CN106967202A - 纳米凝胶酶及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米凝胶酶及其制备和应用。该纳米凝胶酶的制备方法,包括步骤:(1)利用N‑丙烯酰氧基琥珀酰亚胺对辣根过氧化物酶进行化学修饰,制备辣根过氧化物酶‑N‑丙烯酰氧基琥珀酰亚胺大单体;(2)用辣根过氧化物酶‑N‑丙烯酰氧基琥珀酰亚胺大单体和具有两性离子特性的烯类单体进行自由基聚合反应,制备得到纳米凝胶酶。该纳米凝胶酶的制备方法,绿色环保、反应条件温和、成本低,易于工业化。该纳米凝胶酶具有良好的水溶性、亲水性、生物相容性,可以有效的清除染料,可直接作为染料工业废水的降解材料。
Description
技术领域
本发明涉及纳米酶技术领域,具体涉及一种辣根过氧化物酶的纳米凝胶酶及其制备和应用。
背景技术
随着印染与染料工业的发展,染料废水已成为当前主要的水体污染源,对环境及生物危害极大。然而,12%的工业废水并没有得到任何的处理,且经过治理的废水合格率仅63%。印染工业是我国的传统支柱行业,据不完全统计,我国每天染料废水排放量达到300万m3-500万m3,而这类废水的主要来源有纺织工厂和印染包装行业。
染料废水有两个特点。第一,有机物含量高;染料大多是偶氮化合物,这类化合物会对生物的健康产生巨大威胁。第二,偶氮化合物化学稳定性极高,属于典型的高毒性、难降解的有机污染物,相关成分具有高度的持久性和扩散能力,会在水体、土壤等自然环境中持续滞留,并能引起生物富集,含有致癌因子。含偶氮染料的废水在我国水污染控制中被列为重点解决的有害废水之一。
辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP),又称为过氧化物酶。该类生物酶提取自微生物或植物,具有高效的催化能力,能促使体系释放大量氧自由基,可以看做是氧化法的高级形式,兼具生物法的诸多优点。近几年来,过氧化物酶在环境水处理领域引起了极大关注,被认为是最有前景的生物催化剂(Kumar,V.,et al.A horseradishperoxidase immobilized radiation grafted polymer matrix:a biocatalytic systemfor dye waste water treatment.RSC Advances,2016,6,2976)。但是天然的过氧化物酶稳定性差,在催化过程中易失活,不宜重复利用,大大限制了其在催化领域的应用。
发明内容
本发明提供了一种纳米凝胶酶,通过引入双键及具有两性离子特性的烯类单体对辣根过氧化物酶(HRP)进行分子层面的凝胶化包裹,提高其环境适应性,有效抵抗降解产物的吸附,利于回收循环再利用,利用其催化氧化能力,达到高效、绿色降解染料成份的目的。
本发明以商品化的HRP作为初始原料。HRP是一种植物过氧化物酶,为单一肽链与辅基卟啉构成的血红素蛋白,分子量为44000Da,存在广泛,价格相对低廉,因其具有的高效催化性能和催化作用温和的特点,早在80年代中期,人们就发现HRP可以处理废水中多种含有羟基的化合物,比如氯酚,而且对于催化降解工业染料废水如汽巴染料有较好的作用。
本发明所述的纳米凝胶酶,是以HRP为原料进行化学改性,引入双键,然后与具有两性离子特性的烯类单体进行自由基共聚而制得。具体技术方案如下:
一种纳米凝胶酶的制备方法,包括步骤:
(1)利用N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)对辣根过氧化物酶进行化学修饰,制备辣根过氧化物酶-N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(HRP-NAS)大单体;HRP-NAS大单体是一个含有双键的化合物;
(2)用步骤(1)得到的HRP-NAS大单体和具有两性离子特性的烯类单体进行自由基聚合反应,制备得到纳米凝胶酶。
步骤(1)中,利用N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺对辣根过氧化物酶进行化学修饰的反应条件包括:在溶液状态下搅拌反应至少2h,利于反应的进行。为了达到更好的发明效果,优选:将HRP溶于磷酸缓冲溶液(PBS)中得到HRP溶液;将NAS溶于二甲基亚砜(DMSO)得到NAS溶液;搅拌HRP溶液并向HRP溶液中滴加NAS溶液,搅拌反应至少2h。所述的NAS溶液最好一次性连续滴加完,更利于反应的进行。所述反应的反应温度并没有严格的限制,一般自然环境温度即可,比如常温或者室温等18℃-35℃的自然环境温度。
所述磷酸缓冲溶液可采用现有方法配制也可采用市售产品,比如:0.1mol/L-0.2mol/L的磷酸缓冲溶液。
所述NAS的用量为:NAS的摩尔数量大于或等于HRP中氨基的摩尔数量,等量或者过量的NAS可以完成对HRP中所有氨基的化学修饰。优选为:NAS的摩尔数量是HRP中氨基摩尔数量的1倍~20倍。进一步优选为:NAS的摩尔数量是HRP中氨基摩尔数量的3倍~8倍。
优选,步骤(2)中,所述具有两性离子特性的烯类单体的单体末端同时具有正电荷和负电荷的两性离子官能团。进一步优选,所述具有两性离子特性的烯类单体选用含有丙烯酰胺基团且单体末端同时具有正电荷和负电荷的两性离子官能团的化合物、含有丙烯酸酯基团且单体末端同时具有正电荷和负电荷的两性离子官能团的化合物中的一种或者两种。例如可选用羧酸甜菜碱丙烯酰胺(CBAA)、羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯(CBMA)、磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(SBMA)、2-甲基丙烯酸羟基乙酯磷脂酰胆碱(MPC)中的一种或者两种以上。
CBAA结构式如式Ⅰ所示:
CBMA结构式如式II所示:
SBMA结构式如式III所示:
MPC结构式如式IV所示:
所述自由基聚合反应中还可以添加有引发剂和稳定剂两种原料或者还可以添加有引发剂、稳定剂和交联剂三种原料。更利于自由基聚合反应的进行。
所述引发剂可选用自由基聚合反应常用的引发剂,优选过硫酸铵(APS)。
所述交联剂可选用自由基聚合反应常用的交联剂,优选N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBA);N,N'-亚甲基双丙烯酰胺结构式如式V所示:
所述稳定剂可选用自由基聚合反应常用的稳定剂,优选四甲基乙二胺(TEMED)。
步骤(2)中,所述自由基聚合反应的反应条件包括:在溶液状态下搅拌反应至少2h,利于反应的进行。优选在磷酸缓冲溶液中搅拌反应至少2h。为了达到更好的发明效果,进一步优选:将烯类单体和交联剂溶于磷酸缓冲溶液(PBS)中得到第一溶液;将引发剂溶于水得到第二溶液;将第一溶液、第二溶液和稳定剂加入步骤(1)的反应液中,搅拌反应至少2h。所述自由基聚合反应的反应温度并没有严格的限制,一般自然环境温度即可,比如常温或者室温等18℃~35℃的自然环境温度。
步骤(2)中,所述烯类单体与HRP的质量比为20:1,烯类单体与交联剂的质量比为1:0~1:0.3;当质量比为1:0时,即为不添加交联剂的情形。所述引发剂和稳定剂的用量并没有严格的限制,按照自由基聚合反应常用的用量添加即可。
步骤(2)中,所述自由基聚合反应完成后,采用本领域常用的提纯方法,比如:超滤离心、洗涤,即可得到纯化后的产物纳米凝胶酶。
本发明原料均采用市售产品。
本发明所述的纳米凝胶酶,是根据所述纳米凝胶酶的制备方法制备得到的。该纳米凝胶酶含有大量两性离子官能团,具有超亲水性,其特有的结构能够维持HRP的空间结构,提高其环境稳定性,有效抵御降解产物对HRP的吸附性污染,在工业废水尤其是染料工业废水的处理中具有广阔的应用前景。
所述的纳米凝胶酶可以直接作为废水处理材料(例如染料工业废水处理材料)使用,也可以采用纳米凝胶酶为有效组分与现有的辅料或者辅材等一起用于制备废水处理材料(例如用于制备染料工业废水处理材料)。
本发明纳米凝胶酶可以处理辣根过氧化物酶能处理的所有染料(例如碱性红染料、靛蓝胭脂红染料等各种染料)的工业废水,并且降解效果显著优于HRP。
本发明具有以下优点:
(1)以HRP和具有两性离子特性的烯类单体为原料,合成具有超亲水性的纳米凝胶酶,在不影响酶溶解性的前提下,在分子层次上对酶进行凝胶化包覆,大大提高酶的稳定性,提高其环境适应性,可有效抵抗降解产物的吸附,利于回收循环再利用,利用其氧化能力,达到高效、绿色降解工业废水中染料的目的;
而且本发明辣根过氧化物酶的纳米凝胶酶材料本身绿色无生物毒性,不会对环境造成二次污染。
(2)本发明HRP纳米凝胶酶的合成步骤简单,可行性高、周期短,合成过程绿色环保、反应条件温和、成本低,易于工业化。按照本发明的方法进行化学修饰合成凝胶酶可以大大提高天然酶HRP的热稳定性及对染料的降解性能。
(3)本发明纳米凝胶酶具有良好的水溶性、亲水性、生物相容性,可以有效的清除染料,可直接作为染料工业废水的降解材料。对于同一种染料,HRP和本发明纳米凝胶酶都对其有降解的效果,但本发明纳米凝胶酶的降解效果要远远高于HRP;在相同的降解时间下,本发明纳米凝胶酶对染料的降解效果远优于HRP,效果显著。
附图说明
图1为实施例2中各物质在不同浓度下的浓度-吸光值曲线图;其中,纵坐标为波长335nm处的吸光值(OD335),横坐标为浓度(Concentration),μg/mL。
图2为实施例3中相同浓度纳米凝胶酶和HRP在55℃下活性检测效果图;其中,纵坐标为波长450nm处的吸光值(OD450),横坐标为时间,分钟(min)。
图3为实施例4中不同浓度纳米凝胶酶和HRP在55℃恒温20min的活性检测效果图;其中,纵坐标为波长450nm处的吸光值(OD450),横坐标为浓度(Concentration),μg/mL。
图4为实施例7中纳米凝胶酶和HRP对碱性红染料的降解效果图;其中,纵坐标为波长545nm处的吸光值(OD545),横坐标为时间,分钟(min)。
图5为实施例7中纳米凝胶酶和HRP在不同pH值下对碱性红染料的去除率效果图,其中,纵坐标为去除率百分比(Percentage),横坐标为pH值。
图6为实施例8中纳米凝胶酶(CBAA单体)和HRP对靛蓝胭脂红染料的降解效果图;其中,纵坐标为波长610nm处的吸光值(OD610),横坐标为时间,分钟(min)。
图7为实施例1中合成产物纳米凝胶酶的粒径分布图;其中,纵坐标为强度(Intensity),%;横坐标为半径(radius),nm。
具体实施方式
以下结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述,但本发明并不限于此。
实施例1
(1)HRP-NAS单体的制备:
HRP的分子量为44000Da;
称取HRP5.0mg置于微量反应瓶内,量取2mL的0.2mol/L PBS加入微量反应瓶内,在室温下搅拌使HRP溶解;将5.0mg的NAS溶于0.25mL的DMSO,得到NAS溶液;以NAS的摩尔数量与HRP中氨基的摩尔数量之比为6:1的NAS溶液,缓慢滴加于微量反应瓶中,室温搅拌,反应2h,得到HRP-NAS溶液。
(2)HRP纳米凝胶酶(GEL-1)的制备:
将100mg的CBAA和20mg的MBA溶于2.5mL的0.2mol/L PBS中,得到第一溶液;4mgAPS溶于0.5mL去离子水中,得到第二溶液;将上述第一溶液和第二溶液两种溶液和15μL的TEMED全部加入步骤(1)的HRP-NAS溶液中,室温搅拌反应2h后,将反应液全部转移至超滤离心管中进行离心、洗涤6次,得到的产物即为HRP纳米凝胶酶(GEL-1)。该产物为纳米级,:动态光散射(DLS)检测结果如图7所示。
实施例2
HRP-NAS单体中双键数目的确定。
将甘氨酸(Gly)、HRP和实施例1制备的HRP-NAS溶液用0.01mol/L的PBS溶液进行梯度稀释;将2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)用0.1mol/L的碳酸氢钠水溶液稀释100倍得到TNBS溶液,同时配制质量百分浓度10%的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液和1mol/L的HCl水溶液。
在96孔板中,分别加入120μL经梯度稀释的各浓度的Gly、HRP和HRP-NAS溶液并做好标记,然后每孔加入60μL TNBS溶液,在37℃恒温培养2h,然后加入60μL SDS水溶液和30μL HCl水溶液,终止反应,使用酶标仪测定OD值。
甘氨酸的结构式如式Ⅵ所示:
2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)的结构式如式Ⅶ所示:
氨基的接枝度通过直线的斜率来确定。通过甘氨酸作为基准进行对比,HRP和HRP-NAS的斜率逐渐减小,如图1所示。证明已通过反应合成目标化合物HRP-NAS,平均每个HRP上接枝了9.71个双键。
用单位浓度的甘氨酸溶液作标准曲线,根据甘氨酸标准曲线可以算出接枝的氨基数目(等同HRP-NAS单体中双键数目)。则蛋白表面的氨基数为:
HRP表面反应的氨基数12.18个,接枝后剩余氨基数2.47个,说明接枝氨基数为9.71个。
表1 HRP表面氨基与NAS的接枝度
Gly | HRP | HRP-NAS | |
Slope | 0.04 | 8.31×10-4 | 1.69×10-4 |
A | 1 | 48.13 | 236.68 |
Mw/(75*A) | 1 | 12.18 | 2.47 |
注:Slope表示样品溶液的氨基数消耗定量TNBS的速率;
A表示为消耗一个氨基的速率之比[Slope/Slope(Gly)]。
实施例3
实施例1制备的纳米凝胶酶(GEL-1)催化活性的检测。
将相同浓度的纳米凝胶酶(GEL-1)和HRP在55℃下恒温放置不同时间后,按以下方法检测其活性。
向96孔板中分别加入50μL相同浓度的纳米凝胶酶(GEL-1)和HRP并做好标记(GEL-1和HRP用0.01mol/L的PBS溶液进行稀释),然后每孔加入100μL四甲基联苯胺(TMB),5min后加入50μL1mol/L的HCl水溶液终止反应,然后用酶标仪测定OD值,检测结果见图2。
四甲基联苯胺结构式如式Ⅷ所示:
实施例4
实施例1制备的纳米凝胶酶(GEL-1)的环境适应性检测。
将不同浓度的HRP和纳米凝胶酶(GEL-1)在55℃下恒温一段时间后,根据实施例3中测定活性的配比和方法,利用TMB和酶标仪检测活性。检测结果见图3。
在相同浓度下,本发明纳米凝胶酶的热稳定性要远远高于HRP,在第180min时仍然保持一定的活性,如图2所示;对于不同浓度的纳米凝胶酶和HRP在55℃恒温相同时间,纳米凝胶酶的热稳定性也同样高于HRP,并且浓度越高,热稳定性越好,在10ng/mL的时候也保持一定的活性,如图3所示;所以证明将HRP按照本发明的方法进行化学修饰合成凝胶酶可以大大提高天然酶HRP的热稳定性。
实施例5
(1)HRP-NAS单体的制备:
HRP的分子量为44000Da;
称取HRP5.0mg置于微量反应瓶内,量取2mL的0.2mol/L PBS加入微量反应瓶内,在室温下搅拌使HRP溶解;将5.0mg的NAS溶于0.25mL的DMSO,得到NAS溶液;以NAS的摩尔数量与HRP中氨基的摩尔数量之比为8:1的NAS溶液,缓慢滴加于微量反应瓶中,室温搅拌,反应2h,得到HRP-NAS溶液。
(2)HRP纳米凝胶酶(GEL-2)的制备:
将100mg的SBMA和20mg的MBA溶于2.5mL的0.2mol/L PBS中,得到第一溶液;4mgAPS溶于0.5mL去离子水中,得到第二溶液;将上述第一溶液和第二溶液两种溶液和15μL的TEMED全部加入步骤(1)的HRP-NAS溶液中,室温搅拌2h后,将反应液全部转移至超滤离心管中进行离心、洗涤6次,得到的产物即为HRP纳米凝胶酶(GEL-3)。产物为纳米级,其粒径大小为67纳米-72纳米。
该实施例制备的HRP-NAS单体中双键数目的确定方法同实施例2。通过甘氨酸作为基准进行对比,HRP和HRP-NAS的斜率逐渐减小,证明已通过反应合成目标化合物HRP-NAS,平均每个HRP上接枝了2.89个双键。
该实施例制备的纳米凝胶酶(GEL-2)催化活性的检测方法同实施例3。该实施例制备的纳米凝胶酶(GEL-2)的环境适应性检测方法同实施例4。检测结果显示:在相同浓度下,本发明纳米凝胶酶的热稳定性要远远高于HRP,在第180min时仍然保持一定的活性;对于不同浓度的纳米凝胶酶和HRP在55℃恒温相同时间,纳米凝胶酶的热稳定性也同样高于HRP,并且浓度越高,热稳定性越好,在10ng/mL的时候也保持一定的活性;所以证明将HRP按照本发明的方法进行化学修饰合成凝胶酶可以大大提高天然酶HRP的热稳定性。
实施例6
(1)HRP-NAS单体的制备:
HRP的分子量为44000Da;
称取HRP5.0mg置于微量反应瓶内,量取2mL的0.2mol/L PBS加入微量反应瓶内,在室温下搅拌使HRP溶解;将5.0mg的NAS溶于0.25mL的DMSO,得到NAS溶液;以NAS的摩尔数量与HRP中氨基的摩尔数量之比3:1的NAS溶液,缓慢滴加于微量反应瓶中,室温搅拌,反应2h,得到HRP-NAS溶液。
(2)HRP纳米凝胶酶(GEL-3)的制备:
将100mg的MPC和20mg的MBA溶于2.5mL的0.2mol/L PBS中,得到第一溶液;4mgAPS溶于0.5mL去离子水中,得到第二溶液;将上述第一溶液和第二溶液两种溶液和15μL的TEMED全部加入步骤(1)的HRP-NAS溶液中,室温搅拌2h后,将反应液全部转移至超滤离心管中进行离心、洗涤6次,得到的产物即为HRP纳米凝胶酶(GEL-3)。使用DLS检测产物粒径,其大小78纳米-80纳米。
该实施例制备的HRP-NAS单体中双键数目的确定方法同实施例2。通过甘氨酸作为基准进行对比,HRP和HRP-NAS的斜率逐渐减小,证明已通过反应合成目标化合物HRP-NAS,平均每个HRP上接枝了3.6个双键。
该实施例制备的纳米凝胶酶(GEL-3)催化活性的检测方法同实施例3。该实施例制备的纳米凝胶酶(GEL-3)的环境适应性检测方法同实施例4。检测结果显示:在相同浓度下,本发明纳米凝胶酶的热稳定性要远远高于HRP,在第180min时仍然保持一定的活性;对于不同浓度的纳米凝胶酶和HRP在55℃恒温相同时间,纳米凝胶酶的热稳定性也同样高于HRP,并且浓度越高,热稳定性越好,在10ng/mL的时候也保持一定的活性;所以证明将HRP按照本发明的方法进行化学修饰合成凝胶酶可以大大提高天然酶HRP的热稳定性。
实施例7
实施例1制备的纳米凝胶酶(GEL-1)对碱性红(BR29)染料的降解:
配制两份50ppm的BR29染料水溶液,分别加入10mM(mmol/L)的过氧化氢水溶液,调节pH至5.64,在40℃时保持500rpm的搅拌速度,其中一份加入HRP,另一份加入纳米凝胶酶(GEL-1),每份的总体积为10mL,每份中HRP和纳米凝胶酶的浓度均为50μg/mL。
碱性红染料的结构式如式Ⅸ所示:
随着时间的推移,HRP可将碱性红染料降解至原来的二分之一,而本发明纳米凝胶酶能将碱性红染料几乎全部降解,如图4所示;可见,对于同一种染料,HRP和本发明纳米凝胶酶都对其有降解的效果,但本发明纳米凝胶酶的降解效果要远远高于HRP;在相同的降解时间下,本发明纳米凝胶酶对碱性红染料具有显著的降解效果。不同pH值条件下纳米凝胶酶和HRP的降解效果如图5所示;碱性红染料在碱性条件下的降解效果好于酸性条件,在酸性条件下纳米凝胶酶的降解效果要好于HRP的效果,说明在比较宽的pH值范围中,本发明纳米凝胶酶对该染料都有比较好的降解效果。
实施例5制备的纳米凝胶酶(GEL-2)、实施例6制备的纳米凝胶酶(GEL-3)对碱性红(BR29)染料的降解实验同实施例1制备的纳米凝胶酶(GEL-1)对碱性红(BR29)染料的降解实验。实验结果显示:随着时间的推移,HRP可将碱性红染料降解至原来的二分之一,而本发明纳米凝胶酶能将碱性红染料几乎全部降解;可见,对于同一种染料,HRP和本发明纳米凝胶酶都对其有降解的效果,但本发明纳米凝胶酶的降解效果要远远高于HRP;在相同的降解时间下,本发明纳米凝胶酶对碱性红染料具有显著的降解效果。不同pH值条件下,碱性红染料在碱性条件下的降解效果好于酸性条件,在酸性条件下纳米凝胶酶的降解效果要好于HRP的效果,说明在比较宽的pH值范围中,本发明纳米凝胶酶对该染料都有比较好的降解效果。
实施例8
实施例1制备的纳米凝胶酶(GEL-1)对靛蓝胭脂红染料的降解。
配制两份100ppm的靛蓝胭脂红染料水溶液,分别加入10mM的过氧化氢水溶液,调节pH至5.93,在40℃时保持500rpm的搅拌速度,其中一份加入HRP,另一份加入纳米凝胶酶(GEL-1),每份的总体积为10mL,每份中HRP和纳米凝胶酶(GEL-1)的浓度均为50μg/mL。
靛蓝胭脂红的结构式如式Ⅹ所示:
随着时间的推移,HRP可将靛蓝胭脂红染料降解至原来的二分之一,而本发明纳米凝胶酶能将靛蓝胭脂红染料几乎全部降解,如图6所示;可见,对于同一种染料,HRP和本发明纳米凝胶酶都对其有降解的效果,但本发明纳米凝胶酶的降解效果要远远高于HRP。
实施例9
实施例5制备的纳米凝胶酶(GEL-2)、实施例6制备的纳米凝胶酶(GEL-3)对靛蓝胭脂红染料的降解。
配制两份100ppm的靛蓝胭脂红染料水溶液,分别加入10mM的过氧化氢水溶液,调节pH至5.93,在40℃时保持500rpm的搅拌速度,其中一份加入HRP,另一份加入纳米凝胶酶(GEL-2)或者纳米凝胶酶(GEL-3),每份的总体积为10mL,每份中HRP和纳米凝胶酶的浓度均为50μg/mL。
随着时间的推移,HRP可将靛蓝胭脂红染料降解至原来的二分之一,而本发明纳米凝胶酶能将靛蓝胭脂红染料几乎全部降解;可见对于同一种染料,HRP和本发明纳米凝胶酶都对其有降解的效果,但本发明纳米凝胶酶的降解效果要远远高于HRP。
本发明制备方法中参数的变化并不影响纳米凝胶酶的制备,因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现纳米凝胶酶的制备。在此不再赘述。
Claims (10)
1.一种纳米凝胶酶的制备方法,其特征在于,包括步骤:
(1)利用N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺对辣根过氧化物酶进行化学修饰,制备辣根过氧化物酶-N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺大单体;
(2)用步骤(1)得到的辣根过氧化物酶-N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺大单体和具有两性离子特性的烯类单体进行自由基聚合反应,制备得到纳米凝胶酶。
2.根据权利要求1所述的纳米凝胶酶的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,利用N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺对辣根过氧化物酶进行化学修饰的反应条件包括:在溶液状态下搅拌反应至少2h。
步骤(2)中,所述自由基聚合反应的反应条件包括:在溶液状态下搅拌反应至少2h。
3.根据权利要求2所述的纳米凝胶酶的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,反应条件包括:将辣根过氧化物酶溶于磷酸缓冲溶液中得到辣根过氧化物酶溶液;将N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺溶于二甲基亚砜得到N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺溶液;搅拌辣根过氧化物酶溶液并向辣根过氧化物酶溶液中滴加N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺溶液,搅拌反应至少2h;
步骤(2)中,所述自由基聚合反应的反应条件包括:在磷酸缓冲溶液中搅拌反应至少2h。
4.根据权利要求1所述的纳米凝胶酶的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的用量为:N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的摩尔数量大于或等于辣根过氧化物酶中氨基的摩尔数量。
5.根据权利要求1所述的纳米凝胶酶的制备方法,其特征在于,所述具有两性离子特性的烯类单体的单体末端同时具有正电荷和负电荷的两性离子官能团。
6.根据权利要求1或5所述的纳米凝胶酶的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述具有两性离子特性的烯类单体选用含有丙烯酰胺基团且单体末端同时具有正电荷和负电荷的两性离子官能团的化合物、含有丙烯酸酯基团且单体末端同时具有正电荷和负电荷的两性离子官能团的化合物中的一种或者两种。
7.根据权利要求6所述的纳米凝胶酶的制备方法,其特征在于,所述具有两性离子特性的烯类单体选用羧酸甜菜碱丙烯酰胺、羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯、磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯、2-甲基丙烯酸羟基乙酯磷脂酰胆碱中的一种或者两种以上。
8.根据权利要求1所述的纳米凝胶酶的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述自由基聚合反应中还添加有引发剂和稳定剂两种原料或者还添加有引发剂、稳定剂和交联剂三种原料。
9.一种纳米凝胶酶,其特征在于,所述的纳米凝胶酶是根据权利要求1-8任一项所述的纳米凝胶酶的制备方法制备得到的。
10.根据权利要求9所述的纳米凝胶酶在直接作为废水处理材料或者用于制备废水处理材料中的应用。
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