JP2021507770A - 医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
本開示は、脊髄損傷の処置において用いるための多孔質インプラントを提供するポリアクリロニトリル（PANi）ベースの医薬組成物に関する。本開示は、特に、ポリアクリロニトリル（PANi）および/またはエラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）を含み、PANi-Eおよび/またはPANi-Cおよび/またはPANi-E-Cのポリマーネットワークを形成する医薬組成物に関する。また本開示は、特に、ポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（PANi-E-C）を一緒に形成する、ポリアクリロニトリル（PANi）、エラスチン（E）およびコラーゲン（C）を含む、医薬組成物であって、ポリアクリロニトリル（PANi）を架橋して、架橋した相互侵入性のポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（xpi-PANi-E-C）を形成し得て、エラスチン（E）およびコラーゲン（C）のタンパク質二次構造は、再配向する、医薬組成物に関する。本開示は、脊髄損傷の処置における医薬組成物の使用に及ぶ。
Description
本開示は、医薬組成物、典型的に、ヒトまたは動物の体における脊髄損傷（spinal cord traumaおよび/またはspinal cord injury）の処置における使用のための医薬組成物、ならびにその製造方法に関する。特に、本開示は、脊髄損傷の処置における使用のための多孔質インプラントを提供するポリアクリロニトリル（PANi）ベースの医薬組成物に関する。また本開示は、特に、ポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（PANi-E-C）を一緒に形成する、ポリアクリロニトリル（PANi）、エラスチン（E）およびコラーゲン（C）を含む、医薬組成物であって、ポリアクリロニトリル（PANi）を架橋して、架橋した相互侵入性のポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（xpi-PANi-E-C）を形成し得て、エラスチン（E）およびコラーゲン（C）のタンパク質二次構造は、再配向する、医薬組成物に関する。本開示は、脊髄損傷の処置における医薬組成物の使用に及び、さらに、脊髄損傷の処置方法に及ぶ。
脊髄損傷（SCI）および特に外傷性脊髄損傷（TSCI）は、しばしばヒトまたは動物に壊滅的な影響を与え、麻痺または部分麻痺を引き起こす。SCIおよびTSCIは、わずかな神経回復が達成され得る前にさえ対処される必要がある、多数の複雑な介入的課題（例えば広範囲の炎症、軸索繋留、瘢痕形成、神経変性および機能喪失を含む）を提供する。
SCIおよび/またはTSCIの後遺症に苦しむヒトの人口は100万人当たり223〜755人であり、1年当たりのSCIおよび/またはTSCIに苦しむ人口は100万人当たり約10.4〜83人であると言われている。また、SCI/TSCIと共に生きている平均的なヒトは、そうでないヒトとほぼ同じくらい生きることに注目すべきである。したがって、SCI/TSCIに苦しむヒトのために処置および/または修復および/または回復の結果を改善することが切実に必要とされている。
脊髄の損傷は、例えば損傷部位へのマクロファージ、ミクログリアプロセス、オリゴデンドロサイト細胞の前駆体、およびアストロサイトの移動を含む、いくつかの生体分子および生化学的イベントを引き起こし、関与する。脊髄病変部位へのこのような分子の浸透は、順に、ミエリン関連糖タンパク質およびコンドロイチン硫酸プロテオグリカンなどの生体分子を生じる。これらは、病変部位における瘢痕組織の形成を促進し、典型的にはアストログリア構造を含む、阻害分子である。瘢痕組織は、その後の罹患軸索の再成長の失敗を示す。
現在、SCI/TSCIの数時間後に適用された場合であっても、利用可能な神経治療戦略は十分ではない。神経組織の効果的な再生のために、損傷した軸索は、嚢胞腔を超えて、損傷ギャップの再結合を必要とする神経機能の復活のために、慢性的に損傷した索を修復する。SCIの修復は、損傷ギャップの橋渡しが必要である。神経経路として機能し、軸索を直接成長させる生体材料を使用することを目的とする研究があるが、効果的な修復方法を提供することはほとんど成功していない。
神経修復を促進できる医薬組成物および/またはインプラントは、神経細胞、神経組織および/または軸索が該医薬組成物および/またはインプラントの人口的環境内で再生および/または増殖するのを可能にするために、化学的および/または物理的な合図を提供する必要がある。
脊髄損傷の処置における使用のための効果的な医薬組成物および/またはインプラントを提供する上でのいくつかの課題としては、例えば、(i)炎症を最小限にし、細胞死を制限する生体適合性およびそれに付随した生分解性の組成物を製造すること；(ii)外科的介入の数を制限することにより患者に順応性のある組成物を提供すること；(iii)周囲の健康な組織に対する外科的干渉の数を制限する組成物を提供すること；(iv)手術中に血液脊髄関門の保存を可能にする組成物を提供すること；(v)グリア瘢痕組織形成の減少を促進する組成物を提供すること；(vi)神経の成長および/または回復のための接着および/または増殖部位を促進して、病変部位への神経突起の伸長を促進する物理化学的特性を有する組成物を提供すること；および(vii)炎症および/または拒絶を減少させ、神経組織の成長および修復を促進するために、ヒトまたは動物の脊髄を模倣する物理化学的特性を有する組成物を提供することが挙げられる。
上記の1つまたは当該技術分野で知られている他の課題を少なくとも改善または部分的に取り組むことができる、脊髄損傷の処置における使用のための医薬組成物および/またはインプラントの開発が至急必要とされたままである。
広い意味で、かつ本開示の第1態様によれば、ポリアクリロニトリル（PANi）および/またはエラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）のポリマーネットワークを、それぞれPANi-Eおよび/またはPANi-Cおよび/またはPANi-E-Cの形態で一緒に形成する、ポリアクリロニトリル（PANi）および/またはエラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）を含む、医薬組成物を提供する。
医薬組成物において、ポリアクリロニトリル（PANi）を架橋剤によって架橋し得て、その結果、PANi-Eおよび/またはPANi-Cおよび/またはPANi-E-Cが、架橋した多孔質で半相互侵入性（相互侵入性）のポリマーネットワーク（xpi）を形成し得て、ここで、架橋ポリアクリロニトリル（PANi）は、エラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）と結合（associateおよび/またはbondおよび/またはconnect）して、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の二次構造の再配向を促進する。
ポリアクリロニトリル（PANi）および/またはエラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）の間の結合（associationおよび/またはbond formationおよび/またはconnection）は、共有結合および/または非共有結合および/または非結合性相互作用を介し得る。共有結合性相互作用は、例えば、σ結合および/またはπ結合を含み得る。非共有結合性相互作用は、例えば、イオン、イオン-双極子、水素結合、双極子-双極子、ファンデルワールス、双極子-誘起双極子、ロンドン分散、π-π相互作用、πスタッキング、カチオン-π相互作用およびアニオン-π相互作用を含み得る。非結合性相互作用は、タンパク質エラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）の近くでPANi分子が経験する伸び、曲げおよびねじりひずみから生じ得て、その逆も同様である。
本出願人は、予想外にかつ驚くべきことに、PANi-E内におけるタンパク質エラスチン（E）の二次構造の再配向は、タンパク質エラスチン（E）の濃度依存性二次構造をもたらし、すなわち、ランダムコイル＞βシート＞αヘリックス＞βターンの濃度であることを見出した。記号「＞」は、本明細書を通して用語「より大きい」を示す。
本出願人は、予想外にかつ驚くべきことに、PANi-C内におけるタンパク質コラーゲン（C）の二次構造の再配向は、タンパク質コラーゲン（C）の濃度依存性二次構造をもたらし、すなわち、αヘリックス＞ランダムコイル＞βターン＞βシートの濃度であることを見出した。
本出願人は、予想外にかつ驚くべきことに、PANi-E-C内におけるタンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の二次構造の再配向は、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の濃度依存性二次構造をもたらし、すなわち、ランダムコイル＞αヘリックス＞βシート＞βターンの濃度であることを見出した。
再配向の前の、エラスチン（E）単独の濃度依存性二次構造は、βシート＞ランダムコイル＞αヘリックス＞βターンの濃度である。
再配向の前の、コラーゲン（C）単独の濃度依存性二次構造は、βシート＞αヘリックス＞ランダムコイル＞βターンの濃度である。
エラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）の再配向は、ヒトまたは動物の細胞外マトリックス（ECM）において天然で見られるそれらのネイティブな（nativeまたはnatural）形態に近いかまたはネイティブな形態である、タンパク質エラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）の再配向された二次構造を提供して、脊髄模倣（spinomimetic）特性を提供する（すなわち、ヒトまたは動物の脊髄を模倣する）。
再配向は、自己組織化によりさらに促進され得る。
再配向は、ヒトまたは動物の脊髄組織を模倣する、弾性（elasticity）および/または機械的強度および/または変形エネルギーおよび/または剛性（rigidity）および/または剛性（stiffness）および/または堅さおよび/または弾性（resilience）を含むがこれらに限定されない、独特なおよび/または有利な物理化学的特性を医薬組成物に与えて、脊髄模倣医薬組成物を提供する。
医薬組成物は、それにスポンジ様特性を与えるチャネルおよび/またはトンネルのネットワークを備え得る。スポンジ様医薬組成物は、神経スポンジ（neurosponge）であり得る。用語「神経スポンジ」は、必要に応じて「NS」と省略され得る。
医薬組成物が、使用において、ヒトまたは動物の体の脊髄に、その近くに、それに隣接してまたはそれに接続してヒトまたは動物の体内へ埋め込まれるとき、チャネルおよび/またはトンネルは、神経組織の経路（pathwayおよび/またはrouteおよび/またはconduit）、および/または軸索の成長および/または回復を提供する。
チャネルおよび/またはトンネルは、その内部表面に沿って、隆起した形状または突起を含み得る。隆起した形状または突起は、神経組織（nerve tissueまたはneuronal tissue）、特に軸索の成長および/または回復を促進するために、係留手段を提供する。チャネルおよび/またはトンネル内部の突起は、ヒトまたは動物の脊髄を模倣する繊維状のチャネル化および/またはトンネル化したポリマー構造の提供を促進する。
本開示の第1態様の好ましい実施態様によれば、ポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（PANi-E-C）を一緒に形成する、ポリアクリロニトリル（PANi）、エラスチン（E）およびコラーゲン（C）を含む、医薬組成物を提供する。
医薬組成物において、ポリアクリロニトリル（PANi）を架橋剤によって架橋して、架橋した多孔質で半相互侵入性（相互侵入性）のポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（xpi-PANi-E-C）を形成し得て、ここで、架橋ポリアクリロニトリル（PANi）は、エラスチン（E）およびコラーゲン（C）と結合して、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の二次構造の再配向を促進する。
ポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）の間の結合は、共有結合および/または非共有結合および/または非結合性相互作用を介し得る。共有結合性相互作用は、例えば、σ結合および/またはπ結合を含み得る。非共有結合性相互作用は、例えば、イオン、イオン-双極子、水素結合、双極子-双極子、ファンデルワールス、双極子-誘起双極子、ロンドン分散、π-π相互作用、πスタッキング、カチオン-π相互作用およびアニオン-π相互作用を含み得る。非結合性相互作用は、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の近くでPANi分子が経験する伸び、曲げおよびねじりひずみから生じ得て、その逆も同様である。
本出願人は、予想外にかつ驚くべきことに、xpi-PANi-E-C内におけるタンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の二次構造の再配向は、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の濃度依存性二次構造をもたらし、すなわち、ランダムコイル＞αヘリックス＞βシート＞βターンの濃度であることを見出した。
xpi-PANi-E-Cの一部を形成する前の、エラスチン（E）単独の濃度依存性二次構造は、βシート＞ランダムコイル＞αヘリックス＞βターンの濃度である。
xpi-PANi-E-Cの一部を形成する前の、コラーゲン（C）単独の濃度依存性二次構造は、βシート＞αヘリックス＞ランダムコイル＞βターンの濃度である。
エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の両方の再配向は、ヒトまたは動物の細胞外マトリックス（ECM）において天然で見られるそれらのネイティブな形態に近いかまたはネイティブな形態である、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の再配向された二次構造を提供する。
再配向は、自己組織化によりさらに促進され得る。
再配向は、ヒトまたは動物の脊髄組織を模倣する、弾性および/または機械的強度および/または変形エネルギーおよび/または剛性および/または剛性および/または堅さおよび/または弾性を含むがこれらに限定されない、独特なおよび/または有利な物理化学的特性をxpi-PANi-E-Cに与えて、脊髄模倣医薬組成物を提供する。
本出願人は、化学的にネイティブなポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）の間の結合、ならびにエラスチン（E）およびコラーゲン（C）の再配向は、脊髄模倣特性を有するxpi-PANi-E-Cをもたらすことに驚いた。
架橋剤は、メチレンビスアクリルアミド（MBAAm）であってもよいが、これに限定されない。
xpi-PANi-E-C医薬組成物は、xpi-PANi-E-Cにスポンジ様特性を与えるチャネルおよび/またはトンネルのネットワークを備え得る。スポンジ様xpi-PANi-E-Cは、神経スポンジであり得る。用語「神経スポンジ」は、必要に応じて「NS」と省略され得る。
xpi-PANi-E-C-NS/医薬組成物が、使用において、ヒトまたは動物の体の脊髄に、その近くに、それに隣接してまたはそれに接続してヒトまたは動物の体内へ埋め込まれるとき、チャネルおよび/またはトンネルは、神経組織の経路、および/または軸索の成長および/または回復を提供する。
チャネルおよび/またはトンネルは、その内部表面に沿って、隆起した形状または突起を含み得る。隆起した形状または突起は、神経組織、特に軸索の成長および/または回復を促進するために、係留手段を提供する。チャネルおよび/またはトンネル内部の突起は、ヒトまたは動物の脊髄を模倣する繊維状のチャネル化および/またはトンネル化したポリマー構造の提供を促進する。
本開示の第2態様によれば、脊髄損傷の処置における使用のための医薬組成物であって、該医薬組成物が、ヒトまたは動物の体の脊髄に、その近くに、それに隣接してまたはそれに接続してヒトまたは動物の体内へ埋め込むためのものであり、該医薬組成物が、本開示の第1態様によるものである、医薬組成物を提供する。
本開示の第3態様によれば、ヒトまたは動物の体の脊髄に、その近くに、それに隣接してまたはそれに接続してヒトまたは動物の体内へ埋め込むためのインプラントであって、該インプラントが、本開示の第1態様による医薬組成物を含む、インプラントを提供する。
インプラントは、担体および/または添加剤をさらに含み得る。
本開示の第4態様によれば、脊髄損傷の処置における使用のためのインプラントであって、該インプラントが、ヒトまたは動物の体の脊髄に、その近くに、それに隣接してまたはそれに接続してヒトまたは動物の体内へ埋め込むためのものであって、該インプラントが、本開示の第1態様による医薬組成物を含む、インプラントを提供する。
インプラントは、担体および/または添加剤をさらに含み得る。
本開示の第5態様によれば、ヒトおよび/または動物において脊髄損傷を処置する医薬組成物の製造における、ポリアクリロニトリル（PANi）、エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の使用を提供する。
医薬組成物は、本開示の第1態様によるものであり得る。
本開示の第6態様によれば、本開示の第1態様による医薬組成物の製造方法であって、下記工程：
(i)エラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）を酸性水性媒体に溶解させて、第1溶液を形成する工程；
(ii)アクリロニトリルを第1溶液に加え、混合して、第2溶液を形成し、均一になるまで第2溶液を撹拌/混合してもよい工程；および
(iii)重合および/または架橋を生じさせ、架橋した多孔質で相互侵入性のポリアクリロニトリル（PANi）および/またはエラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）のポリマーネットワークを形成する工程
を含む方法を提供する。
(i)エラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）を酸性水性媒体に溶解させて、第1溶液を形成する工程；
(ii)アクリロニトリルを第1溶液に加え、混合して、第2溶液を形成し、均一になるまで第2溶液を撹拌/混合してもよい工程；および
(iii)重合および/または架橋を生じさせ、架橋した多孔質で相互侵入性のポリアクリロニトリル（PANi）および/またはエラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）のポリマーネットワークを形成する工程
を含む方法を提供する。
本開示の第6態様の好ましい実施態様によれば、好ましい本開示の第1態様による医薬組成物の製造方法であって、下記工程：
(i)エラスチン（E）およびコラーゲン（C）を酸性水性媒体に溶解させて、第1溶液を形成する工程；
(ii)アクリロニトリルを第1溶液に加え、混合して、第2溶液を形成し、均一になるまで第2溶液を撹拌/混合してもよい工程；
(iii)例えば過硫酸アンモニウム（APS）であるがこれに限定されない、開始剤を均一な第2溶液に加える工程であって、
開始剤が、アクリロニトリルのフリーラジカル重合を開始して、相互侵入性のポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（iPANi-E-C）を形成する工程；および
(iv)例えばメチレンビスアクリルアミド（MBAAm）であるがこれに限定されない、架橋剤を加える工程であって、
架橋剤が、ポリアクリロニトリル（PANi）を架橋して、架橋した多孔質で相互侵入性のポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（xpi-PANi-E-C）を形成する工程
を含む方法を提供する。
(i)エラスチン（E）およびコラーゲン（C）を酸性水性媒体に溶解させて、第1溶液を形成する工程；
(ii)アクリロニトリルを第1溶液に加え、混合して、第2溶液を形成し、均一になるまで第2溶液を撹拌/混合してもよい工程；
(iii)例えば過硫酸アンモニウム（APS）であるがこれに限定されない、開始剤を均一な第2溶液に加える工程であって、
開始剤が、アクリロニトリルのフリーラジカル重合を開始して、相互侵入性のポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（iPANi-E-C）を形成する工程；および
(iv)例えばメチレンビスアクリルアミド（MBAAm）であるがこれに限定されない、架橋剤を加える工程であって、
架橋剤が、ポリアクリロニトリル（PANi）を架橋して、架橋した多孔質で相互侵入性のポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（xpi-PANi-E-C）を形成する工程
を含む方法を提供する。
工程(i)〜(iv)は、工程(i)で始まり工程(iv)で終わる順番で行われ得る。
その順番内で、工程(iii)および(iv)は、同時に行われ得る。
方法は、工程(v)：促進剤、例えばテトラメチルエチレンジアミン（TEMED）を加える工程をさらに含み得て、ここで、工程(v)は工程(iv)の後に行われる。
工程(i)の酸性水性媒体（acidic aqueous medium）は、水性酢酸媒体（aqueous acetic acidic medium）であり得る。工程(i)は、第1溶液からのエラスチン（E）および/またはコラーゲンの沈殿を防ぐために、過剰な氷酢酸の添加を含み得る。
方法は、工程(vi)：xpi-PANi-E-Cを鋳型、好ましくはポリエチレン鋳型に注ぎ、それを固化させて（さらに重合が生じて）、多孔質xpi-PANi-E-Cスポンジを形成する工程を含み得る。好ましくは、xpi-PANi-E-Cを、一晩、さらに好ましくは室温条件下で、固化させる。
方法は、工程(vii)：多孔質xpi-PANi-E-Cスポンジを、好ましくは再蒸留水で洗浄する工程を含み得る。
方法は、工程(viii)：洗浄したxpi-PANi-E-Cスポンジを約-80℃〜-60℃で、好ましくは約8〜12時間凍結する工程を含み得る。
方法は、工程(ix)：xpi-PANi-E-Cスポンジを、好ましくは約25mmtorrにて約24時間凍結乾燥する工程を含み得る。
添付の図面および/または実施例のいずれか1つを参照して、実質的に説明、図示および/または例示する本開示の第1〜6態様の1つを提供する。
本開示の実施態様は、非限定的な例としてのみで、添付の図面を参照して、以下に説明する：
図1は、脊髄模倣足場について実施した圧縮機械試験を表す典型的な力-距離プロファイルを示す。a)アンカー1と2の間のエリア（図の影付き部分）は変形エネルギーを表し、勾配は剛性勾配に対応する。曲線の最高点は、与えたひずみ下で試料が受けた最大負荷に対応する。b)エリア2（アンカー2と3の間）とエリア1（エリア1と2の間）の比は、足場のマトリックス弾性を表す。
図2は、本開示による水和したxpi-PANi-E-C神経スポンジの扱いやすさ、耐荷重性、柔軟性を示す写真(a)〜(d)を示す。
図3は、凍結乾燥したラットの脊髄の走査電子顕微鏡写真(a)〜(d)を示す。
図4は、本開示によるxpi-PANi-E-C神経スポンジの脊髄模倣構造の表面を示す走査電子顕微鏡写真(a)〜(f)を示す。
図5は、xpi-PANi-E-C神経スポンジの脊髄模倣構造内のチャネルまたはトンネル（いわゆる「神経トンネル（neurotunnel）」）を示す走査電子顕微鏡写真(a)〜(f)を示す。
図6は、xpi-PANi-E-C神経スポンジの脊髄模倣構造の繊維状性質を示す走査電子顕微鏡写真(a)〜(f)を示す。
図7は、xpi-PANi-E-C神経スポンジの脊髄模倣構造比較および確認する走査電子顕微鏡写真を示し、(a)はラットの脊髄を示し、(b)はxpi-PANi-E-C神経スポンジを示す。
図8は、本開示によるa)PANi-E神経スポンジ；b)PANi-C神経スポンジ；およびxpi-PANi-E-C神経スポンジの線形等温線プロットを示す。
図9は、本開示によるPANi、エラスチン（E）、コラーゲン（C）、PANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANI-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジのFTIRスペクトルを示す。
図10は、ネイティブなポリマーの(a)エラスチン（E）、(b)コラーゲン（C）、ならびに(c)PANi-E神経スポンジ、(d)PANi-C神経スポンジおよび(e)xpi-PANi-E-C神経スポンジのアミドIのピークに対応するフーリエデコンボリューションしたフーリエ変換赤外（FT/IR）減衰全反射（ATR）スペクトルを示す。
図11は、ネイティブな(a)コラーゲンおよび(b)エラスチンの示差走査熱量測定（DSC）サーモグラムを示す。
図12は、本開示によるPANi、エラスチン（E）、コラーゲン（C）、PANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジのDSCサーモグラムを示す。
図13は、10〜25％（SD（ML）≦0.04；SD（DE）≦0.05；SD（RG）≦0.08；SD（MR）≦9.2；n＝3）の部分的に適用されるひずみ値下での、本開示によるPANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジ（PANi-ECとラベル）の物理機械的特性を示し、(a)は最大負荷を示し、(b)は変形エネルギーを示し、(c)は剛性勾配を示し、(d)はマトリックス弾性を示す。
図14は、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジ（PANi-ECとラベル）のマトリックスの水和および分解プロファイルを示す棒グラフを示し（SD（WR）≦202；SD（MH）≦118；SD（MD）≦6；n＝3）、(a)は水分保持を示し、(b)はマトリックスの水和を示し、(c)はマトリックスの分解を示す。
図15は、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジ（PANi-ECとラベル）の薬物放出プロファイルを示し（SD（DEX）≦6.6；SD（CURC）≦4.3；n＝3）、(a)はデキサメサゾン放出を示し、(b)はクルクミン放出を示す。
図16は、PANi（左上）、PANi-E（右上）、PANi-C（左下）、xpi-PANi-EC（左下）（PANi-ECとラベル）を示す分子力学シミュレーションからの、ペプチド分子の近くのPANiの慣性軸の視覚化を示す。
図17は、真空でエネルギー最小化後のa)コラーゲン-エラスチン；およびb)PANi-コラーゲン-エラスチの分子複合体の幾何学的選好性の視覚化を示す。PANiは、球棒表現で示した。
図18は、増殖試験を示す3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイの描写を示す（SD≦14；n＝3）。
図19は、処置後の両処置群についてのBasso, Beattie, Bresnahan（BBB）運動スコアの変化を示す線グラフである（SD≦1；n≧3）。
図20(A)〜(H)は、コントロール群（群0）における脊髄損傷（SCI）後28日間にわたる機能回復の程度を逐次的に示す。
図21(A)〜(I)は、xpi-PANi-E-C群におけるSCI後28日間にわたる機能回復の程度を逐次的に示す。
図22は、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）検体ベースライン；L2を示す。5倍対物レンズ：NAD、形態的に平凡な脊髄検体を強調。
図23は、H&E検体-xpi-PANi-E-C-B；L2を示す。30倍対物レンズ：グレード2、多数の変性した神経線維を強調（矢印）。
図24は、H&E検体-コントロール；L3を示す。8倍対物レンズ：グレード4。多数の変性した神経線維を伴う神経の完全な横方向の離断、完全な構造的崩壊/喪失領域（星）および空胞化格子細胞（矢印）による置き換えに注目されたい。
図25は、H&E検体xpi-PANi-E-C-A；L3を示す。3倍対物レンズ：グレード5。神経の完全な横方向の離断、および（推定）再生神経芽細胞の塊（太い矢印）による置き換えに注目されたい。
図26は、H&E検体xpi-PANi-E-C-A；L3を示す。16倍対物レンズ：グレード5。多数の変性した神経線維を伴う神経の完全な横方向の離断、完全な構造的崩壊/喪失領域（星）、および好酸球性細胞外マトリックス（矢印）および多核（推定）再生神経芽細胞（太い矢印）による置き換えに注目されたい。
図27は、ED1検体ベースライン；L2を示す。40倍対物レンズ：グレード0。散在する陽性グリア細胞（矢印）の数が少ないことに注目されたい。
図28は、ED1検体xpi-PANi-E-C-B；L1を示す。40倍対物レンズ：グレード2。陽性グリア細胞（矢印）および内皮細胞（太い矢印）に注目されたい。
図29は、ED1検体xpi-PANi-E-C-A；L1を示す。40倍対物レンズ：グレード4。陽性多核細胞（星）の存在に加えて、無数の、しばしば変性した陽性グリア細胞（矢印）に注目されたい。これは多核格子細胞および/または原子神経芽細胞内における組織球マーカー発現の存在を示している。
図30は、誘導性一酸化窒素シンターゼ（iNOS）検体ベースライン；L2を示す。5倍対物レンズ：グレード0。白質（矢印）および灰白質（星）の細胞内および細胞外構成要素全体の染色のベースラインレベルに注目されたい。
図31は、iNOS検体xpi-PANi-E-C-C；L2を示す。5倍対物レンズ：グレード2。無傷および病変部外の白質（矢印）内における染色の強度増加に注目されたい。
図32は、カルシウム活性化非リソソーム中性プロテアーゼ（カルパイン）検体xpi-PANi-E-C-A；L1を示す。10倍対物レンズ：グレード1。多核巨細胞（矢印）内における細胞内染色（赤）の最小限の存在に注目されたい。
図33は、カルパイン検体コントロール；Lを示す。15倍対物レンズ：グレード1。損傷髄（矢印）内における細胞内/細胞外染色（赤）の最小限の存在に注目されたい。
図34は、グリア繊維状酸性タンパク質/ニューロフィラメント200（GFAP/NF-200）検体ベースライン；L1を示す。60倍対物レンズ：グレード0。散在性で細網状のGFAP陽性構造的ネットワーク（赤）および可変サイズの線形のNF-200-陽性管状ネットワーク（緑）に注目されたい。注-核が青色に染色される。
図35は、GFAP/NF-200検体xpi-PANi-E-C-A；L1を示す。60倍対物レンズ：グレード4。散在性で均一なGFAP陽性タンパク質沈着物（星）による置き換えを伴う細網状GFAP陽性構造的ネットワークの完全な喪失に注目されたい。残存する乏しいNF-200-陽性材料を、凝縮した球状沈着物（矢印）で表す。
図36は、GFAP/NF-200検体xpi-PANi-E-C-A；L1を示す。60倍対物レンズ：グレード4；周辺帯。修復病変（矢印）の周辺におけるGFAP陽性タンパク質の周辺の丸みと肥厚に注目されたい。
具体的であるが、非限定的である本開示の実施態様を下記に説明する。上記発明の概要の内容は、長い繰り返しを避けるために、それを参照することにより以下に繰り返される。
一般的に、かつ本開示の第1態様によれば、ポリアクリロニトリル（PANi）および/またはエラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）を含み、ポリアクリロニトリル（PANi）および/またはエラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）のポリマーネットワークを、PANi-Eおよび/またはPANi-Cおよび/またはPANi-E-Cの形態で一緒に形成する、医薬組成物を提供する。典型的に、ポリアクリロニトリル（PANi）を架橋剤によって架橋し、その結果、PANi-Eおよび/またはPANi-Cおよび/またはPANi-E-Cが、架橋した多孔質で半相互侵入性（相互侵入性）のポリマーネットワーク（xpi）を形成し得る。架橋ポリアクリロニトリル（PANi）は、エラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）と結合して、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の二次構造の再配向を促進する。
ポリアクリロニトリル（PANi）および/またはエラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）の間の結合は、共有結合および/または非共有結合および/または非結合性相互作用を介し得る。共有結合性相互作用は、例えば、σ結合および/またはπ結合を含み得る。非共有結合性相互作用は、例えば、イオン、イオン-双極子、水素結合、双極子-双極子、ファンデルワールス、双極子-誘起双極子、ロンドン分散、π-π相互作用、πスタッキング、カチオン-π相互作用およびアニオン-π相互作用を含み得る。非結合性相互作用は、タンパク質エラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）の近くでPANi分子が経験する伸び、曲げおよびねじりひずみから生じ得て、その逆も同様である。
本出願人は、予想外にかつ驚くべきことに、PANi-E内におけるタンパク質エラスチン（E）の二次構造の再配向は、タンパク質エラスチン（E）の濃度依存性二次構造をもたらし、すなわち、ランダムコイル＞βシート＞αヘリックス＞βターンの濃度であることを見出した。
本出願人は、予想外にかつ驚くべきことに、PANi-C内におけるタンパク質コラーゲン（C）の二次構造の再配向は、タンパク質コラーゲン（C）の濃度依存性二次構造をもたらし、すなわち、αヘリックス＞ランダムコイル＞βターン＞βシートの濃度であることを見出した。
本出願人は、予想外にかつ驚くべきことに、PANi-E-C内におけるタンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の二次構造の再配向は、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の濃度依存性二次構造をもたらし、すなわち、ランダムコイル＞αヘリックス＞βシート＞βターンの濃度であることを見出した。
再配向の前の、エラスチン（E）単独の濃度依存性二次構造は、βシート＞ランダムコイル＞αヘリックス＞βターンの濃度である。再配向の前の、コラーゲン（C）単独の濃度依存性二次構造は、βシート＞αヘリックス＞ランダムコイル＞βターンの濃度である。エラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）の再配向は、ヒトまたは動物の細胞外マトリックス（ECM）において天然で見られるそれらのネイティブな形態に近いかまたはネイティブな形態である、タンパク質エラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）の再配向された二次構造を提供して、脊髄模倣特性を提供する。再配向は、自己組織化によりさらに促進される。
医薬組成物は、それにスポンジ様特性を与えるチャネルおよび/またはトンネルのネットワークを含む。スポンジ様医薬組成物は、神経スポンジと称される。用語「神経スポンジ」は、必要に応じて「NS」と省略される。
医薬組成物が、使用において、ヒトまたは動物の体の脊髄に、その近くに、それに隣接してまたはそれに接続してヒトまたは動物の体内へ埋め込まれるとき、チャネルおよび/またはトンネルは、神経組織の経路、および/または軸索の成長および/または回復を提供する。
チャネルおよび/またはトンネルは、その表面（その内部表面）に沿って、隆起した形状または突起を含む。隆起した形状または突起は、神経組織、特に軸索の成長および/または回復を促進するために、係留手段を提供する。チャネルおよび/またはトンネル内部の突起は、ヒトまたは動物の脊髄を模倣する繊維状のチャネル化および/またはトンネル化したポリマー構造の提供を促進する。
本開示の第1態様の好ましい実施態様によれば、ポリアクリロニトリル（PANi）、エラスチン（E）およびコラーゲン（C）を含む医薬組成物を提供する。PANi、エラスチン（E）およびコラーゲン（C）は、一緒にポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（PANi-E-C）を形成する。
ポリアクリロニトリル（PANi）を、典型的には、架橋剤によって架橋して、架橋した多孔質で相互侵入性のポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（xpi-PANi-E-C）を形成する。架橋ポリアクリロニトリル（PANi）は、エラスチン（E）およびコラーゲン（C）と結合して、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の二次構造の再配向を促進する。再配向は、ヒトまたは動物の体内の細胞外マトリックス（ECM）に天然に存在する形態により厳密に模倣する、二次構造の形成である。
ポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）の間の結合は、共有結合および/または非共有結合および/または非結合性相互作用を介し得る。共有結合性相互作用は、例えば、σ結合および/またはπ結合を含み得る。非共有結合性相互作用は、例えば、イオン、イオン-双極子、水素結合、双極子-双極子、ファンデルワールス、双極子-誘起双極子、ロンドン分散、π-π相互作用、πスタッキング、カチオン-π相互作用およびアニオン-π相互作用を含み得る。非結合性相互作用は、エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の近くでPANi分子が経験する伸び、曲げおよびねじりひずみから生じ得て、その逆も同様である。理論に限定されるものではないが、水素結合および非結合性相互作用などの非共有結合性相互作用は、エラスチン（E）およびコラーゲン（C）タンパク質二次構造の効果的な再配向に対して最大の寄与因子である。
化学結合は、架橋ポリアクリロニトリル（PANi）、エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の2つの原子または原子群間で形成され得て、それらの間で作用する力は、得られた相互侵入性のポリマーネットワークを独立した分子種として定義するのに十分に安定な凝集体の形成を引き起こす。
本出願人は、予想外にかつ驚くべきことに、xpi-PANi-E-C-NS内におけるタンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の二次構造の再配向は、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の濃度依存性二次構造をもたらし、すなわち、ランダムコイル＞αヘリックス＞βシート＞βターンの濃度であることを見出した。記号「＞」は、本明細書を通して用語「より大きい」を示す。
xpi-PANi-E-C-NSの一部を形成する前の、エラスチン（E）単独の濃度依存性二次構造は、βシート＞ランダムコイル＞αヘリックス＞βターンの濃度である。xpi-PANi-E-C-NSの一部を形成する前の、コラーゲン（C）単独の濃度依存性二次構造は、βシート＞αヘリックス＞ランダムコイル＞βターンの濃度である。エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の両方の再配向は、ヒトまたは動物の細胞外マトリックス（ECM）において天然で見られるそれらのネイティブな形態に近いかまたはネイティブな形態である、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の再配向された二次構造を提供する。再配向は、自己組織化によりさらに促進される。
再配向は、ヒトまたは動物の脊髄組織を模倣する、弾性および/または機械的強度および/または変形エネルギーおよび/または剛性および/または剛性および/または堅さおよび/または弾性を提供することを含むがこれらに限定されない、独特なおよび/または有利な物理化学的/物理機械的特性をxpi-PANi-E-C医薬組成物/NSに与えて、脊髄模倣医薬組成物を提供する。
本出願人は、化学的にネイティブなポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）の間の結合、ならびにエラスチン（E）およびコラーゲン（C）の再配向は、脊髄模倣特性を有するxpi-PANi-E-Cをもたらすことに驚いた。
架橋剤は、典型的にはメチレンビスアクリルアミド（MBAAm）である。
xpi-PANi-E-C医薬組成物は、xpi-PANi-E-Cにスポンジ様特性を与えるチャネルおよび/またはトンネルのネットワークを有するものとして生成される。スポンジ様xpi-PANi-E-Cは、神経スポンジ（NS）であり得る。
xpi-PANi-E-C医薬組成物/NSが、使用において、ヒトまたは動物の体の脊髄に、その近くに、それに隣接してまたはそれに接続してヒトまたは動物の体内へ埋め込まれるとき、チャネルおよび/またはトンネルは、神経組織の経路、および/または軸索の成長および/または回復を提供する。
チャネルおよび/またはトンネルは、その表面に沿って、隆起した形状または突起を含む。隆起した形状または突起は、神経組織、特に軸索の成長および/または回復を促進するために、係留手段を提供する。チャネルおよび/またはトンネル内部の突起は、ヒトまたは動物の脊髄を模倣する繊維状のチャネル化および/またはトンネル化したポリマー構造の提供を促進する。該チャネルおよび/またはトンネルの存在を予測し、医薬組成物の構成要素化合物に基づく隆起した形状の存在を予測することは、不可能であった。
第2〜第5態様は、上記発明の概要のとおりここで繰り返される。
本開示の広い第1態様によるPANi-E、PANi-Cおよび/またはPANi-E-C医薬組成物を製造する一般的方法は、以下の実施例でさらに示す。
本開示の第6態様の好ましい実施態様によれば、本開示の第1態様による医薬組成物の製造方法であって、下記工程：
(i)エラスチン（E）およびコラーゲン（C）を酸性水性媒体に溶解させて、第1溶液を形成する工程；
(ii)アクリロニトリルを第1溶液に加え、混合して、第2溶液を形成し、均一になるまで第2溶液を撹拌/混合してもよい工程；
(iii)例えば過硫酸アンモニウム（APS）であるがこれに限定されない、開始剤を均一な第2溶液に加える工程であって、
開始剤が、アクリロニトリルのフリーラジカル重合を開始して、相互侵入性のポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（iPANi-E-C）を形成する工程；および
(iv)例えばメチレンビスアクリルアミド（MBAAm）であるがこれに限定されない、架橋剤を加える工程であって、
架橋剤が、ポリアクリロニトリル（PANi）を架橋して、架橋した多孔質で相互侵入性のポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（xpi-PANi-E-C）を形成する工程
を含む方法を提供する。
(i)エラスチン（E）およびコラーゲン（C）を酸性水性媒体に溶解させて、第1溶液を形成する工程；
(ii)アクリロニトリルを第1溶液に加え、混合して、第2溶液を形成し、均一になるまで第2溶液を撹拌/混合してもよい工程；
(iii)例えば過硫酸アンモニウム（APS）であるがこれに限定されない、開始剤を均一な第2溶液に加える工程であって、
開始剤が、アクリロニトリルのフリーラジカル重合を開始して、相互侵入性のポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（iPANi-E-C）を形成する工程；および
(iv)例えばメチレンビスアクリルアミド（MBAAm）であるがこれに限定されない、架橋剤を加える工程であって、
架橋剤が、ポリアクリロニトリル（PANi）を架橋して、架橋した多孔質で相互侵入性のポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（xpi-PANi-E-C）を形成する工程
を含む方法を提供する。
工程(i)〜(iv)は、工程(i)で始まり工程(iv)で終わる順番で行われる。その順番内で、工程(iii)および(iv)は、同時に行われる。
方法は、工程(v)：促進剤、例えばテトラメチルエチレンジアミン（TEMED）を加える工程をさらに含み、ここで、工程(v)は工程(iv)の後に行われる。
工程(i)の酸性水性媒体は、水性酢酸媒体である。工程(i)は、第1溶液からのエラスチン（E）および/またはコラーゲンの沈殿を防ぐために、過剰な氷酢酸の添加を含み得る。
方法は、工程(vi)：xpi-PANi-E-Cを鋳型、好ましくはポリエチレン鋳型に注ぎ、それを固化させて（さらに重合が生じて）、多孔質xpi-PANi-E-C神経スポンジを形成する工程を含み得る。好ましくは、xpi-PANi-E-Cを、一晩、さらに好ましくは室温条件下で、固化させる。
方法は、工程(vii)：多孔質xpi-PANi-E-C-NSを、好ましくは再蒸留水で洗浄する工程を含み得る。方法は、工程(viii)：洗浄したxpi-PANi-E-C-NSを約-80℃〜-60℃で、好ましくは約8〜12時間凍結する工程を含み得る。方法は、工程(ix)：xpi-PANi-E-C-NSを、好ましくは約25mmtorrにて約24時間凍結乾燥する工程を含み得る。凍結乾燥プロセスは、チャネルおよび/またはトンネル形成に寄与し得て、その中で多孔質を与えるのを促進し得る。
本出願人は、予想外にかつ驚くべきことに、本開示によるxpi-PANi-E-C医薬組成物または神経スポンジは、ヒトまたは動物における脊髄損傷の処置で効果的かつ成功した使用を可能にする独特な物理化学的特性を提供することを見出した。
例えば、先行技術で強調される課題のいくつかは、xpi-PANi-E-C医薬組成物/神経スポンジにより対処され得る。xpi-PANi-E-C医薬組成物/神経スポンジは、ヒトまたは動物の脊髄を模倣して生体適合性および/または生分解性の組成物を提供し、炎症および/または細胞死を最小限にする。
xpi-PANi-E-C医薬組成物/神経スポンジは、1回の外科的介入で十分であることが分かっているように（下記動物試験参照）、外科的介入の数を制限する組成物を提供する。xpi-PANi-E-C医薬組成物/神経スポンジはまた、血液脊髄関門の保存を可能にし、グリア瘢痕組織形成の減少を促進し、神経組織の接着および増殖を促進し、そしてヒトまたは動物の脊髄を模倣する。xpi-PANi-E-C医薬組成物/神経スポンジは、脊髄損傷の処置プロトコールにおいて外科的インプラントしての使用に特に有利である、28日目に約50％のマトリックスが分解する、4週間にわたるほぼ直線的な分解プロファイル（R2＝0.9802）を提供する。
本出願人は、予想外にかつ驚くべきことに、xpi-PANi-E-C-NS内におけるタンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の二次構造の再配向は、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の濃度依存性二次構造をもたらし、すなわち、ランダムコイル＞αヘリックス＞βシート＞βターンの濃度であることを見出した。
xpi-PANi-E-Cの一部を形成する前の、エラスチン（E）単独の濃度依存性二次構造は、βシート＞ランダムコイル＞αヘリックス＞βターンの濃度である。xpi-PANi-E-C-NSの一部を形成する前の、コラーゲン（C）単独の濃度依存性二次構造は、βシート＞αヘリックス＞ランダムコイル＞βターンの濃度である。
エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の両方の再配向は、ヒトまたは動物の細胞外マトリックス（ECM）において天然で見られるそれらのネイティブな形態である、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の再配向された二次構造を提供する。再配向は、ヒトまたは動物の脊髄組織を模倣する、弾性および/または機械的強度および/または変形エネルギーおよび/または剛性および/または剛性および/または堅さおよび/または弾性を含むがこれらに限定されない、独特なおよび/または有利な物理化学的特性をxpi-PANi-E-Cに与えて、脊髄模倣医薬組成物を提供する。
理論に限定されるものではないが、医薬組成物の製造方法は、エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の再配向を提供および/または促進し、チャネル/トンネルおよび突起の形成（使用時に利点を提供するのに寄与するすべての重要な態様）をさらに提供および/または促進する。
本開示の医薬組成物は、先行技術の欠点のいくつかを少なくも改善する。
具体的な実施態様および/または実施例（さらに下記参照）に関して詳細に説明しているが、当該技術分野において、当業者が、上記の理解を得ると、これらの実施態様の代替物、変形物および均等物を容易に想到し得ると解されたい。したがって、本発明の範囲は、本明細書に添付される特許請求の範囲として評価されるべきである。
実施例 製造および特性評価
本開示の非限定的実施例を以下に示す。上記発明の概要の内容は、長い繰り返しを避けるために、それを参照することにより以下に繰り返される。
本開示の非限定的実施例を以下に示す。上記発明の概要の内容は、長い繰り返しを避けるために、それを参照することにより以下に繰り返される。
材料および方法
材料
アクリルアミド（AAm）およびアクリロニトリル（ANi）モノマー、過硫酸カリウム（KPS）、過硫酸アンモニウム（APS）、メチレンビスアクリルアミド（MBAAm）、テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）、コラーゲンIV型。エラスチンペプチドをElastin Products Company, Inc., Owensville, Missouri, USAから入手した。生物活性物質のクルクミンおよびデキサメサゾン二ナトリウム塩をSigma-Aldrich, St. Louise, MO, USAから入手した。用いた他のすべての試薬は分析グレードであり、入手したまま用いた。
材料
アクリルアミド（AAm）およびアクリロニトリル（ANi）モノマー、過硫酸カリウム（KPS）、過硫酸アンモニウム（APS）、メチレンビスアクリルアミド（MBAAm）、テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）、コラーゲンIV型。エラスチンペプチドをElastin Products Company, Inc., Owensville, Missouri, USAから入手した。生物活性物質のクルクミンおよびデキサメサゾン二ナトリウム塩をSigma-Aldrich, St. Louise, MO, USAから入手した。用いた他のすべての試薬は分析グレードであり、入手したまま用いた。
xpi-PANi-E-C医薬組成物/神経スポンジの製造
架橋した相互侵入性のポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（xpi-PANi-E-C）医薬組成物を、水性酢酸媒体中のコラーゲンおよび/またはエラスチンの存在下で、ポリアクリロニトリルを同時に架橋および重合させて、相互侵入性のポリマーネットワークを形成することにより得た（表1）。xpi-PANi-E-C医薬組成物はまた、本明細書においてxpi-PANi-E-C脊髄模倣神経スポンジまたはxpi-PANi-E-C神経スポンジと称される。用語「神経スポンジ」は、必要に応じて「NS」と省略される。ここでの実験作業に関する添付の図面において、xpi-PANi-E-Cについてのラベルは、PANi-ECと示される場合がある。
架橋した相互侵入性のポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（xpi-PANi-E-C）医薬組成物を、水性酢酸媒体中のコラーゲンおよび/またはエラスチンの存在下で、ポリアクリロニトリルを同時に架橋および重合させて、相互侵入性のポリマーネットワークを形成することにより得た（表1）。xpi-PANi-E-C医薬組成物はまた、本明細書においてxpi-PANi-E-C脊髄模倣神経スポンジまたはxpi-PANi-E-C神経スポンジと称される。用語「神経スポンジ」は、必要に応じて「NS」と省略される。ここでの実験作業に関する添付の図面において、xpi-PANi-E-Cについてのラベルは、PANi-ECと示される場合がある。
簡単には、コラーゲンおよびエラスチンを特定量の水性酢酸媒体に溶解させ、そこにアクリロニトリルを加えた。その後、もしあればペプチド内容物の沈殿について溶液を観察した。ペプチドが沈殿する場合、過剰な氷酢酸を上記混合物に加えて、ペプチドの溶解に必要なpHを維持した。均一な溶液を得た後、過硫酸アンモニウム（APS）などの開始剤、メチレンビスアクリルアミド（MBAAm）などの架橋剤およびテトラメチルエチレンジアミン（TEMED）などの促進剤を順次加えた。その後、上記混合物をポリエチレンの円筒の鋳型に注ぎ、室温条件下で一晩重合させた。そのようにして得られたxpi-PANi-E-C神経スポンジマトリックスを過剰な再蒸留水で洗浄し、-80℃にて一晩凍結させた。これに続いて凍結乾燥（25mtorr、24時間）をして、構成成分の水および酢酸を除去し、および三次元（3D）神経スポンジマトリックスを得た。
本出願人は、エラスチン（E）、コラーゲン（C）またはその両方のいずれかを除くことにより、PANi神経スポンジ；PANi-E神経スポンジ；およびPANi-C神経スポンジを製造するのに上記と同じ実験プロトコールを用いた。PANi-E-NS、PANi-C-NSもまた同様に架橋して、相互侵入性または半相互侵入性のポリマーネットワークを得た。PANi-E-NSおよびPANi-C-NSはまた、脊髄損傷の処置における使用のための物理化学的特性を提供し、本開示の広い第1態様の一部を形成する。本出願人はまた、以下でさらに完全に説明および/または例示するように、比較目的でPANi-、PANi-E、およびPANi-C神経スポンジを利用した。用語「神経スポンジ」は、必要に応じて「NS」と省略される。
まとめて、製造した神経スポンジ（PANi神経スポンジ；PANi-E神経スポンジ；PANi-C神経スポンジ；およびxpi-PANi-E-C）を、以下で足場マトリックスと称する。
比較実験プロトコールは、ポリアクリロニトリル（PANi）、エラスチン（E）およびコラーゲン（E）などの構成要素化合物の物理化学的分析からではなくPANi-NS、PANi-E-NS、PANi-C-NSの物理化学的分析に基づいて予測できなかったものである驚くべき独特で有利な物理化学的特性を強調する。
xpi-PANi-E-C-NSは、ヒトまたは動物の脊髄組織を模倣する、弾性および/または機械的強度および/または変形エネルギーおよび/または剛性および/または剛性および/または堅さおよび/または弾性を含むがこれらに限定されない、独特なおよび/または有利な物理化学的特性を提供して、脊髄模倣医薬組成物を提供する。
xpi-PANi-E-Cを考慮すると、架橋ポリアクリロニトリル（xPANi）の存在、ならびにエラスチン（E）およびコラーゲン（C）とのその後の結合は、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の二次構造の再配向を促進する。この上述した再配向は、ヒトまたは動物の脊髄を模倣する物理化学的特性を含む、xpi-PANi-E-C医薬組成物/NSを提供し、すなわちそれは脊髄模倣である。タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の二次構造の再配向がなければ、医薬組成物は、ヒトまたは動物の脊髄を模倣する物理化学的特性を有しない、すなわちそれは脊髄模倣ではない。再配向は、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の再配向された二次構造が、エラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）の市販の等価物と比較すると、天然に存在するエラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）に大いに近づくことである。
本出願人は、予想外にかつ驚くべきことに、xpi-PANi-E-C内におけるタンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の二次構造の再配向は、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の濃度依存性二次構造をもたらし、すなわち、ランダムコイル＞αヘリックス＞βシート＞βターンの濃度であることを見出した。
xpi-PANi-E-Cの一部を形成する前の、エラスチン（E）単独の濃度依存性二次構造は、βシート＞ランダムコイル＞αヘリックス＞βターンの濃度である。xpi-PANi-E-Cの一部を形成する前の、コラーゲン（C）単独の濃度依存性二次構造は、βシート＞αヘリックス＞ランダムコイル＞βターンの濃度である。
形態分析および画像処理
形態分析のために、足場マトリックス（本開示によるPANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジを含む）を、炭素および/またはクロムでスプレッターコーティングし、顕微鏡写真を、FEI Quanta 200 ESEMまたはFEI Nova Nanolab 600 SEM（FEI、Hillsboro、Oregon、USA）を用いて撮影した。そうして得られた顕微鏡写真を、ImageJおよびFIJI（画像処理ソフトウェア）用に作成されたDiameterJおよびNDプラグインを用いて広く分析および定量した。DiameterJプラグインは、「ナノファイバー直径測定ツール」であり、「中心線決定、ユークリッド距離変換、および新しいピクセル変換技術のための既存のアルゴリズムを使用して」（Hotaling et al., 2015）作成された。DiameterJのセグメンテーションツールとImageJの画像しきい値調整機能を組み合わせた独自のアルゴリズムが、SEM顕微鏡写真の処理用に開発された。その後、処理した画像を、細孔面積と部分的真円度について分析した。いくつかのSEM画像を、ブラーリングし、色の定量化、画像ヒストグラムの生成の一連の手順と用いてMathematicaTM 8.0（Wolfram Research, Champaign, IL, USA）で定量処理した。最初に、対象とする面積を足場の画像内容に制限した。
形態分析のために、足場マトリックス（本開示によるPANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジを含む）を、炭素および/またはクロムでスプレッターコーティングし、顕微鏡写真を、FEI Quanta 200 ESEMまたはFEI Nova Nanolab 600 SEM（FEI、Hillsboro、Oregon、USA）を用いて撮影した。そうして得られた顕微鏡写真を、ImageJおよびFIJI（画像処理ソフトウェア）用に作成されたDiameterJおよびNDプラグインを用いて広く分析および定量した。DiameterJプラグインは、「ナノファイバー直径測定ツール」であり、「中心線決定、ユークリッド距離変換、および新しいピクセル変換技術のための既存のアルゴリズムを使用して」（Hotaling et al., 2015）作成された。DiameterJのセグメンテーションツールとImageJの画像しきい値調整機能を組み合わせた独自のアルゴリズムが、SEM顕微鏡写真の処理用に開発された。その後、処理した画像を、細孔面積と部分的真円度について分析した。いくつかのSEM画像を、ブラーリングし、色の定量化、画像ヒストグラムの生成の一連の手順と用いてMathematicaTM 8.0（Wolfram Research, Champaign, IL, USA）で定量処理した。最初に、対象とする面積を足場の画像内容に制限した。
本開示によるPANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-Cの多孔度測定分析
多孔度分析器（Micromeritics ASAP 2020, Norcross, GA, USA）を用いて多孔度測定分析を神経スポンジに実施した。神経スポンジ（足場マトリックス）試料をかみそりの刃で切り、サンプルチューブに加える前に正確に秤量した。足場の多孔質が高く、多段階であることを考慮して、足場を40℃にて22時間脱気した。脱気後、試料を分析ポートに移し、データレポートに、吸脱着等温線に関して表面積、細孔容積および細孔サイズを組み込んだ。BJHおよびBETの両方の計算を評価した。得られた線形等温線プロットを、IUPACによって規定されたガイドライン（Sing et al., 1985）と比較した。
多孔度分析器（Micromeritics ASAP 2020, Norcross, GA, USA）を用いて多孔度測定分析を神経スポンジに実施した。神経スポンジ（足場マトリックス）試料をかみそりの刃で切り、サンプルチューブに加える前に正確に秤量した。足場の多孔質が高く、多段階であることを考慮して、足場を40℃にて22時間脱気した。脱気後、試料を分析ポートに移し、データレポートに、吸脱着等温線に関して表面積、細孔容積および細孔サイズを組み込んだ。BJHおよびBETの両方の計算を評価した。得られた線形等温線プロットを、IUPACによって規定されたガイドライン（Sing et al., 1985）と比較した。
ポリマー構造変化分析
減衰全反射-フーリエ変換赤外（ATR-FTIR）分析を、本開示によるPANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジを含む構成要素化合物および最終的な足場について実施し、構造変換を評価、確認および比較した。ATR-FTIRスペクトルを、ATR-FTIRセルおよびダイヤモンド結晶内部反射エレメントを用いてMIRTGS検出器を備えてPerkin Elmer Spectrum 2000 FTIR分光計（PerkinElmer Spectrum 100, Llantrisant, Wales, UK）で記録した。試料を、4cm-1の分割能およびスペクトル当たり64スキャンで650〜4000cm1の波数範囲にて分析した。
減衰全反射-フーリエ変換赤外（ATR-FTIR）分析を、本開示によるPANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジを含む構成要素化合物および最終的な足場について実施し、構造変換を評価、確認および比較した。ATR-FTIRスペクトルを、ATR-FTIRセルおよびダイヤモンド結晶内部反射エレメントを用いてMIRTGS検出器を備えてPerkin Elmer Spectrum 2000 FTIR分光計（PerkinElmer Spectrum 100, Llantrisant, Wales, UK）で記録した。試料を、4cm-1の分割能およびスペクトル当たり64スキャンで650〜4000cm1の波数範囲にて分析した。
グラフトポリマーの発熱および吸熱マッピング
比較示差走査熱量測定（DSC）分析を、Mettler Toledo, DSC1, STARe System（Schwerzenback, Switzerland）を用いて5〜10℃/分の加熱速度にて-10℃から325℃までN2ガスの一定の流れの下ネイティブなポリマー、および最終的な足場/神経スポンジについて実施した。正確に秤取した試料（5〜10mg±0.1mg）を、中央ピンホールを備えたカバーのあるアルミニウムサンプルフォルダーに入れた。金属インジウム（99.99％）を用いて、温度およびエンタルピーに関してDSC係数を校正した。空のサンプルフォルダーを標準として用い、試料を10℃から125℃まで一定の等温線で15分間加熱することにより実験を実施した。新しい試料を再度秤取し、10℃から250℃まで加熱した。その後、DSCサーモグラムを熱イベントの遷移について比較した。
比較示差走査熱量測定（DSC）分析を、Mettler Toledo, DSC1, STARe System（Schwerzenback, Switzerland）を用いて5〜10℃/分の加熱速度にて-10℃から325℃までN2ガスの一定の流れの下ネイティブなポリマー、および最終的な足場/神経スポンジについて実施した。正確に秤取した試料（5〜10mg±0.1mg）を、中央ピンホールを備えたカバーのあるアルミニウムサンプルフォルダーに入れた。金属インジウム（99.99％）を用いて、温度およびエンタルピーに関してDSC係数を校正した。空のサンプルフォルダーを標準として用い、試料を10℃から125℃まで一定の等温線で15分間加熱することにより実験を実施した。新しい試料を再度秤取し、10℃から250℃まで加熱した。その後、DSCサーモグラムを熱イベントの遷移について比較した。
本開示によるPANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジを含む神経スポンジの物理機械的特性評価
テクスチャマクロ分析
足場マトリックスのマイクロ機械的特性は、軸索が足場マトリックス内で再生、増殖および侵入する能力に直接影響を及ぼし得る。したがって、テクスチャプロファイル分析を、5kgロードセルを備えたテクスチャ分析器（T TA.XTplus Stable Microsystems, Surrey, UK）を用いてマイクロスケールで実施した。足場マトリックスを、メスを用いて切断したシリンダーへ入れ（直径10mm；長さ10mm）、10〜50％の様々なひずみ値下で圧縮した。足場マトリックスをアルミニウムステージに入れ、フラットプローブを用いて圧縮した。表2に詳述するパラメーターを用いて、様々な製剤について連続的な力-時間/距離のプロファイルを作成した。最大負荷、変形エネルギー、剛性勾配および％マトリックスス弾性に関して、機械的計算を図1に示すように実施した。
テクスチャマクロ分析
足場マトリックスのマイクロ機械的特性は、軸索が足場マトリックス内で再生、増殖および侵入する能力に直接影響を及ぼし得る。したがって、テクスチャプロファイル分析を、5kgロードセルを備えたテクスチャ分析器（T TA.XTplus Stable Microsystems, Surrey, UK）を用いてマイクロスケールで実施した。足場マトリックスを、メスを用いて切断したシリンダーへ入れ（直径10mm；長さ10mm）、10〜50％の様々なひずみ値下で圧縮した。足場マトリックスをアルミニウムステージに入れ、フラットプローブを用いて圧縮した。表2に詳述するパラメーターを用いて、様々な製剤について連続的な力-時間/距離のプロファイルを作成した。最大負荷、変形エネルギー、剛性勾配および％マトリックスス弾性に関して、機械的計算を図1に示すように実施した。
急性脊髄損傷後の機能再生の比較のためのxpi-PANi-EC-NS：脊髄模倣、相互侵入性の、ポリマー-ペプチド、神経トンネル
分子の自己組織化、または単に自己組織化は、人の介入なしに、可干渉性で明確でかつ安定な配置へ、熱力学的平衡条件下での分子などの個々のエンティティの自然な組織化として定義し得る（Zhang, 2002）。この自己組織化プロセスは、天然に存在する多機能なマクロ分子の組織化、例えばヘモグロビン、ポリメラーゼ、ATPシンターゼ、膜チャネル、スプライセオソーム、プロテオソームおよびリボソームを模倣する。これらの組織化は、巨視的および微視的スケールで、またはナノスケールでさえ弱い非共有結合性相互作用が主に介在する。自己組織化のための分子の構成要素は、水素結合、静電相互作用（イオン結合）、疎水相互作用、ファンデルワールス相互作用およびπスタッキングの形成により、段階的に集まるように設計される（engineeredおよびdesigned）（Zhang, 2002; Zhang, 2003）。これらの弱い相互作用の集合的な強さは、化学的相補性および構造的互換性を有する極めて安定な超分子の構造および生体模倣のナノ素材の製造のための基礎を形成する（Zhang, 2002）。分子設計のこのような自己組織化原理の設計および特性評価の進行を伴う、このような生体関連マクロ分子の組織化の理解は、ペプチド（ペプチド両親媒性物質を含む）および/またはタンパク質に基づく分子の組織化システムの模造につながる（Hogashi and Koga, 2008）。ペプチドおよびタンパク質は、明確な二次元および/または三次元構造へ、段階的かつ正確に自己組織化（self-organize）/自己凝集（self-assemble）/自己模造（self-fabricate）/自己会合（self-associate）/自己含有（self-contain）する固有の能力を示す。これらの構造は、薬物送達および組織設計で用いるように開発および制御できる高レベルの規則性を示す（Zhang, 2002; Zhang, 2003; Ulijn and Smith, 2008）。超分子の構造を構成する化学的構成要素を分析するときに、超分子の構造の特性を正確に予測することは不可能である。
分子の自己組織化、または単に自己組織化は、人の介入なしに、可干渉性で明確でかつ安定な配置へ、熱力学的平衡条件下での分子などの個々のエンティティの自然な組織化として定義し得る（Zhang, 2002）。この自己組織化プロセスは、天然に存在する多機能なマクロ分子の組織化、例えばヘモグロビン、ポリメラーゼ、ATPシンターゼ、膜チャネル、スプライセオソーム、プロテオソームおよびリボソームを模倣する。これらの組織化は、巨視的および微視的スケールで、またはナノスケールでさえ弱い非共有結合性相互作用が主に介在する。自己組織化のための分子の構成要素は、水素結合、静電相互作用（イオン結合）、疎水相互作用、ファンデルワールス相互作用およびπスタッキングの形成により、段階的に集まるように設計される（engineeredおよびdesigned）（Zhang, 2002; Zhang, 2003）。これらの弱い相互作用の集合的な強さは、化学的相補性および構造的互換性を有する極めて安定な超分子の構造および生体模倣のナノ素材の製造のための基礎を形成する（Zhang, 2002）。分子設計のこのような自己組織化原理の設計および特性評価の進行を伴う、このような生体関連マクロ分子の組織化の理解は、ペプチド（ペプチド両親媒性物質を含む）および/またはタンパク質に基づく分子の組織化システムの模造につながる（Hogashi and Koga, 2008）。ペプチドおよびタンパク質は、明確な二次元および/または三次元構造へ、段階的かつ正確に自己組織化（self-organize）/自己凝集（self-assemble）/自己模造（self-fabricate）/自己会合（self-associate）/自己含有（self-contain）する固有の能力を示す。これらの構造は、薬物送達および組織設計で用いるように開発および制御できる高レベルの規則性を示す（Zhang, 2002; Zhang, 2003; Ulijn and Smith, 2008）。超分子の構造を構成する化学的構成要素を分析するときに、超分子の構造の特性を正確に予測することは不可能である。
自己組織化ペプチド（SAP）システムは、超分子の自己組織化により空間的に解消されたネットワークで複数の細胞相互作用構成要素を示すことができる合成足場を含む。この自己組織化は、通常、原線維形成ペプチドペプチド、ペプチド模倣物およびペプチド誘導体により生じる。自己組織化材料は、多機能性価性、合成定義、分子特異性、およびリガンドおよび他の生体分子の特徴のナノスケールの配置の制御の形態でいくつかの利点を提供する。これらのペプチド、例えば短いフィブリル化ペプチド、β-ヘアピン、ペプチド-両親媒性物質およびペプチド誘導体は、刺激を含む環境で自己組織化して、βシートに富むナノファイバーのネットワークを形成して、さらに結合して、超分子の構造を形成し、巨視的にヒドロゲルをもたらす。SAPはまた、自己組織化した線維の表面に機能的なアミノ酸配列または化学基を示すことができ、これらのペプチドはまた、コンジュゲートして、異なるリガンドの正確な組合せを示し得る。
本開示によるおよび本明細書に記載されるPANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジを、合成および模造することができた。xpi-PANi-E-C神経スポンジを図2に示す。図2は、水和したxpi-PANi-E-C-NSの扱いやすさ、耐荷重性、柔軟性を示す写真を示す。とりわけ、これらの物理化学的特性は、使用時に外科医による容易な操作を可能にし、ヒトまたは動物の脊髄を模倣する。
そのようにして形成されPANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-C-E神経スポンジは、架橋ポリアクリロニトリルポリマーが、細胞外マトリックス構成要素（コラーゲンおよびエラスチン）により組み込まれ、その逆も同様である、半相互侵入性のポリマーネットワークまたは相互侵入性のポリマーネットワークとして説明され得る。理論に限定されるものではないが、表3は、様々な構成要素によって最終的なトリポリマーのxpi-PANi-EC足場/NSに提供される特殊な機能を示す。
PANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-C-E神経スポンジの形態分析
自然なラットの脊髄の走査電子顕微鏡写真は、一方向の巨視的な線維および溝を有する繊維状構造を示した（図3）。xpi-PANi-E-C足場の対応する走査電子顕微鏡（SEM）画像は、繊維多孔質および多孔質繊維状構造から構成されるポリマーマトリックスを示した（図4）。さらに、多孔質構造は、ポリマートンネルの形態の連続的な縦方向のチャネルから構成され、本明細書では「神経トンネル」と称する。これらのポリマートンネルは、神経の成長および増殖を高めることができる多方向および/または一方向のポリマートンネルネットワーク（図5）へさらに分岐および/または収束した。足場の表面構造は、繊維状マトリックスが並ぶマルチレーンの縦溝を示す（図6）。図7は、縦方向の繊維状トンネルの形成によりxpi-PANi-E-Cの脊髄模倣性質を比較および確認する。
自然なラットの脊髄の走査電子顕微鏡写真は、一方向の巨視的な線維および溝を有する繊維状構造を示した（図3）。xpi-PANi-E-C足場の対応する走査電子顕微鏡（SEM）画像は、繊維多孔質および多孔質繊維状構造から構成されるポリマーマトリックスを示した（図4）。さらに、多孔質構造は、ポリマートンネルの形態の連続的な縦方向のチャネルから構成され、本明細書では「神経トンネル」と称する。これらのポリマートンネルは、神経の成長および増殖を高めることができる多方向および/または一方向のポリマートンネルネットワーク（図5）へさらに分岐および/または収束した。足場の表面構造は、繊維状マトリックスが並ぶマルチレーンの縦溝を示す（図6）。図7は、縦方向の繊維状トンネルの形成によりxpi-PANi-E-Cの脊髄模倣性質を比較および確認する。
したがって、xpi-PANi-E-Cは、神経組織および軸索の成長を促進する人工神経細胞外マトリックスを提供し得る。これらの神経トンネルに存在する線維は、軸索の固定点を提供し得て、粗い表面は、軸索接着および細胞移動を促進する環境を提供し得る。トンネルは、厚いPANi壁（15μm）で境界が定められており、ナノ（500nm）からマイクロ（10μm）の厚さの範囲の様々な直径を有する自己組織化されたペプチド繊維状構造で満たされていた。線維は、PANi構造（細孔壁）へ埋め込まれ、クモの巣様のネットワークを形成し、縦方向のトンネル内で壁を接続した。厚い線維はエラスチン線維に起因し、細い線維はコラーゲン原線維を表し得る（Daamen et al., 2003）。
しかしながら、線維に加えて、理論に限定されるものではないが、PANiに起因し得る、足場壁から突き出た短くて薄いリボン様の隆起した形状または露頭が観察された（さらに足場壁の粗さを高める）。結論として、吊り橋様構造の形成が、「神経トンネル」内で観察され、ここで、エラスチン線維が主鎖を形成し、コラーゲン原線維が橋の短い床を形成した。構成要素の各々は、他の機能を補完し、必要とされる強度および機能を一緒に提供する。
脊髄模倣足場の多孔度測定分析
合成したPANi-神経スポンジは、極めて壊れやすく、粉末状であったため、多孔度測定分析を、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジについてのみ実施し、図8および表4に示す。図8は、本開示によるa)PANi-E神経スポンジ；b)PANi-C神経スポンジ；およびxpi-PANi-E-C神経スポンジの線形等温線プロットを示す。多孔質プロファイルの解釈については、Subcommittee on Reporting Gas Adsorption Dataによって提案されたInternational Union for Pure and Applied Chemistry（IUPAC）推奨を参照し（Sing et al., 1985）、IUPAC分類システムに従って、物理吸着曲線を等温線タイプおよびヒステリシスループと比較した。3つすべての足場（神経スポンジ）についての物理吸着曲線は、タイプII等温線に対応し、それにより、足場のマクロ多孔質形態を確認した。Brunauer-Emmett-Teller/Barrett-Joyner-Halenda（BET/BJH）表面積、細孔容積および細孔径は、PANi-E-NSで最低で、PANi-C-NSで最高であり、これは、走査電子顕微鏡（SEM）分析下で議論され示されるように、それぞれ大径エラスチン線維および小径コラーゲン原線維に割当てられ得る。
合成したPANi-神経スポンジは、極めて壊れやすく、粉末状であったため、多孔度測定分析を、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジについてのみ実施し、図8および表4に示す。図8は、本開示によるa)PANi-E神経スポンジ；b)PANi-C神経スポンジ；およびxpi-PANi-E-C神経スポンジの線形等温線プロットを示す。多孔質プロファイルの解釈については、Subcommittee on Reporting Gas Adsorption Dataによって提案されたInternational Union for Pure and Applied Chemistry（IUPAC）推奨を参照し（Sing et al., 1985）、IUPAC分類システムに従って、物理吸着曲線を等温線タイプおよびヒステリシスループと比較した。3つすべての足場（神経スポンジ）についての物理吸着曲線は、タイプII等温線に対応し、それにより、足場のマクロ多孔質形態を確認した。Brunauer-Emmett-Teller/Barrett-Joyner-Halenda（BET/BJH）表面積、細孔容積および細孔径は、PANi-E-NSで最低で、PANi-C-NSで最高であり、これは、走査電子顕微鏡（SEM）分析下で議論され示されるように、それぞれ大径エラスチン線維および小径コラーゲン原線維に割当てられ得る。
xpi-PANi-E-C-NS/医薬組成物の場合、多孔質パラメーターは、大径と小径の繊維の混合に起因するPANi-E-NSとPANi-C-NSの両極端にあった。エラスチンがコラーゲンより極めて高い濃度で存在するため（エラスチン：コラーゲン＝25：1）、大径線維はネットワークを支配していた。
等温線において観察されるヒステリシスループに関して、PANi-E-NSは、タイプH3のループを示し、これはIUPACにより「スリット状の細孔を生じさせる板状粒子の凝集体」と定義されている。理論に限定されるものではないが、エラスチン線維の場合、直径が大きく、これらの繊維が緩く凝集したネットワークを形成して、明確な細孔内の細孔の形成をもたらすため、これは本当である。PANi-C-NSの場合、タイプH1のヒステリシスループが観察され、これはIUPACにより「かなり規則的な配列の凝集体から構成され、細孔サイズの分布が狭いことが知られている多孔質材料に関連する」と定義されている。大径繊維よりも比較的一貫したサイズ分布を示す小径線維を形成したため、コラーゲン線維についてこれは本当だと考えられる。SEMに示すように、繊維が互いに融合したと考えられるため、凝集部分も正しいと考えられる。
興味深いことにかつ予想外に、xpi-PANi-E-C足場/NS/医薬組成物は、0.6の相対圧力までタイプH1のループを示し、その後はオープンループを形成した。xpi-PANi-E-Cのいくつかの試料を試験して、オープンループの動きを確認し、同様のループを、多孔質について試験したすべての試料で形成した。コラーゲンの濃度はエラスチンと比較して最小限であったが、より大きな線維のネットワーク内により小さな繊維の存在は、H1ループを形成する組み合わされたネットワークにより多くの凝集を提供した。また、低圧力でのオープンループは、このような動きのIUPACの説明のように、「非剛性の多孔質構造」に起因し得る。
ポリマー-ペプチド神経スポンジ内のペプチド二次構造の決定のためのFTIR分析
PANiのFTIRスペクトル（図9）は、3650〜3250cm-1（PANi部分と相互作用する水分子（タイプIおよびIIの水））、2937.56cm-1（CH3対称伸びモード；振動C-H伸び）、2243.59cm-1（C≡N伸び振動）、1657.79cm-1（δ C-H曲げ；重合プロセス中に形成される加水分解アクリロニトリル単位）、1519.34cm-1（C-N伸び）、1450.70cm-1（δ CH2非対称）、1377.24cm-1（N-C-H曲げ）、1193.87cm-1（δ CH2非対称）、および1113.28cm-1（C-H振動モード）にて特徴的な波数帯を示した（Cetiner et al., 2010; Moghadam and Bahrami, 2005; Moreno et al., 2010; Wan et al., 2007）。
PANiのFTIRスペクトル（図9）は、3650〜3250cm-1（PANi部分と相互作用する水分子（タイプIおよびIIの水））、2937.56cm-1（CH3対称伸びモード；振動C-H伸び）、2243.59cm-1（C≡N伸び振動）、1657.79cm-1（δ C-H曲げ；重合プロセス中に形成される加水分解アクリロニトリル単位）、1519.34cm-1（C-N伸び）、1450.70cm-1（δ CH2非対称）、1377.24cm-1（N-C-H曲げ）、1193.87cm-1（δ CH2非対称）、および1113.28cm-1（C-H振動モード）にて特徴的な波数帯を示した（Cetiner et al., 2010; Moghadam and Bahrami, 2005; Moreno et al., 2010; Wan et al., 2007）。
コラーゲンにおける特徴的なアミド結合は、3306cm-1（アミドA；N-H伸び振動；N-H基の水素結合）、2964cm-1（アミドB；CH2の非対称伸び）、1640cm-1（アミドI；C=O伸び振動s）、1541cm-1（アミドII；N-H曲げ振動）、および1235cm-1（アミドIII；C-H伸び）にて示した。エラスチンのFTIRスペクトルは、3306cm-1（アミドA）、2964cm-1（アミドB）、1640cm-1（アミドI）、1541cm-1（アミドII）、および1235cm-1（アミドIII）（Nagai, 2010）にて、対応するアミド結合を示した。
構成成分タンパク質の二次構造に対するPANiの効果を評価するために、アミドIピークのデコンボリューションを1705〜1585cm-1で行った（図10）。二次構造を評価するための標準として次の波数帯を用いた：1620〜1640cm-1＝βシート；1640〜1650cm-1＝ランダムコイル；1650〜1658cm-1＝αヘリックス；1660〜1680cm-1＝βターン；および1680〜1695cm-1＝βシート（Yang et al., 2015）。図10は、ネイティブなポリマーのエラスチン（E）、コラーゲン（C）、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジのアミドIのピークに対応するフーリエデコンボリューションしたフーリエ変換赤外（FT/IR）減衰全反射（ATR）スペクトルを示す。
1. PANi-E-NS：サプライヤーから入手したネイティブなエラスチンは、βシート＞ランダムコイル＞αヘリックス＞βターンを有する特徴的なアミドIの成分ピークを示した。しかしながら、PANi-E-NS内で、エラスチンペプチドは自己組織化して、ランダムコイル＞βシート＞αヘリックス＞βターンとなった。インビボでエラスチンに特徴的な「本質的に無秩序なドメイン」を考慮すると、デコンボリューションの結果は、ECM-模倣足場を確認した（(Roberts et al., 2015）。
2. PANi-C-NS：サプライヤーから入手したネイティブなコラーゲンは、βシート＞αヘリックス＞ランダムコイル＞βターンを有する特徴的なアミドIの成分ピークを示した。しかしながら、PANi-C-NS内で、コラーゲンペプチドは自己組織化して、αヘリックス＞ランダムコイル＞βターン＞βシートとなった。コラーゲン鎖は、インビボでは三重らせんとして存在する。PANi-E神経スポンジのエラスチンと比較して、PANiの存在下ではコラーゲンの二次構造が著しく変化したことは注目に値する。
3. xpi-PANi-E-C-NS：エラスチン/コラーゲン足場のデコンボリューションは、エラスチンが最終的な足場のペプチド含有量の大部分を形成したため、ランダムコイル＞αヘリックス＞βシート＞βターンを有する濃度依存性二次構造コンフォメーションを示した。最終的なコンフォメーションは、コラーゲンヘリックスが介在するエラスチンコイルドコイルとして割り当て得て、これによって細胞外マトリックス環境を完全に模倣する（Silver, 2006）。
1. PANi-E-NS：サプライヤーから入手したネイティブなエラスチンは、βシート＞ランダムコイル＞αヘリックス＞βターンを有する特徴的なアミドIの成分ピークを示した。しかしながら、PANi-E-NS内で、エラスチンペプチドは自己組織化して、ランダムコイル＞βシート＞αヘリックス＞βターンとなった。インビボでエラスチンに特徴的な「本質的に無秩序なドメイン」を考慮すると、デコンボリューションの結果は、ECM-模倣足場を確認した（(Roberts et al., 2015）。
2. PANi-C-NS：サプライヤーから入手したネイティブなコラーゲンは、βシート＞αヘリックス＞ランダムコイル＞βターンを有する特徴的なアミドIの成分ピークを示した。しかしながら、PANi-C-NS内で、コラーゲンペプチドは自己組織化して、αヘリックス＞ランダムコイル＞βターン＞βシートとなった。コラーゲン鎖は、インビボでは三重らせんとして存在する。PANi-E神経スポンジのエラスチンと比較して、PANiの存在下ではコラーゲンの二次構造が著しく変化したことは注目に値する。
3. xpi-PANi-E-C-NS：エラスチン/コラーゲン足場のデコンボリューションは、エラスチンが最終的な足場のペプチド含有量の大部分を形成したため、ランダムコイル＞αヘリックス＞βシート＞βターンを有する濃度依存性二次構造コンフォメーションを示した。最終的なコンフォメーションは、コラーゲンヘリックスが介在するエラスチンコイルドコイルとして割り当て得て、これによって細胞外マトリックス環境を完全に模倣する（Silver, 2006）。
神経スポンジにおけるペプチド構造変化を確認する熱分析
ネイティブなコラーゲン、ネイティブなエラスチン、PANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジについての10〜125℃のDSCスキャンは、それぞれ、76.79℃（-200.98J/g）、72.79℃（-104.44J/g）、69.42℃（-89.19J/g）、69.51℃（-78.60J/g）、71.17℃（-122.75J/g）および68.91℃（-77.35）におけう脱水の温度に対応する極めて広い吸熱ピークを示した（図11および図12）。図11は、ネイティブな(a)コラーゲンおよび(b)エラスチンの示差走査熱量測定（DSC）サーモグラムを示す。図12は、様々な温度範囲における、本開示によるPANi、エラスチン（E）、コラーゲン（C）、PANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANI-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジのDSCサーモグラムを示す。10〜325℃の2つ目には、生体分子およびPANi混合物中の結合水を表す脱水吸熱ピークをまだ含まれていた。混合足場の熱転移を評価するために、ネイティブな構成要素の各々から1つの特徴的で明確なピークを選択した。ネイティブなペプチド試料において、コラーゲンの220℃における吸熱ピークは、変性温度に起因し得て、エラスチンの185℃における発熱ピークは、非晶質ガラス転移に起因し得る。PANiのDSC曲線は、280℃にて明確に区別できる発熱分解ピークを示した。PANi-E-NSの場合、エラスチンの発熱遷移は175〜200℃の間でプラトーを形成し、明確な発熱を形成したβシートと比較して、不規則な構造（ランダムコイル）の存在を確認した。PANiに対応する分解発熱は、280℃から285℃にシフトし、これによって足場構造の安定性が改善されたことを証明した。
ネイティブなコラーゲン、ネイティブなエラスチン、PANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジについての10〜125℃のDSCスキャンは、それぞれ、76.79℃（-200.98J/g）、72.79℃（-104.44J/g）、69.42℃（-89.19J/g）、69.51℃（-78.60J/g）、71.17℃（-122.75J/g）および68.91℃（-77.35）におけう脱水の温度に対応する極めて広い吸熱ピークを示した（図11および図12）。図11は、ネイティブな(a)コラーゲンおよび(b)エラスチンの示差走査熱量測定（DSC）サーモグラムを示す。図12は、様々な温度範囲における、本開示によるPANi、エラスチン（E）、コラーゲン（C）、PANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANI-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジのDSCサーモグラムを示す。10〜325℃の2つ目には、生体分子およびPANi混合物中の結合水を表す脱水吸熱ピークをまだ含まれていた。混合足場の熱転移を評価するために、ネイティブな構成要素の各々から1つの特徴的で明確なピークを選択した。ネイティブなペプチド試料において、コラーゲンの220℃における吸熱ピークは、変性温度に起因し得て、エラスチンの185℃における発熱ピークは、非晶質ガラス転移に起因し得る。PANiのDSC曲線は、280℃にて明確に区別できる発熱分解ピークを示した。PANi-E-NSの場合、エラスチンの発熱遷移は175〜200℃の間でプラトーを形成し、明確な発熱を形成したβシートと比較して、不規則な構造（ランダムコイル）の存在を確認した。PANiに対応する分解発熱は、280℃から285℃にシフトし、これによって足場構造の安定性が改善されたことを証明した。
PANi-C-NSの場合、コラーゲンの変性温度は、187〜234℃の間に広いバンドとして現れ、213℃にピークがあった。これは、PANi-C-NSにおいて、より安定なβシート（ネイティブなエラスチン）が安定性の低いαヘリックスに遷移し、タンパク質の変性温度が低下したことに起因し得る（Henzler Wildman et al., 2002）。PANi-E-NSと同様に、PANiに対応する分解温度が、PANi-C-NSにおいてより高い温度（284℃）へシフトし、PANi-NS足場に対するタンパク質の安定化効果がさらに示された。xpi-PANi-E-C-NSにおいて、コラーゲンの吸熱変性ピークは、消失したか、またはガラス転移吸熱プラトーと結合した。理論に限定されるものではないが、これは、xpi-PANi-E-C足場においてコラーゲン濃度が極めて低いこと（2％w/w）によるものであり得る。xpi-PANi-E-Cにおいて、PANi分解ピークは、PANi-EおよびPANi-Cと比較して285℃にて変化しないままであった。
結論として、DSC分析は、足場構造内の構成要素ペプチド（エラスチンおよびコラーゲン）の二次構造遷移に関して、FTIR分析を裏付け、そして足場の安定性向上を確認できた。
独特なコラーゲン-エラスチンのメカノ相乗作用を証明するテクスチャ分析
ペプチドベースの足場（PANi-E-NS、PANi-C-NSおよびxpi-PANi-E-C-NS）のテクスチャプロファイリングでは、仮説は、「エラスチンなどのアモルファスポリマーは、ゴム様材料として振る舞い、一方、コラーゲンなどの力を伝達する堅いタンパク質は、伸長した立体構造として存在し、堅いロープのように振る舞う」（Silver, 2006）という記載に基づくものであった。
ペプチドベースの足場（PANi-E-NS、PANi-C-NSおよびxpi-PANi-E-C-NS）のテクスチャプロファイリングでは、仮説は、「エラスチンなどのアモルファスポリマーは、ゴム様材料として振る舞い、一方、コラーゲンなどの力を伝達する堅いタンパク質は、伸長した立体構造として存在し、堅いロープのように振る舞う」（Silver, 2006）という記載に基づくものであった。
テクスチャ分析を水和した試料について実施し、PANiのみの神経スポンジおよびPANi-E神経スポンジは、乾燥すると柔らかくてもろくなり、ピンセットで持ち上げると粉末状の塊に崩れた。水和状態でも、PANi-およびPANi-E神経スポンジは、柔らかすぎて、スチールのピンセット持ち上げることができなかったため、フラットエンドのプラスチックのピンセットを用いて持ち上げ、これらの足場をステージに配置した。足場を、水和状態でかみそりの刃を用いて切断した。テクスチャ分析では、10〜25％の圧縮ひずみを、同じテスト速度とテスト後速度で適用し、データを分析して、最大の強度、変形エネルギー、剛性勾配、％マトリックスス弾性を得た（図13）。図13は、10〜25％（SD（ML）≦0.04；SD（DE）≦0.05；SD（RG）≦0.08；SD（MR）≦9.2；n＝3）の部分的に適用されるひずみ値下での、本開示によるPANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANI-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジの物理機械的特性を示す。足場は、共通の成分としてPANiを含み、それ故に足場をペプチド含有量に関して比較した。二成分系のPANi-E-NSおよびPANi-C-NSの中で、PANi-E-NSは、はそのゴム状の性質により最高の弾性を示し、コラーゲンは、より高い適用ひずみにおいてその堅い性質により最低の値を示した。反対に、マトリックス強度および変形エネルギーの値は、PANi-E-NSよりPANi-C-NSが高かった。マトリックス強度、変形エネルギーおよび剛性勾配が増加すると、マトリックスの弾性が減少し、その逆も同様であった。PANiへのエラスチンの添加は、固体の含有量を増加させるが（PANi：エラスチン≒1：1）、マトリックス強度および変形エネルギーの減少が観察された。コラーゲンを極めて低い濃度（製剤混合物中0.4％w/v）で加えたが、PANi-C-NSのマトリックス強度、変形エネルギーおよび剛性勾配は、より高い適用ひずみにおいてPANiのものより比較的高かった。最低の適用ひずみ（10％）において、機械的パラメーターに対するペプチド添加の効果は、あまり明白ではなかった。したがって、理論に限定されるものではないが、PANiは、物理機械的にネイティブなポリマーとして機能し、加えたペプチド生体材料の性質にしたがって実施され、更なる結果が得られなかったことが暗示される。これはまた、生体材料が、個々の特性を依然として反映しながら、互いによく混合されている、ポリマーとペプチド生体材料間の相互侵入性のネットワークの効率的な形成を暗示する。マトリックス弾性および剛性は、これらのパラメーターが、埋め込まれた後に細胞応答に直接影響するため、足場に固有の極めて重要な機械的特性である（Lo et al., 2000）。しかしながら、パラメーターいずれかを増加させると、他のパラメーターが減少し、必要とされる弾性-剛性のバランスまたは単に柔らかさ-硬さのバランスを維持することが困難になる。
xpi-PANi-E-C-NSの場合、エラスチンおよびコラーゲンは、PANiで機械的に最適化された足場を形成し、PANiは、スチールのピンセットで扱うことができる最高のマトリックス強度を有する。
円筒形のxpi-PANi-E-C神経スポンジ/医薬品組成物は、最大3層の重量を保持できた（図2）。驚くべきことにかつ予想外に、xpi-PANi-EC神経スポンジは、PANi-NS、PANi-E-NSおよびPANi-EC-NSと比較して、十分に高いマトリックス強度（変形を生じるのに必要な力）、変形エネルギー（堅さ）および剛性勾配（剛性）を示した。
さらに驚くべきことにかつ予想外に、剛性および堅さがほぼ2倍に増加した後でも、弾性は、PANi-E-NSの範囲内を維持し、より高い適用ひずみではPANi-NSおよびPANi-C-NSより高かった。PANiと一緒に、PANiが化学的にネイティブなポリマーとして機能するが、ネイティブな形態へのコラーゲンとエラスチンの両方の配向に影響を及ぼし、大々的に宣言されている「コラーゲンとエラスチンの強化複合材料」を一緒に形成する、最初のそのようなスピンミミック足場が開示された（Miranda-Nieves and Chaikof, 2016; Oxlund and Andreassen, 1980; Muiznieks and Keeley, 2013）。
xpi-PANi-E-C神経スポンジ/医薬組成物の独特で有利な物理化学的特性は、PANi-NS、PANi-E-NSおよびPANi-C-NSの分析からではなく構成要素化合物[ポリアクリロニトリル（PANi）、エラスチン（E）およびコラーゲン]の分析に基づいて予測できなかったものである。理論に限定されるものではないが、架橋したPANi、エラスチン（E）およびコラーゲン（C）間の独特な相互作用は、脊髄模倣性質を有する相互侵入性のポリマーネットワークを提供する。ヒトおよび/または動物の脊髄組織を模倣すること、およびチャネルおよび/またはトンネル、および/またはチャネルおよび/またはトンネル内の突起を提供することにより、本開示による医薬組成物は、神経組織および/または軸索の成長および/または回復を促進した。
脊髄模倣神経スポンジのマトリックスの水和および分解プロファイル
凍結乾燥した足場（PANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびPANi-E-C神経スポンジ）の中性（neuronal）水性媒体（pH7.4）への応答を評価するために、足場を、水を保持する能力（％水保持能；WHC）、水分重量（％マトリックスス水和；MH）および物理的分解（PD）について試験した（図14）。図14は、PANi-E神経スポンジ、PANI-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジのマトリックスの水和および分解プロファイルを示す棒グラフを示す（SD（WR）≦202；SD（MH）≦118；SD（MD）≦6；n＝3）。WHCは、足場がマトリックスネットワーク内およびマトリックスの細孔に保持できる最大の水を指し、有効には、所与の時間に（水性媒体を排出する前に）足場に存在する水性媒体である。WHCは、足場内で細胞が成長および増殖するために利用できる媒体を指す。MHは、平衡重量に達するまで水をろ紙に吸収させて、過剰な足場表面水および細孔内の水を排出することにより計算した。MHは、用いる足場が、完全に水和した状態で予め凍結乾燥され、それ故にサイズの増加は見られないため、膨張率と混同してはならない。物理的分解は、水性媒体中での足場の分解と称され、そのマトリックスを保持する足場の能力を表す。
凍結乾燥した足場（PANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびPANi-E-C神経スポンジ）の中性（neuronal）水性媒体（pH7.4）への応答を評価するために、足場を、水を保持する能力（％水保持能；WHC）、水分重量（％マトリックスス水和；MH）および物理的分解（PD）について試験した（図14）。図14は、PANi-E神経スポンジ、PANI-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジのマトリックスの水和および分解プロファイルを示す棒グラフを示す（SD（WR）≦202；SD（MH）≦118；SD（MD）≦6；n＝3）。WHCは、足場がマトリックスネットワーク内およびマトリックスの細孔に保持できる最大の水を指し、有効には、所与の時間に（水性媒体を排出する前に）足場に存在する水性媒体である。WHCは、足場内で細胞が成長および増殖するために利用できる媒体を指す。MHは、平衡重量に達するまで水をろ紙に吸収させて、過剰な足場表面水および細孔内の水を排出することにより計算した。MHは、用いる足場が、完全に水和した状態で予め凍結乾燥され、それ故にサイズの増加は見られないため、膨張率と混同してはならない。物理的分解は、水性媒体中での足場の分解と称され、そのマトリックスを保持する足場の能力を表す。
PANi-E-NSは、極めて低い％WHCおよび％MHを示し、足場の約50％は、24時間以内に分解した。これは、足場の極めて弱い機械的強度によるものであった。これは、水和チューブ内の足場粒子の存在によって明らかであり、水和媒体の色は、媒体中のエラスチンの存在によって緑がかった黄色に変わった。ゆるい構造が分解すると、足場構造は、水性媒体に残っている40〜45％のマトリックスで平衡に達し、これは極めて柔らかくてもろかった。このような足場は、かなりの量のマトリックスを失い、それ故に埋め込み後極めて短時間でマトリックスの完全性を失うため、組織設計の用途には適さない。
対照的に、PANi-C-NSは堅い足場を形成し、試験期間を通して粒子の分解は見られなかった。％WHC値は、約1000％に達し、4日目までに平衡化のみした。％MHが1日目に約700％に達し、ほとんどの水性媒体はマトリックス構造に保持された。物理的分解のデータは、WHCとMHを補完し、28日目までに約15％の最小の分解を示した。これは、PANi-C-NSの弾力性が最も低く、水分子のマトリックスへの進入を遅らせ、それ故に足場の水和を遅らせたためと説明し得る。PANi-E-NSと比較してPANi-C-NSの著しく高い％WHCは、足場内により多くの量の水性媒体を保持できるPANi-C-NS（表4）の著しく高い多孔度に起因し得る。さらに、コラーゲン原線維により形成されるナノウェブは、著しくより多くの量の水を保持し、一方で、排水はより高い％MH値をもたらした。同様に、弾力性が低いため、水分子は十分なネットワークの動きに影響を与えることができず、足場の物理的な分解はごくわずかであった。このような足場はまた、それらが堅い構造を形成し、極めてゆっくりと分解するため、組織再生には適さず、そして促進せず、それ故に、組織を増殖および成長するための空間的制約が生じる。
xpi-PANi-E-C-NSの場合、％WHCおよび％MHの中間値が最初の4日間観察され、その後％WHCおよび％MHの最低値が示された。3つの棒グラフを詳しく見ると、xpi-PANi-E-C-NSの％WHCおよび％MHがその物理的分解プロファイルに反比例していることがわかった。ゆるい粒子は目に見えて明白ではなかったが、水和容器は分解期間中に緑がかった黄色の色合いを示し、足場からのエラスチンの浸出を確認した。4週間にわたって形状の歪みは観察されず、マトリックス構造の維持を確認した。xpi-PANi-EC-NSの独特な剛性-柔らかさのパラダイムは、4週間にわたってほぼ線形の分解プロファイルを生じ（R2＝0.9802）、28日目で約50％のマトリックスが分解した。最も重要なことには、PANi-E-NSに近い多孔質プロファイルのため、MHは、xpi-PANi-E-C-NSのWHCよりも25％だけ低く、これにより3つの処方間で最適な固体-液体バランスが確認された。一次分解プロファイルおよび比較的高い固体-液体の比により、xpi-PANi-E-C-NSは、組織の再生に最も適すると考えられた。
脊髄模倣神経スポンジからの生物活性物質放出
3つのコア足場（PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびPANi-E-C神経スポンジ）の薬物放出プロファイルは、多孔質、テクスチャ分析および水和/分解のデータ厳密に従っていた。
3つのコア足場（PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびPANi-E-C神経スポンジ）の薬物放出プロファイルは、多孔質、テクスチャ分析および水和/分解のデータ厳密に従っていた。
他のポリマー原型と対照的に、デキサメサゾンおよびクルクミンの放出プロファイルは、PANi-ベースの足場で比較的重ね合わせることができた（図15）。
PANi-E-NSは、生物活性物質の急速な放出を示し、3〜8時間以内に約90％が放出され、24時間以内に生物活性物質が完全に放出された。これは、より長い期間にわたって活性な薬物の放出を必要とする脊椎インプラントの場合には望ましくない。急速な放出は、弱い機械的強度、それ故にポリマー-ペプチドマトリックスの急速な分解に容易に起因し得て、用量ダンピング挙動の典型的な例である。
PANi-C-NSからのDexの放出は、クルクミンと比較して比較的速く、両方の生理活性物質は72時間以内に完全に放出された。％WHCと％MHの値は、PANi-C-NSで（PANi-E-NSと比較して）高いが、マトリックス強度が高く、無傷の足場構造は、薬物の放出を遅らせた。しかしながら、PANi-C-NSの高い多孔性と大きな細孔により、3日以内に生物活性物質は完全に放出された。
xpi-PANi-E-Cは、PANi-E-NSとPANi-C-NSの間の放出プロファイルを示すと予想される。しかしながら、予想に反してこれは観察されていない。xpi-PANi-E-C-NSは最も遅い薬物放出プロファイルを示し、脊髄関連の損傷を処置するための脊髄インプラントとしての用途に最も望ましいと考えられる。
xpi-PANi-E-C-NSは、中間の放出挙動を示さなかった。xpi-PANi-EC-NSの場合、PANi-E-NSおよびPANi-C-NSと比較してより持続的で遅延した放出は、理論に限定されるものではないが、その比較的高い機械的強度、エラスチンとコラーゲンの両方が足場に組み込まれているために最も高いマトリックス含有量（または最高密度）、および低い水和特性に起因し得る。この足場の薬物放出プロファイルは、急性脊髄損傷の治療レジメンに従っており、最初の24時間以内に少なくとも75％の薬物が放出される（xpi-PANi-E-C-NS）。これは、脊髄損傷の介入に対する、水和され、薬物が負荷された、マルチマクロ多孔質な、ナノからマイクロファイバーの、硬くて柔らかいポリマー-ペプチドプラットフォームの適用性を証明している。
分子力学シミュレーションによる分子複合体の幾何学的同化の解釈
真空で分子シミュレーションを実行しているときに、PANiの-C≡N機能は、ペプチド分子-コラーゲンおよびエラスチンの-NH2、-COOHまたは-OH官能基とのH結合を形成しないことが観察された。しかしながら、PANi分子は、ペプチド分子の近くでPANi分子が経験する伸び、曲げおよびねじりひずみから生じ、その逆も同様である、非結合性相互作用に起因し得る特定の幾何学的な変化を受けた。PANiの形状の変化を視覚化するために、ネイティブ状態（PANi）ならびに分子複合体（PANi-E、PANi-Cおよびxpi-PANi-EC）のエネルギー最小化後の分子の慣性軸を捕らえた。興味深いことに、慣性軸の同様の位置で比較すると、PANi分子の形状は、図16に示すように、半円（PANiのみ）からクエスチョンマークの形状（PANi-E）、逆クエスチョンマークの形状（PANi-C）を経て、S-字形状のxi-PANi-ECに変化した。さらに、コラーゲン-エラスチン分子複合体（図17a）間のH結合は、PANiのすぐ近くで著しく増加した（図17b）。これらの幾何学的およびH結合遷移により、ポリマー-ペプチド混合物におけるペプチド分子の二次構造の変化に関する本出願人の主題がさらに確認された（詳細については、FTIRおよびDSC分析の説明を参照）。
真空で分子シミュレーションを実行しているときに、PANiの-C≡N機能は、ペプチド分子-コラーゲンおよびエラスチンの-NH2、-COOHまたは-OH官能基とのH結合を形成しないことが観察された。しかしながら、PANi分子は、ペプチド分子の近くでPANi分子が経験する伸び、曲げおよびねじりひずみから生じ、その逆も同様である、非結合性相互作用に起因し得る特定の幾何学的な変化を受けた。PANiの形状の変化を視覚化するために、ネイティブ状態（PANi）ならびに分子複合体（PANi-E、PANi-Cおよびxpi-PANi-EC）のエネルギー最小化後の分子の慣性軸を捕らえた。興味深いことに、慣性軸の同様の位置で比較すると、PANi分子の形状は、図16に示すように、半円（PANiのみ）からクエスチョンマークの形状（PANi-E）、逆クエスチョンマークの形状（PANi-C）を経て、S-字形状のxi-PANi-ECに変化した。さらに、コラーゲン-エラスチン分子複合体（図17a）間のH結合は、PANiのすぐ近くで著しく増加した（図17b）。これらの幾何学的およびH結合遷移により、ポリマー-ペプチド混合物におけるペプチド分子の二次構造の変化に関する本出願人の主題がさらに確認された（詳細については、FTIRおよびDSC分析の説明を参照）。
結論
PANi-NS、PANi-E-NS、PANi-C-NSおよびxpi-PANi-E-C-NSが合成された。xpi-PANi-E-C神経スポンジの独特な特徴には、ネイティブな脊髄を模倣する繊維状神経トンネル構造の形状が含まれた。物理化学的特性評価により、ペプチド分子の二次構造が、PANiの存在下でネイティブな細胞外マトリックス形態に再構成されることが明らかになり、ポリマー-ペプチド構造の自己組織化性質が確認された。さらに、xpi-PANi-E-C神経スポンジは、インビボでのネイティブなコラーゲン-エラスチン複合体と同様の、マトリックス弾性およびマトリックス硬度の完璧なバランスを提供した。神経組織および軸索の成長を促進する人工神経細胞外マトリックスとしてのxpi-PANi-E-Cの脊髄模倣性質を考慮すると、完全な離断脊髄損傷モデルにおいて神経組織を再生およびサポートする能力についてxpi-PANi-E-Cをさらにインビボで評価した。
PANi-NS、PANi-E-NS、PANi-C-NSおよびxpi-PANi-E-C-NSが合成された。xpi-PANi-E-C神経スポンジの独特な特徴には、ネイティブな脊髄を模倣する繊維状神経トンネル構造の形状が含まれた。物理化学的特性評価により、ペプチド分子の二次構造が、PANiの存在下でネイティブな細胞外マトリックス形態に再構成されることが明らかになり、ポリマー-ペプチド構造の自己組織化性質が確認された。さらに、xpi-PANi-E-C神経スポンジは、インビボでのネイティブなコラーゲン-エラスチン複合体と同様の、マトリックス弾性およびマトリックス硬度の完璧なバランスを提供した。神経組織および軸索の成長を促進する人工神経細胞外マトリックスとしてのxpi-PANi-E-Cの脊髄模倣性質を考慮すると、完全な離断脊髄損傷モデルにおいて神経組織を再生およびサポートする能力についてxpi-PANi-E-Cをさらにインビボで評価した。
参考文献
Cetiner S, Karakas H, Ciobanu R et al 2010. Polymerization of pyrrole derivatives on polyacrylonitrile matrix, FTIR-ATR and dielectric spectroscopic characterization of composite thin films. Synthetic Metals 160:1189-1196.
Daamen WF, van Moerkerk HTB, Hafmans T, Buttafoco L, Poot AA, Veerkamp JH, van Kuppevelt TH 2003. Preparation and evaluation of molecularly-defined collagen-elastin-glycosaminoglycan scaffolds for tissue engineering. Biomaterials 24:4001-4009.
Henzler Wildman KA, Lee DK, Ramamoorthy A 2002. Determination of α-helix and β-sheet stability in the solid state: A solid-state NMR investigation of poly(L-alanine). Biopolymers 64:246-254.
Miranda-Nieves D, Chaikof EL 2016. Collagen and elastin biomaterials for the fabrication of engineered living tissues. ACS Biomater Sci Eng (In press). DOI: 10.1021/acsbiomaterials.6b00250.
Moghadam SS, Bahrami SH 2005. Copolymerization of acrylonitrile-acrylic acid in DMF-water mixture. Iran Polym J 14:1032-1041.
Moore MJ, Friedman JA, Lewellyn EB et al 2006. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials 27:419-29.
Moreno M, Ana MAS, Gonzalez G, Benavente E 2010. Poly(acrylonitrile)-montmorillonite nanocomposites: Effects of the intercalation of the filler on the conductivity of composite polymer electrolytes. Electrochimica Acta 55:1323-1327.
Muiznieks LD, Keeley FW 2013. Molecular assembly and mechanical properties of the extracellular matrix: A fibrous protein perspective. Biochim Biophys Acta 1832:866-875.
Nagai T 2010. Characterization of Acid-Soluble Collagen from Skins of Surf Smelt (Hypomesus pretiosus japonicus Brevoort). Food Nutrition Sci 1:59-66.
Oxlund H, Andreassen TT 1980. The roles of hyaluronic acid, collagen and elastin in the mechanical properties of connective tissues. J Anat 131:611-620.
Roberts S, Dzuricky M, Chilkoti A 2015. Elastin-like polypeptides as models of intrinsically disordered proteins. FEBS Lett 589:2477-2486.
Silver FH 2006. Macromolecular Structures in Tissues. Chapter 2 in Mechanosensing and Mechanochemical Transduction in Extracellular Matrix. Edited by: Frederick H. Silver. Springer US. Pp 28-75. DOI: 10.1007/978-0-387-28176-6_2.
Ulijn RV, Smith AM 2008. Designing peptide based nanomaterials. Chem Soc Rev 37:664-75. van Vlierberghe S, Dubruel P, Schacht E 2011. Biopolymer-based hydrogels as scaffold for tissue engineering applications: A review. Biomacromolecules 12:1387-1408.
Zhang S 2002. Emerging biological materials through molecular self-assembly. Biotech Adv 20: 321-39.
Zhang S 2003. Fabrication of novel biomaterials through molecular self-assembly. Nat Biotechnol 21:1171-8.
Cetiner S, Karakas H, Ciobanu R et al 2010. Polymerization of pyrrole derivatives on polyacrylonitrile matrix, FTIR-ATR and dielectric spectroscopic characterization of composite thin films. Synthetic Metals 160:1189-1196.
Daamen WF, van Moerkerk HTB, Hafmans T, Buttafoco L, Poot AA, Veerkamp JH, van Kuppevelt TH 2003. Preparation and evaluation of molecularly-defined collagen-elastin-glycosaminoglycan scaffolds for tissue engineering. Biomaterials 24:4001-4009.
Henzler Wildman KA, Lee DK, Ramamoorthy A 2002. Determination of α-helix and β-sheet stability in the solid state: A solid-state NMR investigation of poly(L-alanine). Biopolymers 64:246-254.
Miranda-Nieves D, Chaikof EL 2016. Collagen and elastin biomaterials for the fabrication of engineered living tissues. ACS Biomater Sci Eng (In press). DOI: 10.1021/acsbiomaterials.6b00250.
Moghadam SS, Bahrami SH 2005. Copolymerization of acrylonitrile-acrylic acid in DMF-water mixture. Iran Polym J 14:1032-1041.
Moore MJ, Friedman JA, Lewellyn EB et al 2006. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials 27:419-29.
Moreno M, Ana MAS, Gonzalez G, Benavente E 2010. Poly(acrylonitrile)-montmorillonite nanocomposites: Effects of the intercalation of the filler on the conductivity of composite polymer electrolytes. Electrochimica Acta 55:1323-1327.
Muiznieks LD, Keeley FW 2013. Molecular assembly and mechanical properties of the extracellular matrix: A fibrous protein perspective. Biochim Biophys Acta 1832:866-875.
Nagai T 2010. Characterization of Acid-Soluble Collagen from Skins of Surf Smelt (Hypomesus pretiosus japonicus Brevoort). Food Nutrition Sci 1:59-66.
Oxlund H, Andreassen TT 1980. The roles of hyaluronic acid, collagen and elastin in the mechanical properties of connective tissues. J Anat 131:611-620.
Roberts S, Dzuricky M, Chilkoti A 2015. Elastin-like polypeptides as models of intrinsically disordered proteins. FEBS Lett 589:2477-2486.
Silver FH 2006. Macromolecular Structures in Tissues. Chapter 2 in Mechanosensing and Mechanochemical Transduction in Extracellular Matrix. Edited by: Frederick H. Silver. Springer US. Pp 28-75. DOI: 10.1007/978-0-387-28176-6_2.
Ulijn RV, Smith AM 2008. Designing peptide based nanomaterials. Chem Soc Rev 37:664-75. van Vlierberghe S, Dubruel P, Schacht E 2011. Biopolymer-based hydrogels as scaffold for tissue engineering applications: A review. Biomacromolecules 12:1387-1408.
Zhang S 2002. Emerging biological materials through molecular self-assembly. Biotech Adv 20: 321-39.
Zhang S 2003. Fabrication of novel biomaterials through molecular self-assembly. Nat Biotechnol 21:1171-8.
実施例 動物試験
以下に示す動物試験は、完全な離断脊髄損傷モデルで実施した本開示の第1態様によるxpi-PANi-E-C医薬組成物/NSのインビボ評価を含む。
以下に示す動物試験は、完全な離断脊髄損傷モデルで実施した本開示の第1態様によるxpi-PANi-E-C医薬組成物/NSのインビボ評価を含む。
方法
PC12細胞培養およびMTT増殖アッセイ
Cellonex（Separations, South Africa）のラット副腎褐色細胞腫PC12合合付着/浮遊細胞株を、湿った5％CO2雰囲気で37℃にて、10％v/vDES、5％v/vFBSおよび1％v/vP/S/AB溶液を添加したDMEMを用いて、組織培養処理（TPP）T-75フラスコで培養した。培地を2日ごとに75％交換した。エレクトロスピニング繊維の細胞増殖および細胞適合性の検出のために、MTTベースのRoche Cell Proliferation Kit Iを用いた。xpi-PANi-E-C医薬組成物試料をUV光下で12時間滅菌した後、48ウェルプレートにおいて10％v/vDES、5％v/vFBSおよび1％v/vP/S/ABを含む400μLの培地でインキュベートし、37℃、5％CO2を維持した。PC12細胞を、2×104細胞/ウェルの密度でxpi-PANi-E-C医薬組成物試料に播種し、72時間インキュベートした。その後、40μLのMTT溶液を各ウェルに加え、4時間さらにインキュベートし、その後、400μLの可溶化剤を加えてホルマザン結晶を溶解させた。ウェル全体の内容物を吸引除去し、2mLのエッペンドルフチューブに入れ、2000rpmで5分間遠心分離して、浮遊細胞を分離した。得られた上清を96ウェルプレートに移し、マルチプレートリーダー（BioTek, USA）を用いて550nmにおける吸光度を測定した。相対細胞増殖を、次の式を用いて測定した：
％Rp＝（A試験/Aコントロール）×100 …数式1
［式中、Rp＝相対細胞増殖；A試験＝試料を含有するヒドロゲル膜の吸光度；Aコントロール＝コントロールの吸光度（Ray et al., 2010）。
PC12細胞培養およびMTT増殖アッセイ
Cellonex（Separations, South Africa）のラット副腎褐色細胞腫PC12合合付着/浮遊細胞株を、湿った5％CO2雰囲気で37℃にて、10％v/vDES、5％v/vFBSおよび1％v/vP/S/AB溶液を添加したDMEMを用いて、組織培養処理（TPP）T-75フラスコで培養した。培地を2日ごとに75％交換した。エレクトロスピニング繊維の細胞増殖および細胞適合性の検出のために、MTTベースのRoche Cell Proliferation Kit Iを用いた。xpi-PANi-E-C医薬組成物試料をUV光下で12時間滅菌した後、48ウェルプレートにおいて10％v/vDES、5％v/vFBSおよび1％v/vP/S/ABを含む400μLの培地でインキュベートし、37℃、5％CO2を維持した。PC12細胞を、2×104細胞/ウェルの密度でxpi-PANi-E-C医薬組成物試料に播種し、72時間インキュベートした。その後、40μLのMTT溶液を各ウェルに加え、4時間さらにインキュベートし、その後、400μLの可溶化剤を加えてホルマザン結晶を溶解させた。ウェル全体の内容物を吸引除去し、2mLのエッペンドルフチューブに入れ、2000rpmで5分間遠心分離して、浮遊細胞を分離した。得られた上清を96ウェルプレートに移し、マルチプレートリーダー（BioTek, USA）を用いて550nmにおける吸光度を測定した。相対細胞増殖を、次の式を用いて測定した：
％Rp＝（A試験/Aコントロール）×100 …数式1
［式中、Rp＝相対細胞増殖；A試験＝試料を含有するヒドロゲル膜の吸光度；Aコントロール＝コントロールの吸光度（Ray et al., 2010）。
xpi-PANi-E-C-NSのインビボ埋め込みを評価するパイロット試験
xpi-PANi-E-C-NSの性能のインビボ試験に、成体の雌Sprague-Dawleyラットを用いた。ラットを2群に分けた：
群0：脊髄損傷を有するコントロール群。
群II：損傷ラット＋xpi-PANi-E-C-NS
群はそれぞれ4匹の動物を有した。ラットの背中を剃毛する前に、ラットを麻酔した（65mg/kgケタミンi.p./7.5mg/kgキシラジンi.p.）。ラットを手術台に置いた後、背中線に沿って小さな切開（≦2cm）を行った。棘突起および椎弓板に付着した傍脊柱筋を骨膜下で切開して硬膜に到達させた。湾曲した鋭いはさみを用いて、椎弓切除術を、レベルT8〜T10に対応する所定のマークした位置で行った。椎間関節の侵害を慎重に回避した。硬膜が露出したら、鋭いマイクロピンセットとハサミを用いて硬膜を切断し、脊髄の1mmのセグメントを取り除いた（レベルT9）。その後、断端を引っ込めて、xpi-PANi-E-Cスポンジ/足場の埋め込みのために脊髄に2mmのギャップを作った。離断部位をリンガー溶液で洗浄し、完全な離断の確認として導管の底を視覚化した。xpi-PANi-E-Cスポンジ/足場を、2mmのギャップ内に埋め込み、配置しまたは注入した。外科的処置後に皮膚を縫合した（Moore et al., 2006, Meiners et al., 2007, Tysseling-Mattiace et al., 2008）。すべての手順を、University of the Witwatersrand, JohannesburgのAnimal Ethics Screening Committeeのガイドラインに従って実施した。
xpi-PANi-E-C-NSの性能のインビボ試験に、成体の雌Sprague-Dawleyラットを用いた。ラットを2群に分けた：
群0：脊髄損傷を有するコントロール群。
群II：損傷ラット＋xpi-PANi-E-C-NS
群はそれぞれ4匹の動物を有した。ラットの背中を剃毛する前に、ラットを麻酔した（65mg/kgケタミンi.p./7.5mg/kgキシラジンi.p.）。ラットを手術台に置いた後、背中線に沿って小さな切開（≦2cm）を行った。棘突起および椎弓板に付着した傍脊柱筋を骨膜下で切開して硬膜に到達させた。湾曲した鋭いはさみを用いて、椎弓切除術を、レベルT8〜T10に対応する所定のマークした位置で行った。椎間関節の侵害を慎重に回避した。硬膜が露出したら、鋭いマイクロピンセットとハサミを用いて硬膜を切断し、脊髄の1mmのセグメントを取り除いた（レベルT9）。その後、断端を引っ込めて、xpi-PANi-E-Cスポンジ/足場の埋め込みのために脊髄に2mmのギャップを作った。離断部位をリンガー溶液で洗浄し、完全な離断の確認として導管の底を視覚化した。xpi-PANi-E-Cスポンジ/足場を、2mmのギャップ内に埋め込み、配置しまたは注入した。外科的処置後に皮膚を縫合した（Moore et al., 2006, Meiners et al., 2007, Tysseling-Mattiace et al., 2008）。すべての手順を、University of the Witwatersrand, JohannesburgのAnimal Ethics Screening Committeeのガイドラインに従って実施した。
手術後動物のケア
手術後、動物を、予め温めた袋で覆ったケージに入れ、体温を維持した。特定の場合、動物をインキュベーターに入れた。乳酸リンガー液（皮下）およびバイトリル（33mg/kg、皮下）を手術直後と3日間投与し、それぞれ、初期の水分補給を維持し、感染を制御した。試験期間中、または膀胱機能が回復するまで、膀胱を毎日3回手動で空にした。不快感が生じた場合、キュラテックス（皮下、1日2回）を所定の投与量で投与した。損傷の24時間後に後肢の動きを示すラットは、試験から除外した（Tysseling-Mattiace et al., 2008）。
手術後、動物を、予め温めた袋で覆ったケージに入れ、体温を維持した。特定の場合、動物をインキュベーターに入れた。乳酸リンガー液（皮下）およびバイトリル（33mg/kg、皮下）を手術直後と3日間投与し、それぞれ、初期の水分補給を維持し、感染を制御した。試験期間中、または膀胱機能が回復するまで、膀胱を毎日3回手動で空にした。不快感が生じた場合、キュラテックス（皮下、1日2回）を所定の投与量で投与した。損傷の24時間後に後肢の動きを示すラットは、試験から除外した（Tysseling-Mattiace et al., 2008）。
脊髄組織試料の免疫組織化学分析
脊髄損傷後28日目に、動物をペントバルビタール（50mg/kg、腹腔内）で安楽死させ、0.01Mリン酸緩衝生理食塩水、続いて4％パラホルムアルデヒド（PFD）で灌流した。脊髄を解剖し、4％パラホルムアルデヒドで一晩後固定した。その後、脊髄をパラフィンワックスブロックに埋め込み、ミクロトームで水平に切断し、スーパーフロストプラススライドに載せた。この試験の目的は、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）および免疫組織化学（IHC）アッセイを組み込んだ、損傷したラット脊髄内の変性/再生の程度を評価することであった。4〜5μmの切片を各ブロック全体の3つのレベルから採取し、各病変が完全に含まれるようにした。
脊髄損傷後28日目に、動物をペントバルビタール（50mg/kg、腹腔内）で安楽死させ、0.01Mリン酸緩衝生理食塩水、続いて4％パラホルムアルデヒド（PFD）で灌流した。脊髄を解剖し、4％パラホルムアルデヒドで一晩後固定した。その後、脊髄をパラフィンワックスブロックに埋め込み、ミクロトームで水平に切断し、スーパーフロストプラススライドに載せた。この試験の目的は、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）および免疫組織化学（IHC）アッセイを組み込んだ、損傷したラット脊髄内の変性/再生の程度を評価することであった。4〜5μmの切片を各ブロック全体の3つのレベルから採取し、各病変が完全に含まれるようにした。
最初の例では、H&E染色を用いて、各スライドに存在する形態的特徴を特徴付けした。次に、存在する構造的および分子的プロセスをさらに分類するために、様々な免疫組織化学（IHC）染色を下記のように適用した：
・ED1（CD68）：グリア/組織球浸潤（慢性炎症（脊髄炎））の程度/量を決定する。
・カルパイン/誘導型一酸化窒素シンターゼ（iNOS）：進行中のタンパク質分解の程度を決定し（ミエリンおよび細胞骨格）、NOがそれぞれ脊髄損傷/病変の進行の病因（変性）内で発現している程度を評価する。
・グリア繊維状酸性タンパク質（GFAP）/ニューロフィラメント200（NF-200）：構造的な神経膠/軸索の崩壊の程度を決定する。
・ED1（CD68）：グリア/組織球浸潤（慢性炎症（脊髄炎））の程度/量を決定する。
・カルパイン/誘導型一酸化窒素シンターゼ（iNOS）：進行中のタンパク質分解の程度を決定し（ミエリンおよび細胞骨格）、NOがそれぞれ脊髄損傷/病変の進行の病因（変性）内で発現している程度を評価する。
・グリア繊維状酸性タンパク質（GFAP）/ニューロフィラメント200（NF-200）：構造的な神経膠/軸索の崩壊の程度を決定する。
H&E染色切片に下記のようにグレードを付けた：
・NAD：異常検出無。コントロール検体のパラメーター内の形態、脱髄/神経線維変性の欠如。
・1：最小限の病変。ミクログリア/格子細胞の最小限の浸潤の有無にかかわらず、拡張ミエリン鞘の存在および軸索原形質の凝縮（「消化チャンバー」を含む）を特徴とする、神経線維脱髄の散乱および個別化した病巣。
・2：わずかな病変。神経線維変性の多病巣性から癒合領域、最小限の炎症性細胞浸潤。
・3：中等度の病変。全神経線維喪失の局所的に広範囲な領域を伴う散在性脱髄、ならびに反応性および肥大性内皮細胞および初期の繊維状組織沈着を伴う無数の空胞化格子細胞による置き換え（肉芽組織；慢性活動性脊髄炎）。
・4：著しい病変。3に従うが、神経の完全な離断、ならびに炎症性細胞の炎症および初期修復による置き換え。
・5：「修復表現型」。多数の多核細胞による脊髄置き換えの局所的に広範囲な領域、細胞外マトリックスの原線維性および均一な沈着物と混合（変性した、推定の再生神経芽細胞と混合した多核グリア細胞の混合）。グレード4の変更を表す周辺領域。
・NAD：異常検出無。コントロール検体のパラメーター内の形態、脱髄/神経線維変性の欠如。
・1：最小限の病変。ミクログリア/格子細胞の最小限の浸潤の有無にかかわらず、拡張ミエリン鞘の存在および軸索原形質の凝縮（「消化チャンバー」を含む）を特徴とする、神経線維脱髄の散乱および個別化した病巣。
・2：わずかな病変。神経線維変性の多病巣性から癒合領域、最小限の炎症性細胞浸潤。
・3：中等度の病変。全神経線維喪失の局所的に広範囲な領域を伴う散在性脱髄、ならびに反応性および肥大性内皮細胞および初期の繊維状組織沈着を伴う無数の空胞化格子細胞による置き換え（肉芽組織；慢性活動性脊髄炎）。
・4：著しい病変。3に従うが、神経の完全な離断、ならびに炎症性細胞の炎症および初期修復による置き換え。
・5：「修復表現型」。多数の多核細胞による脊髄置き換えの局所的に広範囲な領域、細胞外マトリックスの原線維性および均一な沈着物と混合（変性した、推定の再生神経芽細胞と混合した多核グリア細胞の混合）。グレード4の変更を表す周辺領域。
40倍の高倍率視野の対物レンズ当たりの陽性細胞の平均数（合計約60細胞）に基づいて、ED1染色切片に下記のようにグレードを付けた：
・0：40倍の高倍率視野当たり平均1〜2個の細胞。
・1：40倍の高倍率視野当たり平均2〜10個の細胞。
・2：40倍の高倍率視野当たり平均10〜20個の細胞。
・3：40倍の高倍率視野当たり平均20〜30個の細胞。
・4：40倍の高倍率視野当たり平均30個を超える細胞。
・0：40倍の高倍率視野当たり平均1〜2個の細胞。
・1：40倍の高倍率視野当たり平均2〜10個の細胞。
・2：40倍の高倍率視野当たり平均10〜20個の細胞。
・3：40倍の高倍率視野当たり平均20〜30個の細胞。
・4：40倍の高倍率視野当たり平均30個を超える細胞。
より低い顕微鏡の対物レンズで一般的に観察可能な各検体の染色の平均強度に基づいて、iNOS染色切片に下記のようにグレードを付けた：
・0：わずかな染色；コントロール（「正常」）範囲内とみなした。
・1：最小限増加した染色強度。
・2：わずかから中等度に増加した染色強度；一般に、より深刻な変化と相関した。
・0：わずかな染色；コントロール（「正常」）範囲内とみなした。
・1：最小限増加した染色強度。
・2：わずかから中等度に増加した染色強度；一般に、より深刻な変化と相関した。
約10〜60の高倍率視野の対物レンズ（視野あたり約20〜40細胞）で取得した、染色の全体的な構造（または病変）分析に基づいて、GFAP染色切片に下記のようにグレードを付けた：
・0：正常範囲内；灰白/白質路にわたって保持されている構造的完全性。無傷の細網状ネットワーク。
・1：線形の線維整列の最小限の崩壊；タンパク質/染色量/強度の識別可能な喪失なし。
・2：線形の線維整列のわずかな喪失；タンパク質/染色量/強度の明らかな減少。
・3：線形の線維整列の大きな崩壊；タンパク質/染色量/強度の著しい喪失（離断領域の特徴）。
・4：均一なGFAP陽性マトリックスによる置き換えを伴う網状ネットワークの著しい喪失。周辺帯領域は線維の分岐および肥厚を示す（「修復表現型」の特徴）。
・0：正常範囲内；灰白/白質路にわたって保持されている構造的完全性。無傷の細網状ネットワーク。
・1：線形の線維整列の最小限の崩壊；タンパク質/染色量/強度の識別可能な喪失なし。
・2：線形の線維整列のわずかな喪失；タンパク質/染色量/強度の明らかな減少。
・3：線形の線維整列の大きな崩壊；タンパク質/染色量/強度の著しい喪失（離断領域の特徴）。
・4：均一なGFAP陽性マトリックスによる置き換えを伴う網状ネットワークの著しい喪失。周辺帯領域は線維の分岐および肥厚を示す（「修復表現型」の特徴）。
約10〜60の高倍率視野の対物レンズ（視野あたり約20〜40細胞）で取得した、染色の全体的な構造（または病変）分析に基づいて、NF-200染色切片染色切片に下記のようにグレードを付けた：
・0：正常範囲内；灰白/白質路にわたって保持されている構造的完全性。無傷の管状ネットワーク。
・1：最小限の管状直径の変化を伴う線形の管整列の最小限の崩壊；タンパク質/染色量/強度の識別可能な喪失なし。
・2：管状直径の変化を伴う線形の管整列のわずかな喪失；タンパク質/染色量/強度の明らかな減少。
・3：保持された路の著しい丸みを伴う線形の管整列の大きな崩壊；タンパク質/染色量/強度の著しい喪失（離断領域の特徴）。
・4：管状構造の完全なまたはほぼ完全な喪失；タンパク質の実質的な欠如、時々丸みを帯びた残存病巣を伴う。周辺帯領域は管状構造のグレード3喪失を示す（「修復表現型」の特徴）。
・0：正常範囲内；灰白/白質路にわたって保持されている構造的完全性。無傷の管状ネットワーク。
・1：最小限の管状直径の変化を伴う線形の管整列の最小限の崩壊；タンパク質/染色量/強度の識別可能な喪失なし。
・2：管状直径の変化を伴う線形の管整列のわずかな喪失；タンパク質/染色量/強度の明らかな減少。
・3：保持された路の著しい丸みを伴う線形の管整列の大きな崩壊；タンパク質/染色量/強度の著しい喪失（離断領域の特徴）。
・4：管状構造の完全なまたはほぼ完全な喪失；タンパク質の実質的な欠如、時々丸みを帯びた残存病巣を伴う。周辺帯領域は管状構造のグレード3喪失を示す（「修復表現型」の特徴）。
行動試験-機能的帰結（BBBスコア）
Basso et al., 1995によって提案されたオープンフィールド法を用いて行動試験を実施し、試験した様々な神経スポンジの機能的帰結を、それぞれの有名な21ポイントのBasso, Beattie, Bresnahan（BBB）運動評価尺度（表5）を用いて定量化した。機能的帰結に高さ関数を提供し、ラットの後肢伸展の程度を定性的に決定するように、ラットケージトレイ（蓋なし）を用いて、方法をわずかに修正した。
Basso et al., 1995によって提案されたオープンフィールド法を用いて行動試験を実施し、試験した様々な神経スポンジの機能的帰結を、それぞれの有名な21ポイントのBasso, Beattie, Bresnahan（BBB）運動評価尺度（表5）を用いて定量化した。機能的帰結に高さ関数を提供し、ラットの後肢伸展の程度を定性的に決定するように、ラットケージトレイ（蓋なし）を用いて、方法をわずかに修正した。
結果および考察
神経適合性および神経細胞増殖の決定
MTT増殖試験は、PANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジが、72時間にわたってコントロール比較してPC12細胞の成長を効率的にサポートできることを示した。これは、図18に示すように、PANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジ（PANi-ECとラベル）の神経適合性を確認した。xpi-PANi-E-C神経スポンジ（PANi-ECとラベル）は、PANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジおよびPANi-C神経スポンジと比較して、より優れた神経増殖を示した。理論に限定されるものではないが、これは、xpi-PANi-E-C神経スポンジが、脊髄構造および細胞外マトリックス（ECM）形態とかなり類似することに起因し得る。
神経適合性および神経細胞増殖の決定
MTT増殖試験は、PANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジが、72時間にわたってコントロール比較してPC12細胞の成長を効率的にサポートできることを示した。これは、図18に示すように、PANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジ、PANi-C神経スポンジおよびxpi-PANi-E-C神経スポンジ（PANi-ECとラベル）の神経適合性を確認した。xpi-PANi-E-C神経スポンジ（PANi-ECとラベル）は、PANi神経スポンジ、PANi-E神経スポンジおよびPANi-C神経スポンジと比較して、より優れた神経増殖を示した。理論に限定されるものではないが、これは、xpi-PANi-E-C神経スポンジが、脊髄構造および細胞外マトリックス（ECM）形態とかなり類似することに起因し得る。
SCI後のxpi-PANi-E-C神経スポンジ埋め込み後の機能的および挙動的結果
病変-コントロール群を観察して、SCI後介入なしの機能回復データを得た。概念実証のために、薬物を含まない15個の足場のみをインビボで試験した。機能的な歩行運動の結果の評価に加えて、埋め込み後のSCIラットにおける膀胱機能の回復。BBBの機能的運動転帰分析を、最高の運動機能および膀胱機能の回復を示す動物について実施した（図19）。
病変-コントロール群を観察して、SCI後介入なしの機能回復データを得た。概念実証のために、薬物を含まない15個の足場のみをインビボで試験した。機能的な歩行運動の結果の評価に加えて、埋め込み後のSCIラットにおける膀胱機能の回復。BBBの機能的運動転帰分析を、最高の運動機能および膀胱機能の回復を示す動物について実施した（図19）。
脊髄損傷を有するコントロール群（群0）
これらの動物では2週間後にのみ膀胱機能が回復し、1つのケースでは試験期間を通して膀胱回復が観察されなかったため、この群は手術後のケアの点で最も困難な群であった。後者のケースでは、動物はまた、オートファジーの兆候および重度の（一貫性のない）不快感を示した。膀胱感染もまた2つのケースで観察された。損傷後28日目に最大のBBBスコア7を達成し、この後試験を終了した。後肢にいくらかの感覚が7日目の後に観察されたが、試験期間を通じて尾に感覚は観察されなかった。28日目の損傷部位は、かなりの瘢痕形成を示し、抽出した組織は極めて硬いと考えられた。図20A〜Hは、コントロール群（群0）におけるSCI後28日間にわたる機能回復の程度を逐次的に示す。
これらの動物では2週間後にのみ膀胱機能が回復し、1つのケースでは試験期間を通して膀胱回復が観察されなかったため、この群は手術後のケアの点で最も困難な群であった。後者のケースでは、動物はまた、オートファジーの兆候および重度の（一貫性のない）不快感を示した。膀胱感染もまた2つのケースで観察された。損傷後28日目に最大のBBBスコア7を達成し、この後試験を終了した。後肢にいくらかの感覚が7日目の後に観察されたが、試験期間を通じて尾に感覚は観察されなかった。28日目の損傷部位は、かなりの瘢痕形成を示し、抽出した組織は極めて硬いと考えられた。図20A〜Hは、コントロール群（群0）におけるSCI後28日間にわたる機能回復の程度を逐次的に示す。
xpi-PANi-E-C神経スポンジ（群II）
xpi-PANi-E-C神経スポンは、SCI/埋め込み後の著しい運動機能の結果を提供した。著しい運動機能は、早くも4日で回復し、膀胱機能の回復は、72時間以内に観察された。7日目までに、動物は、後肢で全体重を維持することができ、ケージの端に対して体を従順に伸ばすことができた。この群の動物ではオートファジーは観察されなかった。動物で得られた最大のBBBスコアは19であり、尾が一貫して上がらないため体幹がわずかに不安定であった。28日後の損傷部位は、脊髄断端の完全な再結合を示し、ネイティブな脊髄組織に「似た弾性」を示した。離断組織に瘢痕形成は観察されなかった。図21(A)〜(I)は、xpi-PANi-E-C群におけるSCI後28日間にわたる機能回復の程度を逐次的に示す。
xpi-PANi-E-C神経スポンは、SCI/埋め込み後の著しい運動機能の結果を提供した。著しい運動機能は、早くも4日で回復し、膀胱機能の回復は、72時間以内に観察された。7日目までに、動物は、後肢で全体重を維持することができ、ケージの端に対して体を従順に伸ばすことができた。この群の動物ではオートファジーは観察されなかった。動物で得られた最大のBBBスコアは19であり、尾が一貫して上がらないため体幹がわずかに不安定であった。28日後の損傷部位は、脊髄断端の完全な再結合を示し、ネイティブな脊髄組織に「似た弾性」を示した。離断組織に瘢痕形成は観察されなかった。図21(A)〜(I)は、xpi-PANi-E-C群におけるSCI後28日間にわたる機能回復の程度を逐次的に示す。
組織学的、免疫組織化学および免疫蛍光分析
H&E染色切片は、病変スペクトルを示した。これらは、主に、白質内の最小限に崩壊した神経線維路から、神経/軸索変性/喪失の進行期を介して、完全な神経離断まで及んだ。最終的に、検体の数は、多核細胞の局所化塊および解放された細胞外マトリックスによる髄の完全な横方向の置き換えを用いる、試みた/流れた修復および再生変化によって特徴付けられた（「修復表現型」）。試料番号の例には、ベースライン群（NAD；図22、xpi-PANi-E-C-B（グレード2；図23）、コントロール群（グレード4；図24）およびxpi-PANi-E-C-A（グレード5；図25〜26）が含まれる。
H&E染色切片は、病変スペクトルを示した。これらは、主に、白質内の最小限に崩壊した神経線維路から、神経/軸索変性/喪失の進行期を介して、完全な神経離断まで及んだ。最終的に、検体の数は、多核細胞の局所化塊および解放された細胞外マトリックスによる髄の完全な横方向の置き換えを用いる、試みた/流れた修復および再生変化によって特徴付けられた（「修復表現型」）。試料番号の例には、ベースライン群（NAD；図22、xpi-PANi-E-C-B（グレード2；図23）、コントロール群（グレード4；図24）およびxpi-PANi-E-C-A（グレード5；図25〜26）が含まれる。
ED1染色切片はまた、様々な変化を示した。すべてのグレードの病変の例が、検体群全体に存在した。グリア/組織球/格子細胞集団の中でED1発現に加えて、散在する内皮細胞もまた、推定の再生神経芽細胞の多核凝集と同様に変動陽性の染色を示した。H&E染色病変グレードは、ED1陽性細胞浸潤のレベルの増加と相関していた。試料番号の例には、ベースライン検体（グレード0；図27）、xpi-PANi-E-C-B（グレード2；図28）、およびxpi-PANi-E-C-A（グレード4；図29）が含まれる。
iNOS染色切片は、脊髄の灰白質と白質の両方で、散在性細胞内（神経、グリア、組織球、神経芽細胞）および細胞外の酵素の生成/遊離を示した。染色強度は、存在する病変の重症度と相関する傾向があり、主に分布が均一であり、病変に隣接する脊髄の領域内でより強い染色の時折の病巣があった。試料番号の例には、ベースライン検体（グレード0；図30）、およびxpi-PANi-E-C-C（グレード2；図31）が含まれる。
カルパイン染色切片は可変性であった。影響を受けた検体の病変内領域と白質路の両方で、最小限に増加した（グレード1）染色がいくつかあった。病変内染色は、（推定）再生神経芽細胞内の細胞内（xpi-PANi-E-C-A、図32）、および少数の検体の白質路内（対照、図33）でも認められました。染色の観察が一貫性がなく、散発的であることを考慮すると、この知見の意義は不明であった。
GFAP染色蛍光切片は、スペクトル変化を示し、これは、H&E染色切片内で注目される構造的知見と相関した。H&E染色病変の重症度と、このタンパク質の有する構造的な網状構造の段階的な喪失との間には強い相関関係があった。修復表現型の変化は、GFAP陽性材料の光強度の均一で散在性の沈着による置き換えを伴う、繊維整列の完全な喪失を明らかにした。NF-200染色切片も同様に、H&E染色切片内で注目される知見と相関しており、病変が重症度に関して進行するにつれて、管状構造が徐々に喪失した。修復病変は、離断部位でタンパク質の完全な喪失を示し、これらの試料内の周辺領域はGFAP陽性タンパク質の分岐を示した（早期修復（「瘢痕」））。実施例には、ベースライン検体（グレード0；図34）、およびxpi-PANi-E-C-A（グレード4；図35および36）が含まれる。
図22は、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）検体ベースライン；L2を示す。5倍対物レンズ：NAD、形態的に平凡な脊髄検体を強調。
図23は、H&E検体-xpi-PANi-E-C-B；L2。を示す30倍対物レンズ：グレード2、多数の変性した神経線維を強調（矢印）。
図24は、H&E検体-コントロール；L3を示す。8倍対物レンズ：グレード4。多数の変性した神経線維を伴う神経の完全な横方向の離断、完全な構造的崩壊/喪失領域（星）および空胞化格子細胞（矢印）による置き換えに注目されたい。
図25は、H&E検体xpi-PANi-E-C-A；L3を示す。3倍対物レンズ：グレード5。神経の完全な横方向の離断、および（推定）再生神経芽細胞の塊（太い矢印）による置き換えに注目されたい。
図26は、H&E検体xpi-PANi-E-C-A；L3を示す。16倍対物レンズ：グレード5。多数の変性した神経線維を伴う神経の完全な横方向の離断、完全な構造的崩壊/喪失領域（星）、および好酸球性細胞外マトリックス（矢印）および多核（推定）再生神経芽細胞（太い矢印）による置き換えに注目されたい。
図27は、ED1検体ベースライン；L2を示す。40倍対物レンズ：グレード0。散在する陽性グリア細胞（矢印）の数が少ないことに注目されたい。
図28は、ED1検体xpi-PANi-E-C-B；L1を示す。40倍対物レンズ：グレード2。陽性グリア細胞（矢印）および内皮細胞（太い矢印）に注目されたい。
図29は、ED1検体xpi-PANi-E-C-A；L1を示す。40倍対物レンズ：グレード4。陽性多核細胞（星）の存在に加えて、無数の、しばしば変性した陽性グリア細胞（矢印）に注目されたい。これは多核格子細胞および/または原子神経芽細胞内における組織球マーカー発現の存在を示している。
図30は、誘導性一酸化窒素シンターゼ（iNOS）検体ベースライン；L2を示す。5倍対物レンズ：グレード0。白質（矢印）および灰白質（星）の細胞内および細胞外構成要素全体の染色のベースラインレベルに注目されたい。
図31は、iNOS検体xpi-PANi-E-C-C；L2を示す。5倍対物レンズ：グレード2。無傷および病変部外の白質（矢印）内における染色の強度増加に注目されたい。
図32は、カルシウム活性化非リソソーム中性プロテアーゼ（カルパイン）検体xpi-PANi-E-C-A；L1を示す。10倍対物レンズ：グレード1。多核巨細胞（矢印）内における細胞内染色（赤）の最小限の存在に注目されたい。
図33は、カルパイン検体コントロール；Lを示す。15倍対物レンズ：グレード1。損傷髄（矢印）内における細胞内/細胞外染色（赤）の最小限の存在に注目されたい。
図34は、グリア繊維状酸性タンパク質/ニューロフィラメント200（GFAP/NF-200）検体ベースライン；L1を示す。60倍対物レンズ：グレード0。散在性で細網状のGFAP陽性構造的ネットワーク（赤）および可変サイズの線形のNF-200-陽性管状ネットワーク（緑）に注目されたい。注-核が青色に染色される。
図35は、GFAP/NF-200検体xpi-PANi-E-C-A；L1を示す。60倍対物レンズ：グレード4。散在性で均一なGFAP陽性タンパク質沈着物（星）による置き換えを伴う細網状GFAP陽性構造的ネットワークの完全な喪失に注目されたい。残存する乏しいNF-200-陽性材料を、凝縮した球状沈着物（矢印）で表す。
図36は、GFAP/NF-200検体xpi-PANi-E-C-A；L1を示す。60倍対物レンズ：グレード4；周辺帯。修復病変（矢印）の周辺におけるGFAP陽性タンパク質の周辺の丸みと肥厚に注目されたい。
結論
コントロールおよび処置検体は、様々な変化を示した。これらは、H&E染色によって最もよく示されており、病変を徐々に離断した/変性の表現および修復表現型に特徴付けた。ED1染色検体は、組織球/ミクログリア系統の細胞の病変への進行的な流入を示し、重症度が進行するにつれて数が増加した。損傷は、カルパインの発現/放出の増加を伴う、iNOS発現の進行性上方制御を伴った。病変の重症度が進行するにつれて、GFAPおよびNF-200の構造的完全性は徐々に喪失した。修復変化には、iNOSの著しい上方制御、ED1陽性慢性炎症細胞の著しい流入、推定の再生神経芽細胞に特徴的な多核細胞の出現、GFAPとNF-200のタンパク質/構造的完全性のほぼ完全な喪失が伴った。
コントロールおよび処置検体は、様々な変化を示した。これらは、H&E染色によって最もよく示されており、病変を徐々に離断した/変性の表現および修復表現型に特徴付けた。ED1染色検体は、組織球/ミクログリア系統の細胞の病変への進行的な流入を示し、重症度が進行するにつれて数が増加した。損傷は、カルパインの発現/放出の増加を伴う、iNOS発現の進行性上方制御を伴った。病変の重症度が進行するにつれて、GFAPおよびNF-200の構造的完全性は徐々に喪失した。修復変化には、iNOSの著しい上方制御、ED1陽性慢性炎症細胞の著しい流入、推定の再生神経芽細胞に特徴的な多核細胞の出現、GFAPとNF-200のタンパク質/構造的完全性のほぼ完全な喪失が伴った。
参考文献
Ray M, Pal K, Anis A, Banthia AK 2010. Development and characterization of chitosan-based polymeric hydrogel membranes. Des Monomers Polym 13:193-206.
Yang L, Zhang L, Webster TJ 2011. Nanobiomaterials:state of the art and future trends. Adv Eng Mater 13(6):B197-217.
Zhang S 2003. Fabrication of novel biomaterials through molecular self-assembly. Nat Biotechnol 21(10):1171-8.
Ray M, Pal K, Anis A, Banthia AK 2010. Development and characterization of chitosan-based polymeric hydrogel membranes. Des Monomers Polym 13:193-206.
Yang L, Zhang L, Webster TJ 2011. Nanobiomaterials:state of the art and future trends. Adv Eng Mater 13(6):B197-217.
Zhang S 2003. Fabrication of novel biomaterials through molecular self-assembly. Nat Biotechnol 21(10):1171-8.
Claims (15)
- ポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（PANi-E-C）を一緒に形成する、ポリアクリロニトリル（PANi）、エラスチン（E）およびコラーゲン（C）を含む、医薬組成物。
- ポリアクリロニトリル（PANi）を架橋剤によって架橋して、架橋した多孔質で半相互侵入性（相互侵入性）のポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（xpi-PANi-E-C）を形成し、架橋ポリアクリロニトリル（PANi）が、エラスチン（E）およびコラーゲン（C）と結合して、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の二次構造の再配向を促進し；
xpi-PANi-E-C内におけるタンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の二次構造の再配向が、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の濃度依存性二次構造をもたらし、すなわち、ランダムコイル＞αヘリックス＞βシート＞βターンの濃度であり；
エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の両方の再配向が、ヒトまたは動物の細胞外マトリックス（ECM）において天然で見られるそれらのネイティブな形態に近いかまたはネイティブな形態である、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の再配向された二次構造を提供し、ヒトまたは動物の脊髄組織を模倣する、請求項1に記載の医薬組成物。 - xpi-PANi-E-Cが、それにスポンジ様特性を与えるチャネルおよび/またはトンネルのネットワークをさらに含み、チャネルおよび/またはトンネルが、その内部表面に沿って突起を含み、
その使用に際し、医薬組成物が、ヒトまたは動物の体の脊髄に、その近くに、それに隣接してまたはそれに接続してヒトまたは動物の体内へ埋め込まれるとき、チャネルおよび/またはトンネルが、神経組織および/または軸索の成長および/または回復のために経路を提供し、突起が、神経組織の成長および/または回復を促進するために、係留手段を提供する、請求項2に記載の医薬組成物。 - 架橋剤が、メチレンビスアクリルアミド（MBAAm）である、請求項3に記載の医薬組成物。
- 脊髄損傷の処置における使用のための医薬組成物であって、該医薬組成物が、ヒトまたは動物の体の脊髄に、その近くに、それに隣接してまたはそれに接続してヒトまたは動物の体内へ埋め込むためのものである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 脊髄損傷の処置における使用のためのインプラントであって、該インプラントが、ヒトまたは動物の体の脊髄に、その近くに、それに隣接してまたはそれに接続してヒトまたは動物の体内へ埋め込むためのものであり、担体および/または添加剤と一緒に請求項1〜4のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、インプラント。
- 請求項3に記載の医薬組成物の製造方法であって、下記工程：
(i)エラスチン（E）およびコラーゲン（C）を酸性水性媒体に溶解させて、第1溶液を形成する工程；
(ii)アクリロニトリルを第1溶液に加え、混合して、第2溶液を形成し、均一になるまで第2溶液を撹拌/混合してもよい工程；
(iii)開始剤、好ましくは過硫酸アンモニウム（APS）を均一な第2溶液に加える工程であって、
開始剤が、アクリロニトリルのフリーラジカル重合を開始して、相互侵入性のポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（iPANi-E-C）を形成する工程；および
(iv)架橋剤、好ましくはメチレンビスアクリルアミド（MBAAm）を加える工程であって、
架橋剤が、ポリアクリロニトリル（PANi）を架橋して、架橋した多孔質で相互侵入性のポリアクリロニトリル（PANi）とエラスチン（E）とコラーゲン（C）のポリマーネットワーク（xpi-PANi-E-C）を形成する工程
を含む方法。 - 工程(i)〜(iv)が、工程(i)で始まり工程(iv)で終わる順番で行われ、その順番内で、工程(iii)および(iv)が、同時に行われる、請求項7に記載の方法。
- 方法が、工程(v)：促進剤、好ましくはテトラメチルエチレンジアミン（TEMED）を加える工程をさらに含み、工程(v)が、工程(iv)の後に行われる、請求項7および8のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(i)の酸性水性媒体が、水性酢酸媒体であり、工程(i)が、第1溶液からのエラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）の沈殿を防ぐために、過剰な氷酢酸の添加を含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 下記工程：
(vi)xpi-PANi-E-Cを鋳型、好ましくはポリエチレン鋳型に注ぎ、それを固化させて（さらに重合が生じて）、多孔質xpi-PANi-E-Cスポンジを形成し、好ましくは、xpi-PANi-E-Cを、一晩、さらに好ましくは室温条件下で、固化させる工程；
(vii)多孔質xpi-PANi-E-Cスポンジを、好ましくは再蒸留水で洗浄する工程；
(viii)洗浄したxpi-PANi-E-Cスポンジを-80℃〜-60℃で、好ましくは8〜12時間凍結する工程
をさらに含む、請求項7〜10のいずれか一項に記載の方法。 - 工程(ix)：xpi-PANi-E-Cスポンジを、好ましくは25mmtorrにて24時間凍結乾燥する工程をさらに含む、請求項7〜11のいずれか一項に記載の方法。
- PANi-Eおよび/またはPANi-Cおよび/またはPANi-E-Cのポリマーネットワークをそれぞれ一緒に形成する、ポリアクリロニトリル（PANi）および/またはエラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）を含む、医薬組成物。
- 医薬組成物が、架橋剤をさらに含み、ポリアクリロニトリル（PANi）を架橋して、その結果、PANi-Eおよび/またはPANi-Cおよび/またはPANi-E-Cが、架橋した多孔質で半相互侵入性（相互侵入性）のポリマーネットワーク（xpi）を形成し、架橋ポリアクリロニトリル（PANi）が、エラスチン（E）および/またはコラーゲン（C）と結合して、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の二次構造の再配向を促進し；
PANi-E内におけるタンパク質エラスチン（E）の二次構造の再配向が、タンパク質エラスチン（E）の濃度依存性二次構造をもたらし、すなわち、ランダムコイル＞βシート＞αヘリックス＞βターンの濃度であり；
PANi-C内におけるタンパク質コラーゲン（C）の二次構造の再配向が、タンパク質コラーゲン（C）の濃度依存性二次構造をもたらし、すなわち、αヘリックス＞ランダムコイル＞βターン＞βシートの濃度であり；
PANi-E-C内におけるタンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の二次構造の再配向が、タンパク質エラスチン（E）およびコラーゲン（C）の濃度依存性二次構造をもたらし、すなわち、ランダムコイル＞αヘリックス＞βシート＞βターンの濃度である、請求項13に記載の医薬組成物。 - 医薬組成物が、それにスポンジ様特性を与えるチャネルおよび/またはトンネルのネットワークをさらに含み、チャネルおよび/またはトンネルが、その内部表面に沿って突起を含み、その使用に際し、医薬組成物が、ヒトまたは動物の体の脊髄に、その近くに、それに隣接してまたはそれに接続してヒトまたは動物の体内へ埋め込まれるとき、チャネルおよび/またはトンネルが、神経組織および/または軸索の成長および/または回復のために経路を提供し、突起が、神経組織の成長および/または回復を促進するために、係留手段を提供する、請求項14に記載の医薬組成物。
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009525827A (ja) * | 2006-02-10 | 2009-07-16 | レプリケーション メディカル インコーポレーテッド | 脊髄核インプラント用の半径方向に延在する支持部材およびその用法 |
| US20170049936A1 (en) * | 2015-07-10 | 2017-02-23 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Implants having a drug load of an oxysterol and methods of use |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6368859B1 (en) * | 1999-12-29 | 2002-04-09 | Children's Medical Center Corporation | Methods and compositions for producing a fascial sling |
| US20020026244A1 (en) * | 2000-08-30 | 2002-02-28 | Trieu Hai H. | Intervertebral disc nucleus implants and methods |
| US8945223B2 (en) * | 2004-03-12 | 2015-02-03 | Warsaw Orthopedic, Inc. | In-situ formable nucleus pulposus implant with water absorption and swelling capability |
| US20060089719A1 (en) * | 2004-10-21 | 2006-04-27 | Trieu Hai H | In situ formation of intervertebral disc implants |
| US7857856B2 (en) * | 2005-03-15 | 2010-12-28 | Warsaw Ortho Pedic, Inc. | Composite spinal nucleus implant with water absorption and swelling capabilities |
| US7182783B2 (en) * | 2005-04-25 | 2007-02-27 | Sdgi Holdings, Inc. | Selectively expandable composite structures for spinal arthroplasty |
| US9011754B2 (en) * | 2006-12-05 | 2015-04-21 | Nanyang Technological University | Manufacturing three-dimensional scaffolds using electrospinning at low temperatures |
| US20100222881A1 (en) * | 2008-10-03 | 2010-09-02 | Ann Prewett | Vessel protection device |
| WO2011075516A2 (en) * | 2009-12-18 | 2011-06-23 | President And Fellows Of Harvard College | Active scaffolds for on-demand drug and cell delivery |
| US20130217829A1 (en) * | 2010-08-27 | 2013-08-22 | David Myung | "hydrophobic and hydrophilic interpenetrating polymer networks derived from hydrophobic polymers and methods of preparing the same" |
| US9433698B2 (en) * | 2010-08-30 | 2016-09-06 | President And Fellows Of Harvard College | High strength chitin composite material and method of making |
| KR101360942B1 (ko) * | 2012-10-08 | 2014-02-12 | 조선대학교산학협력단 | 세포가 담지된 생체적합성 고분자-천연생체적합성 재료 하이브리드 구조체 및 그 제조방법 |
| CN103285424B (zh) * | 2013-05-27 | 2016-06-22 | 东华大学 | 一种三维纤维基气凝胶组织工程支架及其制备方法 |
| AU2015314685B2 (en) * | 2014-09-12 | 2021-02-25 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Neural microphysiological systems and methods of using the same |
| EP3229826A4 (en) * | 2014-12-09 | 2018-08-15 | The Regents of The University of California | Methods of promoting tissue healing and repair |
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-
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009525827A (ja) * | 2006-02-10 | 2009-07-16 | レプリケーション メディカル インコーポレーテッド | 脊髄核インプラント用の半径方向に延在する支持部材およびその用法 |
| US20170049936A1 (en) * | 2015-07-10 | 2017-02-23 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Implants having a drug load of an oxysterol and methods of use |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BIOMATERIALS, vol. 24, JPN6022041277, 2003, pages 4001 - 4009, ISSN: 0004888338 * |
| J MATER SCI: MATER MED, vol. 20, JPN6022041274, 2009, pages 173 - 179, ISSN: 0004888337 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7441965B2 (ja) | 2020-07-07 | 2024-03-01 | サクラ ファインテック ユー．エス．エー．， インコーポレイテッド | 生体試料内への試薬の浸透を評価するためのｉｒ分光法の使用 |
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