CN106967801A - 一种人类hla区域基因拷贝数变异检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人类HLA区域基因拷贝数变异检测方法,该方法首先采集人的组织、血液或其他体液基因组作为样品,将样品与CytoscanHD芯片进行杂交,杂交完成后对芯片进行洗涤,然后在GCD3000系统的数据收集系统中进行数据收集,生成CEL文件;然后将CEL文件输入CHAS软件进行初级质控,将质控合格的芯片生成的Cychp文件导入CHAS软件,根据拷贝数特征、marker数量以及CNV gain和CNV loss片段大小三个指标筛选出目的marker。本发明运用CytoscanHD芯片精确检测拷贝数变异的能力和结合CHAS软件直观且简化的分析流程,并通过对CHAS软件区间的特定设置,大大提高了检测HLA区域拷贝数变异的准确率,得到的数据更加可靠、真实,为预防习惯性流产和产前诊断得到了重要的保障。
Description
技术领域:
本发明属于基因诊断领域,具体涉及一种人类HLA区域基因拷贝数变异检测方法。
背景技术:
人类白细胞抗原(HLA)基因位于人类第6号染色体短臂,是目前发现的人体多态性最高的基因。HLA基因分成三类:Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类基因。其中,Ⅰ类包括:HLA-A、HLA-B、HLA-C基因;Ⅱ类包括:HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DPB1基因。HLA系统是目前所知人体最复杂的多态系统。自1958年发现第一个HLA抗原,到20世纪70年代,HLA便成为免疫遗传学、免疫生物学和生物化学等学科的一个重要新兴研究领域。现在,已基本弄清其系统的组成、结构和功能,阐明了其理化性质和生物学作用。这些研究成果不仅具有重要的理论意义,而且具有巨大的生物医学价值。
2016年全国出生人数达1650万,随着计划生育政策的改变,预计2017年新生儿数量可达2000万,按照15%~20%的自然流产发生率来估算,到2017年我国发生自然流产的孕妇可达300万到400万人次。习惯性流产是指连续自然流产三次及三次以上者,自然流产者当中约1%为习惯性流产。目前,我国育龄夫妻每8对夫妻当中有一对就有不孕不育的情况出现,根据中国妇联报道数据显示,我国不孕不育患者数量已经超过5000万,不孕不育的原因很多,如染色体异常、内分泌失调、生殖器官解剖结构异常、细菌或病毒感染、母婴血型不合、环境污染等,其中由染色体异常导致的约占15%,故而在发生自然流产的原因中,染色体异常是其中一个重要的原因。在发生习惯性流产的病例中,夫妻双方或一方或胚胎染色体异常所致的流产,HLA区域拷贝数异常是比较重要的原因,因此,需要做HLA基因区域内的异常检测。
在HLA区域,共有4个主要位点A,B,C,D//DR,大量证据表明:习惯性流产的夫妇具有共同HLA抗原的频率较正常对照组显著增高,并发现与习惯性流产的抗原主要表现在HLA-D伞点上;配偶间D/DR抗原的相容性越高,习惯性流产的发生率也越大。另外,也有研究发现当夫妇高度共有HLA-A,HLA-B位点时,习惯性流产的发生率也明显高于正常对照组。目前,虽然PCR、高通量测序等拷贝数变异检测技术一直在发展,但是由于HLA区域DNA排列顺序的特殊性以及GC含量特征,不是任何一种拷贝数变异检测技术都适合,为此,针对HLA区域拷贝数变异检测的技术,申请人提供一种人类HLA区域基因拷贝数变异检测方法。
发明内容:
本发明的目的旨在应用于习惯性流产检测技术领域,提供一种人类HLA区域基因拷贝数变异检测方法,对即将要孩子的夫妻进行生育风险预警以及发生习惯性流产的患者找出病因,为产前诊断以确保优生优育具有重要作用。
为解决上述技术问题,本发明采取以下技术方案:
一种人类HLA区域基因拷贝数变异检测方法,包括如下步骤:
(1)采集人的组织、血液或其他体液基因组作为样品,将样品与CytoscanHD芯片进行杂交,杂交完成后对芯片进行洗涤,然后在GCD3000系统的数据收集系统中进行数据收集,生成CEL文件;
(2)将CEL文件输入CHAS软件进行初级质控,将质控合格的芯片生成的Cychp文件导入CHAS软件,根据拷贝数特征、marker数量以及CNV gain和CNV loss片段大小三个指标筛选出目的marker。
进一步地,步骤(1)中采集的样品与CytoscanHD芯片进行杂交之前经过标本采集、外周血基因组提取、DNA浓度与纯度测定和琼脂糖凝胶电泳质检基因组DNA获得质控良好的基因组DNA。
进一步地,将上述质控良好的基因组DNA经过酶切、连接、扩增、片段化并进行标记后,将通过质控的DNA与芯片进行杂交,优选地,杂交条件为50℃60r/min,杂交时间为16~18h。
进一步地,步骤(2)中导入CHAS软件的CNV片段大小以及marker数报告阈值设置为全区间。
本发明人类HLA区域基因拷贝数变异检测方法,运用CytoscanHD芯片精确检测拷贝数变异的能力和结合CHAS软件直观且简化的分析流程,并通过对CHAS软件区间的特定设置,可以更加合理和准确地检测出HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-D//DR的位点,由芯片杂交结果分析得到目的基因序列数据。因此,本发明的方法大大提高了检测HLA区域拷贝数变异的准确率,得到的数据更加可靠、真实,为预防习惯性流产和产前诊断得到了重要的保障。
附图说明:
图1是本发明人类HLA区域基因拷贝数变异检测方法的分析流程图;
图2是本发明实施例中芯片杂交图;
图3是本发明实施例中CHAS软件分析结果图。
具体实施方式:
下面结合附图与具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1对已知习惯性流产被检测者的基因组样品进行HLA区域基因拷贝数变异的检测
被检测者情况简介:
张某,男,肠道有轻度炎症、维生素D中度缺乏、机体代谢失衡(碳水化合物代谢、三羧酸循环代谢及神经递质代谢、脂肪酸代谢失衡)、机体内维生素B族不足、缺乏运;无相关疾病家族遗传史;
张某某,女,被虫蚊叮咬易起打包,难消掉;营养不良、亚临床甲减、肠道炎症(菌群紊乱、食物不耐受等级)、活细胞营养分析显示(维生素B族、维生素D中度缺乏;锌、铬缺乏,导致胰岛素抵抗,敏感性下降;整体抗氧化能力下降);机体代谢失衡(碳水化合物代谢、三羧酸循环代谢、神经递质代谢、脂肪酸代谢、肝脏解毒功能及肠道真菌或酵母菌感染等)、肝胆需要营养支持;无相关疾病家族史;
第一次怀孕,胎儿3个月后监测不到胎心,流掉;第二次怀孕,全程孕期检测全做,无任何异常指标,足月生产后,孩子患有先心病,部分肺静脉异位引流,未能下手术台;第三次怀孕,孕酮低,一个月后流产。
如图1所示,具体操作如下:
(一)标本采集
外周静脉血5ml至EDTA抗凝管;
(二)外周血基因组提取
按照Qiagen全基因组核酸提取试剂盒使用说明,对外周血样本提取基因组DNA;
按照Puregene DNA提取试剂盒使用说明对羊水细胞提取基因组DNA。
外周血样本DNA提取具体步骤如下:
1.按样本编号排好EP离心管,并标记;
2.向每个1.5ml的EP管中加入PK酶溶液20ul,然后分别加入脐血、外周血和含生理盐水的绒毛样本200ul;
3.向每个EP管中加入蛋白酶K液200ul,盖好EP管盖,在漩涡振荡器上振荡15秒,随后瞬时离心;
4.将各EP管放入悬浮泡沫孔中,置56℃水浴箱10-30min,期间可适当翻转;
5.取出各离心管,瞬时离心后,向各管中加入无水乙醇200ul,振荡混匀15秒,瞬时离心;
6.将EP管中的酶解混合物转移至Q柱上,8000rpm,离心1分钟;
7.换废液收集管,加AW1液500ul,8000rpm,离心1分钟;
8.换废液收集管,加AW2液500ul,13000rpm,离心3分钟;
9.将Q柱转移至新标记好的1.5ml离心管中,加入60ulAE液,室温静置10分钟后,8000rpm,离心1分钟;
10.丢弃Q柱,将DNA留置于EP管中。
(三)DNA浓度与纯度测定
取2ulDNA提取液,根据NanoDrop公司的ND-1000型紫外分光光度计的操作说明测定DNA的浓度与纯度,记录测定值后余DNA溶液放置于-20℃冰箱中备用。(注:DNA浓度介于50~100ng/ul,且纯度介于1.8~2.0。)
(四)琼脂糖凝胶电泳质检基因组DNA
1.配制浓度2%琼脂糖:用电子天平秤0.8g琼脂糖,放入一个洁净的三角烧瓶中,加入40ml 0.5*TBE,置微波炉中加热使其溶解至透亮后取出。
2.制备凝胶板:将底板放入水平放置的制胶所用的模板中,垂直对应插槽插入梳子;待凝胶冷却至50-60℃时,向其中加入3ul Gold View,充分摇匀后,将凝胶液缓慢倒入凝胶板上,室温静置30-40分钟,至凝胶完全凝固;然后将凝胶板上的梳子垂直拔出,将凝胶板放入装有足够0.5*TBE的电泳槽(中点样端朝向电泳槽的阴极)。
3.点样:按顺序用移液器取2ul样本DNA于干净的点样板上,再分别加入1ul电泳加样缓冲液,用移液器吹打混匀后,依次加2%琼脂糖凝胶板的加样孔中。
4.电泳:加完样本后,接通电源,电压120mv左右,观察染料与加样孔的距离适时终止。
5.观察结果:将完成电泳的凝胶板放入凝胶成像分析系统下观察DNA条带,并拍照记录。
(五)基因芯片实验
1.根据Affymetrix公司提供的标准实验操作流程对样本DNA进行消化、连接、扩增、纯化、片段化、标记信号、与芯片杂交及洗涤、染色与扫描芯片操作。
基因组DNA的准备:根据所测定的DNA浓度与纯度值,若浓度低10ng/ul应放弃使用,或重新提取;高于100ng/ul可加相应的溶液稀释至50ng/ul左右使用。使用前将每个样本分装15ul至新的EP管中,并作标记作为本次实验用。只有浓度、纯度和电泳质检均合格的DNA样本才能进行以下的实验操作。
2.限制性内切酶消化:
1)将5ul基因组DNA加入已标记的孔板中;
2)将10X NspⅠBuffer和100X BSA在室温下解冻,震荡混匀离心后置冰盒中;Nsp I一直保持在-20℃冰箱直到使用前将其取出,震荡一次,瞬时离心;
3)取1.5mL EP管,标记后放置在冰块上,向其中加入Affymetrix Nuclease-FreeWater 110.9ul、10X Nsp I Buffer 19.2ul、100X BSA 1.9ul、NspI 9.6ul,共141.6ul消化混合液;
4)高速震荡EP管中的消化混合液3次,每次持续1s,瞬时离心;
5)将混合液分装至已标记的8联管中,每管大约分装16.3ul,瞬时离心;
6)用排枪从8联管中吸取14.75ul混合液加入已有样本DNA的孔板中,此时每份样本的总容量为19.75ul;
7)对PCR System 9700进行预热;
8)用塑料封膜将孔板密封;分5部分高速震荡孔板,每部分持续1s;
9)离心,2000rpm,1min;
10)把孔板放入PCR仪中,运行CytoScan Digest程序:37℃,2h;65℃,20min;4℃,维持。
3.连接反应:
1)从PCR仪上取下孔板,确保孔板密封完好,2000rpm离心1min;
2)取1.5mLEP管,标记后放置在冰块上;
3)准备连接反应混合液:吸取预先准备好的10X T4 DNA Ligase Buffer 25ul、50μM Adaptor NspI 7.5ul,T4 DNA Ligase20ul于EP管中,高速震荡、瞬时离心;
4)将混合液分装至已标记的8联管中,每管约6.3ul,瞬时离心后,用10ul排枪从8联管中吸取5.25ul连接反应混合液至相应的样本孔板中,此时每份样本的总容量为25ul;
5)预热PCR仪,密封孔板,充分震荡混匀样本中的液体,离心,2000rpm,1min;
6)运行CytoScan Ligate程序:16℃,3h;70℃,20min;4℃,维持。(注:若不能继续PCR反应,可把样本放置-20℃保存。)
4.PCR反应:
1)从PCR仪上取下孔板,确保孔板密封完好,离心2000rpm,1min;
2)稀释连接反应产物:向每份产物中加入75ul ChilledNuclease-Free Water;
3)密封孔板;高速震荡孔板,离心,2000rpm,1min;
4)从每份样本中吸取10ul稀释液,对应加入新标记的4排8联PCR孔板中,每孔均为10ul,共从每份样本中移取40ul稀释液(注:原孔板中剩下的样本可密封放-20℃保存,直至实验结束);
5)配置PCR反应混合液:除酶以外的所有试剂均预先解冻混匀准备好,将15mL离心管放在冰块上,向其中加入Nuclease-Free water 1453.6ul,10X TITANIUMTM Taq PCRBuffer 368.0ul,GC-Melt Reagent 736.0ul,dNTP Mixture515.2ul,PCR Primer002165.6ul,50X TITANIUMTM Taq DNA聚合酶73.6ul,总共混合液3312.0ul,震荡混匀;
6)将PCR反应混合液加入加样槽中,使用100ul排枪向每份样本加90ul混合液,共转移4次,此时每孔的总容量为100ul;
7)密封PCR孔板,充分震荡,离心2000rpm,1min;
8)将密封后的孔板置于冰块上,进入Post-PCR室;
9)确保PCR仪已预热;把孔板放入PCR仪上,运行CytoScan PCR程序:94℃3min;(94℃30s,60℃45s,68℃15s)×30个循环;68℃7min;4℃维持(PCR反应完样本可放置于4℃保存)。
5.PCR产物电泳质检:
1)分装5ul Nuclease-Free water至已标记的新8联管中;
2)从每个样本的PCR反应产物中转移3ul产物至相应的8联管中;
3)密封8联管,震荡混匀,离心;
4)把全部的8ul稀释PCR产物与Loading Buffer混合后在2%的凝胶上进行电泳;电泳结果大部分产物片段应在150-2000bp之间,合格后进行以下步骤,否则重做。
6.PCR产物纯化反应:
1)将每个样本的四份PCR产物均完全转移至标记好的1.5mLEP管中;
2)混匀磁珠,加720ul纯化磁珠至每份样本中;
3)确保每个EP管已盖紧,上下颠倒10次以充分混合,室温孵育10min;
4)EP管盖的尖端朝外,以最大的速度16100rcf,离心3min;
5)置EP管于磁力架上,吸去上清液而不要触碰磁珠,丢弃上清液至废液缸;
6)用1000ul移液器吸取1.0mL Purification Wash Buffer加入EP管中(注意:在Purification Wash Buffer使用之前确保已加入45mL无水乙醇);
7)盖好EP管盖,放入泡沫振荡器,以最大速度震荡2min;
8)离心,EP管盖尖端朝外,16100rcf,3min;
9)将EP管置于磁力架上,等磁珠吸附完全时,移走上清液而不要触碰到磁珠,丢弃上清液;
10)使EP管盖尖端朝外16100rcf离心30s,随后把EP管放回磁力架上;
11)使用20ul移液器,完全移走每个EP管底部的液体;
12)把每个EP管从磁力架上移至空的架子上,打开每个管盖,室温静置10min,使管中剩余的液体蒸发;
13)使用200ul移液器,加52ul Elution Buffer至每个EP管,使液体直接加到磁珠上;
14)盖上EP管,置泡沫振荡器上,以最大的速度震荡10min使磁珠悬浮;如果磁珠没有完全悬浮,轻弹EP管使磁珠离开管壁,额外再震荡2min;
15)离心,EP管盖尖端朝外,16100rcf,3min;
16)把EP管放回磁力架上10min,静置,直到所有的磁珠均吸附在管壁的一侧;
17)转移47ul洗脱后的样本至一排新的已标记的孔板上;
18)密封孔板,高速震荡孔板混匀样本,离心,2000rpm 1min(注:若不连续做以下的操作,可置样本于-20℃保存)
7.对纯化产物进行定量分析:
1)分装18ul Nuclease-Free Water至新的已标记的8联管中;
2)从每份纯化样本中转移2ul至相应的8联管中;
3)密封8联管,震荡,离心;
4)使用NanoDrop分光光度计测量稀释后纯化样本的浓度和纯度:用Nuclease-Free Water空白对照后,取2ul稀释后的样本测量其在320nm处的OD值;
5)评估OD值:平均纯化产物OD值应该大于等于300ng/ul,如果小于250ng/ul则不建议进行以下的步骤;OD260/280比值应介于1.8-2.0之间;OD 320应尽量接近0。
8.片段化反应:
1)预冷离心机至4℃,预热PCR仪;
2)将纯化、定量后的样本从-20℃冰箱中取出,室温解冻后,确保孔板密封,震荡、离心,把孔板置冰块上;
3)直到使用前Fragmentation Reagent一直放置在-20℃,其他所有试剂使用之前均已溶解,震荡混匀后置于冰块上,操作均在冰上进行;
4)取1.5mL EP管,并作标记,根据片段化试剂管标签上的浓度配制片段化混合液于EP管中;
5)高速震荡混匀混合液3次,每次持续1s;
6)将EP管中的片段化混合液分装到8联管中,每管36ul,使用移液器从8联管中转移10ul片段化混合液至每份样本,此时每个样本的总容量应为55ul;
7)使用塑料膜密封孔板,充分震荡混匀;
8)在已经预冷的离心机离心,2000rpm,1min;
9)确保PCR仪已经预热,把孔板放入PCR仪中,运行CytoScan Fragment程序:37℃35min,95℃15min,4℃保存。
9.片段化产物电泳质检:
1)离心样本后,从孔板中转移每个已经片段化的样本4ul至8联管中,并作标记;
2)向8联管的每份样本中加入28ul Nuclease-Free Water,密封8联管,震荡混匀、离心;
3)从8联管中取8ul稀释后的片段化样本在4%的凝胶上进行电泳,5V/cm电泳45min;
4)核查电泳结果,平均片段化产物长度应在25-125bp之间。若此步质检结果良好,则进行下一步骤;若片段化产物长度不符合要求,则不建议进行下一步。
10.标记反应:1)把5X TdT Buffer和30mM DNA Labeling Reagent在室温解冻后震荡3次,每次1s,瞬时离心后放置于冰上;TdT enzyme一直放置在-20℃,直到使用时从冰箱中取出,快速震荡、瞬时离心后放置在冰盒中;
2)配制标记混合液:取1.5mL离心管,向其中加入5X TdT Buffer 134.4ul、30mMDNA Labeling Reagent 19.2ul和TdT 33.6ul,总共187.2ul混合液;
3)震荡标记反应混合液,瞬时离心;把混合液分装至8联管中,每管约23ul,离心,用移液器向每份样本中加入19.5ul标记混合液,此时每个样本中的总容量应为70.5ul;
4)密封孔板,分5个部分高速震荡;离心2000rpm 1min;
5)把孔板放入已经预热的PCR仪中,运行CytoScan Label程序:37℃4h,95℃15min,4℃维持(如果不准备马上进行杂交反应,储存标记孔板于-20℃过夜冰箱)。
11.杂交反应:
1)从4℃冰箱中取出样本数量的芯片,置于干净的工作台面上10-15min,使其接近室温;
2)接通杂交箱电源,50℃预热至少1h,并使其中的转杆处于旋转状态;
3)在计算机上注册芯片;
4)打开芯片包装,在芯片背面标记上相应样本的次序及编号;
5)向每张芯片背面右上方加样孔插入一个200ul的枪头,并在芯片上方的边缘贴上小的圆形粘贴纸的1/2;
6)把杂交所需的试剂置室温,融解后震荡3次,每次1s,瞬时离心后放在冰块上;
7)配制杂交混合液:取15mL离心管放置于冰上,向其中加入Hyb Buffer Part11584.0ul、Hyb BufferPart2 144.0ul、Hyb Buffer Part3 67.2ul、Hyb Buffer Part49.6ul和Oligo Control Reagent 0100 19.2ul,总共混合液1824.0ul;
8)高速震荡杂交混合液3次,每次持续3s,随后把混合物倒入放置在冰块上的加样槽中;
9)用移液器向每个样本中加入190ul杂交混合液;
10)密封孔板,反复震荡确保孔板中样本与杂交混合液充分混匀,离心,2000rpm1min;
11)把孔板放入已经预热的PCR仪中,运行CytoScan Hyb程序:95℃10min,49℃保存;
12)将样本加入芯片之前确保样本在49℃时至少维持1min后,用200ul移液器向每张芯片加入200ul样本,此时样本仍然置于PCR仪上;
13)擦净加样孔周围的所有液体,用上方的圆形贴纸粘住加样孔,同时拔去之前插入的空200ul枪头,也用贴纸贴上小孔,按紧后立即将芯片放入杂交箱中;
14)等所有样本均加完杂交液放入杂交箱后,让芯片在杂交箱中以50℃、60rpm转速杂交16-18小时。
12.洗涤、染色与扫描芯片:
1)准备洗涤芯片之前要确保洗涤用的Wash A,Wash B和去离子水(DI Water)足够;
2)对洗涤工作站进行一次Shutdown维护;
3)对洗涤工作站进行一次Prime维护;
4)工作站在Prime期间可准备洗涤芯片用的染液:将下列试剂分别加入1.5ml的离心管中:A.500ul Stain Buffer 1溶液加入外面套有锡箔纸的管中;B.500ul StainBuffer2直接加入管中;C.800ul Array Holding Buffer加入外层套有锡箔纸的管中;
5)计算机选择命令,将芯片从杂交箱中取出,揭下背面贴的两张小贴纸,放入工作站的Block中,把A、B、C三种染料从左至右顺次放入针孔对应的槽中,按照工作站上面的显示屏指示完成操作;
6)洗涤过程完成后从Block中取出芯片,注意观察芯片的窗口中是否有气泡。若无气泡,即可直接用小的圆形粘贴纸贴住背面的两个加样孔;若有气泡,则立即将芯片重新放入Block中,关闭Block,系统会自动去除气泡,运行停止后,取出芯片观察没有气泡后即可用粘贴纸贴住背面的两个加样孔,室温避光放置。
若有条件工作站一次性可洗涤8张芯片,则可对洗涤工作站进行一次Shutdown维护即可;若一次性只能洗涤4张芯片,则重复此过程中的步骤4-6,完全洗涤完后,对工作站进行一次Shutdown维护,即可关闭工作站的电源;打开扫描芯片软件,选择命令,将洗涤完的芯片放入已经预热好的扫描仪中,进行扫描,所有芯片扫描完后即可关闭扫描仪电源。
13.芯片杂交结果分析
1)从图2芯片杂交图中可以得知:被检测者基因组DNA的HLA区域基因上高度共有HLA-A位点。
2)芯片初级质控
3)在CHAS软件中将Marker size和Marker Count设置为整个区间,然后综合CNState,Marker size和Marker Count从而得到目的marker为图3中被红色标记的内容。
由上可知,本发明的方法对被检测者HLA区域基因上的基因组DNA的分析,通过CHAS软件出具目的marker分析报告显示出:被检测者习惯性流产基因拷贝数变异风险的高低,由医师向被检测者详细说明和提出产前诊断的建议性方案。该方法的检测结果可靠性高、可重复性验证,对即将要孩子的夫妻进行生育风险预警以及发生习惯性流产的患者找出病因,为产前诊断以确保优生优育具有重要作用。
Claims (6)
1.一种人类HLA区域基因拷贝数变异检测方法,其特征在于:
包括如下步骤:
(1)采集人的组织、血液或其他体液基因组作为样品,将样品与CytoscanHD芯片进行杂交,杂交完成后对芯片进行洗涤,然后在GCD3000系统的数据收集系统中进行数据收集,生成CEL文件;
(2)将CEL文件输入CHAS软件进行初级质控,将质控合格的芯片生成的Cychp文件导入CHAS软件,根据拷贝数特征、marker数量以及CNV gain和CNV loss片段大小三个指标筛选出目的marker。
2.根据权利要求1所述的人类HLA区域基因拷贝数变异检测方法,其特征在于:步骤(1)中所述采集的样品与CytoscanHD芯片进行杂交之前经过标本采集、外周血基因组提取、DNA浓度与纯度测定和琼脂糖凝胶电泳质检基因组DNA获得质控良好的基因组DNA。
3.根据权利要求2所述的人类HLA区域基因拷贝数变异检测方法,其特征在于:所述获得的质控良好的基因组DNA的浓度介于50~100ng/ul,且纯度介于1.8~2.0。
4.根据权利要求2或3所述的人类HLA区域基因拷贝数变异检测方法,其特征在于:所述获得的质控良好的基因组DNA经过酶切、连接、扩增、片段化并进行标记后,将通过质控的DNA与芯片进行杂交。
5.根据权利要求4所述的人类HLA区域基因拷贝数变异检测方法,其特征在于:所述质控的DNA与芯片进行杂交的条件为50℃60r/min,杂交时间为16~18h。
6.根据权利要求1所述的人类HLA区域基因拷贝数变异检测方法,其特征在于:步骤(2)中所述导入CHAS软件的CNV片段大小以及marker数报告阈值设置为全区间。
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Non-Patent Citations (2)
Title |
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余永国等: ""123例多发畸形和/或不明原因智力落后患者全基因组芯片扫描结果分析"", 《中华医学会第十七次全国儿科学术大会论文汇编(上册)》 * |
钱小兵等: ""湖南地区汉族人群中HLA-A、B、DRB1等位基因与原因不明习惯性流产相关性研究"", 《现代免疫学》 * |
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