CN106957354B - Hoxb-as3多肽及编码其的开放阅读框 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表达HOXB‑AS3多肽的方法及提供了编码其的开放阅读框序列，确认了编码HOXB‑AS3多肽的开放阅读框、起始密码子活性和HOXB‑AS3多肽在组织中的存在情况，确认HOXB‑AS3多肽是内源性天然存在，是真实存在的，其对应的起始密码子是有活性的，此起始密码子可以诱导HOXB‑AS3多肽的表达。

Description

HOXB-AS3多肽及编码其的开放阅读框
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及表达HOXB-AS3多肽方法及提供编码其的开放阅读框。
背景技术
随着RNA深度测序的发展，大量先前未知的RNA转录本被鉴定。这些转录本中大概只有1％可以编码为蛋白质，其余绝大部分被认为是非编码RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)。这些不具有蛋白编码潜能的基因组序列曾被一度认为是基因组在进化过程中累积的无功能的“垃圾序列”或者基因组中的“暗物质”。
随着研究的深入，越来越多的证据表明这些曾经的“垃圾序列”可能具有重要的生物学功能。早在几十年前，人们就发现很多非编码RNA对生命活动具有重要作用，例如参与蛋白质合成的核糖体RNA(rRNAs)、转运RNA(tRNA)以及在信使RNA(mRNA)剪切和核定位过程中起到关键作用的小核RNA(snRNA)，这些非编码RNA往往被称为持家非编码RNA(housekeeping ncRNAs)。结合2012年发布的ENCODE研究数据，人们意外地发现在占据人类基因组98.5％的非蛋白编码序列中，绝大多数被转录成长度大于200个碱基、不具备蛋白质编码功能的长链非编码RNA(Long non-coding RNAs，lncRNAs)。
目前研究发现lncRNAs主要作为信号分子、诱饵分子、向导分子和脚手架分子，在表观遗传、转录水平和转录后水平调节靶标基因的功能活性，从而参与正常生理和疾病的发生发展等过程。
HOXB-AS3(HOXB gene cluster antisense RNA 3)属于HOXB基因簇中的一个反义RNA，在NCBI人类基因数据库中注释为一个lncRNA(NR_033201.2)。到目前，还没有出现lncRNA HOXB-AS3能够编码出一个多肽的公开报道。
针对现有技术中存在的上述问题，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供能启动HOXB-AS3多肽编码的起始密码子以及其开放阅读框序列，提供一种可令长链非编码RNA HOXB-AS3表达出一个多肽的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
HOXB-AS3多肽，所述HOXB-AS3多肽具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
优选地，所述HOXB-AS3多肽的氨基酸序列在灵长目动物中存在高度保守性。
编码HOXB-AS3多肽的开放阅读框，所述编码HOXB-AS3多肽的开放阅读框具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
一种重组载体，所述重组载体由如上述的开放阅读框与质粒构建得到。
一种重组载体，所述重组载体由上述的开放阅读框在5′端连接非翻译序列后与质粒构建得到；所述开放阅读框的5′端连接的非翻译序列如SEQ ID NO.3所示。
一组引物对，所述引物对用于扩增得到上述的开放阅读框，所述引物对的两条引物分别由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列组成。
一组引物对，所述引物对用于扩增得到5′端连接非翻译序列的开放阅读框，所述引物对的两条引物分别由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.5所示的序列组成。
制备上述重组载体的方法，包括利用PCR扩增合成具有如权利要求3所述的开放阅读框，插入到基因转移载体中，得到重组载体。
优选的，制备权利要求上述重组载体的方法，包括利用PCR扩增得到融合基因，插入到基因转移载体中，得到重组载体。
本发明的有益效果如下：
本发明突破了传统认为HOXB-AS3是一个长链非编码RNA的认识，研究开发出一种长链非编码RNA HOXB-AS3表达出一个多肽的方法，本发明提供了能启动HOXB-AS3多肽编码的起始密码子以及其开放阅读框序列，从而利用此起始密码子翻译表达出HOXB-AS3多肽。
附图说明
图1为实施例1中lncRNA HOXB-AS3序列中对应的HOXB-AS3氨基酸序列，开放阅读框(ORF)的核苷酸序列，起始密码子和终止密码子的位置；
图2为实施例1中HOXB-AS3多肽的氨基酸序列在物种中的保守性；
图3为实施例2中构建编码HOXB-AS3多肽的融合基因表达载体示意图；
图4A为实施例2中采用抗Flag抗体的免疫荧光分析融合基因表达载体表达HOXB-AS3-Flag融合多肽的结果图；
图4B为实施例2中采用抗HOXB-AS3多肽抗体的免疫荧光分析融合基因表达载体表达HOXB-AS3-Flag融合多肽的结果图；
图5为实施例2中采用抗Flag和HOXB-AS3多肽抗体的western blotting检测分析融合基因表达载体表达HOXB-AS3-Flag融合多肽的结果图；
图6A为实施例3中用质谱技术鉴定HOX3-AS3多肽中的PVLPGTQRYPHQR肽段序列；
图6B为实施例3中用质谱技术鉴定HOXB-AS3多肽中的FQAAGGGAESGK肽段序列；
图6C为实施例3中用质谱技术鉴定HOXB-AS3多肽中的GSEEAPGVAWSGSESGR多肽序列；
图6D为实施例3中用质谱技术鉴定HOXB-AS3多肽中的FQAAGGGAESGKRGSEEAPGVAWSGSESGR多肽序列；
图7为实施例4中用抗HOXB-AS3多肽抗体免疫荧光检测细胞中内源性表达的HOXB-AS3多肽结果图；
图8为实施例4中用抗HOXB-AS3多肽抗体western blotting检测细胞中内源性表达的HOXB-AS3多肽结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
生物信息学预测lncRNA HOXB-AS3的核苷酸序列中存在编码多肽的开放阅读框(open reading frame，ORF)，提供能编码HOXB-AS3多肽的ORF序列，ORF序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的发明人发现了能编码HOXB-AS3多肽的起始密码子位置和终止密码子位置。
另外，本发明的发明人还提供了HOXB-AS3多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
通过同源比较确定此HOXB-AS3多肽序列在灵长目动物中存在高度保守性；
发明人构建了用HOXB-AS3ORF序列和其起始密码子启动的HOXB-AS3ORF融合基因表达载体以及突变此起始密码子的融合基因表达载体；以验证HOXB-AS3ORF的起始密码子是否有活性。
本发明的发明人确证了此HOXB-AS3多肽在细胞内是内源性表达和存在。
实施例1
利用lncRNA HOXB-AS3序列中存在的开放阅读框(ORF)编码HOXB-AS3多肽
1.从NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)核酸数据库中搜索获得注释为lncRNA的HOXB-AS3的RNA序列数据(NR_033201.2)，寻找在lncRNA HOXB-AS3的核苷酸序列上的开放阅读框(ORF)，开放阅读框的序列如SEQ ID NO.2所示；
SEQ ID NO.2的序列如下：
5′-ATGCCAGTGCTGCCGGGAACCCAGCGATATCCGCACCAGCGGAGAAGGTTCCAGGCTGCCGGCGGCGGCGCAGAGAGCGGGAAGAGAGGCTCGGAGGAAGCCCCGGGCGTGGCGTGGTCAGGCTCCGAGAGCGGCCGGGATGCGGCCACACCGGCCTGGTAA-3′；
如下所示，在开放阅读框的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)中划下划线的核苷酸序列为起始密码子，方框内的序列为终止密码子，
Figure BSA0000143248360000051
2.通过此HOXB-AS3开放阅读框编码一个53个氨基酸的蛋白多肽，HOXB-AS3多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
SEQ ID NO.1的序列如下：
MPVLPGTQRYPHQRRRFQAAGGGAESGKRGSEEAPGVAWSGSESGRDAATPAW。
图1中为lncRNAHOXB-AS3的核苷酸序列及其包含的编码HOXB-AS3多肽的开放阅读框序列、起始密码子位置和终止子密码子位置信息和编码出的53个氨基酸序列；
图1中，方框内对应的是开放阅读框编码的HOXB-AS3多肽氨基酸序列，浅色字体的核苷酸序列表示的是开放阅读框的核苷酸序列。
3.对于HOXB-AS3多肽的氨基酸序列进行同源性分析，
利用NCBI中蛋白序列比对Protein BLAST
(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)分析此HOXB-AS3多肽的53个氨基酸序列在Non-redundant protein sequences(nr)蛋白数据库中的同源性，发现HOXB-AS3多肽在人(Homosapiens)、大猩猩(Gorilla)和猕猴(Macaca mulatta)灵长目动物中高度保守，说明此HOXB-AS3存在一定的物种保守性，结果见图2所示；
4.对于开放阅读框ORF序列进行保守性分析，
利用NCBI中的核苷酸序列序列比对Nucleotide BLAST软件(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)分析此编码HOXB-AS3多肽的开放阅读框(ORF)核苷酸序列在Nucleotidecollection(nr/nt)核苷酸数据库中的同源性，发现编码HOXB-AS3多肽的ORF序列不存在物种保守性。
实施例2
HOXB-AS3lncRNA中编码表达HOXB-AS3多肽的起始密码子是有活性的，可以表达出HOXB-AS3多肽
1.将编码HOXB-AS3多肽的ORF序列3′末端连接上Flag的核苷酸序列，构建入pcDNA3.1(+)载体中(Cat#V790-20，InVitrogen公司)，产生HOXB-AS3融合基因表达载体ORF-Flag，如图3所示；
PCR扩增开放阅读框所用引物对的上游引物序列如SEQ ID NO.4所示，
SEQ ID NO.4序列如下：
5′-CGGGGTACCCCCTCCAAGTCCAGTAAGAAGT-3′；
如下所示，在上游引物序列(SEQ ID NO.4)中，方框内的碱基是3个酶切保护性碱基，带下划线的碱基是Kpn I内切酶核苷酸序列，
Figure BSA0000143248360000071
下游引物序列如SEQ ID NO.5所示，
SEQ ID NO.5序列如下：
5′-CGGAATTCTTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCCAGGCCGGTGTGGC-3′；
如下所示，在下游引物序列(SEQ ID NO.5)中，方框内的碱基是2个酶切保护性碱基，带下划线的碱基是EcoR I内切酶核苷酸序列，加粗的是编码Flag标签的核苷酸序列，
Figure BSA0000143248360000072
2.将编码HOXB-AS3多肽的开放阅读框(ORF)序列的5′端连接非其翻译序列(5′Untranslated Regions，5′UTR)，在ORF序列的3′末端连接上Flag的核苷酸序列，构建入pcDNA3.1(+)载体中，产生HOXB-AS3融合基因表达载体5′UTR-ORF-Flag，如图3所示；
用于构成融合基因的5′端非翻译序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
SEQ ID NO.3的序列如下：
5′-GTCATAGCGACTTTTGGGATAGTTTGCTATCGACAAAGGGAGACAAAGTCAAGGGGTGAAGGGAAAGGAGGGCCAAGTAGAGCCTCCACGACCCTCGGCTTCCTCCTCACCAGCTCCCCCTCCCTCCAAGTCCAGTAAGAAGTTGGGCCAAGCTGGAAGGGATTGACCGGCCGTTTCCTCTCCCTCGCCGGCCTCGGCGGAGATTCCAGGCCCTATAGAAACCAGGACGTCCCTTAGCGCCACCGCCTCAC-3′；
PCR扩增融合基因所用引物对的上游引物序列如SEQ ID NO.6所示，
SEQ ID NO.6序列如下：
5′-CGGGGTACCGTCATAGCGACTTTTGGGATAGTTTG-3′；
如下所示，在上游引物序列(SEQ ID NO.6)中，方框内的碱基是3个酶切保护性碱基，带下划线的碱基是Kpn I内切酶核苷酸序列；
Figure BSA0000143248360000081
下游引物序列如SEQ ID NO.5所示，
SEQ ID NO.5序列如下：
5′-CGGAATTCTTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCCAGGCCGGTGTGGC-3′；
如下所示，在下游引物序列(SEQ ID NO.5)中，方框内的碱基是2个酶切保护性碱基，带下划线的碱基是EcoR I内切酶核苷酸序列，加粗的是编码Flag标签的核苷酸序列，
Figure BSA0000143248360000082
3.将上面构建的HOXB-AS35′UTR-ORF-Flag融合基因表达载体中编码HOXB-AS3多肽的起始密码子ATG突变为ATT的融合基因表达载体5′UTR-ORFmut-Flag，如图3所示；
突变引物的上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，
5′-AGCGCCACCGCCTCACATTCCAGTGCTGCCGG-3′
如下所示，在上游引物序列(SEQ ID NO.7)中，加粗有下划线的位置表示突变位点；
Figure BSA0000143248360000091
下游引物序列如SEQ ID NO.8所示，
5′-CCGGCAGCACTGGAATGTGAGGCGGTGGCGCT-3′；
如下所示，在下游引物序列(SEQ ID NO.8)中，加粗有下划线的位置表示突变位点；
Figure BSA0000143248360000092
4.将上述构建的HOXB-AS3ORF-Flag、5′UTR-ORF-Flag和5′UTR-ORFmut-Flag载体转染HEK293T细胞(CRL-1126，美国ATCC)48小时后，分别用抗Flag和抗HOXB-AS3多肽抗体，免疫荧光结合激光共聚焦显微镜分析这些载体表达HOXB-AS3-Flag多肽的情况；结果如图4A和4B所示，抗Flag和抗HOXB-AS3多肽抗体均可以在HOXB-AS3ORF-Flag和5′UTR-ORF-Flag转染的HEK293T细胞中检测到HOXB-AS3多肽的表达，而在5′UTR-ORFmut-Flag转染的HEK293T细胞中，检测不到荧光，即检测不到HOXB-AS3-Flag多肽的表达；
5.将上述构建的HOXB-AS3ORF-Flag、5′UTR-ORF-Flag和5′UTR-ORFmut-Flag载体转染HEK293T细胞(CRL-1126，美国ATCC)48小时后，分别用抗Flag和抗HOXB-AS3多肽抗体，western blotting检测这些载体表达HOXB-AS3-Flag多肽的情况；结果如图5所示，抗Flag和抗HOXB-AS3多肽抗体均可以在HOXB-AS3ORF-Flag和5′UTR-ORF-Flag转染的HEK293T细胞中检测到HOXB-AS3多肽的表达，而在5′UTR-ORFmut-Flag转染的HEK293T细胞中检测不到HOXB-AS3-Flag多肽的存在；
经本实施例验证HOXB-AS3ORF起始密码子是有活性的，可以启动HOXB-AS3多肽的表达，产生HOXB-AS3-Flag融合多肽。
实施例3
质谱技术鉴定细胞内HOXB-AS3多肽的肽段序列，确定HOXB-AS3多肽在细胞中的存在
1.将HOXB-AS3ORF-Flag表达载体转染HEK293T细胞48小时后，分离细胞总蛋白，采用抗Flag的抗体免疫沉淀出细胞总蛋白中的HOXB-AS3-Flag多肽；
2.Trypsin胰酶酶解此免疫沉淀出的HOXB-AS3-Flag多肽，获得HOXB-AS3-Flag酶解肽段混合物；
3.采用LC-MS/MS(Liquid chromatography tandem mass spectrometry，高压液相串联色谱)鉴定此酶解的HOXB-AS3-Flag肽段混合物，从而鉴定获得酶解的的HOXB-AS3-Flag多肽肽段序列，结果如图6所示，通过质谱技术鉴定到了HOXB-AS3多肽的4个肽段序列，图6A为PVLPGTQRYPHQR序列；图6B为FQAAGGGAESGK序列；图6C为GSEEAPGVAWSGSESGR序列；图6D为FQAAGGGAESGKRGSEEAPGVAWSGSESGR序列，从而确证HOXB-AS3多肽确实在细胞中表达。
实施例4
确定HOXB-AS3多肽在细胞中内源性表达和天然存在
1.进行细胞爬片，将结肠癌细胞SW480和SW620铺在玻片上，贴壁培养生长24小时候后，吸掉细胞培养基，PBS洗2遍，用冰甲醇固定2小时；
2.进行间接免疫荧光分析，即用兔源性抗HOXB-AS3多肽抗体进行一抗4℃孵育过夜，用Cy3标记山羊抗兔IgG(H+L)二抗(产品编号：A0516，碧云天公司)孵育2小时后，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色细胞核；
3.激光共聚焦显微镜观测和采集细胞荧光发光情况，结果如图7所示，在结肠癌细胞SW480和SW620细胞中均可见荧光，即均可见内源性天然存在的HOXB-AS3多肽表达；并且在高侵袭转移潜能结肠癌细胞中HOXB-AS3多肽的水平下调；
4.收集同一来源不同侵袭转移潜能结肠癌细胞SW480和SW620、HTC-116和HTC-116high，乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-231high，卵巢癌细胞OVCAR3和OVCAR3high、SK-OV3和SK-OV3high，鼻咽癌细胞S26和S18的细胞总蛋白；
5.采用Tricine-SDS-PAGE技术分离上面细胞总蛋白，用抗HOXB-AS3多肽抗体western blotting检测HOXB-AS3多肽在上述细胞中的表达情况；结果如图8所示，HOXB-AS3在结肠癌、乳腺癌、卵巢癌和鼻咽癌等多种肿瘤细胞中存在内源性天然表达。并且相对于低侵袭转移潜能细胞，发现HOXB-AS3多肽水平在高侵袭转移潜能肿瘤细胞中下调。
经过本实施例验证，HOXB-AS3多肽在组织中是内源性天然存在，表明此HOXB-AS3多肽真实存在的，其对应起始密码子是有活性的，且可以诱导HOXB-AS3多肽的表达。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.编码HOXB-AS3多肽的开放阅读框，其特征在于，所述编码HOXB-AS3多肽的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体由如权利要求1所述的开放阅读框与质粒构建得到。
3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体由如权利要求1所述的开放阅读框在5′端连接非翻译序列后与质粒构建得到；所述开放阅读框的5′端连接的非翻译序列如SEQ IDNO.3所示。
4.一组引物对，其特征在于，所述引物对用于扩增得到如权利要求1所述的开放阅读框，所述引物对的两条引物分别由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列组成。
5.一组引物对，其特征在于，所述引物对用于扩增得到5′端连接非翻译序列的开放阅读框，所述开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述非翻译序列如SEQ ID NO.3所示；所述引物对的两条引物分别由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.5所示的序列组成。
6.制备权利要求2所述重组载体的方法，其特征在于，包括利用PCR扩增合成具有如权利要求1所述的开放阅读框，插入到基因转移载体中，得到重组载体。
7.制备权利要求3所述的重组载体的方法，其特征在于，包括利用PCR扩增得到融合基因，插入到基因转移载体中，得到重组载体。
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A Peptide Encoded by a Putative lncRNA HOXB-AS3 Suppresses Colon Cancer Growth;Huang JZ等;《Mol Cell》;20171005;第68卷(第1期);第171-184页 *
登录号：AAH10732.1;Strausberg,R.L等;《GenBank》;20040624;第1-53位 *

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CN106957354A (zh) 2017-07-18

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