CN106905272A - 一种从健脾生血颗粒中提取化合物的方法及该化合物的用途 - Google Patents

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    • C07D307/60—Two oxygen atoms, e.g. succinic anhydride

Abstract

本发明公开了一种从健脾生血颗粒中提取结构如式Ⅰ所示化合物的方法，包括萃取、上大孔吸附树脂柱、硅胶柱层析等步骤，该方法能获得高纯度的目标化合物，是首次从健脾生血颗粒中分离获得。本发明还公开了该化合物的新用途，可用于制备促进淋巴细胞增殖和提高免疫力的药物。

Description

一种从健脾生血颗粒中提取化合物的方法及该化合物的用途
技术领域
本发明属于制药领域，具体涉及一种从健脾生血颗粒中提取化合物的方法，以及该化合物的新用途。
背景技术
CN1554386A公开了一种防治贫血病的药物及制备方法，该药物属于中西药复方制剂，采用补气补血、健脾和胃的中药与西药铁剂进行配伍，用于治疗小儿脾胃虚弱及心脾两虚型缺铁性贫血，成人气血两虚型缺铁性贫血等。该药物已有20多年的临床应用历史，是健民药业集团股份有限公司的独家品种，商品名为健脾生血颗粒，是国家基本药物和二级中药保护品种，收载于《中国药典》2015年版一部。本品的制备方法是将党参、茯苓、白术、黄芪、大枣、山药、鸡内金、龟甲、麦冬、南五味子用水煎煮提取，然后将提取液浓缩成浸膏并与硫酸亚铁、维生素C等混合制粒。
为了探明复方配伍规律，揭示其治疗缺铁性贫血及改善气虚脾虚的物质基础，我们在前期研究的基础上对健脾生血颗粒进行了效应物质和作用机制研究，其中包括采用现代提取分离技术对方中总多糖、总皂苷、总黄酮等部位进行提取分离，结合药效学试验确定有效部位群，为处方化裁和效应物质基础研究奠定了基础；同时还开展血清药理学研究，观察了进入体内的有效成分及其代谢产物以及一些经药物作用后机体所产生的内生性活性成分的药理作用。在研究过程中我们首次发现一系列新化合物并验证其功能，从而完成本发明。
发明内容
本发明首次从健脾生血颗粒的中药浸膏中提取出一种活性成分，其结构如式Ⅰ所示，通过细胞和动物模型试验，证明该化合物促进淋巴细胞增殖，增强小鼠免疫功能。本发明的目的是提供该化合物的制备方法和用途。
本发明提供的制备方法包括以下步骤：
1)将健脾生血颗粒的浸膏用水溶解，先用非极性有机溶剂进行萃取，剩余的水溶液部位用极性有机溶剂进行萃取，萃取液回收溶剂得到萃取物；
2)将萃取物用水溶解并上大孔吸附树脂柱，依次用水和20-50％乙醇进行洗脱，收集乙醇洗脱液，并浓缩成浸膏；
3)将浸膏与硅胶粉搅拌混匀并过100-200目筛，然后上层析柱进行分离，用甲醇、二氯甲烷、水混合溶剂进行洗脱，用薄层色谱法检查洗脱流份，收集含有结构如式Ⅰ所示化合物的洗脱流份，减压浓缩得粗品；
4)将粗品用水溶解后按步骤3)的方法再进行1-3次柱层析分离，洗脱，将洗脱流份浓缩，干燥得到纯品，
优选地，步骤1)中所述非极性有机溶剂是石油醚，所述极性有机溶剂是水饱和正丁醇。
优选地，步骤2)中所述的乙醇浓度为30％。
优选地，所述甲醇、二氯甲烷、水混合溶剂的体积比为2-10：0-8：0-1。
所述结构如式Ⅰ所示的化合物在制备促淋巴细胞增殖的药物中的应用。
优选地，所述药物是提高免疫力的药物。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细地说明。
实施例1：化合物的分离
1、萃取
取健脾生血颗粒的中药材，原料及配比如下：
将龟甲、鸡内金煎煮四次，其余黄芪等八味煎煮三次，将上述煎煮液合并浓缩至相对密度为1.3(20℃)的浸膏。
取浸膏1kg，用3L的蒸馏水溶解，并用等体积的石油醚进行萃取，剩余的水溶液部位用水饱和正丁醇萃取三次，回收溶剂得到正丁醇萃取物(约33g)。
2、大孔树脂分离
取洗净的D101型大孔树脂装入玻璃柱中，向其中加入适量蒸馏水，使得水液面高于大孔树脂面约5cm。将正丁醇萃取物用适量水溶解后置于分液漏斗中，将分液漏斗置于大孔树脂玻璃柱正上方，打开分液漏斗及玻璃柱旋塞，使样品过柱分离，保持二者流速接近。样品滴加完毕后，取与样品溶液同体积的纯水于分液漏斗中继续同速滴加，滴加完毕后将玻璃柱旋塞关闭，静置过夜。然后依次用纯水和30％(质量浓度)乙醇对样品进行洗脱，每次洗脱4个柱体积，合并30％乙醇的洗脱液，并浓缩成相对密度为1.30的浸膏(约4.7g)。
3、柱层析分离
取上述浸膏及与其等质量的硅胶粉于蒸发皿中，搅拌混匀，将蒸发皿置于60℃的恒温水浴锅上，搅拌至样品干燥为砂粒状，并过100目筛，未通过筛部分用碾钵碾细后继续过筛，确保吸附样品的硅胶粒径均一。所得样品经过层析柱进行分离，洗脱剂比例为甲醇：二氯甲烷＝2：8→甲醇：二氯甲烷：水＝3：7：0.3→甲醇：二氯甲烷：水＝4：6：0.4→甲醇：二氯甲烷：水＝5：5：0.5→甲醇：二氯甲烷：水＝6：4：0.6→甲醇：二氯甲烷：水＝7：3：0.7→甲醇：二氯甲烷：水＝8：2：0.2→甲醇：二氯甲烷：水＝9：1：0.9→甲醇：水＝10：1。每个浓度洗脱2个柱体积。用薄层色谱法检查洗脱流份(波长254nm，展开剂为甲醇、二氯甲烷、水混合溶剂)，收集含有目标化合物的洗脱流份，减压浓缩得粗品(1.2g)。
4、纯品的制备
将步骤3中的粗品用水溶解后按步骤3的方法再进行2次柱层析分离，洗脱，将洗脱流份浓缩，干燥得到纯品(0.45g，纯度91.5％)。
实施例2：化学结构鉴定
淡黄色粉末(甲醇)，GF254硅胶板254nm下显暗斑，该化合物的13C NMR(126MHz，DMSO)谱给出了δC：170.47、δC：152.02、δC：124.80、δC：110.10四个芳香碳信号，推测该结构中具有一个呋喃环；1H NMR(500MHz，DMSO)谱给出了一个与烷基相连的羟基质子信号δH：2.39、两个芳香氢信号：δH：7.48和δH：6.45，这表明呋喃环有两个碳被完全取代。该化合物的HMBC谱主要给出了甲基碳与羟基氢的相关(2.39，49.03)，羰基碳与芳香氢的相关(6.45，170.47)、(7.48，170.47)，芳香碳与甲基氢的关(3.18，110.10)，芳香碳与亚甲基氢的相关(4.08，110.10)，芳香碳与芳香氢的相关(7.48，110.10)、(6.45，110.10)。结合13C NMR、1HNMR及HMBC谱图信息，鉴定为5-methoxy-5-hydroxymethyl-2-furanone(5-甲氧基-5-羟甲基-2-呋喃酮)，为首次从健脾生血颗粒中分离得到。
实施例3：细胞模型验证试验
本发明通过小鼠脾淋巴细胞的增殖情况对分离所得的化合物进行药理活性验证，考察其促进淋巴细胞增殖的作用。试验所用的动物为SPF级昆明小鼠，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号为SCXK(鄂)2008-0005。
1.材料
RPMI-1640基础培养基(含10％胎牛血清)、无菌磷酸盐缓冲液(PBS)、红细胞裂解液、刀豆球蛋白A(Con A)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)等均为商业途径购买。
2.方法
昆明小鼠经断颈处死后，迅速通过无菌操作去除脾脏，剪碎，悬浮于无菌PBS中，通过200目尼龙网过滤，滤液加入到离心管中，1500rpm离心5min，加入PBS重新操作一次后，加入红细胞裂解液1.5mL，加样器吹打混匀，1500rpm离心5min，加入RPMI-1640培养基于37℃，5％的CO2培养箱中培养24h，收集未贴壁的细胞悬液(淋巴细胞)备用。
所得的化合物经培养基稀释配制为不同浓度(10、50、100、250、500μg/mL)的含药培养液，加入到96孔板中，每孔接种1.5×106个淋巴细胞，其中，空白对照组为纯培养基，阳性对照组为含5μg/mL的Con A培养液。各实验组设置5个复孔。细胞于37℃，5％的CO2培养箱中分别培养24、48h，检测细胞增殖情况。在检测前4h于每孔培养液中加入20μl MTT(5mg/mL)，并继续培养4h，3000rpm离心10min，弃去上清液，加入150μl的DMSO，溶解蓝紫色沉淀，通过酶标仪于492nm波长下检测吸光度值。
3.结果
化合物对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响情况见表1。与空白对照组相比，阳性对照组培养24、48h，促增殖作用均非常明显(P<0.01)。淋巴细胞在100μg/mL的化合物溶液中培养24h，表现出一定的促增殖作用(P<0.05)，化合物浓度超过100μg/mL后培养24h，则具有显著的促增殖作用(P<0.01)。细胞培养48h结果显示，50～500μg/mL的化合物均能明显促进淋巴细胞增殖(P<0.01)，并且，促增殖作用呈现剂量依赖性。低浓度10μg/mL的化合物与空白对照组间差异无统计学意义。
表1不同浓度的化合物对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响(n＝6)
**P<0.01vs空白对照组；##P<0.01vs培养24h
4.结论及讨论
本实验主要验证化合物对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响。结果发现，该化合物具有明显的促淋巴细胞增殖作用。MTT试验结果显示，细胞于100～500μg/mL的化合物溶液中培养24h，50～500μg/mL的化合物溶液中培养48h，增殖率明显升高，且呈现剂量依赖性。此外，每个浓度的化合物促淋巴细胞增殖作用均呈现时间依赖性，即培养48h后的吸光度值相对于培养24h的明显升高。这表明该化合物对促进淋巴细胞增殖具有一定的时效性和剂量依赖性。
实施例4：脾虚模型动物试验
通过上述细胞试验筛选得到化合物具有明显促进淋巴细胞增殖的作用，进一步建立脾虚动物模型验证该化合物改善脾虚、提高免疫力的作用。
1.试验动物及材料
SPF级昆明小鼠，18～22g，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号为SCXK(鄂)2008-0005。利血平、印度墨汁、碳酸钠、氯化钠等，均为商业途径购买。
2.试验方法
2.1小鼠单核吞噬细胞功能试验
动物被随机分为5组：正常对照组、模型对照组、化合物低、中、高剂量组。其中，模型对照组和化合物低、中、高剂量组动物于每日皮下注射0.1mg/kg利血平，连续注射14天造模，正常对照组注射蒸馏水。造模完成后给药，化合物低、中、高剂量组大鼠通过灌胃给药剂量分别为1、2、4mg/kg，给药容积均为10mL/kg，正常对照组和模型对照组则灌胃10mL/kg的蒸馏水。所有动物连续给药21天。
造模和给药过程中，观察动物表现和体征。末次给药后，采用碳粒廓清法测定吞噬细胞活性，于尾静脉处注射0.01mL/g的印度墨汁，于注射完成后1、5min分别于眼眶后静脉丛取血20μL，溶于2mL 0.1％的碳酸钠溶液中，摇匀，紫外分光光度计测定吸光度(波长630nm)，分别记为OD1，OD2。处死小鼠，分别摘取肝脏和脾脏，称重，分别按照公式(1)、(2)计算廓清指数K和吞噬活性α。
廓清指数K＝(1gOD1-1gOD2)/(t2-t1) (1)
吞噬活性α＝体重/(肝重+脾重)K1/3 (2)
2.2小鼠血清溶血素试验
动物分组及灌胃给药方法同上，从第一次给药开始，所有小鼠每天腹腔注射5％鸡红细胞混悬液予以免疫，连续注射7天。于末次给药40min后，各组小鼠采取摘眼球法取血，3000rpm离心，取上层血清，以1:100比例加入到生理盐水中，制成稀释血清。随机取2只豚鼠的血清，以1:10比例加入到生理盐水中，制成补体血清。取稀释血清与补体血清混合，37℃保温30min，取出置于冰箱中中止反应，取出反应液，3000rpm离心，取上清液，在波长540nm下测定其吸光度值，根据公式(3)计算HC50。
HC50＝(吸光度值/红血球半数溶血时吸收度值)×稀释倍数 (3)
3.结果
3.1小鼠单核吞噬细胞功能试验
经过14天的造模，动物出现躁动、焦虑、情绪不安等反应，且体重和进食量相对于正常组小鼠均明显降低。灌胃给予化合物后，各浓度组对动物躁动、焦虑、情绪不安等表现有一定的缓解。化合物对小鼠廓清指数和吞噬活性的影响情况见表2。结果显示，化合物各剂量组廓清指数与模型对照组比较具有显著差异(P<0.01)，吞噬活性则是中、高剂量的化合物与模型对照组间差异具有显著统计学意义(P<0.01)，低剂量组吞噬活性与模型对照组间差异也具有统计学意义(P<0.05)。
表2化合物对小鼠廓清指数和吞噬活性的影响(n＝10)
分组 廓清指数 吞噬活性
正常对照组 0.0367±0.0084 6.42±0.98
模型对照组 0.0113±0.0038 3.90±0.57
化合物F低剂量组
化合物F中剂量组
化合物F高剂量组
**P<0.01vs廓清指数模型对照组；▲p<0.05，▲▲p<0.01vs吞噬活性模型对照组
3.2小鼠血清溶血素试验
各组动物血清溶血素HC50结果见表3。结果显示，给予不同剂量化合物灌胃21天后，各组小鼠溶血素水平均高于模型对照组(低剂量组p<0.05，中、高剂量组p<0.01)，并且HC50值呈现剂量依赖关系。
表3各组小鼠血清溶血素HC50(n＝10)
组别
正常对照组 25.11±1.93
模型对照组 18.64±2.02
化合物F低剂量组
化合物F中剂量组
化合物F高剂量组
**P<0.01vs模型对照组
4.结论
通过整体动物试验验证发现，化合物在1～4mg/kg的剂量下灌胃给药能明显提高免疫力，小鼠廓清指数显著升高，并呈现剂量依赖关系。2mg/kg以上的化合物灌胃可显著增加吞噬活性。化合物在1～4mg/kg的剂量下灌胃给药能显著提高小鼠血清溶血素HC50值，该值越高，表明小鼠溶血素生成越多，其溶解鸡红细胞释放血红蛋白而引起的溶液颜色越深，即小鼠释放抗体越多，免疫功能越强。

Claims (6)

1.一种从健脾生血颗粒中提取结构如式Ⅰ所示化合物的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将健脾生血颗粒的浸膏用水溶解，先用非极性有机溶剂进行萃取，剩余的水溶液部位用极性有机溶剂进行萃取，萃取液回收溶剂得到萃取物；
2)将萃取物用水溶解并上大孔吸附树脂柱，依次用水和20-50％乙醇进行洗脱，收集乙醇洗脱液，并浓缩成浸膏；
3)将浸膏与硅胶粉搅拌混匀并过100-200目筛，然后上层析柱进行分离，用甲醇、二氯甲烷、水混合溶剂进行洗脱，用薄层色谱法检查洗脱流份，收集含有结构如式Ⅰ所示化合物的洗脱流份，减压浓缩得粗品；
4)将粗品用水溶解后按步骤3)的方法再进行1-3次柱层析分离，洗脱，将洗脱流份浓缩，干燥得到纯品，
2.如权利要求1所述从健脾生血颗粒中提取结构如式Ⅰ所示化合物的方法，其特征在于：步骤1)中所述非极性有机溶剂是石油醚，所述极性有机溶剂是水饱和正丁醇。
3.如权利要求1所述从健脾生血颗粒中提取结构如式Ⅰ所示化合物的方法，其特征在于：步骤2)中所述的乙醇浓度为30％。
4.如权利要求1所述从健脾生血颗粒中提取结构如式Ⅰ所示化合物的方法，其特征在于：所述甲醇、二氯甲烷、水混合溶剂的体积比为2-10：0-8：0-1。
5.权利要求1中所述的结构如式Ⅰ所示化合物在制备促淋巴细胞增殖的药物的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述药物是提高免疫力的药物。
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