CN106990188B - 一种绿脓杆菌外毒素a的高效液相色谱检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种绿脓杆菌外毒素A的高效液相色谱检测方法。本发明的HPLC分析方法，提高了绿脓杆菌外毒素A样品分析的准确性和快速性。

Description

一种绿脓杆菌外毒素A的高效液相色谱检测方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种绿脓杆菌外毒素A的HPLC分析检测方法。
背景技术
绿脓杆菌，又称铜绿假单胞菌(学名Pseudomonasaeruginos′)，是一种革兰氏阴性菌、好氧、呈长棒形的细菌，只有单向的运动性。它是一种机会性感染细菌，且对植物亦是机会性感染的。与其他假单胞菌属的细菌一样，绿脓杆菌分泌多种的色素，包括绿脓菌素(呈青色)、萤光素(呈荧光黄色)及绿脓菌红素(呈绯红色)。假单胞菌属培养基P就是用作增加绿脓菌素及绿脓菌红素的生产，而假单胞菌属培养基F就是加强萤光素的生成。
绿脓杆菌是1882年首先由Gersard氏从伤口脓液分离得到。该菌在自然界广泛存在于水、土壤、空气以及动物的肠道和皮肤中，为一种条件性致病菌，在特定的情况下能引起人及动物感染发病，如规模化养狐场母狐的流产、羊群的化脓性肺炎、雏鸡的败血症以及绿脓杆菌感染鹧鸪、鸽和人等。随着养殖业规模的不断扩大，由绿脓杆菌引起的疫病也呈现上升的趋势。绿脓杆菌对禽属条件性致病性菌，常从正常禽的肠道、呼吸道和卵中分离出来，能引起各种年龄的禽发病，致死率在1％～90％以上，应激是幼禽暴发绿脓杆菌病的主要原因。该菌给规模化养殖场和人类的健康造成了很大威胁。在人体上，绿脓杆菌能引起术后和伤口的感染，还能引起人的关节炎和角膜炎等疾病，免疫力下降是重要的发病诱因。绿脓杆菌的毒素残留还能引起食物中毒。
1972年，P.v.Liu在临床分离株的培养液中，发现了导致绿脓杆菌感染的毒性因子——外毒素A，并指出绿脓杆菌外毒素A(PEA)对皮肤黏膜有坏死作用，进入血液中能诱发败血症。在脏器组织细胞中，绿脓杆菌外毒素A与白喉毒素类似，具有阻碍蛋白质合成的作用；对小鼠和大鼠感受性高，具有致死作用。对培养细胞有“细胞崩坏毒性”。绿脓杆菌外毒素A的毒性最强，能够对机体组织及器官造成极大危害，甚至能够破坏角膜基质细胞。为了探讨有效控制和治疗绿脓杆菌外毒素A相关疾病的方法，对绿脓杆菌外毒素A的生物学特性及其致病性的研究也越来越多。
Khan AA等人(Detection of Pseudomonas aeruginosa from clinical andenvironmental samples by amplification of the exotoxin a gene usingPCR.Applied and Environmental Microbiology.1994)公开了一种是用PCR对绿脓杆菌进行检测的方法。陈晨等人(貂源绿脓杆菌的分离鉴定及其致病性，兽类学报，2015)公开了一种貂源绿脓杆菌的分离鉴定的方法。CN101392289B公开了一种环介导等温扩增方法检测绿脓杆菌的试剂盒及方法。CN101429539B公开了一种实时荧光定量PCR检测绿脓杆菌的试剂盒。艾启俊等人(PCR技术检测编码绿脓杆菌外毒素A基因，中国食品学报2006/06)公开了一种检测绿脓杆菌外毒素A基因的方法。虽然现有技术公开了绿脓杆菌或绿脓杆菌外毒素A检测方法，但还存在分辩率低、速度慢、重复性差等问题。特别是分析多个样品时，相互之间还会出现明显的干扰，影响分析的准确性。
发明内容
发明人经过广泛而深入的研究，通过大量的试验、摸索得到了一种绿脓杆菌外毒素A的HPLC检测方法。发明人发现了有效分离、检测绿脓杆菌外毒素A的流动相组成以及流动相的体积比，进一步地，发明人还发现在一定的时间内，采用梯度洗脱方式，使流动相的体积比逐步变化，可以得到更佳的分离、检测效果。
本发明旨在提供一种绿脓杆菌外毒素A的高效液相检测方法。
在本发明中，提供了一种绿脓杆菌外毒素A的检测方法，所述的检测方法为高效液相色谱，其流动相为甲醇、乙腈和水，甲醇、乙腈和水的起始体积比为：(5-15)：(5-20)：(65-90)，甲醇、乙腈和水的最终体积为：(25-50)：(20-50)：(0-55)。
在本发明的一个实施例中，公开了一种利用HPLC法检测绿脓杆菌外毒素A的方法，步骤包括：
(1)取绿脓杆菌发酵液和甲醇进行混合浸泡，再加入NaOH溶液，置于摇床上振摇提取，离心得到含有绿脓杆菌外毒素A的上清液，取上清过滤，获得样品溶液；
(2)使用HPLC法测定，流动相为甲醇、乙腈和水；起始流动相中甲醇、乙腈和水的体积比为10：15：75，洗脱3-5分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：35：35，洗脱10-15分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：40：30，洗脱5-10分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为35：45：20，洗脱3-5分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比调整为10：15：75，洗脱3-5分钟；
其中，所述的分离色谱柱选自TC-C18色谱柱、HypersilBDS、HypersilODS、LiChrosorb、SHIMADZUVP-ODS、Inertsil ODS-SP、Extend-C18、ZORBAXODS、ZORBAXSB-C18、LiChrosorbC18、HypersilODS中的一种；
在一个优选实施例中，反应条件为：柱温为30-40℃；流速为0.3-1.5ml/min；波长为200-220nm；进样量10μl；柱长为150mm，柱内径为5μm。
在一个优选实施例中，使用的分离色谱柱为TC-C18色谱柱。
在一个优选实施例中，使用的色谱条件为柱温为35℃。
在一个优选实施例中，使用的流动相的流速为1ml/min。
在一个优选实施例中，使用的波长为210nm。
在一个优选实施例中，使用的步骤(2)为：使用HPLC法测定，流动相为甲醇、乙腈和水；起始流动相中甲醇、乙腈和水的体积比为10：15：75，洗脱5分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：35：35，洗脱15分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：40：30，洗脱10分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为35：45：20，洗脱5分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比调整为10：15：75，洗脱5分钟。
在另一个优选实施例中，使用的步骤(2)为：使用HPLC法测定，流动相为甲醇、乙腈和水；起始流动相中甲醇、乙腈和水的体积比为10：15：75，洗脱3分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：35：35，洗脱10分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：40：30，洗脱5分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为35：45：20，洗脱3分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比调整为10：15：75，洗脱3分钟。
在一个优选实施例中，使用的HPLC的流动相中还含有有机酸。
在一个优选实施例中，使用的有机酸的含量为0.05-0.15％(v/v)。
在一个优选实施例中，使用的有机酸为甲酸、乙酸或丁酸中的一种或多种。
据此，本发明提供了一种分辩率高、速度快、重复性好的检测绿脓杆菌外毒素A的HPLC方法。
本发明的有益效果在于：
(1)完成检测仅需要20-40分钟，缩短检测时间。
(2)缩短出峰时间。
(3)分离效果好。
(4)节省人力成本。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司购得：
高效液相色谱仪(美国贝克曼公司)；
KQ-300BD 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；
TC-C18 色谱柱(美国安捷伦公司)
UV-2550 紫外分光光度计(日本岛津公司)；
MRS 培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司)；
色谱甲醇、乙腈(美国Dikma公司)。
实施例1
取8g绿脓杆菌发酵液，转移至250mL三角瓶中，然后用量筒量取75mL甲醇进行浸泡，再加入1mL2N NaOH溶液，封口，将三角瓶置于摇床上，于室温、转速250rpm下进行振摇提取1小时，用50mL离心管取40mL浸提液于4000rpm离心15分钟，得到经过前处理的绿脓杆菌外毒素A发酵液，取上清过滤，获得样品溶液。
用HPLC方法分析经过上述处理获得的绿脓杆菌外毒素A样品溶液。将样品溶液直接进样分析即可。色谱柱为TC-C18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)，紫外检测器，检测波长210nm，流速1.0mL/min，柱温35℃。
实施例2
流动相为甲醇、乙腈和水；起始流动相中甲醇、乙腈和水的体积比为10：15：75，洗脱3分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：35：35，洗脱10分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：40：30，洗脱5分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为35：45：20，洗脱3分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比调整为10：15：75，洗脱3分钟，平衡。
此方法下对照品保留时间为12.15min，且分离度1.05，理论塔板数达到15800。
实施例3
流动相为甲醇、乙腈和水；起始流动相中甲醇、乙腈和水的体积比为10：15：75，洗脱5分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：35：35，洗脱15分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：40：30，洗脱10分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为35：45：20，洗脱5分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比调整为10：15：75，洗脱5分钟，平衡。
此方法下出峰时间为20min左右，且分离度1.09，理论塔板数为12300。
实施例4
流动相为甲醇、乙腈和水，并加入0.08％(v/v)的丁酸；起始流动相中甲醇、乙腈和水的体积比为10：15：75，洗脱3分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：35：35，洗脱10分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：40：30，洗脱5分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为35：45：20，洗脱3分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比调整为10：15：75，洗脱3分钟，平衡。
此方法下对照品保留时间约为14min左右，且分离度1.07，理论塔板数达到16300。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.一种利用HPLC法检测绿脓杆菌外毒素A的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)取绿脓杆菌发酵液和甲醇进行混合浸泡，再加入NaOH溶液，置于摇床上振摇提取，离心得到含有绿脓杆菌外毒素A的上清液，取上清过滤，获得样品溶液；
(2)使用HPLC法测定，流动相为甲醇、乙腈和水；起始流动相中甲醇、乙腈和水的体积比为10：15：75，洗脱3-5分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：35：35，洗脱10-15分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：40：30，洗脱5-10分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为35：45：20，洗脱3-5分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比调整为10：15：75，洗脱3-5分钟；
其中，所述的HPLC法中分离色谱柱选自TC-C18色谱柱、HypersilBDS、HypersilODS、LiChrosorb、SHIMADZUVP-ODS、Inertsil ODS-SP、Extend-C18、ZORBAXODS、ZORBAXSB-C18、LiChrosorbC18、HypersilODS中的一种；
色谱条件为：柱温为30-40℃；流动相的流速为0.3-1.5ml/min；波长为200-220nm；进样量10μl；柱长为150mm，柱内径为5μm。
2.如权利要求1所述的利用HPLC法检测绿脓杆菌外毒素A的方法，其特征在于：所述的分离色谱柱为TC-C18色谱柱。
3.如权利要求1-2任一项所述的利用HPLC法检测绿脓杆菌外毒素A的方法，其特征在于：所述的色谱条件为柱温为35℃。
4.如权利要求3所述的利用HPLC法检测绿脓杆菌外毒素A的方法，其特征在于：流动相的流速为1ml/min。
5.如权利要求1、2、4任一项所述的利用HPLC法检测绿脓杆菌外毒素A的方法，其特征在于：波长为210nm。
6.如权利要求1所述的利用HPLC法检测绿脓杆菌外毒素A的方法，其特征在于：步骤(2)为：使用HPLC法测定，流动相为甲醇、乙腈和水；起始流动相中甲醇、乙腈和水的体积比为10：15：75，洗脱5分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：35：35，洗脱15分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：40：30，洗脱10分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为35：45：20，洗脱5分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比调整为10：15：75，洗脱5分钟。
7.如权利要求1所述的利用HPLC法检测绿脓杆菌外毒素A的方法，其特征在于：步骤(2)为：使用HPLC法测定，流动相为甲醇、乙腈和水；起始流动相中甲醇、乙腈和水的体积比为10：15：75，洗脱3分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：35：35，洗脱10分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为30：40：30，洗脱5分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比连续性调整为35：45：20，洗脱3分钟；之后甲醇、乙腈和水的体积比调整为10：15：75，洗脱3分钟。
8.如权利要求1所述的利用HPLC法检测绿脓杆菌外毒素A的方法，其特征在于：使用的HPLC的流动相中还含有有机酸。
9.如权利要求8所述的利用HPLC法检测绿脓杆菌外毒素A的方法，其特征在于：所述有机酸为甲酸、乙酸或丁酸中的一种或多种。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000033882A1 (en) * 1998-12-04 2000-06-15 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A vi-repa conjugate vaccine for immunization against salmonella typhi
CN105647841A (zh) * 2014-09-04 2016-06-08 苏静 铜绿假单胞菌突变株构建方法及其应用
CN105849120A (zh) * 2013-10-06 2016-08-10 美国卫生和人力服务部 修饰的假单胞菌外毒素a

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000033882A1 (en) * 1998-12-04 2000-06-15 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A vi-repa conjugate vaccine for immunization against salmonella typhi
CN105849120A (zh) * 2013-10-06 2016-08-10 美国卫生和人力服务部 修饰的假单胞菌外毒素a
CN105647841A (zh) * 2014-09-04 2016-06-08 苏静 铜绿假单胞菌突变株构建方法及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
In Vitro Enzyme Activation and Folded Stability of Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A and Its C-Terminal Peptide;Bryan K.Beattie 等;《Biochemistry》;19960716;第35卷(第28期);9042-9051 *
PCR技术检测编码绿脓杆菌外毒素A基因;艾启俊 等;《中国食品学报》;20061231;第6卷(第6期);117-120 *
绿脓杆菌外毒素A功能片段重组蛋白GP38质控方法和质量标准的建立;史新昌 等;《中国生物制品学杂志》;20100430;第23卷(第4期);399-402 *
重组铜绿假单胞菌外毒素A工程菌发酵及表达产物的纯化;赵志强 等;《中国生物制品学杂志》;20060731;第19卷(第4期);407-410 *

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