CN106977617A - 益生菌中具有抗紫外、修复敏感皮肤及抗衰老功能的多糖及其分离方法和应用 - Google Patents

益生菌中具有抗紫外、修复敏感皮肤及抗衰老功能的多糖及其分离方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种益生菌中具有抗紫外、修复敏感皮肤及抗衰老功能的多糖及其分离方法和应用。所述具有抗紫外、修复敏感皮肤及抗衰老功能的多糖采用裂解益生菌分离而获得，其可应用于护肤品以及化妆品等。由于多糖是经过提纯而获得，因此有效成分浓度高；去除了蛋白质及其他抗原，因此更加的安全，无副作用。

Description

益生菌中具有抗紫外、修复敏感皮肤及抗衰老功能的多糖及 其分离方法和应用
技术领域
本发明涉及一种益生菌中具有抗紫外、修复敏感皮肤及抗衰老功能的多糖及其分离方法和应用。
背景技术
众所周知，一些外界因素，如紫外线照射、氧化刺激会直接损伤人的皮肤细胞。当今市面上玲琅满目的护肤产品，以生物活性提取物作为有效成分的越来越多。但是，以益生菌作为护肤品主要成分或有效成分的产品数量却相对较少，但是现有技术已经表明使用益生菌制备的护肤品具有良好效果。但是益生菌的作为护肤品有效成分的产品，都以益生菌菌体、代谢产物、培养溶液、提取物或其直接裂解产物作为有效成分，而对于在裂解物中哪些成分起作用并没有进一步研究或申明。另外，蛋白质（包括酶）也有可能引起某些特殊体质人群的过敏反应，从而造成以益生菌裂解原液为有效成分的护肤品具有潜在副作用。
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。人体、动物体内有益的细菌或真菌主要有：酪酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌、酵母菌等。
但是目前大多数益生菌产品的有效性验证相对缺乏，至于益生菌中的何种物质发挥了保护皮肤的作用还是未知的，尚未有相关文献报道。随着人民生活水平的逐渐提高、消费者对护肤品的功效、成分和品牌的认知日益深入，分析和提取生物活性物质，研发更加高效、天然环保的护肤产品，已成为化妆品行业发展的一个新热点及需求。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，发明人发现益生菌中的提取的天然多糖是益生菌中唯一有效的护肤物质，基于以上发现本发明的目的在于提供一种益生菌中具有抗紫外、修复敏感皮肤及抗衰老功能的多糖及其分离方法和应用，用于解决现有技术中的不足。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明另一方面公开了所述的益生菌中具有抗紫外、修复敏感皮肤及抗衰老功能的多糖的分离方法，所述分离方法至少包括以下步骤：
（1）将益生菌置于溶剂中得混合液，采用物理方法裂解益生菌，并离心，取上清液；
（2）将上清液加入阴离子交换柱进行洗脱，分别收集每个组分；
（3）检测并去除无多糖的组分以及含有蛋白质的组分，即粗品；
（4）将粗品进一步提纯。
所述抗紫外、修复敏感皮肤及抗衰老功能包括：一方面是多糖能够调高细胞DNA修复功能，特别是指细胞在受到紫外线照射后受到伤害后细胞的DNA修复能力，另一方面是指多糖能够有效降低神经对刺激带来的影响，尤其是降低神经在受到刺激后降钙素基因相关肽的产生。
优选地，所述益生菌选自双歧杆菌属（Bifidobacterium）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）或拟杆菌属（Bacteroides）中的任意一种或几种。
所述步骤（1）还含有以下特征中的任意一种或几种：
优选地，所述混合液中菌的重量百分数为5%~45%；进一步的，所述所述混合液中菌的重量百分数为8%~45%；
优选地，所述裂解的方法选自超声波裂解仪裂解、组织破碎仪裂解、高压均质机裂解或者化学方法裂解中的任意一种或几种；
优选地，所述离心的条件为8000g~10000g/分，时间是10~60分钟；
优选地，将离心获得的沉淀物再次采用物理方法裂解，离心后取上清液，将两次离心后的上清液合并。
所述裂解的方法选自超声波裂解仪裂解、组织破碎仪裂解、高压均质机裂解或者化学方法裂解中的任意一种或几种。
所述溶剂可以选自水、磷酸钠水溶液中的任意一种。
优选地，所述步骤（2）还含有以下特征中的任意一种或几种：
优选地，所述洗脱前使用平衡液调整阴离子交换柱，所述平衡液选自10-100mM pH6.5-8.5的Tris-HCl（三（羟甲基）氨基甲烷）溶液或 10-200mM pH 6-9的磷酸溶液；
优选地，所述洗脱液选用10-100mM Tris-HCl/1M氯化钠溶液和10-200mM的磷酸溶液/1M氯化钠溶液；pH为6.0-8.5；
优选地，所述洗脱时使用检测器选用比旋度检测器、视差折光检测器或紫外检测器中的任意一种。
所述步骤（3）中检测并去除无多糖的组分以及含有蛋白质的组分，可以采用现有技术，例如采用苯酚-硫酸方法测总糖含量，采用BCA蛋白试剂盒测总蛋白。
为了进一步优化设计方案，步骤（3）还包括将粗品中的蛋白质出去，更优选的，采用分子排阻层析法除去蛋白质。
优选地，所述步骤（4）将粗品进一步提纯包括将粗品通过分子排阻层析和滤膜所述分子排阻层析中平衡液选自10-100mM pH 6.5-8.5的Tris-HCl溶液或 10-200mM pH 6-9的磷酸溶液；收集多糖组分并通过孔径小于等于0.22μm的滤膜。
本发明另一方面公开了上述益生菌中具有抗紫外、修复敏感皮肤及抗衰老功能的多糖的分离方法所制备的多糖。
本发明另一方面公开了一种护肤品，所述护肤品中含有如上所述的多糖。
本发明另一方面公开了一种化妆品，所述化妆品中含有如上所述的多糖。
一般地，本领域的技术人员可以采用现有技术，将多糖加入合适的基质中，从而获得护肤品或者化妆品。
本发明的另一方面公开了益生菌中分离获得的多糖作为唯一成分、有效成分和/或辅助成分在制备护肤品、化妆品、药物或保健品中的用途。
优选地，所述护肤品或者化妆品具有提高细胞修复DNA 修复能力、降低细胞应激动能力或者提高细胞抗氧化能力的任意一种或几种。
如上所述，本发明的益生菌中具有抗紫外、修复敏感皮肤及抗衰老功能的多糖，具有以下有益效果：
（1）获得的多糖是纯天然成分，并且经过提纯大大提高了有效组分的浓度，从而对品质得到了进一步的提升；
（2）产品去除了潜在抗原（蛋白质及其他固形物），从而大大降低了对使用者的的副作用，尤其是某些特殊人群，潜在过敏隐患；
（3）由于去除了蛋白等物质，大大提高了产品的稳定性，进一步提升了产品的存储和保藏，并且不会造成因长期储藏而造成的有效物质沉降或蛋白质等物质水解而影响产品的品质。
附图说明
图1显示为本发明实施例6结果示意图。
图2显示为本发明实施例7结果示意图。
图3显示为本发明实施例8结果示意图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING ：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，1987 and periodic updates ；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego ；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998 ；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin (P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999 ； 和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1：
将短双歧杆菌 (Bifidobacterium breve) 干菌粉与无菌水混合得混合液，混合液中菌的重量为8%（w/w）。将上述混合液用超声波裂解仪进行裂解。将该裂解过的菌液用离心机以10,000g，30分钟的速度离心并收集上清液，将不溶性细菌裂解碎片和未裂解细菌再次使用超声波裂解仪进行裂解，然后离心，收集上清液。将两次收集获得的上清液合并。
将上述收集的上清液用等体积的20 mMpH8.0 Tris-HCl溶液稀释。将该稀释的上清液通过阴离子交换柱。在上样之前，阴离子交换住用10mM pH 8.0的Tris-HCl平衡液调节。当平衡液调节交换柱以后，将样品加入，用平衡液洗脱不与交换柱结合的组分，然后用10mMTris-HCl/1M 氯化钠溶液的洗脱液进行线性梯度洗脱，分别收集每一个组分（采用紫外检测器，由UV260 和UV280显示为峰）。
收集的每一个组分，用苯酚-硫酸方法测总糖含量，用BCA蛋白试剂盒测总蛋白。去除无多糖或有蛋白的组分，将其他的只含多糖的组分收集并合并作为多糖组分。
将该收集的多糖组分通过分子排阻层析，平衡液选自10mM pH 8.5的Tris-HCl溶液，并通过0.22μm滤膜过滤除不溶性杂质。
实施例2
将长双歧杆菌 (Bifidobacterium longum) 干菌粉与20mM pH 8.5的磷酸钠水溶液混合得混合液，并使混合液中菌的重量15%（w/w）。将上述菌液用组织破碎仪进行裂解。将该裂解过的菌液用离心机以13,000g的速度离心25分钟，分别收集上清液。去除不溶性细菌裂解碎片和未裂解细菌。
将上清液通过阴离子交换柱。在上样之前，阴离子交换住用20mM pH8.5的磷酸钠溶液调节，加入样品，用20 mM 磷酸钠/1M 氯化钠溶液pH 8.5的洗脱液进行线性梯度洗脱，分别收集每一个组分（用紫外检测器，由UV260 和UV280显示为峰）。
收集的每一个组分用苯酚-硫酸方法测总糖和用BCA蛋白试剂盒测总蛋白。去除无多糖或有蛋白的峰/组分，将其他的峰收集并合并作为多糖组分。
该收集的多糖组分通过分子排阻层析脱盐，平衡液选自100mM pH 6.5Tris-HCl溶液并通过0.22μm滤膜过滤除不溶性杂质。
实施例3
将两岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum) 干菌粉与无菌水混合得混合液，并使混合液中菌的重量12%（w/w）。将上述菌液用高压均质机进行裂解。将该裂解过的菌液用离心机以20,000g的速度离心10分钟，并收集上清液，去处除不溶性细菌裂解碎片和未裂解细菌。
将上述收集的上清液用等体积的20 mMpH8.2磷酸钠溶液稀释。将该稀释的上清液通过一个阴离子交换柱。在上样之前，阴离子交换住用10mM pH8.2的磷酸钠溶液，当样品附着以后，用10 mM 磷酸钠/1M 氯化钠溶液pH 8.2的洗脱液进行线性梯度洗脱，分别收集每一个组分或峰（用紫外检测器，由UV260 和UV280显示为峰）。
收集的每一个组分，用苯酚-硫酸方法测总糖和用BCA蛋白试剂盒测总蛋白。去除无糖或有蛋白的峰/组分，将其他的峰收集并合并作为多糖组分。
将该多糖组分加入到体积为多糖组分1/4的5M氯化钠溶液中，使最后的氯化钠浓度大于等于1M。并将该含多糖的组分通过疏水层析进行进一步分离。平衡液为用10 mM pH8.2磷酸钠/1M 氯化钠溶液，并收集不附着疏水层析柱的组分。当样品其他组分附着以后，用10 mM pH 8.2的磷酸钠溶液进行线性梯度洗脱，根据导电率，收集先于600mM氯化钠（按照分离设备上显示的导电性曲线来确定）洗脱的多糖组分，并与未附着组分进行合并作为有效总糖组分。
将以上多糖组分通过分子排阻层析脱盐，平衡液选自50mM pH 8的Tris-HCl溶液，并通过0.22μm滤膜过滤除菌和其他不溶性杂质。
实施例4
将脆弱类拟杆菌(Bacteroides fragilis) 干菌粉与无菌水（或其他溶液中）混合并使最终菌比例占种重量的5%（w/w）比例混合。将上述菌液用高压均质机进行裂解。将该裂解过的菌液用离心机以8000g的速度离心60分钟分别收集上清液。去处除不溶性细菌裂解碎片和未裂解细菌。
将上清液通过阴离子交换柱，平衡液30mM pH 6.5的Tris-HCl溶液，当样品附着以后，用30 mM Tris-HCl /1M 氯化钠溶液pH 6.5的洗脱液进行洗脱，分别收集每一个组分或峰（由UV260 和UV280显示为峰）。
分别收集每一个峰，并用苯酚-硫酸方法测总糖和用BCA蛋白试剂盒来测总蛋白。去除无多糖或有蛋白的峰/组分，将其他的峰收集并合并作为多糖组分。
将该多糖组分加入体积为多糖组分1/4的5M氯化钠溶液中，使最后的氯化钠浓度大于等于1M。并将该含多糖的组分通过疏水层析进行进一步分离。平衡液为10 mM Tris-HCl /1M 氯化钠溶液pH 6.5，并收集不附着的组分。当样品其他组分附着以后，用10 mM pH8.5的Tris-HCl溶液进行线性洗脱，根据导电率，收集先于600mM氯化钠（按照分离设备上显示的导电性来确定）洗脱的多糖组分，并与未附着组分进行合并作为有效总糖组分。
将以上糖组分通过一个分子排阻层析脱盐，平衡液选自10mM pH 9的磷酸溶液，并通过0.22μm滤膜过滤除菌和其他杂质。
实施例5
将嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) 湿菌与50mM pH 6.8的Tris-HCl溶液混合并使最终菌比例占种重量的45%（w/w）比例混合。将上述菌液用高压均质机进行裂解。将该裂解过的菌液用离心机以8,000g的速度离心60分钟分别收集上清液。去处除不溶性细菌裂解碎片和未裂解细菌。
将上清液通过阴离子交换柱，平衡液为50mM pH 6.8的Tris-HCl溶液，当样品附着以后，用50mM Tris-HCl/1M 氯化钠溶液pH 6.8的洗脱液进行洗脱，分别收集每一个组分或峰（由UV260 和UV280显示为峰）。
将收集每一个组分用苯酚-硫酸方法测总糖和用BCA蛋白试剂盒测定总蛋白。去除无多糖或有蛋白的峰/组分，将其他的峰收集并合并作为多糖组分。
将该收集的多糖组分通过分子排阻层析脱盐，平衡液选自200mM pH 6的磷酸溶液并通过0.22μm滤膜过滤除菌和其他杂质。
实施例6
将人化角化细胞通过培养，然后经过以上提纯的多糖组分的预处理，将从并加入从实施例1, 实施例2、实施例3、实施例4和实施例5提纯的多糖有效成分分别加入到以上培养的培养的细胞，使多糖组分最终浓度为5 mg/L。在预处理后，以上细胞经过与太阳光等同的紫外线照射处理，照射总量为0-50J/m2。照射后，细胞表达IL-10的量进行测定和对比。
结果如图1显示，不同菌种中提取的多糖组分对细胞产生的IL-10都引起不同程度的降低。IL-12具有对DNA紫外损伤修复的功能，IL-10对IL-12有免疫抑制作用。上述提纯组分对IL-10有抑制作用，表明在细胞受到紫外伤害后，该提纯多糖组分可有效提高细胞DNA修复功能。
实施例7
将人成纤维细胞通过培养，并加入从实施例1, 实施例2、实施例3、实施例4和实施例5提纯的多糖组分做预处理，提纯组分加入量为10mg/L，并经过与太阳光等同的紫外线照射处理，照射总量为5kJ/m2。经过照射后，紫外线对细胞的伤害通过检测微核来鉴定。
结果如图2显示，上述不同细菌中提纯的多糖组分均对微核的形成均有降低作用。因此可证明从各个细菌中提纯多糖组分可以有效的提高对DNA的修复作用。
实施例8
背根神经节神经元细胞经过培养后，加入从并加入从实施例1, 实施例2、 实施例3、实施例4和实施例5提纯的多糖组分，经过500 mg/L上述提纯多糖组分处理4-10小时。经过处理后，换新的培养基并在培养基里加入1-5μM的辣椒素对细胞进行处理。经过辣椒素处理后，收集培养基上清液（无细胞组分），然后测定降钙素基因相关肽（CGRP）的含量。
结果如图3所示，细胞在加入上述提纯组分的情况下会明显降低CGRP的产生，表明以上提纯多糖组分可以有效降低神经对刺激因素带来的影响。
实施例9
背根神经节神经元细胞经过培养后，加入从并加入从实施例1, 实施例2、 实施例3、实施例4和实施例5提纯的多糖组分，制成 500 mg/L，并混合培养4-10小时。经过处理后，换新的培养基并在培养基里加入1-5μM的辣椒素对细胞进行处理。经过辣椒素处理后，收集培养基上清液（无细胞组分），然后测定降钙素基因相关肽（CGRP）的含量。
结果如图4所示，以上提纯多糖组分的抗氧化作用以维生素E类似物Trolox来衡量(ORAC分析法)，结果显示以上分离获得的多糖具有高效的抗氧化能力。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种益生菌中具有抗紫外、修复敏感皮肤及抗衰老功能的多糖的分离方法，其特征在于，所述分离方法至少包括以下步骤：
将益生菌置于溶剂中得混合液，采用物理方法裂解益生菌，并离心，取上清液；
将上清液加入阴离子交换柱进行洗脱，分别收集每个组分；
检测并去除无多糖的组分以及含有蛋白质的组分，得粗品；
将粗品进一步提纯。
2.如权利要求1所述的益生菌中具有抗紫外、修复敏感皮肤及抗衰老功能的多糖的分离方法，其特征在于，所述益生菌选自双歧杆菌属（Bifidobacterium）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）或拟杆菌属（Bacteroides）中的任意一种或几种。
3.如权利要求1所述的益生菌中具有抗紫外、修复敏感皮肤及抗衰老功能的多糖的分离方法，其特征在于，所述步骤（1）还含有以下特征中的任意一种或几种：
所述混合液中菌的重量百分数为5%~45%；
b. 所述裂解的方法选自超声波裂解仪裂解、组织破碎仪裂解、高压均质机裂解的任意一种或几种；
c. 所述离心的条件为8000g~20000g/分，时间是10-60分钟；
d．将离心获得的沉淀物再次采用物理方法裂解，离心后取上清液，将两次离心后的上清液合并。
4.如权利要求1所述的益生菌中具有抗紫外、修复敏感皮肤及抗衰老功能的多糖的分离方法，其特征在于，所述步骤（2）还含有以下特征中的任意一种或几种：
a.所述洗脱前使用平衡液调整阴离子交换柱，所述平衡液选自10-100mM pH 6.5-8.5的Tris-HCl溶液或10-200mM pH 6-9的磷酸钠溶液；
b.所述洗脱液选用10-100mM Tris-HCl/1M氯化钠溶液或10-200mM的磷酸钠溶液/1M氯化钠溶液；pH为6.0-8.5；
c．所述洗脱时使用检测器选用比旋度检测器、视差折光检测器或紫外检测器中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的益生菌中具有抗紫外、修复敏感皮肤及抗衰老功能的多糖的分离方法，其特征在于：所述步骤（4）将粗品进一步提纯包括将粗品通过分子排阻层析和滤膜，所述分子排阻层析中平衡液选自10-100mM pH 6.5-8.5的Tris-HCl溶液或 10-200mMpH 6-9的磷酸溶液；收集多糖组分并通过孔径小于等于0.22μm的滤膜。
6.如权利要求1~5任意项所述的益生菌中具有抗紫外、修复敏感皮肤及抗衰老功能的多糖的分离方法所制备的多糖。
7.一种护肤品，其特征在于，所述护肤品中含有如权利要求6所述的多糖。
8.一种化妆品，其特征在于，所述化妆品中含有如权利要求6所述的多糖。
9.益生菌中分离获得的多糖在作为唯一成分、有效成分和/或辅助成分在制备护肤品、化妆品、药物或保健品中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述护肤品或者化妆品具有提高细胞修复DNA 修复能力、降低细胞应激能力或者提高细胞抗氧化能力中的任意一种或几种。
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