CN106995477B - 一种模拟移动床技术制备分离虫草素的方法 - Google Patents
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Abstract
一种模拟移动床技术制备分离虫草素的方法，其特征在于：将烘干的富含虫草素的北冬虫夏草粉碎、经超声波水提取，离心取上清液、大孔树脂吸附，除蛋白质、洗脱，浓缩、除多糖，再浓缩得到虫草素粗提取液，虫草素粗提取液经过分离纯化，最后浓缩得到高纯度的虫草素产品；有益效果：采用模拟移动床色谱技术制备分离虫草素，选用合适的填料和相应的流动相，可以实现虫草粗提液中虫草素与其他杂质的分离，产品虫草素的纯度和收率都可以达到99%以上，可以实现对虫草素分离过程的合理设计和优化，应用非线性优化等方法对建立的模型操作条件进行优化，可以最大限度的获得虫草素产品的生产能力。
Description
技术领域
本发明属于化工色谱分离技术领域，尤其涉及一种利用模拟移动床技术制备分离高纯度虫草素的方法。
背景技术
虫草素又名3’-脱氧腺苷，是一种核苷类抗菌素，1951年首次从蛹虫草中分离得到，具有光谱抗菌活性，具有抗菌、消炎、抗肿瘤、抗病毒、调节人体免疫力等作用，可用于白血病的治疗，目前美国将虫草素作为治疗白血病药物的研究已经进入III期临床，近20年来，在临床医疗领域取得了开创性的成果；随着科学技术的发展，虫草素在临床上的应用将会得到进一步的发掘，因此其具有重要的开发和应用价值；然而虫草素的大量提取分离得到纯品存在困难，导致国际市场上虫草素的价格非常昂贵，高达2000美元/克以上，研究者们通过北冬虫夏草发酵生产虫草素获得了富含虫草素的发酵液，高效率、高纯度、高收率的分离提取成为日益关注的问题。
目前常用的虫草素分离纯化方法有离子交换树脂吸附法、硅胶柱层析以及高速逆流色谱技术等，上述方法的处理能力、收率都不尽人意，难以进行工业化生产，近年来大孔树脂吸附分离虫草素得到研究者的关注，大孔树脂吸附容量大、选择性好、吸附速率快、解吸条件温和等优点，适合用于从发酵液或提取液中富集得到虫草素粗提液。
模拟移动床是一种连续制备色谱分离技术，其高效的处理能力使其区别于一般的色谱分离技术，工业上应用模拟移动床技术分离功能性糖、手性物质、生物活性药物等工艺日趋成熟，通过上述大孔树脂富集得到含虫草素的粗提液，应用模拟移动床技术进行精制高纯度虫草素，可以实现虫草素的高效率、高纯度、高收率、低溶剂消耗、无有毒溶剂引入等优势；CN102321135A公开了一种利用高速逆流色谱分离纯化虫草素的方法，采用两相分配系数K值在0.5～1.0范围内的溶剂系统，可以得到纯度大于98%的虫草素产品；CN102977172A公开了一种提取虫草素的方法，采用反相ODS填料柱富集虫草素，在通过HPLC纯化虫草素的方法；CN104926904A公开了一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，经硅胶层析柱处理后浓缩洗脱液，最后结晶得到高纯度的虫草素。
上述方法都是间歇操作过程，处理能力较低，高速逆流色谱虽然处理量已经可以达到克级，但是仍然不能满足市场需求，而且溶剂消耗量大。
发明内容
本发明的目的是提供一种以富含虫草素的北冬虫夏草为原料，通过NKA-II大孔树脂富集虫草素，除杂后得到虫草素粗提液，以反相C18填料为固定相，以乙醇水溶液为流动相，利用模拟移动床系统从上述粗提掖中得到高纯度虫草素的方法。
为实现上述目的本发明采用的技术方案如下：
一种模拟移动床技术制备分离虫草素的方法，其特征在于：将烘干的富含虫草素的北冬虫夏草粉碎、经超声波水提取，离心取上清液、大孔树脂吸附，除蛋白质、洗脱，浓缩、除多糖，再浓缩得到虫草素粗提取液，虫草素粗提取液经过分离纯化，最后浓缩得到高纯度的虫草素产品；具体包括以下步骤：
（1）、将烘干的富含虫草素的北冬虫夏草粉碎、经超声波水提取，离心取上清液、经大孔树脂吸附、除杂后的虫草素粗提液溶解在流动相中配成进料液，浓度0－1g/L；
（2）、用两步模拟移动床分离，在进行第一步模拟移动床分离时，将进料液和乙醇水溶液洗脱液连续通入模拟移动床色谱分离系统中，从萃取液口连续收集虫草素与N6-(2羟乙基)腺苷溶液，从萃余液口连续收集腺苷及其他杂质；
（3）、在进行第二步模拟移动床分离时，将上一步得到的虫草素与N6-(2羟乙基)腺苷溶液作为进料液与乙醇水溶液洗脱液连续通入模拟移动床色谱分离系统中，从萃取液口连续收集高纯度虫草素溶液，从萃余液口连续收集高纯度N6-(2羟乙基)腺苷；
（4）、经减压浓缩，真空干燥后得到虫草素产品，经HPLC检测，纯度大于99%。
上述方案中，所述超声波水提取：料液比1:5～1:20，超声功率300～450W，超声时间1～2h，温度25℃，所得溶液分装离心取上清液，离心转速大于4000r/min，离心时间5～10min；所述大孔树脂吸附步骤为：将分装入锥形瓶中的离心上清液加入大孔树脂，放入摇床混匀，步骤中所用的树脂为NKA-II大孔树脂，树脂用量为1:10体积比，吸附时间6-12h，温度20-35℃，优选20℃；所述除蛋白质步骤为：大孔树脂吸附饱和后，倾倒去上清液，清水洗涤树脂，然后NaOH溶液浸泡树脂，放入摇床中震荡，倒去溶液后再清水洗涤，步骤中NaOH溶液批pH为9-11，优选pH=10，摇床震荡时间大于1h；所述洗脱浓缩步骤为：加入三倍树脂体积的洗脱液，摇床震荡，减压浓缩洗脱液，步骤中洗脱液为35%-75%乙醇水溶液，优选50%乙醇水溶液，脱附时间6h以上；所述除多糖步骤为：将上一步得到的洗脱液减压旋蒸浓缩，浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，于4℃冰箱中静置过夜，离心取上清液；所述的分离纯化步骤为：粗提取液通过两步模拟移动床分离，在萃取液口收集到高纯度的虫草素产品；所述的两步模拟移动床分离步骤为：第一步收集虫草素与N6-(2羟乙基)腺苷，除去腺苷及其他保留能力弱的杂质，在萃取液口收集虫草素与N6-(2羟乙基)腺苷，基本无其他杂质并保持虫草素与N6-(2羟乙基)腺苷有较高收率；第二步以完全分离上一步中得到的虫草素与N6-(2羟乙基)腺苷，在萃取液口连续得到虫草素产品，在萃余液口得到N6-(2羟乙基)腺苷产品；所述的浓缩步骤为：将分离纯化后的虫草素溶液与N6-(2羟乙基)腺苷溶液通过旋蒸蒸发浓缩。
上述方案中，所述北冬虫夏草富含腺苷、虫草素、N6-(2羟乙基)腺苷等腺苷类物质，腺苷及虫草素含量高于1.5mg/g，同时富含虫草多糖等其他活性成分。
上述方案中，所述的吸附除杂所用到的大孔树脂为AB-8、NKA、NKA-9、NKA-II，优选NKA-II。
上述方案中，所述洗脱步骤的洗脱液为35%-75%乙醇水溶液。
上述方案中，所述的浓缩操作为减压旋转蒸发，蒸发温度为35－55℃。
上述方案中，所述的模拟移动床分离系统的洗脱剂为常见极性有机溶剂，包括乙醇、甲醇、正丙醇、异丙醇水溶液，优选乙醇水溶液。
上述方案中，所述的模拟移动床分离系统的吸附剂为反相C8或C18填料，优选反相C18填料。
上述方案中，所述的模拟移动床分离系统的第一步分离目的是除去大部分保留能力弱的杂质，保证非常高的虫草素收率；第二步分离目的是获得高纯度且高收率的虫草素产品。
上述方案中，所述的模拟移动床为4－12根色谱柱首尾顺序连接，可根据实际情况划分为3-4区带，每个区带至少包含一根色谱柱，填充吸附剂，通过3-4台恒流泵控制进出流量，计算机控制4个电磁阀切换时间，第一步SMB操作时，洗脱剂流量为2.0ml/min，萃取液流量为0.6－0.9ml/min，进料流量为0－0.3ml/min，切换时间为21－23min；第二步SMB操作时，洗脱剂流量为2.0ml/min，萃取液流量为0.35－0.5ml/min，进料流量为0－0.3ml/min，切换时间为21－23min，所述的模拟移动床分离系统操作温度为0－50℃。
产品分析：
流动相：乙醇：水=10：90(V:V)
流速：1.0mL/min
泵：伊力特P-230恒流泵
色谱柱：依利特SinoChrom ODS-BP(10um,4.6*150mm)
检测器：伊力特UV230II紫外-可见检测器
柱温：25℃
检测波长：260nm
本发明有益效果：采用模拟移动床色谱技术制备分离虫草素，选用合适的填料和相应的流动相，可以实现虫草粗提液中虫草素与其他杂质的分离，产品虫草素的纯度和收率都可以达到99%以上，由于模拟移动床的连续进样的特点，处理量比一般的分批色谱要高的多，通过应用非线性数学、色谱理论对该分离过程建立准确的数学模型，可以实现对虫草素分离过程的合理设计和优化，应用非线性优化等方法对建立的模型操作条件进行优化，可以最大限度的获得虫草素产品的生产能力。
具体实施方式
分离实施例：
将300g北冬虫夏草粉末加入3L蒸馏水，超声提取，超声功率450W，温度45℃，时间1h，静置1h后收集提取液离心，离心转速8000r/min，时间10min，取上清液，收集得到大约3L的上清液，分装入10个锥形瓶中，每个锥形瓶加入30g处理好的NKA-II大孔树脂，于20℃摇床震荡过夜，倾倒上清液残余，收集吸附后的NKA-II树脂，用清水洗涤树脂表面的残余液，之后加入300ml pH11的N溶液，摇床震荡1h去除可溶性蛋白，最后再用清水洗涤树脂，加入300ml 50%乙醇水溶液脱附，35℃摇床震荡6h，收集脱附液进行旋蒸浓缩成粘稠状，往浓缩液中缓慢加入3倍浓缩液体积的无水乙醇，于4℃冰箱中静置过夜，进行多糖沉淀，取上清液离心后旋蒸去除乙醇，得到虫草素粗提液，备用。
模拟移动床设置为三区带4柱串联开环结构，区带内柱子分配情况为1-2-2，五根色谱柱为不锈钢柱（10mm*150mm），填料为反相C18填料（75um，120A），装填好后用纯甲醇（HPLC）冲洗4h，三台恒流泵控制三个进出料口的流量，四个电磁阀控制端口同时切换，切换时间及策略由台式电脑控制，模拟移动床系统由恒温箱控温为25℃，模拟移动床进行第一步分离时流动相确定为10%乙醇水溶液(v:v)，通过建模及优化计算后设定其操作条件为：洗脱流量2.0ml/min，萃取液流量0.71ml/min，进料流量0.20ml/min，萃余液流量1.49ml/min，切换时间22.1min，样品质量浓度腺苷为0.21g/L，虫草素为0.24g/L，N6-(2羟乙基)腺苷为0.15g/L，萃取液口获得虫草素与N6-(2羟乙基)腺苷产品，待系统运行10周期达到稳定后，收集一个完整周期时间内的萃取液口和萃余液口产品溶液。
经HPLC检测，萃取液口虫草素含量57.1%，N6-(2羟乙基)腺苷含量42.1%，二者合计总含量为99.2%，腺苷含量0.8%，虫草素与N6-(2羟乙基)腺苷各自收率为99.5%，将萃取液产品低温旋蒸浓缩，作为第二步模拟移动床分离时进料液，模拟移动床进行第二步分离时流动相确定为10%乙醇水溶液(v:v)，通过建模及优化计算后设定其操作条件为：洗脱流量2.0ml/min，萃取液流量0.45ml/min，进料流量0.20ml/min，萃余液流量1.75ml/min，切换时间21.9min，样品质量浓度虫草素为0.24g/L，N6-(2羟乙基)腺苷为0.17g/L，萃取液口获得虫草素产品，萃余液口获得N6-(2羟乙基)腺苷产品。待系统运行10周期达到稳定后，收集一个完整周期时间内的萃取液口和萃余液口产品溶液，经HPLC检测，萃取液口虫草素纯度达到99.9%，收率为99.5%，萃余液口N6-(2羟乙基)腺苷纯度达到98.0%，收率为99.9%，两步SMB处理后，虫草素的总收率为99.0%，N6-(2羟乙基)腺苷收率为99.5%。
Claims (6)
1.一种模拟移动床技术制备分离虫草素的方法，其特征在于：将烘干的富含虫草素的北冬虫夏草粉碎、经超声波水提取，离心取上清液、大孔树脂吸附，除蛋白质、洗脱，浓缩、除多糖，再浓缩得到虫草素粗提取液，虫草素粗提取液经过分离纯化，最后浓缩得到虫草素产品；具体包括以下步骤：
（1）、将烘干的富含虫草素的北冬虫夏草粉碎、经超声波水提取，离心取上清液、经大孔树脂吸附、除杂后的虫草素粗提液溶解在流动相中配成进料液，浓度0－1g/L；
（2）、用两步模拟移动床分离，在进行第一步模拟移动床分离时，将进料液和洗脱剂乙醇水溶液连续通入模拟移动床色谱分离系统中，从萃取液口连续收集虫草素与N6-(2-羟乙基)腺苷溶液，从萃余液口连续收集腺苷及其他杂质，模拟移动床为4－12根色谱柱首尾顺序连接，划分为3-4区带，每个区带至少包含一根C18色谱柱，通过3-4台恒流泵控制进出流量，计算机控制4个电磁阀切换时间,洗脱剂流量为2.0ml/min，萃取液流量为0.6－0.9ml/min，进料流量为0－0.3ml/min，切换时间为21－23min；
（3）、在进行第二步模拟移动床分离时，采用与第一步相同的模拟移动床结构、相同的C18固定相和洗脱剂乙醇水溶液，将上一步得到的虫草素与N6-(2-羟乙基)腺苷溶液作为进料液，控制操作条件为：洗脱剂流量为2.0ml/min，萃取液流量为0.35－0.5ml/min，进料流量为0－0.3ml/min，切换时间为21－23min,从萃取液口连续收集虫草素溶液，从萃余液口连续收集N6-(2-羟乙基)腺苷；
（4）、经减压浓缩，真空干燥后得到虫草素产品，经HPLC检测，纯度大于99%。
2.根据权利要求1所述的一种模拟移动床技术制备分离虫草素的方法，其特征在于：所述超声波水提取：料液比1:5～1:20，超声功率300～450W，超声时间1～2h，温度25℃，所得溶液分装离心取上清液，离心转速大于4000r/min，离心时间5～10min；所述大孔树脂吸附步骤为：将分装入锥形瓶中的离心上清液加入大孔树脂，放入摇床混匀，步骤中所用的树脂为NKA-II大孔树脂，树脂用量为1:10体积比，吸附时间6-12h，温度20-35℃；所述除蛋白质步骤为：大孔树脂吸附饱和后，倾倒去上清液，清水洗涤树脂，然后NaOH溶液浸泡树脂，放入摇床中震荡，倒去溶液后再清水洗涤，步骤中NaOH溶液pH为9-11，摇床震荡时间大于1h；所述洗脱浓缩步骤为：加入三倍树脂体积的洗脱液，摇床震荡，减压浓缩洗脱液，步骤中洗脱液为35%-75%乙醇水溶液，脱附时间6h以上；所述除多糖步骤为：将上一步得到的洗脱液减压旋蒸浓缩，浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，于4℃冰箱中静置过夜，离心取上清液；所述的分离纯化步骤为：粗提取液通过两步模拟移动床分离，在萃取液口收集到虫草素产品；所述的两步模拟移动床分离步骤为：第一步收集虫草素与N6-(2-羟乙基)腺苷，除去腺苷及其他保留能力弱的杂质，在萃取液口收集虫草素与N6-(2-羟乙基)腺苷，基本无其他杂质并保持虫草素与N6-(2-羟乙基)腺苷有较高收率；第二步以完全分离上一步中得到的虫草素与N6-(2-羟乙基)腺苷，在萃取液口连续得到虫草素产品，在萃余液口得到N6-(2-羟乙基)腺苷产品；所述的浓缩步骤为：将分离纯化后的虫草素溶液与N6-(2-羟乙基)腺苷溶液通过旋蒸蒸发浓缩。
3.根据权利要求1所述的一种模拟移动床技术制备分离虫草素的方法，其特征在于：所述洗脱步骤的洗脱液为35%-75%乙醇水溶液。
4.根据权利要求1所述的一种模拟移动床技术制备分离虫草素的方法，其特征在于：所述的浓缩操作为减压旋转蒸发，蒸发温度为35－55℃。
5.根据权利要求1所述的一种模拟移动床技术制备分离虫草素的方法，其特征在于：所述的模拟移动床分离系统的吸附剂为反相C18填料。
6.根据权利要求1所述的一种模拟移动床技术制备分离虫草素的方法，其特征在于：所述的模拟移动床分离系统操作温度为0－50℃。
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