CN106932495A - 分析氟甲基酮及其有关物质的液相色谱法、流动相和套装 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分析化学领域，提供一种分析氟甲基酮(Z-VAD-FMK)及其有关物质的液相色谱法、流动相和套装，其中使用的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；使用的流动相由以下流动相A和流动相B组成：流动相A：100～300mM的铵盐和80～250mM的钠盐或钾盐的水溶液，pH为2.5～3.5，流动相B：体积比乙腈:水＝0.5～1.5:1，pH为2.5～3.5；流动相A和流动相B的体积比为：45～15:55～85。本发明方法具体可为高效液相色谱法，可对Z-VAD-FMK及其有关物质进行分离及含量分析，为Z-VAD-FMK作为药物研究和使用提供了质量可控性，并且操作简单环保。

Description

分析氟甲基酮及其有关物质的液相色谱法、流动相和套装
技术领域
本发明属于分析化学领域，特别涉及一种分析氟甲基酮及其有关物质的液相色谱法，适合分析氟甲基酮及其有关物质的流动相，以及分析氟甲基酮及其有关物质的套装。
背景技术
氟甲基酮(Z-VAD-FMK)，CAS号：187389-52-2，化学名称：N-[苄氧羰基]-L-缬氨酰基-N-[(1S)-3-氟-1-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-2-氧代丙
基]-L-丙氨酰胺，分子式：C22H30FN3O7，分子量，467.5，为白色粉未。结构式为：
Z-VAD-FMK是一种半胱氨酸蛋白酶(caspase)抑制剂，能够抑制caspase家族蛋白酶活性和阻断凋亡发生，可能具有预防老年性耳聋、保护人体器官和癌症治疗等作用。目前，已有很多文献报告了Z-VAD-FMK的药效试验和作用机制，例如在以下文献中的报告：李胜利、王玉虎、张敏燕等，小鼠耳蜗毛细胞凋亡方式及Z-VAD-FMK对毛细胞的保护作用，听力学及言语疾病杂志，2015年第23卷第1期：50-56；朱宝昌、盛小辉、刘群、李红卫，广谱caspase抑制剂对大鼠烫伤后肾脏的保护作用，中国现代医药杂志，2014年l1月第16卷第11期：17-20；李红卫、刘群、朱宝昌、盛小辉，Z-VAD-FMK对烫伤大鼠肾脏细胞凋亡的影响，山东医药，2014年第54卷第46期：14-16；夏璐、鲍英、袁耀宗、张学军，全反式维甲酸和Caspase抑制剂Z-VAD-FMK对胰腺癌细胞凋亡的作用，胰腺医学，2003年12月第3卷第4期：198-202；等等。
但是，没有文献公开检测Z-VAD-FMK及其有关物质的方法，因此难以在药物研究和使用中提供可控的质量。
发明内容
本发明首先提供一种分析氟甲基酮(Z-VAD-FMK)及其有关物质的液相色谱法，其中
使用的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶(ostade-cylsilane，ODS或C18)；
使用的流动相由以下流动相A和流动相B组成：
流动相A：100～300mM的铵盐和80～250mM的钠盐或钾盐的水溶液，pH为2.5～3.5，
流动相B：体积比乙腈:水＝0.5～1.5:1，pH为2.5～3.5；
流动相A和流动相B的体积比为：45～15:55～85。
本发明还提供一种用于液相色谱法分析氟甲基酮及其有关物质的流动相，所述流动相由以下流动相A和流动相B组成：
流动相A：100～300mM的铵盐和80～250mM的钠盐或钾盐的水溶液，pH为2.5～3.5，
流动相B：体积比乙腈:水＝0.5～1.5:1，pH为2.5～3.5；
流动相A和流动相B的体积比为：45～15:55～85。
本发明还提供一种用于分析氟甲基酮及其有关物质的液相色谱法套装，包括：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶；
由以下流动相A和流动相B组成的流动相：
流动相A：100～300mM的铵盐和80～250mM的钠盐或钾盐的水溶液，pH为2.5～3.5，
流动相B：体积比乙腈:水＝0.5～1.5:1，pH为2.5～3.5；
流动相A和流动相B的体积比为：45～15:55～85。
本方法的重点在于流动相A中两种盐的浓度和比例，以及调节的pH值范围。将该流动相用于液相色谱法，更具体地用于高效液相色谱法，可对Z-VAD-FMK及其有关物质进行分离及含量分析，为Z-VAD-FMK作为药物研究和使用提供质量可控性，并且操作简单环保。
附图说明
图1为系统适用性试验中的灵敏度溶液的测试图谱(图中横坐标为分钟，最小分度为0.5；纵坐标为AU，最小分度为0.002)；
图2为线性实验中绘制的标准曲线；
图3为实施例1样品溶液的测试图谱(图中横坐标为分钟，最小分度为0.5；纵坐标为AU，最小分度为0.002)；
图4为实施例2样品溶液的测试图谱(图中横坐标为分钟，最小分度为0.2；纵坐标为AU，最小分度为0.005)；
图5为实施例3样品溶液的测试图谱(图中横坐标为分钟，最小分度为0.1；纵坐标为AU，最小分度为0.002)。
具体实施方式
本发明分析Z-VAD-FMK及其有关物质的液相色谱法，其中
使用的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；
使用的流动相由以下流动相A和流动相B组成：
流动相A：100～300mM(优选200mM)的铵盐和80～250mM(优选150mM)的钠盐或钾盐的水溶液，pH为2.5～3.5，
流动相B：体积比乙腈:水＝0.5～1.5:1，pH为2.5～3.5；
流动相A和流动相B的体积比为：45～15:55～85。
所述分析包括定性或定量分析，或涉及Z-VAD-FMK与其相关物质分离的分析。
在具体的实施方案中，流动相A中所述铵盐、钠盐、钾盐可为有机酸或无机酸的盐，所述有机酸优选醋酸，所述无机酸优选磷酸、硫酸、高氯酸。
在一个优选的实施方案中，所述铵盐选自硫酸铵、磷酸铵和醋酸铵中的一种或多种，且更优选硫酸铵和/或醋酸铵；所述钠盐或钾盐选自高氯酸钠、磷酸钠、醋酸钠、高氯酸钾、磷酸钾和醋酸钾中的一种或多种，且更优选高氯酸钠。
在一个优选的实施方案中，所述流动相B中，体积比乙腈:水＝1:1。
在一个优选的实施方案中，所述流动相A的pH为3。
在一个优选的实施方案中，所述流动相B的pH为3。
在更优选的实施方案中，用无机酸调节所述流动相的pH，并更优选用磷酸调节。
液相色谱法是用液体作流动相的色谱法。本发明的测试体系适应于柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法等液相色谱法。在优选的实施方案中，所述液相色谱法为柱色谱法；进一步，所述柱色谱法优选高效液相色谱法(HPLC)或液质联用(HPLC-MS)。液质联用(HPLC-MS)又叫液相色谱-质谱联用技术，是以液相色谱作为分离系统、质谱为检测系统的一种分析方法。
本发明通过测试体系特别地选择和组合，提供了一种有效的分离和分析Z-VAD-FMK及其有关物质的方法。
所述高效液相色谱法在具体的实施方案中，采用十八烷基硅胶键合色谱柱，并使用上述任意技术方案及其任意组合定义的液相色谱法中的流动相。所述色谱柱可市售获得。
在一个具体的实施方案中，所述高效液相色谱法所述的流动相A和流动相B在体积比45～15:55～85内进行梯度洗脱。
在一个具体的实施方案中，所述高效液相色谱法采用WatersSunFire C18色谱柱(3.5μm 4.6*150mm)或其他等效柱作为分析色谱柱。
在一个具体的实施方案中，所述高效液相色谱法采用的柱温为30～40℃，优选35℃。
在一个具体的实施方案中，所述高效液相色谱法采用的流速为0.6～1.0ml/min，优选0.8ml/min。
在一个具体的实施方案中，所述高效液相色谱法采用的检测波长为200nm～220nm，优选210nm。
在一个具体的实施方案中，所述高效液相色谱法按如下梯度进行洗脱：
在一个具体的实施方案中，所述高效液相色谱法中氟甲基酮的供试品溶液的浓度为0.10mg/ml～0.40mg/ml。
本发明特别的优点在于，通过建立、优化的高效液相色谱法，为测定Z-VAD-FMK的含量和有关物质，提供了一种稳定性好、重复性好的测定方法，为Z-VAD-FMK的质量控制提供可靠依据，便于该新药质控，从而使Z-VAD-FMK的药理药效等试验的可信度更高，使Z-VAD-FMK走向可靠的临床应用。
鉴于上述液相色谱法中所述流动相在分离和分析Z-VAD-FMK及其有关物质的实用价值，本发明还提供一种用于液相色谱法分析氟甲基酮(Z-VAD-FMK)及其有关物质的流动相，所述流动相由以下流动相A和流动相B组成：
流动相A：100～300mM的铵盐和80～250mM的钠盐或钾盐的水溶液，pH为2.5～3.5，
流动相B：体积比乙腈:水＝0.5～1.5:1，pH为2.5～3.5；
流动相A和流动相B的体积比为：45～15:55～85。
本发明还提供一种用于分析氟甲基酮及其有关物质的液相色谱法套装，包括：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶；
由以下流动相A和流动相B组成的流动相：
流动相A：100～300mM的铵盐和80～250mM的钠盐或钾盐的水溶液，pH为2.5～3.5，
流动相B：体积比乙腈:水＝0.5～1.5:1，pH为2.5～3.5；
流动相A和流动相B的体积比为：45～15:55～85。
所述套装包括装置、试剂和/或它们的组合，具体例如类似于试剂盒的形式。
在一个具体的实施方案中，所述固定相优选为层状设置(例如薄层色谱)或柱状设置(例如柱色谱)。
上述实施方案任意组合形成的新的实施方案也包括在本发明的范围内。
为进一步阐述本发明的技术方案及技术效果，以下通过方法验证和实施例进行说明，但以下内容并不用于限制本发明。其中，未详细说明的操作步骤、条件、仪器及试剂，按照本领域的常规进行。
本发明提供的高效液相色谱法根据中国药典2015年版完成了方法学验证，包括系统适性试验、专属性(降解试验)、重复性试验、线性试验、回收率试验(准确度试验)、精密度以及耐用性等试验。
以下列举如下进行的试验：
样品来源：
Z-VAD-FMK：来自深圳翰宇药业；
Z-VAD-FMK对照品：来自深圳翰宇药业。
通用测试条件：
选用Waters SunFire C18色谱柱(3.5μm 4.6*150mm)作为分析色谱柱，以200mM硫酸铵和150mM高氯酸钠的水溶液(磷酸调节pH值至3.0)为流动相A，以乙腈：水＝1:1(磷酸调节pH值为3.0)为流动相B；检测波长为210nm；流速0.8ml/min；柱温为35℃。按下表梯度进行洗脱：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 45 55
30 30 70
45 15 85
50 15 85
51 45 55
60 45 55
步骤：取20μl待测液进液相色谱分析，以外标法按峰面积计算含量；以自身对照法计算有关物质含量。
试验1：系统适用性试验
配制以下溶液进行测试：
1)灵敏度溶液：取对照品溶液适量，加稀释液(乙腈-水＝1:1，以下同)稀释制成每毫升含Z-VAD-FMK0.1μg的溶液。
2)对照品溶液：取Z-VAD-FMK对照品约25mg精密称定，置100ml容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
3)供试品溶液：取供试品约25mg，精密称定，置100mL量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
4)对照溶液：精密量取供试品溶液1ml置100ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，即得。
结果如下：
系统适用性溶液测定结果：
灵敏度溶液：主峰信噪比为3.2，见图1。
对照品溶液：5针对照品溶液主峰面积RSD值小于0.5％(符合《中国药典》2015年版要求)。
信噪比计算公式为s/n＝2h/hn
其中，h＝与组分对应的峰高
hn＝在等于半高处峰宽的五倍
因此：Z-VAD-FMK最低检测限为：0.1μg/ml。
试验2：专属性试验
配制以下溶液进行测试：
1)酸降解溶液：精密称定Z-VAD-FMK 20mg，加入适量1mol/L的盐酸溶解样品，于室温放置适当时间使Z-VAD-FMK降解5％～20％，然后加入等量的1mol/L氢氧化钠溶液中和，再加稀释液稀释并定容至100ml的容量瓶中。
2)酸降解空白溶液：不加样品，其他操作同酸降解溶液。
3)碱降解溶液：精密称定Z-VAD-FMK20mg，加入适量0.1mol/L的氢氧化钠溶液溶解样品，于室温放置适当时间使得Z-VAD-FMK降解5％～20％，然后加入等量的0.1mol/L盐酸溶液中和，再加稀释液稀释并定容至100ml的容量瓶中。
4)碱降解空白溶液：不加样品，其他操作同碱降解溶液。
5)氧化降解溶液：精密称定Z-VAD-FMK20mg，加入适量3％的双氧水液溶解样品，于室温放置适当时间使得Z-VAD-FMK降解5％～20％，再加稀释液稀释并定容至100ml的容量瓶中。
6)氧化降解空白溶液：不加样品，其他操作同氧化降解溶液。
7)光降解溶液：精密称定Z-VAD-FMK20mg置于光照强度为4500±500Lux/h、温度为10℃的环境中，放置10天后，用稀释液溶解并定容至100ml容量瓶中。
8)高温降解溶液：精密称定Z-VAD-FMK20mg置于60℃恒温箱中，放置10天后，用水溶解并定容至100ml容量瓶中。
9)高湿降解溶液：精密称定Z-VAD-FMK20mg置于高湿(湿度92.5％，室温)环境中，放置10天后，用稀释液溶解并定容至100ml容量瓶中。
10)光降解空白溶液、高温降解空白溶液：不加样品，其他操作分别同光降解溶液、高温降解溶液。
取以上溶液测定，主峰纯度因子均大于990，因此可认为本检测方法测定Z-VAD-FMK不受工艺杂质和降解杂质干扰。且主峰与相邻杂质之间的分离度达到2.0，达到充分分离的要求。
试验3：重复性试验
取试验1中供试品溶液6份和对应的对照品溶液6份，进行有关物质测定，结果见下表：
No. 最大单杂含量(％) 总杂含量(％) 测得杂质个数(个)
1 0.14 0.47 4
2 0.15 0.49 4
3 0.14 0.44 4
4 0.14 0.46 4
5 0.15 0.47 4
6 0.13 0.45 4
平均 0.14 0.46 --
RSD 3.8％ 3.8％ --
测得本品最大单杂的含量为0.15％，最大总杂含量为0.49％，测得的杂质个数为4个，RSD均为3.8％。
试验4：Z-VAD-FMK含量测定线性试验
配制以下溶液进行测试：
1)60％线性溶液：取Z-VAD-FMK对照品15mg，置100mL量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2)80％线性溶液：取Z-VAD-FMK对照品20mg，置100mL量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
3)100％线性溶液：取Z-VAD-FMK对照品25mg，置100mL量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
4)120％线性溶液：取Z-VAD-FMK对照品30mg，置100mL量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
5)140％线性溶液：取Z-VAD-FMK对照品35mg，置100mL量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
取60％、80％、100％、120％和140％线性溶液进样分析，结果见下表：
溶液 浓度(mg/mL) 平均面积
60％线性溶液 0.15 352662
80％线性溶液 0.20 468436
100％线性溶液 0.25 587857
120％线性溶液 0.30 705236
140％线性溶液 0.35 820604
以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线(见图2)：
Y＝2E+06X+617，R2＝1
得Z-VAD-FMK线性方程为Y＝2345368X+617(其中Y为峰面积，X为Z-VAD-FMK浓度)，R2＝0.999985。
试验5：Z-VAD-FMK含量测定回收率试验
配制以下溶液进行测试：
1)80％准确度溶液：取Z-VAD-FMK对照品20mg，置100mL量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。
2)100％准确度溶液：取Z-VAD-FMK对照品25mg，置100mL量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。
3)120％准确度溶液：取Z-VAD-FMK对照品30mg，置100mL量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。
将以上各准确度溶液进样分析，以Z-VAD-FMK对照品溶液，作为对照进行测定，按外标法计算回收率。
Z-VAD-FMK三个浓度水平的平均回收率分别为95.45％、96.25％和97.22％，9个样品Z-VAD-FMK回收率RSD为2.87％。
试验6：Z-VAD-FMK含量测定重复性试验
分别称取Z-VAD-FMK 25.33mg、25.14mg、25.89mg、24.95mg、25.22mg、25.64mg，精密称定，分别置100ml量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
取供试品溶液进行分析，按试验4中绘得的标准曲线计算六份Z-VAD-FMK的含量。结果显示，六份DZ-VAD-FMK的含量分别为：99.52％、99.45％、99.47％、99.38％、99.61％、99.49％，平均含量为99.49％。
经过上述验证，说明本发明提供的分析方法对于Z-VAD-FMK的含量测定和有关物质测定实用可靠、稳定性较好。
实施例1：
选用Waters SunFire C18色谱柱(3.5μm 4.6*150mm)作为分析色谱柱，以100mM硫酸铵和250mM高氯酸钠的水溶液(磷酸调节pH值至3.5)为流动相A，以乙腈：水＝1:1(磷酸调节pH值为3.5)为流动相B；检测波长为210nm；流速0.8ml/min；柱温为35℃。按下表梯度进行洗脱：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 45 55
30 30 70
45 15 85
50 15 85
51 45 55
60 45 55
步骤：精密量取Z-VAD-FMK样品适量，稀释液(乙腈-水＝1:1)定量稀释制成每毫升含Z-VAD-FMK样品0.25mg的溶液，取20μl待测液进液相色谱分析，以外标法按峰面积计算含量；以自身对照法计算有关物质含量。
样品溶液测定的图谱如图3所示，其中主峰Z-VAD-FMK的保留时间为30.66分钟，含量为98.32％；从图谱由左至右，主要的杂质峰分别的保留时间为29.27分钟、29.75分钟、32.09分钟、33.32分钟，含量分别为0.45％、0.47％、0.37％、0.40％。可见，本方法对
Z-VAD-FMK及其有关物质的分离良好，并可获得有效的定量结果。
实施例2：
选用Waters SunFire C18色谱柱(3.5μm 4.6*150mm)作为分析色谱柱，以270mM硫酸铵和80mM高氯酸钠的水溶液(磷酸调节pH值至3.0)为流动相A，以乙腈：水＝1:1(磷酸调节pH值为3.0)为流动相B；检测波长为210nm；流速0.8ml/min；柱温为35℃。按下表梯度进行洗脱：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 45 55
30 30 70
45 15 85
50 15 85
51 45 55
60 45 55
步骤：精密量取Z-VAD-FMK样品适量，稀释液(乙腈-水＝1:1)定量稀释制成每毫升含Z-VAD-FMK样品0.25mg的溶液，取20μl待测液进液相色谱分析，以外标法按峰面积计算含量；以自身对照法计算有关物质含量。
样品溶液测定的图谱如图4所示，其中主峰Z-VAD-FMK的保留时间为31.88分钟，含量为98.20％；从图谱由左至右，主要的杂质峰分别的保留时间为30.83分钟、31.24分钟、32.66分钟、33.77分钟，含量分别为0.44％、0.47％、0.46％、0.43％。可见，本方法对
Z-VAD-FMK及其有关物质的分离良好，并可获得有效的定量结果。
实施例3：
选用Waters SunFire C18色谱柱(3.5μm 4.6*150mm)作为分析色谱柱，以250mM磷酸铵和100mM醋酸钠的水溶液(磷酸调节pH值至3.0)为流动相A，以乙腈：水＝1:1(磷酸调节pH值为2.5)为流动相B；检测波长为210nm；流速0.8ml/min；柱温为35℃。按下表梯度进行洗脱：
步骤：精密量取Z-VAD-FMK样品适量，稀释液(乙腈-水＝1:1)定量稀释制成每毫升含Z-VAD-FMK样品0.25mg的溶液，取20μl待测液进液相色谱分析，以外标法按峰面积计算含量；以自身对照法计算有关物质含量。
样品溶液测定的图谱如图5所示，其中主峰Z-VAD-FMK的保留时间为27.96分钟，含量为98.32％；从图谱由左至右，主要的杂质峰分别的保留时间为26.94分钟、27.36分钟、28.56分钟、29.92分钟，含量分别为0.39％、0.42％、0.43％、0.44％。可见，本方法对Z-VAD-FMK及其有关物质的分离良好，并可获得有效的定量结果。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。本领域技术人员在不脱离本发明技术方案的宗旨和范围的情况下，对本发明的技术方案进行的修改或者等同替换，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种分析氟甲基酮(Z-VAD-FMK)及其有关物质的液相色谱法，其特征在于，其中
使用的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；
使用的流动相由以下流动相A和流动相B组成：
流动相A：100～300mM的铵盐和80～250mM的钠盐或钾盐的水溶液，pH为2.5～3.5，
流动相B：体积比乙腈:水＝0.5～1.5:1，pH为2.5～3.5；
流动相A和流动相B的体积比为：45～15:55～85。
2.根据权利要求1所述的液相色谱法，其特征在于，所述铵盐选自硫酸铵、磷酸铵和醋酸铵中的一种或多种，优选硫酸铵和/或醋酸铵；和/或，所述钠盐或钾盐选自高氯酸钠、磷酸钠、醋酸钠、高氯酸钾、磷酸钾和醋酸钾中的一种或多种，优选高氯酸钠。
3.根据权利要求1或2所述的液相色谱法，其特征在于，所述流动相A的pH为3；和/或，所述流动相B的pH为3。
4.根据权利要求1至3任一项所述的液相色谱法，其特征在于，所述液相色谱法为柱色谱法、纸色谱法或薄层色谱法；所述柱色谱法优选高效液相色谱法(HPLC)或液质联用(HPLC-MS)。
5.根据权利要求4所述的液相色谱法，其特征在于，所述高效液相色谱法中，所述流动相A和流动相B在体积比45～15:55～85内进行梯度洗脱。
6.根据权利要求4或5所述的液相色谱法，其特征在于，所述高效液相色谱法中，采用Waters SunFire C18色谱柱，3.5μm 4.6*150mm；
柱温：30～40℃，优选35℃；
流速：0.6～1.0ml/min，优选0.8ml/min；
检测波长：200nm～220nm，优选210nm。
7.根据权利要求4至6任一项所述的液相色谱法，其特征在于，所述高效液相色谱法中，按如下梯度进行洗脱：
0分钟：流动相A 45％，流动相B 55％；
30分钟：流动相A 30％，流动相B 70％；
45分钟：流动相A 15％，流动相B 85％；
50分钟：流动相A 15％，流动相B 85％；
51分钟：流动相A 45％，流动相B 55％；
60分钟：流动相A 45％，流动相B 55％。
8.根据权利要求4至7任一项所述的液相色谱法，其特征在于，所述高效液相色谱法中，其中氟甲基酮的供试品溶液的浓度为0.10mg/ml～0.40mg/ml。
9.一种用于液相色谱法分析氟甲基酮及其有关物质的流动相，其特征在于，所述流动相由以下流动相A和流动相B组成：
流动相A：100～300mM的铵盐和80～250mM的钠盐或钾盐的水溶液，pH为2.5～3.5，
流动相B：体积比乙腈:水＝0.5～1.5:1，pH为2.5～3.5；
流动相A和流动相B的体积比为：45～15:55～85。
10.一种用于分析氟甲基酮及其有关物质的液相色谱法套装，其特征在于，包括：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶；
由以下流动相A和流动相B组成的流动相：
流动相A：100～300mM的铵盐和80～250mM的钠盐或钾盐的水溶液，pH为2.5～3.5，
流动相B：体积比乙腈:水＝0.5～1.5:1，pH为2.5～3.5；
流动相A和流动相B的体积比为：45～15:55～85；
其中，所述固定相优选为层状设置或柱状设置。
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