CN106970053A - 巯基类化合物的检测方法及荧光成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种巯基类化合物的检测方法及荧光成像方法,涉及生物检测技术领域。一种巯基类化合物的检测方法,包括:向含有荧光探针分子的荧光探针溶液中加入待检测物形成检测液,检测检测液是否存在荧光或荧光母体的特征峰,荧光探针分子由2,4‑二硝基苯磺酰氯和荧光母体反应而成。该检测方法可快速、高效的检测巯基类化合物,专一性强、灵敏度高、抗干扰能力强,对巯基类化合物具有很好的荧光响应。一种荧光成像方法,将上述荧光探针分子结合到待成像物,使巯基类化合物与荧光探针分子反应以使待成像物产生荧光,利用成像仪检测待成像物产生的荧光。该方法检测荧光效果明显,操作简便,在细胞成像应用中具有良好的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,且特别涉及一种巯基类化合物的检测方法及荧光成像方法。
背景技术
巯基类化合物在(如半胱氨酸,谷胱甘肽和高半胱氨酸等)生物体内的许多生理过程中发挥着重要作用,例如维持生物体内氧化还原的动态平衡、影响体内生物酶活性等,而且多种疾病的发病机制也与生物体内的巯基化合物水平密切相关。巯基类物质的变化,在人体生命现象中主要表现为:半胱氨酸的缺乏会导致生长缓慢、头发变白、脑水肿、肝损伤、嗜眠症、皮肤病变、身体虚弱等;细胞内高半胱氨酸的高表达与心血管疾病及阿尔茨海默有直接关联;作为三肽化合物的谷胱甘肽,是哺乳动物组织中含量最丰富的细胞内小分子生物巯基化合物之一,在维持生物体还原性内环境方面发挥着重要作用;作为一种抗氧化剂,还原型的谷胱甘肽可以有效阻止自由基或过氧化物对细胞内重要组成部分的损伤,并且与氧化型的谷胱甘肽的比例也是监测细胞内氧化水平的重要参数指标。因此,巯基化合物的检测对于人体健康和疾病诊断具有重要的意义。
目前,巯基类化合物检测的方法主要有:酶促法、高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法(GC)、结合电化学检测的毛细管电泳法、荧光分析与比色法等。上述方法各具优势,但是作为快速检测方法,会明显暴露出缺点,例如,酶促实验过程复杂,不适宜用于日常分析。HPLC的特异性好,但是仪器依赖度高,价格昂贵,耗时较长,可用于能检测生物巯基的总量,但灵敏度不高,对样品的需求量较大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种巯基类化合物的检测方法,以制备的荧光检测物质作为探针,可快速、高效的检测巯基类化合物,专一性强、灵敏度高、抗干扰能力强,对巯基类化合物具有很好的荧光响应。
本发明的另一目的在于提供一种荧光成像方法,将上述荧光探针分子结合到待成像物,检测荧光。该方法检测荧光效果明显,操作简便,在细胞成像应用中具有良好的效果。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出一种巯基类化合物的检测方法,包括:向含有荧光探针分子的荧光探针溶液中加入待检测物形成检测液,检测检测液是否存在荧光或荧光母体的特征峰,荧光探针分子由2,4-二硝基苯磺酰氯和如式(I)所示的荧光母体反应而成;
其中,R1表示烷氧基、羧基、硝基、氢基、烷基中任一种,R2表示烷氧基、羧基、硝基、氢基、羟烷基、氨基中任一种,R1、R2的结合位点分别独立地为苯环上剩余的4个未结合位点中的任一个;
如果存在荧光、特征峰中的一种或两种,则待检测物中存在巯基类化合物;如果不存在荧光和特征峰,则待检测物中不存在巯基类化合物。
本发明还提供了一种荧光成像方法,将上述荧光探针分子结合到待成像物,使巯基类化合物与荧光探针分子反应以使待成像物产生荧光,利用成像仪检测待成像物产生的荧光;荧光探针分子由2,4-二硝基苯磺酰氯和如式(I)所示的荧光母体反应而成;
其中,R1表示烷氧基、羧基、硝基、氢基、烷基中任一种,R2表示烷氧基、羧基、硝基、氢基、羟烷基、氨基中任一种,R1、R2的结合位点分别独立地为苯环上剩余的4个未结合位点中的任一个。
本发明实施例的一种巯基类化合物的检测方法及荧光成像方法的有益效果是:
本发明以制备的荧光探针分子配制荧光探针溶液,向荧光探针溶液中加入待检测物质进行荧光检测。荧光探针分子中的苯磺酸酯键与半胱氨酸分子结构中的巯基发生专一性化学反应后,由于影响激发态分子内质子转移(excited-state intramolecular protontransfer,ESIPT)过程的羟基官能团的2,4-二硝基苯磺酸基从母体分子脱离,荧光母体的荧光性质恢复,出现特征发射峰。该检测方法可快速、高效的检测巯基类化合物,专一性强、灵敏度高、抗干扰能力强,对巯基类化合物具有很好的荧光响应。一种荧光成像方法,将上述荧光探针分子结合到待成像物,检测荧光。该方法检测荧光效果明显,操作简便,在细胞成像应用中具有良好的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例4的荧光探针在两组细胞内的透射电镜图;
图2为本发明实施例8的荧光探针溶液与不同浓度的半胱氨酸的荧光光谱图;
图3为本发明实施例8的荧光探针溶液与相同浓度的半胱氨酸及不同物质混合物的荧光光谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的巯基类化合物的检测方法及荧光成像方法进行具体说明。
本发明实施例提供的一种巯基类化合物的检测方法,包括:
步骤S101:由如式(I)所示的荧光母体与2,4-二硝基苯磺酰氯反应制备荧光探针分子。
其中,R1表示烷氧基、羧基、硝基、氢基、烷基中任一种,R2表示烷氧基、羧基、硝基、氢基、羟烷基、氨基中任一种,R1、R2的结合位点分别独立地为苯环上剩余的4个未结合位点中的任一个。在本发明的实施例中,具体地,荧光母体为2-(2-羟基苯基)苯并咪唑,其可以通过购买直接获得,也可通过实验制备获得。具体地,荧光母体2-(2-羟基苯基)苯并咪唑的制备方法包括:
将水杨醛溶于一定量的乙醇溶剂中,加入亚硫酸氢钠后,为了溶解的充分,磁力搅拌1.5~2.5h;
再加入溶有邻苯二胺的乙醇溶剂,升温加热至回流后,继续反应3~5h;
反应结束后,将反应产物置于冰水浴中,静置3~5h待无固体继续析出后,过滤得固体,该固体为粗产品;
为了得到纯物质,将过滤后的固体真空干燥,以体积比为1:4~6的乙酸乙酯和石油醚作为淋洗剂,进行柱层析提纯,产物即为2-(2-羟基苯基)苯并咪唑。
其中,水杨醛、乙醇、亚硫酸氢钠、邻苯二胺的用量比为1mmol:15~35ml:1~1.5mmol:1~1.5mmol。
在本发明实施例中,作为荧光母体的2-(2-羟基苯基)苯并咪唑与2,4-二硝基苯磺酰氯的反应包括:
在冰水浴中,将荧光母体充分溶于二氯甲烷溶剂中,加入缚酸剂三乙胺;在本发明的实施例中,溶剂也可以选用其他有机试剂,如乙醇等;
为了让反应更加充分,在磁力搅拌的条件下,逐滴滴加溶有2,4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷;
在冰水浴中反应18~24h,反应结束后,通过减压蒸馏得粗产品,再通过柱层析提纯产物。提纯过程中,以乙酸乙酯和石油醚的混合液作为淋洗剂,乙酸乙酯与石油醚的体积比为1:2~4。较优的,在本发明实施例中,冰水浴的温度为-10~0℃。
其中,荧光母体、溶剂、三乙胺、2,4-二硝基苯磺酰氯的用量比为1mmol:30~50ml:1~2mmol:1~2mmol。该范围值是发明人经过创造性劳动并结合自身经验得到的优选值。
步骤S102:制得荧光探针分子后,配制荧光探针溶液。
在本发明实施例中,荧光探针溶液由荧光探针分子及荧光探针溶剂混合而成。具体地,荧光探针溶剂由体积比为1:1~2的乙腈和含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸的缓冲液混合而成。其中,含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸的缓冲液由水及4-羟乙基哌嗪乙磺酸混合而成,较优的,4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为15~35mmol/L。当缓冲液的pH值为7~7.5时,荧光探针分子对巯基类化合物的检测较为灵敏。
步骤S103:向荧光探针溶液中加入待检测物形成检测液,对检测液进行过荧光测试,检测检测液中是否存在荧光或荧光母体的特征峰。
本发明将可产生激发态分子内质子转移(excited-state intramolecularproton transfer,ESIPT)机理的羟基光能团用2,4-二硝基苯磺酰氯封闭,使荧光母体荧光关闭。在检测物质的作用下,使2,4-二硝基苯磺酰氯从荧光探针分子脱离,从而将荧光打开,再通过检测荧光、特征峰中的一种或两种起到检测的效果。
如果存在荧光、特征峰中的一种或两种,则待检测物中存在巯基类化合物;如果不存在荧光和特征峰,则待检测物中不存在巯基类化合物。
在本发明实施例中,巯基类化合物包括半胱氨酸。在一些实施例中,巯基类化合物包括选自天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、亮氨酸、丝氨酸、异亮氨酸中的任一种的氨基酸与半胱氨酸的混合物。在本发明的其他实施例中,巯基类化合物包括选自钾盐、镁盐、钠盐、钙盐、锌盐中的任一种的水溶性盐与半胱氨酸的混合物。更进一步地,巯基类化合物包括上述任一种的水溶性盐、上述任一种的氨基酸以及半胱氨酸的混合物。
在本发明实施例中,钾盐、镁盐、钠盐、钙盐、锌盐均指的是水溶性盐,例如,KCl、NaCl、MgCl2、CaSO4、ZnSO4。
本发明实施例还提供了一种荧光成像方法,将上述荧光探针分子结合到待成像物,使巯基类化合物与荧光探针分子反应以使待成像物产生荧光,利用成像仪检测待成像物产生的荧光。
荧光探针分子具有(a)所示的结构,
本发明实施例中,荧光探针分子由2,4-二硝基苯磺酰氯和如式(I)所示的荧光母体反应而成,
其中,R1表示烷氧基、羧基、硝基、氢基、烷基中任一种,R2表示烷氧基、羧基、硝基、氢基、羟烷基、氨基中任一种,R1、R2的结合位点分别独立地为苯环上剩余的4个未结合位点中的任一个。
其中,将荧光探针分子结合到待成像物的方式例如可以是,将荧光探针分子配制为溶液,然后把待成像物浸泡于上述溶液中,或者进一步地,还可以在浸泡后捞出在适当的温度下干燥。或者,还可以是通过喷涂的形式将探针分子固体粉末附着到待成像的物体表面。
将荧光探针分子结合到待成像物后,再将巯基类化合物固体粉末或者溶液转移到待成像物表面,使荧光探针分子和巯基类化合物接触并反应。
在其他实施例中,可以将荧光探针分子和巯基化合物配制为培养液,再将待成像物(组织、细胞等等)在上述培养液中进行培养。
本发明实施例提供的上述探针分子可应用于细胞成像、分子识别方面。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种荧光母体,通过以下步骤制得:
将水杨醛溶于乙醇溶剂中,加入亚硫酸氢钠后,磁力搅拌2h;
再加入溶有邻苯二胺的乙醇溶剂,升温加热至回流后,继续反应4h;
其中,水杨醛、乙醇、亚硫酸氢钠、邻苯二胺的用量比为1mmol:25ml:1.2mmol:1.2mmol;
反应结束后,将反应产物置于冰水浴中,静置4h过滤得固体;
将过滤后的固体真空干燥,以体积比为1:5的乙酸乙酯和石油醚作为淋洗剂,进行柱层析提纯,产物即为2-(2-羟基苯基)苯并咪唑。提纯,产物即为2-(2-羟基苯基)苯并咪唑。
实施例2
本实施例提供了一种荧光探针分子,通过以下步骤制得:
在冰水浴条件下,将实施例1的荧光母体2-(2-羟基苯基)苯并咪唑充分溶于二氯甲烷中;加入三乙胺得混合溶液;
在磁力搅拌的条件下,将溶有2,4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷逐滴滴加至混合溶液中;
在0℃的条件下反应18h后,通过减压蒸馏、柱层析提纯产物。提纯过程中,乙酸乙酯与石油醚的体积比为1:2。
其中,荧光母体、二氯甲烷、三乙胺、2,4-二硝基苯磺酰氯的摩尔比为1mmol:15ml:1mmol:1mmol。
实施例3
本实施例提供了一种荧光探针分子,通过以下步骤制得:
在冰水浴条件下,将实施例1的荧光母体2-(2-羟基苯基)苯并咪唑充分溶于二氯甲烷中;加入三乙胺得混合溶液;
在磁力搅拌的条件下,将溶有2,4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷逐滴滴加至混合溶液中;
在-10℃的条件下反应24h后,通过减压蒸馏、柱层析提纯产物。提纯过程中,乙酸乙酯与石油醚的体积比为1:4。
其中,荧光母体、二氯甲烷、三乙胺、2,4-二硝基苯磺酰氯的摩尔比为1mmol:30ml:2mmol:2mmol。
实施例4
本实施例提供了一种荧光探针分子,通过以下步骤制得:
在冰水浴条件下,将实施例1的荧光母体2-(2-羟基苯基)苯并咪唑充分溶于二氯甲烷中;加入三乙胺得混合溶液;
在磁力搅拌的条件下,将溶有2,4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷逐滴滴加至混合溶液中;
在-5℃的条件下反应21h后,通过减压蒸馏、柱层析提纯产物。提纯过程中,乙酸乙酯与石油醚的体积比为1:3。
其中,荧光母体、二氯甲烷、三乙胺、2,4-二硝基苯磺酰氯的摩尔比为1mmol:20ml:1.2mmol:1.2mmol。
实施例5
本实施例提供了一种巯基类化合物的检测方法,包括:
将4-羟乙基哌嗪乙磺酸与水混合配制浓度为15mmol/L的缓冲液,该缓冲液的pH值为7.2;
将缓冲液与乙腈以体积比为1:1.5混合配制荧光探针溶剂;
将荧光探针溶剂与实施例4的荧光探针分子混合配制荧光探针溶液;
将待检测物加入荧光探针溶液中进行荧光测试。
实施例6
本实施例提供了一种巯基类化合物的检测方法,包括:
将4-羟乙基哌嗪乙磺酸与水混合配制浓度为35mmol/L的缓冲液,该缓冲液的pH值为7.5;
将缓冲液与乙腈以体积比为1:2混合配制荧光探针溶剂;
将荧光探针溶剂与实施例4的荧光探针分子混合配制荧光探针溶液;
将待检测物加入荧光探针溶液中进行荧光测试。
实施例7
本实施例提供了一种巯基类化合物的检测方法,包括:
将4-羟乙基哌嗪乙磺酸与水混合配制浓度为15mmol/L的缓冲液,该缓冲液的pH值为7.2;
将缓冲液与乙腈以体积比为1:1.5混合配制荧光探针溶剂;
将荧光探针溶剂与实施例4的荧光探针分子混合配制荧光探针溶液;
将待检测物加入荧光探针溶液中进行荧光测试。
实施例8
本实施例提供了一种巯基类化合物的检测方法,包括:
将4-羟乙基哌嗪乙磺酸与水混合配制浓度为25mmol/L的缓冲液,该缓冲液的pH值为7;
将缓冲液与乙腈以体积比为1:1混合配制荧光探针溶剂;
将荧光探针溶剂与实施例4的荧光探针分子混合配制荧光探针溶液;
将待检测物加入荧光探针溶液中进行荧光测试。
实施例9
本实施例提供了一种荧光成像方法,其采用实施例8制备的荧光探针溶剂配制浓度为20μM的荧光探针溶液,同时用实施例8的荧光探针溶剂配制浓度为20μM的半胱氨酸溶液。分别用DMEM培养基(市售产品)培养2组Hela细胞(海拉细胞)。在第一组细胞中只加入荧光探针溶液,在37摄氏度下培养30分钟。在第二组细胞中加入荧光探针溶液和半胱氨酸溶液,相同条件下培养30min。两组细胞中加入的液体体积相同。培养结束后,分别用磷酸盐缓冲液洗涤3次,每次1分钟,将细胞置于成像仪下观察,观察加入探针前后的荧光变化,结果见图1。
由图1可知,两组细胞在明场像中可同时观察到细胞,但在荧光场中,无法看到第一组细胞,但可以清楚的看到第二组细胞。说明实荧光探针溶液中的荧光探针分子可准确的检测出半胱氨酸,即巯基类化合物。本发明的巯基类化合物的检测方法可应用于荧光成像中,且具有良好的效果。
需要说明的是,成像仪可以采用市售设备,如荧光显微镜,特别地,本实施例中,成像仪为激光共聚焦显微镜。
试验例1
对实施例2~实施例4制备的荧光探针分子进行产率计算,实施例2制备的荧光探针分子的产率为79%,实施例3制备的荧光探针分子的产率为84%,实施例4制备的荧光探针分子的产率为89%。故实施例5~8均采用实施例4制备的荧光探针分子进行荧光探针溶液的配制。
试验例2
分别配制荧光探针分子浓度相同的实施例5~8的荧光探针溶液,均加入相同浓度相同体积的半胱氨酸,进行荧光检测,观察发现,实施例8的荧光探针溶液较灵敏,对半胱氨酸具有较好的荧光响应。
试验例3
配制16份荧光探针分子浓度为40μM的实施例8的荧光探针溶液,分别加入浓度依次为2.5、5、7.5、10、20、30、40、50、60、70、80、120、160、200、300、400μM的半胱氨酸。对16份待测样品进行荧光测试,测试结果如图2。
由图2可知,初始条件下,荧光探针分子在350nm激发波长下无发射峰。荧光探针分子中的苯磺酸酯键与半胱氨酸分子结构中的巯基发生专一性化学反应后,由于影响ESIPT过程的羟基官能团的2,4-二硝基苯磺酸基从母体分子脱离,荧光母体的荧光性质恢复,在452nm处出现特征发射峰。在荧光探针分子浓度相同、半胱氨酸浓度不同的条件下,荧光强度随着半胱氨酸浓度的提高而逐渐增加。说明实施例8的荧光探针溶液较为灵敏、准确的检测巯基类化合物。
试验例4
配制14份荧光探针分子浓度为20μM的实施例8的荧光探针溶液,分别加入含有不同干扰物质的溶液,检测荧光探针分子对半胱氨酸的选择性。分别加入的物质为:1.Cys;2.Cys+K+;3.Cys+Mg2+;4.Cys+Na+;5.Cys+Ca2+;6.Cys+Zn2+;7.Cys+Asp;8.Cys+Ala;9.Cys+Val;10.Cys+Phe;11.Cys+His;12.Cys+Leu;13.Cys+Ser;14.Cys+Ile。测试结果如图3。
由图3可知,14份含有不同干扰物质的荧光探针溶液均检测出特征光谱峰,且峰值均较高,说明荧光探针分子对半胱氨酸的选择性好、专一性强,能够有效的抵抗其他分子和离子的干扰。
综上所述,本发明以制备的荧光探针分子配制荧光探针溶液,向荧光探针溶液中加入待检测物质进行荧光检测。荧光探针分子中的苯磺酸酯键与半胱氨酸分子结构中的巯基发生专一性化学反应后,由于影响ESIPT过程的羟基官能团的2,4-二硝基苯磺酸基从母体分子脱离,荧光母体的荧光性质恢复,出现特征发射峰。该检测方法可快速、高效的检测巯基类化合物,专一性强、灵敏度高、抗干扰能力强,对巯基类化合物具有很好的荧光响应,在细胞成像应用中具有良好的效果。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围,而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
Claims (10)
1.一种巯基类化合物的检测方法,其特征在于,包括:
向含有荧光探针分子的荧光探针溶液中加入待检测物形成检测液,检测所述检测液是否存在荧光或荧光母体的特征峰,所述荧光探针分子由2,4-二硝基苯磺酰氯和如式(I)所示的所述荧光母体反应而成;
其中,R1表示烷氧基、羧基、硝基、氢基、烷基中任一种,R2表示烷氧基、羧基、硝基、氢基、羟烷基、氨基中任一种,R1、R2的结合位点分别独立地为苯环上剩余的4个未结合位点中的任一个;
如果存在所述荧光、所述特征峰中的一种或两种,则所述待检测物中存在所述巯基类化合物;如果不存在所述荧光和所述特征峰,则所述待检测物中不存在所述巯基类化合物。
2.根据权利要求1所述的巯基类化合物的检测方法,其特征在于,所述荧光母体为2-(2-羟基苯基)苯并咪唑。
3.根据权利要求1所述的巯基类化合物的检测方法,其特征在于,所述荧光探针溶液的溶剂由体积比为1:1~2的乙腈和含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸的缓冲液混合而成。
4.根据权利要求3所述的巯基类化合物的检测方法,其特征在于,所述缓冲液中所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为15~35mmol/L。
5.根据权利要求3或4所述的巯基类化合物的检测方法,其特征在于,所述缓冲液的pH值为7~7.5。
6.根据权利要求2所述的巯基类化合物的检测方法,其特征在于,所述2-(2-羟基苯基)苯并咪唑与所述2,4-二硝基苯磺酰氯反应的方法包括:向溶解有所述2-(2-羟基苯基)苯并咪唑的溶剂中加入三乙胺,再加入所述2,4-二硝基苯磺酰氯,在-10~0℃的条件下反应18~24h。
7.根据权利要求6所述的巯基类化合物的检测方法,其特征在于,所述2-(2-羟基苯基)苯并咪唑与所述2,4-二硝基苯磺酰氯反应后,还包括:将反应产物蒸馏、柱层析提纯。
8.根据权利要求6所述的巯基类化合物的检测方法,其特征在于,所述2-(2-羟基苯基)苯并咪唑、所述溶剂、所述三乙胺、所述2,4-二硝基苯磺酰氯的用量比为1mmol:30~50ml:1~2mmol:1~2mmol。
9.根据权利要求2所述的巯基类化合物的检测方法,其特征在于,所述巯基类化合物包括半胱氨酸,进一步所述巯基类化合物还包括天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、亮氨酸、丝氨酸、异亮氨酸中的任一种;更进一步所述巯基类化合物还包括钾盐、镁盐、钠盐、钙盐、锌盐中任一种。
10.一种荧光成像方法,其特征在于,将荧光探针分子结合到待成像物,使巯基类化合物与所述荧光探针分子反应以使所述待成像物产生荧光,利用成像仪检测所述待成像物产生的荧光;所述荧光探针分子由2,4-二硝基苯磺酰氯和如式(I)所示的荧光母体反应而成;
其中,R1表示烷氧基、羧基、硝基、氢基、烷基中任一种,R2表示烷氧基、羧基、硝基、氢基、羟烷基、氨基中任一种,R1、R2的结合位点分别独立地为苯环上剩余的4个未结合位点中的任一个。
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