CN106950375B - 一种玉米赤霉烯酮单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种玉米赤霉烯酮单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种玉米赤霉烯酮单克隆抗体及其应用，该玉米赤霉烯酮单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.13281的杂交瘤细胞克隆得到的，可用于定性检测玉米赤霉烯酮，不仅灵敏度更高，而且最低检测限更低。本发明的有益之处在于：因为采用保藏编号为CGMCC No.13281的杂交瘤细胞克隆得到了高灵敏度的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，所以定性检测玉米赤霉烯酮时，灵敏度更高，可达到2μg/kg，最低检测限更低，可达到30μg/kg。

Description

一种玉米赤霉烯酮单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及一种单克隆抗体及其应用，具体涉及一种玉米赤霉烯酮单克隆抗体及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
玉米赤霉烯酮的检测方法主要有：薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、质谱联用、酶联免疫吸附法(ELISA)及胶体金免疫层析法。
薄层色谱法(TLC)在处理样品时工作量大，检测过程中需接触标准品，危害到操作人员的健康。
高效液相色谱法(HPLC)、质谱联用所需检测仪器价格昂贵，需要专业技术人员操作，且样品前处理复杂，不便推广应用，也不适合大批量样品检测。
酶联免疫吸附法(ELISA)需要专业技术人员操作，同时对检测条件有较严格的要求，每次检测都需同时做标准品，检测成本稍高。
胶体金免疫层析法操作简便、快速、灵敏度高，且无需贵重仪器设备，人员参照说明书即可操作，一份样本也可进行检测，成本低，因此发展迅速。
但是，现有玉米赤霉烯酮胶体金检测试剂盒最低检测限不能满足粮食类检测要求，且只适用于谷物类样本的检测。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种玉米赤霉烯 酮单克隆抗体及其应用，该单克隆抗体可用于定性检测玉米赤霉烯酮，不仅灵敏度更高，而且最低检测限更低。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一株杂交瘤细胞，其特征在于，能够分泌高灵敏度和特异性的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，保藏编号为CGMCC No.13281。
一种玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有由前述的杂交瘤细胞克隆得到的玉米赤霉烯酮单克隆抗体。
前述的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：提取液、稀释液和检测卡，其中，
前述提取液为60v/v％甲醇水溶液；
前述稀释液为0.02M、pH7.4的磷酸盐缓冲液；
前述检测卡由PVC底板(1)、样品垫(2)、胶体金结合垫(3)、吸水滤纸(4)和NC膜(5)组成，NC膜(5)粘贴在PVC底板(1)的中段，吸水滤纸(4)粘贴在PVC底板(1)的上段，并且吸水滤纸(4)的下端部压住NC膜(5)的上端部，胶体金结合垫(3)和样品垫(2)均粘贴在PVC底板(1)的下段，并且胶体金结合垫(3)的上端部压住NC膜(5)的下端部、样品垫(2)的上端部压住胶体金结合垫(3)的下端部，其中，
前述胶体金结合垫(3)做了如下处理：
取1mL浓度为0.01％的胶体金溶液并调节pH值至9.0，将由保藏编号为CGMCCNo.13281的杂交瘤细胞克隆得到的玉米赤霉烯酮单克隆抗体按照3μg/mL标记，然后用终浓度1wt％BSA封闭，离心去 上清液后用PBS洗涤一次，再次离心后用300μL胶体金重悬液悬浮，按10μL/cm喷金量将标记好的玉米赤霉烯酮单克隆抗体包被在胶体金结合垫(3)上，37℃干燥2h；
前述NC膜(5)是通过如下方法制备得到的：
将玉米赤霉烯酮偶联BSA稀释到0.1mg/mL，按1μL/cm划膜量包被到硝酸纤维素膜上检测线T位置，将羊抗鼠IgG稀释到0.1mg/mL，按1μL/cm划膜量包被到硝酸纤维素膜上质控线C位置，37℃干燥1h，组装大板、切条，即得NC膜(5)。
前述的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒，其特征在于，前述吸水滤纸(4)和NC膜(5)、胶体金结合垫(3)和NC膜(5)、样品垫(2)和胶体金结合垫(3)的搭接宽度均为1mm-2mm。
前述的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒，其特征在于，前述胶体金溶液的制备方法为：
在圆底烧瓶中加入1L超纯水，加热，煮沸后加入10mL 1％氯金酸溶液，2min后加入12mL 1％柠檬酸三钠溶液，继续煮沸15min后停止加热，冷却至室温，即得胶体金溶液。
前述的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒，其特征在于，前述玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备方法为：
用玉米赤霉烯酮偶联OVA做为免疫原免疫雌性BALB/c小鼠，第三次免疫后选择血清效价大于或等于1:4.2×105的小鼠制备免疫细胞悬液，然后将免疫细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，融合后加入已铺有饲养细胞的96孔培养板中，将培养板置37℃、含5％CO2的培养箱 内培养，接下来对杂交瘤细胞株进行培养、筛选和扩大培养，得到保藏编号为CGMCCNo.13281的杂交瘤细胞，最后将该杂交瘤细胞注入小鼠腹腔中，采用小鼠体内诱生腹水的方法制备单克隆抗体。
前述的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒，其特征在于，前述玉米赤霉烯酮单抗制备完毕后需要纯化，纯化的方法为：
先采用二氧化硅吸附法预处理腹水，然后采用辛酸－硫酸铵沉淀法或者亲和层析法纯化IgG。
利用前述的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒定性检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1：称取5±0.05g样本到50mL离心管中，加入20mL提取液，振荡提取3min-5min；
Step 2：于4000rpm离心5min，取上清液40μL，根据检测限加入适量稀释液，得到待测液；
Step3：在20℃-30℃环境下，将检测卡平放在桌面上，用滴管垂直滴加3滴待测液至加样孔中，10min-15min内观察结果。
本发明的有益之处在于：
(1)因为采用保藏编号为CGMCC No.13281的杂交瘤细胞克隆得到了高灵敏度的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，所以本发明的检测试剂盒灵敏度更高，可达到2μg/kg；
(2)因为灵敏度高达2μg/kg，所以最低检测限低，最低检测限可达到30μg/kg；
(3)样品先在提取液中振荡提取3min-5min，然后离心5min，上 清液经稀释液稀释后滴加至检测卡的加样孔中，10min-15min内即可观察结果，所以操作起来十分方便，20min左右就可以完成检测，大大提高了检测效率。
附图说明
图1是检测卡的结构示意图；
图2是样品中玉米赤霉烯酮的浓度小于检测限时检测卡的显示图；
图3是样品中玉米赤霉烯酮的浓度大于或等于检测限时检测卡的显示图；
图4(a)和图4(b)是检测无效时检测卡的显示图。
图中附图标记的含义：1-PVC底板、2-样品垫、3-胶体金结合垫、4-吸水滤纸、5-NC膜、T-检测线、C-质控线。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
第一部分：制备玉米赤霉烯酮单克隆抗体
一、材料
1、主要材料
(1)6周龄-8周龄雌性健康BALB/c小鼠，体重18g-22g。
(2)SP2/0骨髓瘤细胞。
(3)玉米赤霉烯酮偶联OVA。
2、主要试剂
四甲基联苯胺(TMB)，明胶，DMEM培养基；青霉素，链霉素，L-谷氨酰胺(L-G)，二甲基亚砜(DMSO)；4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)；HRP标记羊抗鼠IgG，辣根过氧化物酶(HRP streptoavidin)；福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂，次磺嘌呤、甲氨喋呤和胸腺嘧啶核苷混合剂(HAT)，次磺嘌呤和胸腺嘧啶核苷混合剂(HT)；胎牛血清(FBS)；Mabs类及亚型检测试剂盒；葡萄球菌A蛋白免疫亲和层析柱(HiTrapTM Protein AHP)；其它常规试剂。
3、溶液系统
(1)不完全DMEM培养基：DMEM(1L包装)粉剂1袋，超纯水1000mL，NaHCO3 3.7g，1mol/L盐酸调节pH值到7.0-7.2，过滤除菌，分装4℃保存。
(2)完全DMEM培养基：不完全DMEM培养基88mL，加小牛血清12mL，无菌条件下配制。
(3)HT培养基：完全DMEM培养基99mL，加100×HT贮存液1mL，无菌条件下配制。
(4)HAT培养基：完全DMEM培养基98mL，加100×HT贮存液1mL，100×A贮存液1mL，无菌条件下配制。
(5)50％PEG：称取PEG2000 2g，放入青霉素小瓶中，塞紧橡皮塞，塞上插一9号针头(排气用)，8磅高压灭菌15min或水浴灭菌30min，使PEG融化并达到灭菌目的，待冷却至50℃-60℃时(在此温度以上PEG仍为均匀的液体状态)，加入已在37℃预热的不完全DMEM培养基2mL，充分混匀，调pH到7.2，盖紧瓶塞，4℃保存， 用前可置37℃加温助溶。
(6)8-氮杂鸟嘌呤贮存液(100×)：称取200mg8-氮杂鸟嘌呤(8-azayuanine，MW152.1)，加入4N NaOH 1mL，待其溶解后，加三蒸水或去离子水99mL，过滤除菌，分装小瓶，-20℃冻存，使用时按1％浓度加入到培养液中(即终浓度为20μg/mL)。
(7)细胞冻存液：含10％DMSO的完全DMEM培养液。
(8)包被缓冲液(0.02M、pH7.4的磷酸盐缓冲液)：磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)5.8g，磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)0.59g，加蒸馏水至1000mL。
(9)封闭液：牛血清白蛋白(BSA)10g，小牛血清100mL，吐温-20 0.5mL，蔗糖100g，加蒸馏水至1000mL。
(10)洗涤缓冲液(PBST)：含0.05％吐温-20的0.01M、pH7.4的PBS(V/V)。
(11)抗体稀释液：含0.01％吐温-20和0.1％明胶的0.01M、pH7.4的PBS(V/V)。
(12)终止液(4MH2SO4)：取蒸馏水156.6mL，逐滴加入98％浓硫酸43.4mL。
(13)底物液A：过氧化氢脲1g，磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)35.8g，一水柠檬酸10.3g，吐温-20 0.1mL，加蒸馏水定容至1000mL。
(14)底物液B：四甲基联苯胺(TMB.2HCl)0.4g，一水合柠檬酸2g，硫代硫酸钠0.1g，加蒸馏水定容至1000mL。
二、单克隆抗体的制备
1、动物饲养及处理
健康雌性BALB/c小鼠先饲养观察1周，无异样，断尾取血，以间接竞争ELISA分析血清，阴性者用于制备抗体，阴性血清-20℃保存备用。
2、动物免疫
将玉米赤霉烯酮偶联OVA溶于0.5mL生理盐水中，加入等体积佐剂制成乳化剂，免疫雌性BALB/c小鼠。
免疫程序见表1：
表1动物免疫程序
第三次免疫后7d-10d测定血清效价。
3、测定血清效价
免疫后的BALB/c小鼠尾部采血0.1mL，3000rpm离心5min，收集血清，4℃保存。
用ELISA法测定血清效价，具体过程如下：
(1)包被抗原：用包被缓冲液将包被抗原稀释至适当的工作浓度(2μg/mL左右)，然后加入到酶标板中，每孔100μl，4℃过夜，弃去孔内的液体。
(2)封闭：每孔加封闭液200μl，37℃湿盒孵育1h，然后用洗涤缓冲液洗3次，每次90s(简称洗涤，下同)，拍干。
(3)加待测血清样品：将待测血清样品倍比稀释后加入酶标板中，每孔100μl，同时设空白对照、阴性对照和阳性对照各2孔，37℃孵育0.5h，洗涤、拍干。
(4)加酶标第二抗体：先用抗体稀释液将酶标第二抗体稀释到适当的工作浓度(1μg/mL)，每孔加入100μl，置37℃孵育0.5h，然后洗涤、拍干。
(5)加底物溶液：各孔加新鲜配制的底物液A、底物液B各100μl，37℃孵育15min。
(6)终止反应：每孔加终止液50μl。
(7)判定结果：测定OD450nm，以空白孔调零，若待测孔OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍，则为阳性，这样可以得出血清的效价。
最终得到的测定结果见表2：
表2各小鼠免疫后血清的效价
小鼠编号 待测孔OD450nm OD待测/OD阴性对照 结果 血清效价
1 2.429 2.2 阳性 1:2.4×105
2 2.760 2.5 阳性 1:3.5×105
3 3.202 2.9 阳性 1:4.2×105
4、细胞融合
(1)制备免疫细胞悬液
在本实施例中，我们选择用编号为3的BALB/c小鼠来制备免疫细胞悬液，它的血清效价最高，达到了1:4.2×105。
制备免疫细胞悬液的过程具体如下：
①取编号为3的BALB/c小鼠，融合前3天超免。
②处死小鼠，在75％酒精中浸泡消毒5min。
③取出小鼠，移入超净工作台，无菌操作，小鼠腹部朝上固定在解剖板上，剪开腹部皮肤和腹膜，找到脾脏。
④取出脾脏后，将脾脏上的结缔组织去除干净，置于包有120目尼龙纱布的小烧杯中，用少量不完全DMEM培养液湿润纱布和脾脏。
⑤剪碎脾脏，用摄子轻轻研磨，再用少量不完全DMEM培养液冲洗，将脾细胞过滤到烧杯中。
⑥离心收集脾细胞。
(2)制备饲养细胞
制备饲养细胞的过程具体如下：
①取健康的未注射过玉米赤霉烯酮的BALB/c小鼠，放血致死，收集血液，制备血清留作阴性血清备用。
②将放血致死的小鼠置于75％的酒精中浸泡消毒5min。
③在超净台中将小鼠腹部朝上，固定在解剖板上，无菌操作剪开腹部皮肤，露出腹膜，用酒精棉球对腹膜进行消毒。
④小心提起腹膜，腹腔注射5mL4℃预冷的不完全DMEM培养基，反复柔打腹部数次，再吸回注射器中。
⑤将注射器中的液体注入离心管，1000rpm离心10min，弃上清。
⑥先用5mL HAT培养液将沉淀细胞悬浮并混匀，作细胞计数，然后根据细胞计数结果，补加适量HAT培养液至40mL，充分混匀，即得到饲养细胞悬液。
⑦将饲养细胞悬液加入4块96孔培养板中，每孔0.1mL。
⑧将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)制备骨髓瘤细胞悬液
制备骨髓瘤细胞悬液的过程具体如下：
①融合前一周复苏SP2/0骨髓瘤细胞于完全DMEM培养液中。
②用20μg/mL的8-氮杂鸟嘌呤溶液来处理SP2/0骨髓瘤细胞，使其对HAT培养液呈均一的敏感性。
③选择呈对数生长的细胞，于融合前48h-36h，将SP2/0骨髓瘤细胞扩大培养于100mL细胞培养瓶中，每瓶加10mL HAT培养液，置37℃、5％CO2温箱内培养。
④融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50mL离心管内，1000rpm离心5min，弃去上清。
⑤向沉淀中加入30mL不完全DMEM培养液，同上离心洗涤一次。
⑥将细胞重悬至10mL完全DMEM培养液中，混匀。
⑦取SP2/0骨髓瘤细胞悬液，加台酚兰染液进行活细胞计数，备用。
(4)细胞融合
所有操作过程都在37℃进行。细胞融合的具体过程如下：
①分别吸取含1×108个脾细胞和2×107个-3×107个骨髓瘤细胞的细 胞悬液，加入到同一只50mL离心管中，补加不完全DMEM培养液至30mL，充分混匀。
②1000rpm离心7min，将上清尽量弃去，轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状。
③一手均匀转动离心管，另一手用1mL吸管吸取50％的PEG溶液1mL，并沿转动的管壁(尽量接近细胞处)加入离心管中，从加入到加完的时间控制在60s左右。
④加完PEG溶液后，立即将细胞悬液全部吸入吸管(时间控制在30s左右)，静置30s，再将其吹入离心管内(时间也控制30s左右)。
⑤吹入离心管后，立即在5min内加入25mL不完全DMEM培养液，使PEG稀释而失去促融作用，具体加法是：边加边轻轻转动离心管，第1min加1mL，第2min加4mL，随后的3min内将剩余液体加完。
⑥800rpm离心7min，弃去上清，向沉淀的细胞中加入10mL HAT培养液，轻轻吹吸沉淀的细胞，使其悬浮并混匀。
⑦将细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.1mL(相当于2滴)。
⑧将培养板置37℃、含5％CO2的培养箱内培养。
5、杂交瘤细胞株的培养
杂交瘤细胞培养至第4d-5d时，显微镜下观察其生长情况，并作记录，如发现污染，对有污染的孔采用高浓度抗生素清洗处理。
杂交瘤细胞培养至第5d-6d时，取单克隆孔的培养上清液，ELISA 法检测其效价及阻断情况。
杂交瘤细胞培养至第7d-10d时，细胞集落约占显微镜下1/3-1/2视野大小，此时将培养液更换为HT培养液，换液时，用消毒的8孔移液器和灭菌枪头每孔吸去0.1mL细胞上清液，每个枪头只用于一个孔，随后用滴管吸取HAT培养液，每孔滴加两滴(约0.1mL)，封盖，37℃、含5％CO2的培养箱内培养。
6、杂交瘤细胞株的筛选及扩大培养
用间接ELISA法检测细胞培养上清液，选出阳性产抗玉米赤霉烯酮抗体的单克隆孔，挑出阳性高、阻断情况好的单克隆孔继续做亚克隆，直至最后一次克隆有细胞的孔都为阳性产目的抗体。
本实验采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆。有限稀释法可以弥补因细胞计数不准确带来的误差。
按照前面的方法制备饲养细胞悬液，取阳性较高、抗体敏感性好的孔，用弯头吸管吹打均匀，以HT培养液倍比稀释至1个/孔，检测培养上清，挑选保持强阳性的孔继续进行亚克隆。
经三次亚克隆后，我们筛选出了6株强阳性单克隆细胞，分别记为3F6、2C7、5G4、3F5、6C3、6A2。
7、单克隆抗体的鉴定
(1)抗体的类及亚型
取阳性杂交瘤细胞的培养液，2000rpm离心8min去除细胞及其碎片，按照使用说明书用ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit I测定Mabs的类和IgG亚类及轻链的亚型，方法仍为前述间接法ELISA。
采用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒进行鉴定，具体操作步骤如下：
①用无菌PBS以1:1000倍稀释各种亚类鉴定试剂，IgM、IgA、IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3；
②加入稀释的亚类鉴定试剂，0.1mL/孔，每种亚类试剂加2平行对照；
③37℃反应1h，PBST洗3次，每次3min；
④加入细胞上清液，0.1mL/孔；
⑤37℃反应1h，PBST洗3次，每次3min；
⑥加入羊抗鼠酶标二抗，用PBST以1:600稀释，0.1mL/孔；
⑦37℃反应30min，PBST洗3次，每次3min；
⑧加入TMB底物显色溶液，0.1mL/孔，37℃反应10min，显色者为阳性。
(2)抗体的效价
用玉米赤霉烯酮包被酶标板，将腹水进行倍比稀释，用ELISA方法测定抗体的效价。
(3)抗体亲和力
采用非竞争性ELISA法测定杂交瘤细胞培养液中单克隆抗体的亲和常数，操作程序如下：
①三种浓度(0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL)交联抗原包被酶标板，0.1mL/孔，4℃过夜，用封闭液封闭酶标板(同上)；
②洗涤后，加入系列稀释的已知浓度的被检的杂交瘤细胞培养液，0.1mL/孔，37℃孵育1h；
③洗涤后，加入适宜浓度的HRP标记的兔抗鼠IgG抗体，0.1mL/孔，37℃孵育1h；
④洗涤后，加入底物(OPD)溶液，0.1mL/孔，37℃闭光显色20min；
⑤用50μl 2M H2SO4终止反应后，测定各孔的OD492nm值；
⑥以被检样品的不同浓度为横坐标，以其相应的OD值为纵坐标，绘制3条测定曲线，以各曲线上部趋于平坦的OD值为100％，计算OD值为50％时的Mabs的浓度[Ab]t，这样每份被检样品可得[Ab]t﹑[Ab]′t﹑[Ab]″t三个值，然后根据公式计算其亲和常数(徐志凯，1992)。
(4)鉴定结果
按照上述方法，我们对所筛选出的6株单克隆细胞所对应的培养液进行了鉴定，鉴定结果如下：
①编号为3F6、2C7、5G4、6C3的单克隆细胞所对应的培养液中的抗体有IgG和IgM两种类型，其中IgG有三种亚类，分别为IgG1、IgG2a和IgG2b，所有抗体的轻链的亚型均为κ链；
②培养液效价在1:20000-1:100000之间，都很高；
③亲合常数在108M-1-1011M-1之间，都很高。
具体如下：
表3各组培养液的鉴定结果
因为2C7有较高的效价和亲合常数，所以我们将编号为2C7的单克隆细胞做了保藏。
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
保藏日期：2016年10月31日。
保藏编号：CGMCC No.13281。
8、单克隆抗体的大量制备
采用小鼠体内诱生腹水的方法制备单克隆抗体。取健康BALB/c雌性小鼠，注入液体石蜡0.5mL，1周-2周后备用。将扩大培养的阳性克隆杂交瘤细胞(保藏编号为CGMCCNo.13281)用基础培养液制备成细胞悬液，细胞计数后，将细胞数调至106/mL，注射小鼠腹腔lmL/只。
7d-10d后收集腹水，一只小鼠可获5mL-10mL腹水，3000rpm离心10min，弃脂肪层和细胞层，收集中间澄清层，分装，-70℃冻存。
三、单克隆抗体的纯化
1、预处理腹水
采用二氧化硅吸附法：取一定量的腹水，先加等量巴比妥缓冲盐水(VBS)稀释，再加适量二氧化硅粉末，室温时不时的摇动30min，最后2000g离心20min，即得澄清的腹水。
2、纯化IgG
采用辛酸－硫酸铵沉淀法，具体如下：
(1)向一体积预处理过的腹水中加入两体积0.06M、pH5.0的乙酸缓冲液，用0.1NHCl调pH至4.8；
(2)于室温下边搅拌边在30min内逐滴缓慢加入辛酸，每1mL稀释前的腹水加33μl辛酸，然后4℃静置2h，再15000g离心30min，弃沉淀；
(3)上清经砂心漏斗过滤，加入1/10体积的0.1M PBS，再用1NNaOH调pH至7.4；
(4)于4℃冰浴下在30min内加入0.277g/mL的(NH4)2SO4，使(NH4)2SO4达到45％的饱和度，然后静置1h以上；
(5)4℃下10000g离心30min，弃上清，沉淀溶于适量pH7.4、含137mM NaCl、2.6mMKCl和0.2mM EDTA的PBS中，用50倍-100倍的PBS于4℃下透析过夜；
(6)4℃下10000g离心30min，除去不溶性沉渣。
或者，采用亲和层析法，具体如下：
(1)柱子用结合buffer平衡10个柱体积(约10mL)；
(2)样品用0.45μm的滤器过滤去除不溶物，与结合buffer按1:1(V:V)混合；
(3)用注射器进样，然后依次用10个柱体积(约10mL)洗脱Buffer B1和Buffer B2洗脱，并分别加入0.5mL和1.3mL中和Buffer C；
(4)收集Buffer B1洗脱液和Buffer B2洗脱液，对5mM PBS透析，浓缩备用。
四、杂交瘤细胞的冻存与复苏
1、冻存
收集处于对数生长细胞，1000rpm离心l0min，弃去上清，打散细胞团，加入细胞冻存液，制成细胞悬液。用1.8mL的细胞冻存管分装，每管加入1.5mL细胞悬液。在管壁上写上细胞种类，冻存日期标记。快速将细胞冻存管移到-20℃保存1h，再转入-80℃超低温冰箱保存12h，然后转入液氮中存放。
2、复苏
从液氮中取出冻存细胞，直接投入37℃水浴锅中，待完全融解后，将细胞悬液转移到细胞培养瓶中，补加预热好的完全DMEM培养基至10mL，于37℃、5％CO2培养箱中培养。
第二部分：制备玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒
一、材料
1、主要材料
PVC底板，硝酸纤维素膜(NC膜)，胶体金结合垫，样品垫，吸水滤纸。
2、主要试剂
玉米赤霉烯酮单抗；玉米赤霉烯酮偶联BSA；羊抗鼠IgG；其它常规试剂。
3、溶液系统
(1)1％氯金酸溶液：氯金酸1g，加蒸馏水至100mL。
(2)1％柠檬酸三钠溶液：柠檬酸三钠1g，加蒸馏水至100mL。
(3)PB缓冲液(0.02M、pH7.4的磷酸盐缓冲液)：磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)5.8g，磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)0.59g，加蒸馏水至1000mL。
(4)划膜液：含3％甲醇的0.02M PB缓冲液。
(5)胶体金重悬液：含20％蔗糖、1％BSA的0.02M PB缓冲液。
二、胶体金溶液的制备
在圆底烧瓶中加入1L超纯水，加热，煮沸后加入10mL 1％氯金酸溶液，2min后加入12mL 1％柠檬酸三钠溶液，继续煮沸15min后停止加热，冷却至室温，即得胶体金溶液，4℃贮存。
三、抗体最佳标记量与抗原最佳包被量的确定
取1mL胶体金溶液，加入5μL2M K2CO3溶液调节pH值，使pH值达到8.0，玉米赤霉烯酮单克隆抗体分别按照2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL标记，然后用终浓度1％BSA封闭，离心去上清液后用PBS洗涤一次，再次离心后用300μL胶体金重悬液悬浮，按10μL/cm喷金量将标记好的玉米赤霉烯酮单克隆抗体包被在胶体金结合垫上，37℃干燥2h。
将玉米赤霉烯酮偶联BSA分别稀释到0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL，按1μL/cm划膜量包被到硝酸纤维素膜(NC膜)上检测线T位置，将羊抗鼠IgG稀释到0.1mg/mL，按1μL/cm划膜量包被到NC膜上质控线C位置，37℃干燥1h，组装大板、切条。
检测玉米赤霉烯酮标准品(含量为0μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、3μg/kg)，选择0μg/kg显色明显且灵敏度最高的组合为最佳条件。
经试验，我们确定的最佳条件为：玉米赤霉烯酮单克隆抗体按照3μg/mL标记，玉米赤霉烯酮半抗原偶联大蛋白稀释到0.1mg/mL划膜。
四、制备检测试剂盒
检测试剂盒包括：提取液、稀释液和检测卡。
1、提取液
提取液为60v/v％甲醇水溶液。
制备方法：将甲醇与蒸馏水按6:4的体积比混匀。
2、稀释液
稀释液为0.02M、pH7.4的磷酸盐缓冲液。
制备方法：磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)5.8g，磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)0.59g，加蒸馏水至1000mL。
3、检测卡
参照图1，检测卡由PVC底板1、样品垫2、胶体金结合垫3、吸水滤纸4和NC膜5组成。其中，NC膜5粘贴在PVC底板1的中段，吸水滤纸4粘贴在PVC底板1的上段，并且吸水滤纸4的下端部压住NC膜5的上端部(搭接宽度大约1mm)，胶体金结合垫3和样品垫2均粘贴在PVC底板1的下段，并且胶体金结合垫3的上端部压住NC膜5的下端部(搭接宽度大约1mm)、样品垫2的上端部压住胶体金结合垫3的下端部(搭接宽度大约1mm)。
胶体金结合垫在使用前做了如下处理：
取1mL浓度为0.01％的胶体金溶液并调节pH值至9.0，将由保藏编号为CGMCCNo.13281的杂交瘤细胞克隆得到的玉米赤霉烯酮单克隆抗体按照3μg/mL标记，然后用终浓度1wt％BSA封闭，离心去上清液后用PBS洗涤一次，再次离心后用300μL胶体金重悬液悬浮，按10μL/cm喷金量将标记好的玉米赤霉烯酮单克隆抗体包被在胶体金结合垫上，37℃干燥2h。
NC膜是通过如下方法制备得到的：
将玉米赤霉烯酮偶联BSA稀释到0.1mg/mL，按1μL/cm划膜量包被到硝酸纤维素膜上检测线T位置，将羊抗鼠IgG稀释到0.1mg/mL，按1μL/cm划膜量包被到硝酸纤维素膜上质控线C位置，37℃干燥1h。组装大板、切条，即得NC膜。
第三部分：应用玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒测定样本中玉米赤霉烯酮的含量
一、样本
样本取自北京龙科方舟生物工程技术有限公司样本库。
二、样本前处理
称取5±0.05g样本到50mL离心管中，加入20mL提取液，振荡提取3min-5min，4000rpm离心5min，取上清液40μL，根据检测限，加入适量稀释液。
检测限与稀释液用量见表4：
表4检测限与稀释液用量对照表
检测限(μg/kg) 30 60 100 150 200 500 1000
稀释液(μL) 110 260 500 750 1000 2500 5000
在本实施例中，稀释液的加入量为110μL。
三、样品检测
检测时，室温需达到20℃-30℃。
将检测卡平放在桌面上，用滴管垂直滴加3滴(或100μL)样品至加样位置，10min-15min内观察结果。
四、结果判断
阴性：检测线T与质控线C都出现，表明样品中玉米赤霉烯酮的浓度小于检测限，如图2所示。
阳性：只出现质控线C，表明样品中玉米赤霉烯酮的浓度大于或等于检测限，如图3所示。
无效：质控线C不出现，表明此次检测无效，如图4(a)或图4(b)所示。
在本实施例中，检测结果如图3所示，说明样品中玉米赤霉烯酮的浓度大于30μg/kg。
第四部分：本发明的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒的性能评价
1、灵敏度
取玉米赤霉烯酮标准品，用样本稀释液稀释到0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、3μg/kg、4μg/kg，分别取100μL加到加样孔中，10min后观察结果。
结果如下：
标准品浓度(μg/kg) 0.5 1 2 3 4
结果 阴性 阳性 阳性 阳性 阳性
结论：本发明的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒具有较高的灵敏度，灵敏度可达2μg/kg。
2、最低检测限
取一份阴性玉米样本，其玉米赤霉烯酮含量为0μg/kg，向其中加入玉米赤霉烯酮标准品，使其含量分别为10μg/kg、20μg/kg、30μg/kg、40μg/kg、50μg/kg，按试剂盒操作方法检测样本。
结果如下：
加标后样本浓度(μg/kg) 10 20 30 40 50
结果 阴性 阴性 阳性 阳性 阳性
结论：本发明的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒具有较低的检测限，最低检测限可达30μg/kg。
3、重复性
取玉米赤霉烯酮标准品，用样本稀释液稀释到1、2、3μg/kg，分别取100μL加到加样孔中，每个浓度检测5个检测卡，10min后观察结果。
结果如下：
标准品浓度(μg/kg) 1 2 3 4 5
1 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性
2 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
3 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
结论：本发明的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒具有较好的重复性。
4、有效期
将本发明的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒室温放置，分别在第1天、第1个月、第3个月、第6个月、第9个月、第12个月、第15个月，取试剂盒，检测玉米赤霉烯酮标准品，用样本稀释液稀释到1μg/kg、2μg/kg、3μg/kg，分别取100μL加到加样孔中，每个浓度检测2个检测卡，10min后观察结果。
结果如下：
标准品浓度(μg/kg) 1 2 3
第1天 阴性 阳性 阳性
1个月 阴性 阳性 阳性
3个月 阴性 阳性 阳性
6个月 阴性 阳性 阳性
9个月 阴性 阳性 阳性
12个月 阴性 阳性 阳性
15个月 阴性 阳性 阳性
结论：本发明的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒可室温放置1年以上，即有效期为12个月。
综上所述，使用本发明的试剂盒检测样本中玉米赤霉烯酮含量时，不仅无需调节pH值、操作简便、快速、成本低，而且不受样本数量限制，更重要的是灵敏度高、最低检测限低、结果重复性好，不同的检测线可满足不同客户的需求，可检测不同类型样本，除谷物外，还 可检测玉米副产物等样本。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一株杂交瘤细胞，其特征在于，能够分泌高灵敏度和特异性的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，保藏编号为CGMCC No.13281。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞克隆得到的玉米赤霉烯酮单克隆抗体。
3.一种玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有由权利要求1所述的杂交瘤细胞克隆得到的玉米赤霉烯酮单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：提取液、稀释液和检测卡，其中，
所述提取液为60v/v％甲醇水溶液；
所述稀释液为0.02M、pH7.4的磷酸盐缓冲液；
所述检测卡由PVC底板(1)、样品垫(2)、胶体金结合垫(3)、吸水滤纸(4)和NC膜(5)组成，NC膜(5)粘贴在PVC底板(1)的中段，吸水滤纸(4)粘贴在PVC底板(1)的上段，并且吸水滤纸(4)的下端部压住NC膜(5)的上端部，胶体金结合垫(3)和样品垫(2)均粘贴在PVC底板(1)的下段，并且胶体金结合垫(3)的上端部压住NC膜(5)的下端部、样品垫(2)的上端部压住胶体金结合垫(3)的下端部，其中，
所述胶体金结合垫(3)做了如下处理：
取1mL浓度为0.01％的胶体金溶液并调节pH值至9.0，将由保藏编号为CGMCC No.13281的杂交瘤细胞克隆得到的玉米赤霉烯酮单克隆抗体按照3μg/mL标记，然后用终浓度1wt％BSA封闭，离心去上清液后用PBS洗涤一次，再次离心后用300μL胶体金重悬液悬浮，按10μL/cm喷金量将标记好的玉米赤霉烯酮单克隆抗体包被在胶体金结合垫(3)上，37℃干燥2h；
所述NC膜(5)是通过如下方法制备得到的：
将玉米赤霉烯酮偶联BSA稀释到0.1mg/mL，按1μL/cm划膜量包被到硝酸纤维素膜上检测线T位置，将羊抗鼠IgG稀释到0.1mg/mL，按1μL/cm划膜量包被到硝酸纤维素膜上质控线C位置，37℃干燥1h，组装大板、切条，即得NC膜(5)。
5.根据权利要求4所述的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒，其特征在于，所述吸水滤纸(4)和NC膜(5)、胶体金结合垫(3)和NC膜(5)、样品垫(2)和胶体金结合垫(3)的搭接宽度均为1mm-2mm。
6.根据权利要求4所述的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒，其特征在于，所述胶体金溶液的制备方法为：
在圆底烧瓶中加入1L超纯水，加热，煮沸后加入10mL 1％氯金酸溶液，2min后加入12mL1％柠檬酸三钠溶液，继续煮沸15min后停止加热，冷却至室温，即得胶体金溶液。
7.根据权利要求4所述的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备方法为：
用玉米赤霉烯酮偶联OVA做为免疫原免疫雌性BALB/c小鼠，第三次免疫后选择血清效价大于或等于1:4.2×105的小鼠制备免疫细胞悬液，然后将免疫细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，融合后加入已铺有饲养细胞的96孔培养板中，将培养板置37℃、含5％CO2的培养箱内培养，接下来对杂交瘤细胞株进行培养、筛选和扩大培养，得到保藏编号为CGMCC No.13281的杂交瘤细胞，最后将该杂交瘤细胞注入小鼠腹腔中，采用小鼠体内诱生腹水的方法制备单克隆抗体。
8.根据权利要求7所述的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮单抗制备完毕后需要纯化，纯化的方法为：
先采用二氧化硅吸附法预处理腹水，然后采用辛酸－硫酸铵沉淀法或者亲和层析法纯化IgG。
9.利用权利要求4所述的玉米赤霉烯酮定性检测试剂盒定性检测玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1：称取5±0.05g样本到50mL离心管中，加入20mL提取液，振荡提取3min-5min；
Step2：于4000rpm离心5min，取上清液40μL，根据检测限加入适量稀释液，得到待测液；
Step3：在20℃-30℃环境下，将检测卡平放在桌面上，用滴管垂直滴加3滴待测液至加样孔中，10min-15min内观察结果。
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