中，以维持肽溶解所需的pH。在获得均匀的混合物后，依次添加引发剂(诸如过硫酸铵(APS)、交联剂(诸如亚甲基双丙烯酰胺(MBAAm))和促进剂(诸如四甲基乙二胺(TEMED))。然后将以上混合物倒入聚乙烯注射器模具中，并且使其在室温条件下聚合过夜。将如此获得的xpi-PANi-E-C神经海绵基质用过量的双蒸馏水洗涤，并在-80℃下冷冻过夜。这之后进行冻干(25mtorr持续24小时)以去除成分水和乙酸，并且获得三维(3D)神经海绵基质。
申请人使用相同的上述实验方案，通过省略弹性蛋白(E)、胶原蛋白(C)或两者来制备以下物质：PANi神经海绵；PANi-E神经海绵；和PANi-C神经海绵。PANi-E-NS、PANi-C-NS本身也是交联的并提供互穿或半互穿的聚合物网络。PANi-E-NS和PANi-C-NS还提供用于治疗脊髓损伤的化学物理性质，并且形成本公开内容的广泛的第一方面的一部分。申请人还出于比较目的利用了PANi-、PANi-E和PANi-C神经海绵，如下文更充分地描述和/或进一步例示。术语“神经海绵”在适当的情况下缩写为“NS”。
表1.xpi-PANi-E-C药物组合物和比较神经海绵(NS)的配制物成分。
Figure BDA0002581195260000141
总的来说，所产生的神经海绵(PANi神经海绵；PANi-E神经海绵；PANi-C神经海绵；和xpi-PANi-E-C)在下文中称为支架基质。
比较实验方案突出了xpi-PANi-E-C-NS令人惊讶的独特和有利的化学物理性质，这无法通过分析PANi-NS、PANi-E-NS、PANi-C-NS的化学物理性质或通过分析其组分化合物(诸如聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(E))的化学物理性质来预测。
xpi-PANi-E-C-NS提供了独特和/或有利的化学物理性质，包括但不限于提供模拟人或动物脊髓组织的弹性和/或机械强度和/或变形能和/或刚度和/或硬度和/或坚固度和/或回弹性，并且在其中提供了一种模拟脊髓的药物组合物。
当考虑xpi-PANi-E-C时，交联的聚丙烯腈(xPANi)的存在以及其随后与弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的缔合和/或键形成和/或连接促进蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的二级结构的重新定向。这种前述的重新定向提供了包括模拟人或动物脊髓(即其为模拟脊髓的)的化学物理性质的xpi-PANi-E-C药物组合物/NS。在没有蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的二级结构的重新定向的情况下，药物组合物将不会具有模拟人或动物脊髓的化学物理性质，即，它将不是模拟脊髓的。当与市售的弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)的等同物相比时，重新定向使得蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的重新定向的二级结构在更大程度上接近天然和/或自然存在的弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)。
申请人出乎意料且令人惊讶地发现，在xpi-PANi-E-C内的蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的二级结构的重新定向导致蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的浓度依赖性二级结构使得无规卷曲的浓度>α-螺旋>β-片层>β-转角。
在形成xpi-PANi-E-C的部分之前，单独的弹性蛋白(E)的浓度依赖性二级结构使得β-片层的浓度>无规卷曲>α-螺旋>β-转角。在形成xpi-PANi-E-C的部分之前，单独的胶原蛋白(C)的浓度依赖性二级结构使得β-片层的浓度>α-螺旋>无规卷曲>β-转角。
形态学分析和图像处理
为了进行形态分析，将支架基质(包括根据本公开内容的PANi神经海绵、PANi-E神经海绵、PANi-C神经海绵和xpi-PANi-E-C神经海绵)溅射涂有碳和/或铬，并且使用FEIQuanta 200 ESEM或FEI Nova Nanolab 600 SEM(FEI，美国俄勒冈州希尔斯伯勒(Hillsboro,Oregon,USA))以各种放大率捕获显微照片。使用为ImageJ和FIJI(图像处理软件)创建的DiameterJ和ND插件对如此获得的显微照片进行了广泛的分析和量化。DiameterJ插件是“纳米纤维直径测量工具”，并且是“使用现有的中心线确定算法、欧氏距离变换和一种新颖的像素变换技术”创建的(Hotaling等人,2015)。开发了一种结合DiameterJ的分割工具和ImageJ的图像阈值调整功能的独特算法，用于处理SEM显微照片。然后分析处理后的图像的孔隙面积和分数圆度。一些SEM图像在MATHEMICATM 8.0(美国伊利诺伊州香槟市沃尔夫拉姆研究中心(Wolfram Research,Champaign,IL,USA))上使用模糊、颜色量化和生成图像直方图的顺序程序，对一些SEM图像进行定量处理。最初，感兴趣的区域限于支架的图像内容。
根据本公开内容的PANi神经海绵、PANi-E神经海绵、PANi-C神经海绵和xpi-PANi-E-C的孔隙率计量分析
使用孔隙率分析仪((Micromeritics ASAP 2020，美国佐治亚州诺克罗斯(Norcross，GA，USA))对神经海绵进行孔隙率计量分析。在添加到样品管中之前，用剃刀刀片将神经海绵(支架基质)样品切开并准确称重。考虑到支架的高且多层多孔性，将支架在40C下脱气22小时。脱气后，将样品转移到分析端口，以及一份包括与吸附和解吸等温线相关的表面积、孔体积和孔径的数据报告。评估了BJH和BET计算两者。将获得的线性等温线图与IUPAC(Sing等人,1985)规定的准则进行比较。
聚合物结构变化分析
对组分化合物和最终支架(包括根据本公开内容的PANi神经海绵、PANi-E神经海绵、PANi-C神经海绵和xpi-PANi-E-C神经海绵)进行衰减全反射傅里叶变换红外(ATR-FTIR)分析，以评估、确定和比较结构转变。使用ATR-FTIR池和金刚石晶体内部反射元件，在带有MIRTGS检测器的Perkin Elmer Spectrum 2000FTIR光谱仪(PerkinElmer Spectrum100，英国威尔士郡兰特里桑特(Llantrisant,Wales,UK))上记录ATR-FTIR光谱。样品在650-4000cm-1的波数范围内进行分析，分辨率为4cm-1，每个光谱扫描64次。
接枝聚合物的放热和吸热图
在恒定的N2气体流下，以5-10℃/分钟的加热速率，从-10℃至325℃，使用MettlerToledo，DSC1，STARe系统(瑞士施韦岑巴克公司(Schwerzenback,Switzerland))对天然聚合物和最终支架/神经海绵进行比较差示扫描量热法(DSC)分析。将准确称量的样品(5-10mg±0.1mg)放入带中心针孔的有盖铝样品架中。金属铟(99.99％)用于校准与温度和焓相关的DSC模数。使用空样品架作为参考，并且通过在恒定等温线下将样品从10℃加热到125℃持续15分钟来进行实验运转。新样品重新称重并从10℃加热到250℃。随后比较DSC热分析图的热事件转变。
神经海绵(包括根据本公开内容的PANi神经海绵、PANi-E神经海绵、PANi-C神经海绵和xpi-PANi-E-C神经海绵)的物理-机械特性质构宏观分析
支架基质的微机械性质可直接影响轴突在支架基质内再生、增殖和穿透的能力。因此，采用装有5kg称重传感器的质构分析仪(TA.XTplus Stable Microsystem，英国萨里郡(Surrey,UK))在微观尺度上进行质构特征分析。使用解剖刀(直径10mm；长度10mm)将支架基质切成圆柱体，并且在10％与50％之间的各种应变值下压缩。将支架基质放置在铝制工作台上，并且使用扁平探针压缩。使用表2中详细列出的参数，针对各种配制物生成了一系列的力-时间/距离特征曲线。如图1所示，进行了关于最大载荷、变形能、刚度梯度和基质回弹性％的机械计算。
表2.根据本公开内容的PANi神经海绵、PANi-E神经海绵、PANi-C神经海绵和xpi-PANi-E-C神经海绵的物理-机械性质分析所采用的质构参数设置。
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xpi-PANi-E-C-NS：用于急性脊髓损伤后完全功能再生的模拟脊髓的、互穿的聚合物肽、神经隧道
分子自组装或简单地自组装，可被定义为在没有人为干预的情况下，在热力学平衡条件下单个实体(诸如分子)自发地组织成连贯的、界限清楚的且稳定的排列(Zhang,2002)。这种自组装过程模拟了几种自然存在的多功能大分子组装，诸如血红蛋白、聚合酶、ATP合酶、膜通道、剪接体、蛋白体和核糖体。这些组装主要由在宏观和微观尺度上或甚至在纳米尺度上的弱非共价相互作用介导。用于自组装的分子构建块被改造和设计成通过氢键形成、静电相互作用(离子键)、疏水相互作用、范德华相互作用和π-堆积进行逐步聚集(Zhang,2002；Zhang,2003)。这些弱相互作用的共同强度形成了生产非常稳定的超分子架构和具有化学互补性和结构相容性的仿生纳米材料的基础(Zhang,2002)。对此类生物相关大分子组装体的了解以及在分子工程中此类自组织原理的设计和表征方面的进展，导致了基于肽(包括肽两亲物)和/或蛋白质的分子组装系统的制造(Hogashi和Koga,2008)。肽和蛋白质显示出分层次和精确地自组织/自组装/自制造/自缔合/自含有成界限清楚的二维和/或三维结构的固有能力。这些结构显示出高度的规律性，这可被开发和控制用于药物递送和组织工程改造(Zhang,2002；Zhang,2003；Ulijn和Smith,2008)。当分析构成超分子架构的化学组分时，不可能准确地预测所述超分子架构的性质。
自组装肽(SAP)系统涉及能够经由超分子自组装在空间分辨网络中呈现多个细胞相互作用的组分的合成支架。这种自组装通常由原纤维形成肽肽、肽模拟物和肽衍生物产生。自组装材料提供了呈多功能性、多价、合成定义、分子特异性以及控制配体的纳米级定位和其它生物分子特征形式的多种优势。这些肽，诸如原纤维化肽、β-发夹、肽-两亲物和肽衍生物在含刺激物的环境中自组装，以形成富含β-片层的纳米纤维网络，其进一步融合以形成超分子架构，宏观上形成水凝胶。SAP还能够在其自组装纤维的表面上显示出功能性氨基酸序列或化学基团，并且这些肽也可偶联以显示出不同配体的精确组合。
成功地合成和制造了根据本公开内容并在本文描述的PANi神经海绵、PANi-E神经海绵、PANi-C神经海绵和xpi-PANi-E-C神经海绵。图2中示出了xpi-PANi-E-C神经海绵。图2示出了照片，其显示出水合xpi-PANi-E-C-NS的易处理性、承重能力和柔韧性。这些化学物理性质特别允许外科医生在使用时易于操纵，并且模拟人或动物脊髓。
如此形成的PANi-E神经海绵、PANi-C神经海绵和xpi-PANi-CE神经海绵可描述为半互穿的聚合物网络或互穿的聚合物网络，其中交联的聚丙烯腈聚合物被细胞外基质组分(胶原蛋白和弹性蛋白)互穿，反之亦然。在不限于理论的情况下，表3提供了最终的三聚xpi-PANi-E-C支架/NS中各种组分所提供的专门功能的指示。
表3.化学组分及其(一个或多个)特定功能
Figure BDA0002581195260000181
PANi神经海绵、PANi-E神经海绵、PANi-C神经海绵和xpi-PANi-C-E神经海绵的形态学分析
天然大鼠脊髓的扫描电子显微照片显示出具有单向肉眼可见的纤维和沟槽的纤维结构(图3)。xpi-PANi-E-C支架的对应扫描电子显微照片(SEM)图像展示了由纤维多孔和多孔纤维架构构成的聚合物基质(图4)。此外，多孔架构由呈聚合物隧道(在此称为“神经隧道”)形式的连续纵向通道构成。这些聚合物隧道进一步分叉和/或汇聚成能够增强神经元生长和增殖的多向和/或单向聚合物隧道网络(图5)。支架的表面架构描绘了衬有纤维基质的多道纵向沟槽(图6)。图7经由纵向纤维隧道的形成比较并证实了xpi-PANi-E-C的模拟脊髓的性质。
因此，xpi-PANi-E-C可提供有益于神经元组织和轴突生长的人工神经元细胞外基质。这些神经隧道中存在的纤维可提供轴突锚定点，而粗糙的表面为轴突粘附和神经元移动提供有益的环境。隧道以厚PANi壁(15μm)划界并填充有在纳米(500nm)到微米(10um)厚度范围内的不同直径的自组装肽纤维结构。纤维嵌入PANi架构(孔壁)中，形成连接纵向隧道内的壁的网状网络。粗纤维可归因于弹性蛋白纤维，而细纤维则表示胶原蛋白原纤维(Daamen等人,2003)。
然而，除了纤维之外；还观察到从支架壁突出的短、薄且宽的带状凸起构造或露头(进一步增强了支架壁的粗糙度)，这不限于理论，可归因于PANi。总之，在“神经隧道”内观察到了绳桥状架构的形成，其中弹性蛋白纤维形成主链，而胶原蛋白原纤维形成桥的短甲板。每一种组分补充另一组分的功能，并且一起提供所需的强度和功能。
模拟脊髓的支架的孔隙率计量分析
合成的PANi-神经海绵非常易碎且呈粉状，因此仅对PANi-E神经海绵、PANi-C神经海绵和xpi-PANi-E-C神经海绵进行了孔隙率计量分析，并且示于图8和表4中。图8示出了根据本公开内容的a)PANi-E神经海绵；b)PANi-C神经海绵；以及xpi-PANi-E-C神经海绵的线性等温图。对于孔隙率特征曲线的解释，参考了由气体吸附数据报告小组委员会提出的国际纯化学与应用化学联合会(IUPAC)建议(Sing等人,1985)，并且根据IUPAC分类系统，将物理吸附曲线与等温线类型和滞后回线进行了比较。所有三种支架(神经海绵)的物理吸附曲线对应于II型等温线，从而证实了支架的大孔形态。对于PANi-E-NS，Brunauer-Emmett-Teller/Barrett-Joyner-Halenda(BET/BJH)表面积、孔体积和孔径最低，而对于PANi-C-NS则最高，这可分别归属于大直径弹性蛋白纤维和小直径胶原蛋白纤维，如在扫描电子显微镜(SEM)分析下所论述和所示。
在xpi-PANi-E-C-NS/药物组合物的情况下，孔隙率参数位于PANi-E-NS和PANi-C-NS极端值之内，这归因于大直径和小直径纤维的混合。直径较大的纤维在网络中占主导地位，因为弹性蛋白存在的浓度远高于胶原蛋白(弹性蛋白:胶原蛋白::25:1)。
来到等温线中观察到的滞后回线；PANi-E-NS示出H3型回线，IUPAC将其定义为“产生狭缝状孔的板样颗粒聚集体”。在不限于理论的情况下，这在弹性蛋白纤维的情况下是正确的，因为它们的直径大，并且这些纤维形成松散连贯的网络，导致形成界限清楚的孔内孔。在PANi-C-NS的情况下，观察到H1型滞后回线，IUPAC将其定义为“与已知由相当规则排列的附聚体组成并具有窄的孔径分布的多孔材料相关联。”对于胶原蛋白纤维而言，这似乎是正确的，因为它们形成小直径纤维，其比较大直径纤维表现出相对更一致的尺寸分布。如SEM所示，由于纤维似乎融合在一起，因此附聚部分似乎也是正确的。
有趣且出乎意料的是，xpi-PANi-E-C支架/NS/药物组合物展示出相对压力高达0.6的H1型回线，并且此后形成开放回线。测试了若干个xpi-PANi-E-C样品以确定其开放回线行为，并且在所有测试的孔隙率样品中均形成了类似的回线。尽管与弹性蛋白相比，胶原蛋白的浓度最小；但是较大的纤维网络内较小纤维的存在为形成H1回线的组合网络提供了更多的聚集。此外，根据IUPAC对此类行为的描述，较低压力下的开放回线可归因于“非刚性多孔结构”。
表4.PANi-E-、PANi-C-和xpi-PANi-E-C神经海绵的表面积和孔隙率特性。
Figure BDA0002581195260000201
用于确定聚合物-肽神经海绵内的肽二级结构的FTIR分析
PANi的FTIR光谱(图9)示出了在以下处的特征波数带：3650-3250cm-1(水分子与PANi部分相互作用(I和II型水))、2937.56cm-1(CH3对称拉伸模式；振动C-H拉伸)、2243.59cm-1(C≡N拉伸振动)、1657.79cm-1(δC-H弯曲；在聚合过程期间形成的水解的丙烯腈单元)、1519.34cm-1(C-N拉伸)、1450.70cm-1(δCH2不对称)、1377.24cm-1(N-C-H弯曲)、1193.87cm-1(δCH2不对称)和1113.28cm-1(C-H振动模式)(Cetiner等人,2010；Moghadam和Bahrami,2005；Moreno等人,2010；Wan等人,2007)。
胶原蛋白中的特征酰胺带出现在3306cm-1(酰胺A；N-H拉伸振动；氢键合的N-H基团)、2964cm-1(酰胺B；CH2的不对称拉伸)、1640cm-1(酰胺I；C＝O拉伸振动)、1541cm-1(酰胺II；N-H弯曲振动)和1235cm-1(酰胺III；C-H拉伸)处。弹性蛋白FTIR光谱示出了在3306cm-1(酰胺A)、2964cm-1(酰胺B)、1640cm-1(酰胺I)、1541cm-1(酰胺II)和1235cm-1(酰胺III)处的对应酰胺带(Nagai,2010)。
为了评估PANi对组成蛋白的二级结构的影响，在1705与1585cm-1之间对酰胺I峰进行了去卷积(图10)。以下波数带用作指定二级结构的参考：1620-1640cm-1≈β-片层；1640-1650cm-1＝无规卷曲；1650-1658cm-1＝α-螺旋；1660-1680cm-1＝β-转角；且1680-1695cm-1＝β-片层(Yang等人,2015)。图10示出了傅立叶去卷积傅立叶变换/红外(FT/IR)衰减全反射(ATR)光谱，其对应于原始聚合物弹性蛋白(E)、胶原蛋白(C)、PANi-E神经海绵、PANi-C神经海绵和xpi-PANi-E-C神经海绵的酰胺I峰。
1.PANi-E-NS：从供应商获得的天然弹性蛋白示出特征酰胺I分量峰，其中β-片层>无规卷曲>α-螺旋>β-转角。然而，在PANi-E-NS内，弹性蛋白肽自组装成无规卷曲>β-片层>α-螺旋>β-转角。考虑到体内弹性蛋白的“内在无序结构域”，去卷积结果证实了ECM模拟支架的形成(Roberts等人,2015)。
2.PANi-C-NS：从供应商获得的天然胶原蛋白示出特征酰胺I分量峰，其中β-片层>α-螺旋>无规卷曲>β-转角。然而，在PANi-C-NS内，胶原蛋白肽自组装成α-螺旋>无规卷曲>β-转角>β-片层。胶原链在体内以三重螺旋形式存在。值得注意的是，与PANi-E神经海绵中的弹性蛋白相比，在PANI-E存在的情况下，胶原蛋白的二级结构发生了明显的变化。
3.xpi-PANi-E-C-NS：弹性蛋白/胶原蛋白支架的去卷积示出浓度依赖性二级结构构象，其中无规卷曲>α-螺旋>β-片层>β-转角，因为弹性蛋白形成最终支架中的大部分肽含量。可将最终构象指定为胶原蛋白螺旋介入的弹性蛋白卷曲螺旋，从而完美地模拟细胞外基质环境(Silver,2006)。
热分析以确定神经海绵中的肽结构变化
在10-125度内对原始胶原蛋白、原始弹性蛋白、PANi神经海绵、PANi-E神经海绵、PANi-C神经海绵和xpi-PANi-E-C神经海绵的DSC扫描示出了非常宽的吸热峰，分别对应于76.79℃(-200.98J/g)、72.79℃(-104.44J/g)、69.42℃(-89.19J/g)、69.51℃(-78.60J/g)、71.17℃(-122.75J/g)、68.91℃(-77.35)的脱水温度(图11和图12)。图11示出了原始(a)胶原蛋白和(b)弹性蛋白的差示扫描量热法(DSC)热分析图。图12示出了在各种温度范围下根据本公开内容的PANi、弹性蛋白(E)、胶原蛋白(C)、PANi神经海绵、PANi-E神经海绵、PANI-C神经海绵和xpi-PANi-E-C神经海绵的DSC热分析图。从10℃-325℃的第二个仍然含有脱水吸热峰，表示生物分子和PANi共混物中的结合水。为了评估共混支架中的热转变，从每一种原始组分中选择一个特征和定义的峰。在原始肽样品中，胶原蛋白在220℃的吸热峰可归因于变性温度，而弹性蛋白在185℃的放热峰可归因于无定形玻璃化转变。PANi的DSC曲线示出在280℃处的清晰可辨的放热分解峰。在PANi-E-NS的情况下，弹性蛋白的放热转变形成了在175℃-200℃之间的平台，从而证实了与形成界限清楚的放热的β-片层相比，无序结构(无规卷曲)的存在。对应于PANi的分解放热从280℃偏移到285℃，从而证明了支架结构的改进的稳定性。
在PANi-C-NS的情况下，胶原蛋白的变性温度出现为在187℃与234℃之间的宽带和在213℃的峰。这可能归因于PANi-C-NS中更稳定的β-片层(原始弹性蛋白)转变为不太稳定的α-螺旋，从而降低了蛋白质变性温度(Henzler Wildman等人,2002)。同样地PANi-E-NS，在PANi-C-NS中对应于PANi的分解温度偏移到更高的温度(284℃)，进一步证实了蛋白质对PANi-NS支架的稳定作用。在xpi-PANi-E-C-NS中，胶原蛋白的吸热变性峰消失或与玻璃化转变吸热平台合并。在不限于理论的情况下，这可能是由于xpi-PANi-E-C支架中胶原蛋白的浓度非常低(2％w/w)。与PANi-E和PANi-C相比，在xpi-PANi-E-C中，PANi分解峰保持不变在285℃处。
总之，DSC分析成功地证实了关于支架结构中组分肽(弹性蛋白和胶原蛋白)的二级结构转变的FTIR分析，并且证实了支架稳定性增强。
质构分析证明了独特的胶原蛋白-弹性蛋白机械协同作用
对于基于肽的支架(PANi-E-NS、PANi-C-NS和xpi-PANi-E-C-NS)的质构特征分析，假设基于以下陈述，“无定形聚合物(诸如弹性蛋白)表现为橡胶状材料，而力传递刚性蛋白(诸如胶原蛋白)则以扩展的构象形式存在并且表现为像硬绳索一样(Silver,2006)。
对水合样品进行了质构分析，干燥时只有PANi的神经海绵和PANi-E神经海绵太软且易碎，并且当镊子提起时粉碎成粉状。即使在水合状态下，PANi-和PANi-E神经海绵也太软而无法用钢镊子提起，因此使用平端塑料镊子将这些支架提起并放置在台上。使用剃刀刀片在水合状态下切割支架。对于质构分析，在相同的测试和测试后速度的情况下施加10％至25％的压缩应变并分析数据以获得最大强度、变形能、刚度梯度和基质回弹性％(图13)。图13示出了根据本公开内容的PANi神经海绵、PANi-E神经海绵、PANI-C神经海绵和xpi-PANi-E-C神经海绵在10％-25％的部分施加的应变值下的物理机械性质(SD(ML)≤0.04；SD(DE)≤0.05；SD(RG)≤0.08；SD(MR)≤9.2；n＝3)。支架含有PANi作为共同组分，因此支架就肽含量进行了比较。在双组分系统(PANi-E-NS和PANi-C-NS)中，在较高的施加的应变下，PANi-E-NS由于其橡胶性质而提供最高的回弹性，而胶原蛋白由于其刚性性质而提供最低的回弹性。相反，对于PANi-C-NS，基质强度和变形能值高于PANi-E-NS。随着基质强度、变形能和刚度梯度的增加，基质的回弹性降低，反之亦然。向PANi中添加弹性蛋白尽管增加了固含量(PANi:弹性蛋白≈1:1)，但观察到基质强度和变形能降低。尽管胶原蛋白以非常低的浓度(配制物混合物中为0.4％w/v)添加；但在较高的施加的应变下，PANi-C-NS的基质强度、形变能和刚度梯度相对地高于PANi的基质强度、形变能和刚度梯度。在最低的施加的应变(10％)下，肽添加对机械参数的影响不是很明显。因此可以暗示，在不限于理论的情况下，PANi充当物理机械中性聚合物，并且根据添加的肽生物材料的性质执行，而没有获得添加的结果。这进一步暗示了在聚合物与肽生物材料之间互穿网络的有效形成，其中生物材料很好地共混在一起，同时仍然反映出各自的性质。基质回弹性以及刚度是支架固有的非常重要的机械性质，因为这些参数直接影响植入后的细胞反应(Lo等人,2000)。然而，增加任一个参数会减小另一个参数，使得很难维持所需的回弹性-刚度平衡或简单地柔软度-硬度平衡。
在xpi-PANi-E-C-NS的情况下，弹性蛋白和胶原蛋白与PANi形成了机械优化的支架，具有能够用钢镊子处理的最高基质强度。
圆柱形xpi-PANi-E-C神经海绵/药物组合物能够保持高达三层的自身重量(图2)。值得注意且出乎意料的是，与PANi-NS、PANi-E-NS和PANi-EC-NS相比，xpi-PANi-EC神经海绵示出显著更高的基质强度(引起变形所需的力)、变形能(坚固度)和刚度梯度(硬度)。
更值得注意且出乎意料的是，即使在刚度和坚固度几乎增加了两倍之后，在较高的施加的应变下，回弹性仍保持在PANi-E-NS的范围内，且高于PANi-NS和PANi-C-NS。与PANi一起，公开了第一个此类模拟脊髓的支架，其中PANi充当化学中性聚合物，但影响胶原蛋白和弹性蛋白两者向其自然形式的定向，一起形成了广为人知的“胶原蛋白和弹性蛋白的增强复合物”(Miranda-Nieves和Chaikof,2016；Oxlund和Andreassen,1980；Muiznieks和Keeley,2013)。
无法基于其组成化合物[聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白]的分析，也无法通过PANi-NS、PANi-E-NS和PANi-C-NS的分析来预测xpi-PANi-E-C神经海绵/药物组合物的独特和有利的物理化学性质。在不限于理论的情况下，交联的PANi、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)之间的独特相互作用提供了具有模拟脊髓的性质的互穿聚合物网络。通过模拟人和/或动物脊髓组织并通过在通道和/或隧道内提供通道和/或隧道和/或突起，根据本公开内容的药物组合物促进神经组织和/或轴突的生长和/或修复。
模拟脊髓的神经海绵的基质水合和降解特征曲线
为了评估冻干的支架(PANi神经海绵、PANi-E神经海绵、PANi-C神经海绵和PANi-E-C神经海绵)对神经元水性介质(pH 7.4)的反应，测试了支架的持水能力(持水量％；WHC)、湿重(基质水合％；MH)和物理降解(PD)(图14)。图14示出了条形图，其描绘了PANi-E神经海绵、PANI-C神经海绵和xpi-PANi-E-C神经海绵的基质水合和降解特征曲线(SD(WR)≤202；SD(MH)≤118；SD(MD)≤6；n＝3)。WHC指在基质网络内以及在基质孔中支架能够保持的最大量水，并且有效地是在给定时间(在排出水性介质之前)支架中存在的水性介质。WHC表示了可供细胞在支架内生长和增殖的培养基。MH通过将水吸到滤纸上直至达到平衡重量，通过将过量的支架表面水以及孔隙内的水排出来计算。MH不应与溶胀％相混淆，因为所用的支架事先在其完全水合状态下冻干，并且因此没有示出尺寸增加。物理降解指支架在水性介质中的降解，并且表示支架将其基质保持在一起的能力。
PANi-E-NS示出非常低的WHC％和MH％，因为几乎50％的支架在24小时内降解。这是由于支架的机械强度非常弱。这由于在水合管中存在支架颗粒而显而易见，并且由于介质中存在弹性蛋白，水合介质的颜色变成黄绿色。一旦松散的结构降解，支架架构在40％-45％基质残留在水性介质中时达到平衡，其非常软且易碎。此类支架不适合用于组织工程应用，因为它们在植入后很短的时间内丧失了大量的基质，并且因此丧失了其基质完整性。
相比之下，PANi-C-NS形成了刚性支架，在整个研究期间均没有看到降解的颗粒。WHC％值达到≈1000％，并且仅到第4天达到平衡。大多数水性介质保留在基质结构中，因为在第1天，MH％接近≈700％。物理降解数据补充了WHC和MH并示出到第28天最小程度降解为≈15％。这可由于PANi-C-NS的回弹性最小来解释，它延迟了水分子进入基质并因此延迟了支架的水合。与PANi-E-NS相比，PANi-C-NS中WHC％显著更高可归因于PANi-C-NS的显著更高的孔隙率(表4)，这能够在支架中保持更高量的水性介质。此外，由胶原蛋白原纤维形成的纳米纤维网在排出的同时保留了显著更高量的水，从而得到更高的MH％值。类似地，由于回弹性较小，水分子无法影响足够的网络移动，导致支架的物理降解几乎可忽略。此类支架也不适合且不益于组织再生，因为它们形成刚性结构，非常缓慢地降解，因此对于增殖和生长的组织形成了空间限制。
在xpi-PANi-E-C-NS的情况下，最初4天观察到WHC％和MH％的中间值，此后示出WHC％和MH％的最低值。仔细查看三个条形图，发现xpi-PANi-E-C-NS的WHC％和MH％相反地遵循其物理降解特征曲线。尽管没有可见明显的松散颗粒，但是水合容器在降解期间示出淡黄绿色，从而证实了弹性蛋白从支架中浸出。在4周时间内未观察到形状变形，从而证实了整个过程中基质结构的维持。xpi-PANi-E-C-NS独特的硬度-柔软度范式在4周时间内产生了几乎线性的降解特征曲线(R2＝0.9802)，其中在第28天≈50％基质降解。最重要的是，由于孔隙率特征曲线更接近PANi-E-NS，对于xpi-PANi-E-C-NS，MH仅比WHC小25％，从而证实了这三种配制物中的最佳固液平衡。在一级降解特征曲线和相对较高的固液比的情况下，xpi-PANi-E-C-NS似乎最适合神经组织再生。
从模拟脊髓的神经海绵中生物活性释放
三种核心支架(PANi-E神经海绵、PANi-C神经海绵和PANi-E-C神经海绵)的药物释放特征曲线密切遵循孔隙率、质构分析和水合/降解数据。
与其它聚合物原型不同，地塞米松和姜黄素的释放特征曲线在基于PANi的支架中相对可叠加(图15)。
PANi-E-NS示出生物活性物质的快速释放，其中在3至8小时内释放了≈90％并且在24小时内生物活性物质完全释放。在脊柱植入物的情况下，这将是不希望的，在该情况下，将需要在更长的时间段内释放药物活性物质。快速释放可很容易地归因于弱的机械强度以及因此聚合物-肽基质的快速降解－剂量突释行为的典型示例。
与姜黄素相比，从PANi-C-NS中释放地米塞松相对快，两种生物活性物质均在72小时内完全释放。尽管在PANi-C-NS中WHC％和MH％值较高(与PANi-E-NS相比)，但较高的基质强度和完整的支架架构延迟了药物的释放。然而，PANi-C-NS中的高孔隙率和大孔导致生物活性物质在3天内完全释放。
预望xpi-PANi-E-C示出在PANi-E-NS与PANi-C-NS之间的释放特征曲线。然而，与预期的相反，这不是观察到的情况。xpi-PANi-E-C-NS示出最慢的药物释放特征曲线，并且被认为最希望作为脊柱植入物用于应用用于治疗脊髓相关损伤。
xpi-PANi-E-C-NS没有示出中间释放行为。在xpi-PANi-E-C-NS的情况下，在不限于理论的情况下，与PANi-E-NS和PANi-C-NS相比，更持久和延迟的释放可归因于其相对较高的机械强度、最高的基质含量(或最高的密度)，因为弹性蛋白和胶原蛋白均结合到支架中，以及较低的水合特性。该支架的药物释放特征曲线符合急性脊髓损伤后的治疗方案，在最初的24小时内至少75％的药物释放(xpi-PANi-E-C-NS)。这证明了水合的、载药的、多大孔、纳米到微纤维的、硬且软的聚合物肽平台对脊髓损伤干预的适用性。
经由分子力学模拟解释分子复合物的几何同化
当在真空中进行分子模拟时，观察到PANi的-C≡N官能团未与肽分子－胶原蛋白和弹性蛋白的-NH2、-COOH或-OH官能团形成H键。然而，PANi分子确实发生了某些几何变化，这可归因于由PANi分子在肽分子附近所经历的拉伸、弯曲和扭转应变引起的非键合相互作用，反之亦然。为了使PANi几何形状的变化可视化，捕获分子在其天然状态(PANi)以及分子复合物(PANi-E、PANi-C和xpi-PANi-E-C)的能量最小化后的惯性轴。有趣的是，当在惯性轴的类似位置处进行比较时，PANi分子的几何形状从半圆(单独的PANi)经过问号形状(PANi-E)和反向问号形状(PANi-C)到xpi-PANi-E-C-NS的S形，如图16所示。此外，与PANi紧密相邻的胶原蛋白-弹性蛋白分子复合物之间的H键(图17a)显著增加(图17b)。这些几何和H键转变进一步证实了我们关于聚合物-肽共混物中肽分子的二级结构变化的主张(详情请参见FTIR和DSC分析论述)。
结束语
合成了PANi-NS、PANi-E-NS、PANi-C-NS和xpi-PANi-E-C-NS。xpi-PANi-E-C神经海绵的独特特征包括模拟天然脊髓的纤维神经隧道架构的形成。物理化学特征揭示，在PANi的存在下，肽分子的二级结构重新排列成其天然的细胞外基质形式，从而证实了聚合物-肽架构的自组装性质。此外，xpi-PANi-E-C神经海绵提供了类似于体内天然胶原蛋白-弹性蛋白复合物的基质回弹性和基质硬度的完美平衡。考虑到xpi-PANi-E-C作为一种有益于神经元组织和轴突生长的人工神经元细胞外基质的模拟脊髓的性质，进一步在体内测试了xpi-PANi-E-C在完整交易脊髓损伤模型中再生和支撑神经元组织的能力。
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示例－动物研究
下文呈现的动物研究包括在完全横断脊髓损伤模型中进行的根据本公开内容的第一方面的xpi-PANi-E-C药物组合物/NS的体内评估。
方法
PC12细胞培养和MTT增殖测定
使用补充有10％v/v DES、5％v/v FBS和1％v/v P/S/AB溶液的DMEM，在37℃的潮湿5％CO2气氛中，在经组织培养物处理的(TPP)T-75烧瓶中培养来自Cellonex(Separations，南非(South Africa))的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12混合贴壁/悬浮细胞系。每2天更换75％的培养基。为了检测电纺纤维的细胞增殖和细胞相容性，使用了基于MTT的罗氏细胞增殖试剂盒I。将xpi-PANi-E-C药物组合物标本在紫外线下灭菌12小时，之后在维持在37℃和5％CO2下的48孔板中，在含有10％v/v DES、5％v/v FBS和1％v/v P/S/AB的400μL培养基中过夜温育。将PC12细胞以2×104个细胞/孔的密度接种到xpi-PANi-E-C药物组合物样品上并温育72小时。此后，向每个孔中添加40μL MTT溶液，然后再进行4小时的温育期，之后添加400μL增溶剂以溶解甲瓒晶体。吸出全部孔内容物，放入2mL埃普多夫(Eppendorf)管中并以2000rpm离心5分钟以分离悬浮的细胞。将所得上清液转移到96孔板中并使用多板读数器(BioTek，美国(USA))在550nm处测量吸光度。通过使用以下等式测量相对细胞增殖：
％Rp＝(A测试/A对照)×100 等式1
其中Rp＝相对细胞增殖；A测试＝含有样品的水凝胶膜的吸光度；A对照＝对照物的吸光度(Ray等人,2010)。
评估xpi-PANi-E-C-NS的体内植入的初步研究
成年雌性斯普格-杜勒(Sprague-Dawley)大鼠用于体内测试xpi-PANi-E-C-NS的性能。将大鼠分成两组：
第0组：患有脊髓损伤的对照组。
第II组：受伤的大鼠+xpi-PANi-E-C-NS
每组有4只动物。在对大鼠背部进行剃毛之前，将大鼠麻醉(65mg/kg氯胺酮(ketamine)腹腔注射/7.5mg/kg甲苯噻嗪(xylazine)腹腔注射)。在将大鼠放在手术台上后，沿背部中线做一个小切口(≤2cm)。以骨膜下方式切开附着于棘突和椎板的椎旁肌以到达硬脑膜。使用弯曲的锋利剪刀，在预先确定并标记的位置对应的T8-T10椎层进行椎板切除术。小心避免破坏小关节。一旦硬脑膜暴露，使用锋利的微型镊子和剪刀切开硬脑膜并取出1mm脊髓段(T9椎层)。然后将残肢收回，在脊髓中留出2mm的间隙，用于植入xpi-PANi-E-C海绵/支架。用林格氏溶液(Ringer’s solution)冲洗处理过的部位以使根管的底部可视化，作为完全横断的证实。将xpi-PANi-E-C海绵/支架植入、放置或注射在2mm间隙内。在手术过程之后缝合皮肤(Moore等人,2006，Meiners等人,2007，Tysseling-Mattiace等人,2008)。所有程序均按照约翰内斯堡威特沃特斯兰德大学动物伦理筛查委员会的指导方针(Animal Ethics Screening Committee guidelines of the University of theWitwatersrand,Johannesburg)进行。
术后动物护理
术后，将动物饲养在笼子里在事先温热的麻布袋上，以维持它们的体温。在某些情况下，将动物饲养在温育箱中。手术后立即施用乳酸林格氏溶液(皮下)和拜有利(baytril)(33mg/kg，皮下)，并且分别持续3天以维持初始水合作用和控制感染。在整个研究期间或直到膀胱功能恢复，每天手动排空膀胱三次。如果发生不适，则按处方剂量施用科瑞泰克斯(curatex)(皮下，每天两次)。从研究中除去损伤后24小时表现出任何后肢运动的大鼠(Tysseling-Mattiace等人,2008)。
脊髓组织样品的免疫组织化学分析
在脊髓损伤后第28天，用戊巴比妥(pentobarbital)(50mg/kg，静脉注射)对动物实施安乐死，并且用0.01M磷酸盐缓冲盐水，随后4％多聚甲醛(PFD)灌注。切开脊髓并在4％多聚甲醛中后固定过夜。然后将脊髓包埋在石蜡块中，并用切片机水平地切片并安装到superfrost plus载玻片上。这项研究的目的是结合苏木精和曙红(H&E)和免疫组化(IHC)测定，评估受伤的大鼠脊髓内的退化/再生程度。在整个每个区块中从3个椎层中取4-5μm切片，确保完全包括每个病变。
首先，H&E染色用于表征存在于每个载玻片上的形态特征。其次，应用了一系列免疫组织化学(IHC)染色剂，以便进一步对存在的结构和分子过程进行分类，如下：
·EDI(CD68)：确定胶质/组织细胞浸润的程度/数量(慢性炎症(脊髓炎))。
·钙蛋白酶/诱导型一氧化氮合酶(iNOS)：分别确定正在进行的蛋白水解的程度(髓鞘和细胞骨架)，并且评估NO在脊髓损伤/病变进展的发病机理(退化)中表达的程度。
·胶质纤维性酸性蛋白(GFAP)/神经丝200(NF-200)：确定神经胶质/轴突结构紊乱的程度。
对H&E染色的切片进行分级，如下：
·NAD：未检测到异常。对照标本参数内的形态学，脱髓鞘/神经纤维退化不存在。
·1：最小程度病变。神经纤维脱髓鞘的分散和个别化病灶，其特征在于存在髓鞘扩张和轴浆(包括“消化室”)凝结，伴有或不伴有微胶质细胞/格子细胞的最小程度浸润。
·2：轻度病变。神经纤维退化的多病灶到聚结区域，最小程度的炎症性细胞浸润。
·3：中度病变。弥漫性脱髓鞘，伴有全神经纤维丧失的病灶性广泛区域，并由无数空泡化的格子细胞替代，并伴有反应性和肥大性内皮细胞及早期纤维组织沉积(肉芽组织；慢性活动性脊髓炎)。
·4：明显病变。如3，其中神经全部横断并由炎症性细胞炎症和早期修复替代。
·5：“修复性表型”。大量多核细胞替代脊髓的病灶性广泛区域，混杂着细胞外基质的原纤维和均质沉积物(多核胶质细胞与退化的和假定的再生神经母细胞混合的混合物)。外围区域表示4级变化。
基于每40X高倍率视场物镜阳性细胞的平均数量，(总共约60个细胞)，对ED1染色的切片进行分级，如下：
·0：每40X高倍率视场平均1-2个细胞。
·1：每40X高倍率视场平均2-10个细胞。
·2：每40X高倍率视场平均10-20个细胞。
·3：每40X高倍率视场平均20-30个细胞。
·4：每40X高倍率视场平均>30个细胞。
基于每个标本上的平均染色强度，通常在较低的显微镜物镜下可观察到的，对iNOS染色的切片进行分级，如下：
·0：轻微染色；被认为在控制(“正常”)范围内。
·1：最小程度地增加染色强度。
·2：中等轻微地增加染色强度；通常与更严重的变化相关。
基于对取自约十个60X高倍率视场物镜(每个视场约20-40个细胞)的染色的整体泛结构(或病变)分析，对GFAP染色的切片进行分级，如下：
·0：在正常极限内；在灰质/白质束中保留了结构完整性。细网状网络完好无损。
·1：线性纤维队列的最小程度破坏；没有可看出的蛋白质/染色量/强度丧失。
·2：线性纤维队列的轻微丧失；蛋白质/染色量/强度明显降低。
·3：线性纤维队列严重破坏；蛋白质/染色量/强度明显丧失(横断区域的特性)。
·4：网状网络明显丧失，由均质GFAP阳性基质替代。边缘区区域显示出纤维的分支和增厚(“修复性表型”的特性)。
基于对取自约十个60X高倍率视场物镜(每个视场约20-40个细胞)的染色的整体泛结构(或病变)分析，对NF-200染色的切片进行分级，如下：
·0：在正常极限内；在灰质/白质束中保留了结构完整性。管状网络完好无损。
·1：线性管状队列的最小程度破坏，伴有管状直径的最小程度变化；没有可看出的蛋白质/染色量/强度丧失。
·2：线性管状队列的轻微破坏，伴有管状直径变化；蛋白质/染色量/强度明显降低。
·3：线性管状队列的严重破坏，伴有保留束明显变圆；蛋白质/染色量/强度明显丧失(横断区域的特性)。
·4：管状结构的全部或几乎全部丧失；事实上没有蛋白质，偶尔有圆形的残留病灶。边缘区区域显示出管状结构的3级丧失(“修复性表型”的特性)。
行为测试－功能结果(BBB评分)
通过使用Basso等人,1995提出的开放场方法进行行为测试，并且使用各自著名的21点Basso、Beattie、Bresnahan(BBB)运动评分表来量化测试的各种神经海绵的功能结果(表5)。通过使用大鼠笼托盘(无盖)稍微对方法进行了修改，以便为功能性结果提供高度功能，并且定性地确定大鼠后肢的伸展程度。
表5.21点Basso、Beattie、Bresnahan(BBB)运动评分表以及类别和属性的操作定义(Basso等人,1995)。
Figure BDA0002581195260000301
Figure BDA0002581195260000311
Figure BDA0002581195260000321
结果和讨论
神经相容性和神经元细胞增殖的测定
MTT增殖研究指示，与对照组相比，在72小时内，PANi神经海绵、PANi-E神经海绵、PANi-C神经海绵和xpi-PANi-E-C神经海绵能够有效支持PC12细胞的生长。这证实了PANi神经海绵、PANi-E神经海绵、PANi-C神经海绵和xpi-PANi-E-C神经海绵(标记为PANi-EC)的神经相容性，如图18所示。与PANi神经海绵、PANi-E神经海绵和PANi-C神经海绵相比，xpi-PANi-E-C神经海绵(标记为PANi-EC)显示出更好的神经元增殖。在不限于理论的情况下，这可归因于xpi-PANi-E-C神经海绵与脊髓架构和细胞外基质(ECM)形态的接近的相似性。
SCI后xpi-PANi-E-C神经海绵植入后的功能和行为结果
还观察了病变对照组以获得在没有干预的情况下SCI后的功能恢复数据。只有不含药物的支架进行了用于概念验证的体内测试。除了评估功能运动结果外，还有植入后SCI大鼠的膀胱功能的恢复。对示出最高运动功能和膀胱功能恢复的动物进行了BBB功能运动结果分析(图19)。
患有脊髓损伤的对照组(第0组)
就术后护理而言，该组是最具挑战性的组，因为这些动物的膀胱功能仅在2周后才恢复，并且在一个案例中，在整个研究期间均未观察到膀胱恢复。在后一种案例中，动物也表现出自噬和严重(不连贯)不适的迹象。在2例中还观察到膀胱感染。受伤后第28天达到的最大BBB评分为7，在此之后该研究终止。尽管在第7天后观察到后肢有一些感觉；但在整个研究期间，未观察到尾巴有任何感觉。在第28天受伤的部位示出明显的疤痕形成，并且提取的组织显得非常僵硬。图20A-H示出了对照组(第0组)中在SCI后28天持续时间内功能恢复程度的顺序呈现。
xpi-PANi-E-C神经海绵(第II组)
xpi-PANi-E-C神经海绵在SCI后/植入后提供了显著的运动功能结果。在72小时内观察到膀胱功能恢复的情况下，显著的运动功能早在4天就恢复。到第7天，动物能够将全部体重支撑在后肢上并顺着笼子边缘舒适地伸展它们的身体。在该组动物中未观察到自噬。动物获得的最大BBB评分为19，由于尾巴未始终向上，因此有轻微躯干不稳定性。28天后受伤的部位显示出脊髓段完全重新接合，其中“回弹性类似”天然脊髓组织。在横断的组织上未观察到疤痕形成。图21示出了在xpi-PANi-E-C组中在SCI后28天持续时间内功能恢复程度的顺序呈现(A)至(I)。
组织学、免疫组织化学和免疫荧光分析
H&E染色的切片显示出一系列病变。这些的范围从主要在白质内的最小程度破坏的神经纤维束到，经过神经/轴突退化/丧失的进行性阶段，到全部神经横断。最后，许多标本的特征在于未遂/失败的修复性和再生性变化，其中多核细胞和游离的细胞外基质局部质量完全横向替代脊髓(“修复性表型”)。样品数量的示例包括基线组(NAD；图22，xpi-PANi-E-C-B(2级；图23)、对照组(4级；图24)和xpi-PANi-E-C-A(5级；图25-26)。
ED1染色的切片也显示出一系列变化。在整个标本组中存在所有级别病变的示例。除了在胶质/组织细胞/格子细胞群中表达EDI之外，分散的内皮细胞也显示出不同阳性染色，假定再生神经母细胞的多核聚集体也是如此。H&E染色的病变级别与ED1阳性细胞浸润水平升高相关。样品的示例包括基线标本(0级；图27)、xpi-PANi-E-C-B(2级；图28)和xpi-PANi-E-C-A(4级；图29)。
iNOS染色的切片在整个脊髓灰质和白质中均显示出酶的弥漫性的细胞内(神经元、胶质、组织细胞和神经母细胞)和细胞外产生/释放。染色强度倾向于与存在的病变的严重程度相关，并且分布上主要均匀，其中在病变附近的脊髓区域内偶尔有染色较强的病灶。样品的示例包括基线标本(0级；图30)和xpi-PANi-E-C-C(2级；图31)。
钙蛋白酶染色的切片是可变的。受影响标本的病变内区域和白质束两者内均有一些最小程度增加(1级)的染色。在(假定的)再生性神经母细胞内细胞内地注意到病变内染色(xpi-PANi-E-C-A，图32)，并且在少数标本中，在白质束内也注意到了(对照，图33)。考虑到对染色的不一致和零星的观察，这一发现的意义尚不确定。
GFAP染色的荧光切片显示出一系列变化，这与H&E染色的切片中注意到的结构发现相关。H&E染色的病变严重程度和结构性网状架构的逐渐消失与该蛋白之间存在很强的相关性。修复性表型变化揭示纤维队列完全丧失，被GFAP阳性物质的均质且弥散的沉积所替代，光强度完全丧失。NF-200染色的切片同样与H&E染色的切片中注意到的发现相关，随着病变的严重程度进展，管状结构逐渐丧失。修复性病变在交易部位处显示出蛋白质全部丧失，这些样品中的边缘区域显示出GFAP阳性蛋白质的分支(早期修复(“结疤”))。示例包括基线标本(0级；图34)和xpi-PANi-E-C-A(4级；图35和36)。
表6.样品数量和相关的严重性级别(请参见上面的文本内容)。
样品数量: H&E： EDI： iNOS： 钙蛋白酶： GFAP： NF-200：
基线-LI NAD 0 0 0 0 0
基线-L2 NAD 0 0 0 0 0
基线-L3 NAD 0 0 0 0 0
对照-LI 3 2 1 1 2 2
对照-L2 3 2 1 1 3 3
对照-L3 4 2 1 1 3 3
xpi-PANi-E-C I-A 5 4 2 1 4 4
xpi-PANi-E-C-A- 5 4 2 1 4 4
xpi-PANi-E-C-A- 5 3 2 1 4 4
xpi-PANi-E-C-B- 2 2 1 0 2 2
xpi-PANi-E-C-B- 2 2 2 0 1 2
xpi-PANi-E-C-B- 2 1 1 0 2 1
xpi-PANi-E-C-C- 5 4 2 0 4 4
xpi-PANi-E-C-C- 5 4 2 1 4 4
xpi-PANi-E-C-C- 5 4 2 0 4 4
图22示出了苏木精和曙红(H&E)标本基线；L2。5X物镜：NAD，突出形态学上不明显的脊髓标本。
图23示出了H&E标本-xpi-PANi-E-C-B；L2。30X物镜：2级，突出了许多退化的神经纤维(箭头)。
图24示出了H&E标本-对照；L3。8X物镜：4级。注意神经全部横向横断，其中有许多退化的神经纤维，全部结构破坏/丧失的区域(星形)，并由空泡化的格子细胞替代(箭头)。
图25示出了H&E标本xpi-PANi-E-C-A；L3。3X物镜：5级。注意神经全部横向横断，并由大量(假定)再生神经母细胞替代(粗箭头)。
图26示出了H&E标本xpi-PANi-E-C-A；L3.16X物镜：5级。注意神经全部横向横断，其中有许多退化的神经纤维，全部架构破坏/丧失的区域(星形)，并由嗜酸性细胞外基质(箭头)和多核(假定)再生神经母细胞替代(大箭头)。
图27示出了EDI标本基线；L2。40X物镜：0级。注意分散的阳性胶质细胞数量少(箭头)。
图28示出了EDI标本xpi-PANi-E-C-B；L1。40X物镜：2级。注意阳性胶质细胞(箭头)和内皮细胞(粗箭头)。
图29示出了EDI标本xpi-PANi-E-C-A；L1。40X物镜：4级。除了存在阳性多核细胞(星形)外，注意无数且常有的退化/退化的阳性胶质细胞(箭头)，指示在多核格子细胞和/或原始神经母细胞内存在组织细胞标记物表达。
图30示出了诱导型一氧化氮合酶(iNOS)标本基线；L2。5X物镜：0级。注意在白质(箭头)和灰质(星形)的整个细胞内和细胞外组分中的基线染色水平。
图31示出了iNOS标本xpi-PANi-E-C-C；L2。5X物镜：2级。注意完整的和病变外白质内的染色强度增加(箭头)。
图32示出了钙活化的非溶酶体中性蛋白酶(钙蛋白酶)标本xpi-PANi-E-C-A；L1。10X物镜：1级。注意多核巨细胞(箭头)内细胞内染色(红色)的最小程度的存在。
图33示出了钙蛋白酶标本对照；L。15X物镜：1级。注意受损的脊髓(箭头)内细胞内/细胞外染色(红色)的最小程度的存在。
图34示出了胶质纤维性酸性蛋白/神经丝-200(GFAP/NF-200)标本基线；L1.60X物镜：0级。注意弥漫性和细网状GFAP阳性结构网络(红色)和大小可变的线性NF-200阳性管状网络(绿色)。注意-细胞核染成蓝色。
图35示出了GFAP/NF-200标本xpi-PANi-E-C-A；L1。60X物镜：4级。注意细网状GFAP阳性结构网络的全部丧失，并由弥散且均质的GFAP阳性蛋白沉积物(星形)替代。残留的少量NF-200阳性物质由凝结的球状沉积物表示(箭头)。
图36示出了GFAP/NF-200标本xpi-PANi-E-C-A；L1。60X物镜：4级；边缘区。注意在修复性病变边缘的GFAP阳性蛋白的边缘变圆和增厚(箭头)。
结束语
对照和处理过的标本显示出一系列变化。这些可通过H&E染色得到最好的证明，H&E染色将病变分为渐进横断/退化性表现和修复性表型。EDI染色的标本展示组织细胞/小胶质细胞系细胞渐进进入病变中，随着严重程度的进展，数量也在增加。损伤伴随着iNOS表达的连续上调，伴有钙蛋白酶表达/释放的增加。随着病变严重程度的进展，GFAP和NF-200的结构完整性渐进地丧失。修复性变化伴随着iNOS的显著上调、EDI阳性慢性炎症性细胞的大量涌入、假定的再生性神经母细胞的多核细胞特性的出现以及GFAP和NF-200蛋白/结构完整性的接近完全丧失。
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Claims (10)

1.一种药物组合物，其包含聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)，所述聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)一起形成聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)、胶原蛋白(C)聚合物网络(PANi-E-C)，其中所述聚丙烯腈(PANi)经由交联剂交联，以形成交联的、多孔的、半互穿的或互穿的聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)聚合物网络(xpi-PANi-E-C)，其中所述交联的聚丙烯腈(PANi)与所述弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)缔合和/或键合和/或连接，从而促进蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的二级结构的重新定向；
其中在xpi-PANi-E-C中的蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的所述二级结构的所述重新定向，导致蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的浓度依赖性二级结构如下：无规卷曲的浓度>α-螺旋>β-片层>β-转角；
并且其中弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)两者的重新定向提供了蛋白质弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)的所述重新定向的二级结构以接近或处于其自然存在于人或动物的细胞外基质(ECM)中的天然或自然形式，使得所述药物组合物模拟人或动物脊髓组织。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述xpi-PANi-E-C进一步包含向其赋予海绵状特性的通道和/或隧道的网络，并且其中所述通道和/或隧道包括沿其内表面突起，
使得在使用中，当将所述药物组合物在人或动物体的脊髓处、附近、邻近或以与所述人或动物体的脊髓相连接的方式植入所述人或动物体内时，所述通道和/或隧道为神经组织和/或轴突生长和/或修复提供通路，并且所述突起为神经组织或神经元组织提供锚定装置，从而促进生长和/或修复。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述交联剂为亚甲基双丙烯酰胺(MBAAm)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其用于治疗脊髓损伤，所述药物组合物用于在人或动物体的脊髓处、附近、邻近或以与所述人或动物体的脊髓相连接的方式植入所述人或动物体内。
5.一种用于治疗脊髓损伤的植入物，所述植入物用于在人或动物体的脊髓处、附近、邻近或以与所述人或动物体的脊髓相连接的方式植入所述人或动物体内，所述植入物包含根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物以及载体和/或赋形剂。
6.一种生产根据权利要求2所述的药物组合物的方法，所述方法包含以下步骤：
(i)将弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)溶解在酸性水性介质中，以形成第一溶液；
(ii)将丙烯腈添加到所述第一溶液中并混合，以形成第二溶液，可将所述第二溶液搅拌/混合直至均匀；
(iii)将引发剂添加到所述均匀的第二溶液中，
其中所述引发剂引发所述丙烯腈的自由基聚合，以形成互穿的聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)聚合物网络(iPANi-E-C)；以及
(iv)添加交联剂，
其中所述交联剂使所述聚丙烯腈(PANi)交联，以形成交联的、多孔的、互穿的聚丙烯腈(PANi)、弹性蛋白(E)和胶原蛋白(C)聚合物网络(xpi-PANi-E-C)。
7.根据权利要求6所述的方法，其中步骤(i)至(iv)按以步骤(i)开始并以步骤(iv)结束的顺序进行，并且其中在所述顺序内，步骤(iii)和(iv)同时进行。
8.根据权利要求6和7中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括步骤(v)：添加促进剂，其中步骤(v)在步骤(iv)之后进行。
9.根据权利要求7所述的方法，其中步骤(i)的所述酸性水性介质为乙酸酸性水性介质，并且其中步骤(i)包括添加过量的冰乙酸以防止弹性蛋白(E)和/或胶原蛋白(C)从所述第一溶液中沉淀。
10.根据权利要求8所述的方法，其进一步包含步骤(vi)：将所述xpi-PANi-E-C倒入模具中，并且使其凝固，其中发生进一步聚合，以形成多孔的xpi-PANi-E-C海绵；所述方法进一步包含步骤(vii)：洗涤所述多孔的xpi-PANi-E-C海绵；所述方法进一步包含步骤(viii)：将所述洗涤过的xpi-PANi-E-C海绵在-80℃与-60℃之间冷冻，并且其中所述方法进一步包含步骤(ix)：将所述xpi-PANi-E-C海绵冻干。
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