CN106902153A - 一种马钱子总碱的提取及纯化方法 - Google Patents

一种马钱子总碱的提取及纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种马钱子总碱的提取及纯化方法，属于药物的技术领域。该方法包括：采用 Box‑Behnken 响应面法设计优化回流提取工艺，得到液料比、提取时间、pH值等参数的回归模型，在据此分析得到的最佳提取工艺条件下，将马钱子粗粉经酸水回流提取、浓缩得到膏状提取物，再通过大孔树脂柱层析分离方法进行富集纯化。本发明的有益效果是：通过使用本发明的方法，可以很好的预测并优化酸水回流提取工艺，简便快速地从马钱子中提取并分离纯化马钱子总碱，提高生物总碱的富集量和纯度。

Description

一种马钱子总碱的提取及纯化方法
技术领域
本发明涉及一种马钱子总碱的提取及纯化方法，属于药物的技术领域。
背景技术
马钱子为马钱科植物马钱（Strychnos nux-vomica L.）或云南马钱（Strychnos pierriana A.W.Hill）的干燥成熟种子，主要活性成分为生物碱类，含量为生药的1.5%~5%，其中士的宁和马钱子碱约占总碱量的80%。在我国马钱子作为药用具有悠久的历史，其性苦味温，归肝脾经，具有通络止痛、散结消肿的功效，可用于风湿顽痹、跌打损伤、小儿麻痹后遗症、类风湿性关节炎、各种神经系统疾病、癌症、慢性支气管炎和慢性再生障碍性贫血等方面的治疗。但马钱子活性成分作为一个中成药用于临床治疗上述各类病症的数据还很少，主要是因为从中药马钱子分离出各活性成分很困难，所得的提取物组成复杂，难以就马钱子活性成分定性定量研究以便进行临床观察。因此，利用现代分离技术把生物碱从天然产物中分离出来并对其进行纯化，开发其药用价值，提高天然产物的经济和社会效益均具有非常重要的意义。
目前关于生物碱的提取方法主要有回流法、微波法、超声法、超临界提取法等，其中回流提取法出膏量最大，单位质量药材中提取的生物总碱量也最多。回流提取法可采用的提取溶剂一般有水、乙醇、酸性乙醇、50%乙醇、酸水、氨性氯仿等，实验研究表明，采用酸水提取法得到的提取物总量以及马钱子碱和士的宁碱单体量均高于其他溶剂。因而研究酸水回流提取马钱子总碱的工艺条件及其优化很有必要。
前期文献调研发现，马钱子提取工艺优化主要以单因素考察，正交设计为主，对多因素的关联研究较少。传统的柱层析色谱分离方法采用硅胶柱分离纯化马钱子总碱，有机溶剂消耗量大，且分离周期长，洗脱得到的总碱量较少，无法满足高效快速制备纯品的要求。离子交换树脂预处理过程复杂，洗脱率也不理想。大孔吸附分离技术是一种中药深加工技术，具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、速度快、选择性好，解吸条件温和，再生处理方便，使用周期长，易构成闭路循环，节省费用等诸多优点，已被广泛用于中草药有效成分的分离纯化。据此，本发明提供了一种简便快速地从马钱子中提取并分离纯化马钱子总碱，提高生物总碱的富集量和纯度的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种马钱子总碱的提取及纯化方法，包括如下步骤：
（1）通过 Box-Behnken 响应面法设计优化酸水回流提取马钱子总碱工艺，得到液料比、提取时间、pH值等参数的回归模型，并据此分析预测最佳的提取工艺条件；
（2）称取马钱子制品，用粉碎机粉碎，将粗粉装入圆底烧瓶，以6-12倍量加入酸水溶液，在步骤（1）得到的最佳工艺条件下加热回流1-2h，过滤提取液，浓缩成膏；
（3）将步骤（2）中所得的膏状提取物粉碎研磨，搅拌溶解于蒸馏水中，倒入装填有大孔吸附树脂的玻璃柱内，用洗脱液进行洗脱，洗脱4倍柱体积，洗脱液流速为1. 0ml/min，浓缩烘干，得到马钱子总碱的纯化物。
回流提取工艺中所用的酸水pH=1-3，优选盐酸溶液。
以马钱子碱含有量的 40%、士的宁含有量的 60%为综合效应值，得到液料比、提取时间、pH值等参数的回归模型为：
相关系数r=0.9257，整体模型达到显著水平 (P<0.05)。
由上述模型得到的最佳提取工艺条件为：酸水与制马钱子最优液料比为10：1，提取时间1.5h，酸水pH值为1。
所用大孔吸附树脂型号为LSA-10、HPD-500、AB-8、D101，优选AB-8型大孔吸附树脂。
分离纯化过程中使用的洗脱液为乙醇溶液，优选乙醇浓度为30%-50%的溶液。
本发明的有益效果是：通过Box-Behnken 响应面法关联多因素模型，能够很好的预测并优化酸水回流提取工艺，得到最佳的提取工艺条件，提高马钱子总碱的出膏量；同时采用大孔吸附树脂柱和合适浓度的洗脱液，能够最大限度地富集并分离纯化马钱子总碱。通过本发明的方法，可简便快速地从马钱子中提取并分离纯化马钱子总碱，提高马钱子总碱的富集总量和纯度。
附图说明
图1至图3是具体实施方式中采用Box-Behnken 响应面法设计优化回流提取工艺，得到液料比、提取时间、pH值等参数的回归模型，采用Design-Expert V.8.0.6 软件，根据回归方程的分析结果作出的综合效应随各因素变化的效应面图。
具体实施方式
（一）马钱子提取工艺的确定
1.马钱子药材来源的确定
（1）对照品的制备：精密称取对照品马钱子碱1.55mg，士的宁1.19mg，分别置于10ml容量瓶内，加入甲醇定容。
（2）供试品的制备：精密称取生马钱子和制马钱子粗粉各1.5g，置于100ml锥形瓶内，精密加入50ml的甲醇-水-浓盐酸（50:50:1），称定重量，超声提取30min，取出，放凉，再称重补足重量，取上清液，用0.45μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品。
（3）色谱条件：色谱柱:ODS250mm×4.6mm，5μm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；流动相：0.05%磷酸溶液（A）：乙腈（B）=12:88
（4）测量结果如下：
表1 马钱子药材测量结果
由此可以得出制马钱子中生物碱的含量高于生马钱子中的含量，之后的实验中均选取制马钱子进行实验。
2.提取方法的确定
（1）回流法：称取马钱子制品100g，用粉碎机粉碎2~3s，将粗粉装入1000ml圆底烧瓶并加入600ml的蒸馏水，经过回流装置安装，打开电热套回流提取1h，取蒸发皿洗净烘干，贴上标签水提，然后称重分别为234.348g，将所得提取液抽滤倒入蒸发皿内，并置于水浴锅上设置温度为99℃进行浓缩，当溶液挥干至膏状后，放入烘箱内烘干，取出放冷之后称重为230.322g。
（2）超声辅助提取法：称取马钱子制品100g，用粉碎机粉碎2~3s，至1000ml平底烧瓶中，加入50%乙醇600ml，至超声仪内，每次20min，间隔5min共三次1h，取出静置，进行抽滤，浓缩成膏重量为5.993g。
（3）微波辅助提取法：称取马钱子制品100g，用粉碎机粉碎2~3s，至900ml的烧杯中，加入600nl蒸馏水，用保鲜膜盖住扎孔。放入微波炉中火，每次提取3min共10次30min。抽
（4）超临界提取法：称取制马钱子和生马钱子粗粉各200g。检查柱子是否干净并进行装柱，一次约40g粗粉，按照超临界CO2萃取仪正规操作流程一次打开各个机器，装柱，检查是否漏气，设定温度为79℃，压力为34.47MPa，CO2静态萃取30min，动态萃取30min，生马钱子和制马钱子各萃取约120g。
（5）对照品的制备：精密称取对照品士的宁2.13mg，马钱子碱1.73mg，加氯仿溶解，并定容至10ml。
（6）供试品的制备：精密称取他们的提取物0.5g，放入容量瓶内加入约40ml的甲醇-水-浓盐酸（50:50:1）溶剂超声30min，取出静置放凉定容至50ml。
（7）色谱条件：色谱柱：ODS250mm×4.6mm，5μm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；流动相：采用0.05%磷酸溶液（A）：乙腈（B）为12:88。
（8）测定结果如下：
表2 不同提取工艺测量结果
由上述结果可以看出，加热回流提取的出膏量最大，所含马钱子碱和士的宁总量也最高，故选择加热回流法提取马钱子。
3.提取溶剂的确定
（1）水提取:称取马钱子粗粉100g，放入1000ml圆底烧瓶内，加入600ml蒸馏水，电热套回流加热1h，抽滤，取蒸发皿洗净烘干，贴上标签水提，然后称重分别为234.348g，将所得提取液抽滤倒入蒸发皿内，并置于水浴锅上设置温度为99℃进行浓缩，当溶液挥干至膏状后，放入烘箱内烘干，取出放冷之后称重为230.322g。
（2）酸水提取:称取马钱子粗粉100g，放入1000ml圆底烧瓶内，加入600ml pH=1的酸水，电热套回流加热1h，抽滤，浓缩成膏。
（3）乙醇提取:称取马钱子粗粉100g，放入1000ml圆底烧瓶内，加入600ml的乙醇，电热套回流加热1h，抽滤，浓缩成膏。
（4）50%乙醇提取:称取马钱子粗粉100g，放入1000ml圆底烧瓶内，加入600ml的乙醇，电热套回流加热1h，抽滤，浓缩成膏。
（5）酸性乙醇提取:称取马钱子粗粉100g，放入1000ml圆底烧瓶内，加入600ml的酸性乙醇，电热套回流加热1h，抽滤，浓缩成膏。
（6）氨性氯仿提取:称取马钱子粗粉100g，放入1000ml圆底烧瓶内，加入600ml的氨性氯仿，电热套回流加热1h，抽滤，浓缩成膏。
（7）采用高效液相色谱法测定各提取物中马钱子碱，士的宁，马钱苷，马钱子碱氮氧化物，士的宁氮氧化物的含量和总生物碱来确定提取溶剂。
①对照品的制备：精密称取对照品士的宁2.13mg，马钱子碱1.73mg，加氯仿溶解，并定容至10ml。
②供试品的制备：精密称取他们的提取物0.5g，放入容量瓶内加入约40ml的甲醇-水-浓盐酸（50:50:1）溶剂超声30min，取出静置放凉定容至50ml。
③色谱条件：色谱柱：ODS250mm×4.6mm，5μm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；流动相：采用0.05%磷酸溶液（A）：乙腈（B）为12:88。
④测量结果如下：
表3 不同提取溶剂测量结果
可以看出，采用酸水溶液提取马钱子得到的出膏量最大，马钱子碱和士的宁总含量最高，故采用酸水作为提取溶剂提取马钱子。
（二）马钱子的提取及分离纯化
1.Box-Behnken 响应面法优化马钱子回流提取工艺
1.1试验设计与结果
参考文献显示，影响马钱子回流提取较显著的因素有pH值、提取时间和料液比。根据Box-Behnken 的中心组合试验设计原理对各因素进行三水平试验设计，各因子编码值试验设计方案和试验结果见表4和表5。按其选择的因素和水平进行回流提取，测定马钱子碱和士的宁含有量。
表4 Box-Behnken 试验设计因素与水平编码
表5 Box-Behnken 设计与试验结果
1.2 模型拟合
将所有数据用软件进行效应面试验分析。综合考虑马钱子碱和士的宁的药效和毒性，以马钱子碱含有量的40%、士的宁含有量的60%为综合效应值分别对各因素进行多元线性回归和二次多项回归模型拟合得：
该方程的相关系数r=0.9257，表明该回归模型的拟合情况良好，回归方程的代表性较好，能准确地预测实际情况。
1.3响应面分析与优化
1.3.1二次回归模型的建立及显著性检验
表6 方差分析
注：(1)P ＜ 0. 05 显著性差异；(2)P ＜ 0. 01 极显著性差异
由表 3 可知整体模型达到显著水平 (P<0.05)该方程对试验拟合较好，可以对不同条件下的马钱子碱和士的宁碱提取量进行预测。
1.3.2提取工艺的响应面分析与优化
采用Design-Expert V.8.0.6软件，根据回归方程分析结果，作出综合效应随因素变化的效应面图见附图1-3，软件分析最佳提取工艺条件为：液料比为10，提取时间为1.5h，pH值为1。1.4验证实验
根据最佳提取工艺条件：pH值为1的酸水与制马钱子10：1混合加热回流提取1.5h，过滤浓缩提取液得到总生物碱浸膏，平行处理三次，进行马钱子碱与士旳宁的含量测定。由于液料比10:1为试验范围端点值，为进一步验证结果，以pH值为1的酸水与制马钱子12：1混合加热回流提取1.5h进行试验，平行处理三次，进行马钱子碱与士旳宁的含量测定。实验结果如表7所示。
可见，液料比增加后，综合效应值的提高并不明显，采用10:1的液料比确为最佳工艺条件；同时可看出该模型预测较好，得到的拟合方程可较好地描述因素与指标的关系。
表7 验证实验结果
2.马钱子总碱的提取及纯化过程
2.1样品的制备：
称取制马钱子300g，用粉碎机进行粉碎装入5000ml的圆底烧瓶内，加入pH值为1的3000ml酸水，加热回流提取1.5h，进行过滤，浓缩成膏，放置干燥器常温保存。
酸水提取物中的马钱子碱和士旳宁的含量的测定：
（1）对照品的配置：精密称取士的宁对照品2.62mg，马钱子碱对照品3.42mg，分别放入10ml容量瓶加入甲醇溶液定容。
（2）供试品的配置：称取马钱子提取物0.5g倒入50ml容量瓶内，加入溶剂甲醇-水-浓盐酸（50:50:1）约40ml超声30min，取出，放冷用溶剂定容至50ml。
（3）高效液相测定：测量计算得出结果为马钱子碱的含量为103.12mg/g，士旳宁的含量为105.47mg/g。
2.2马钱子生物总碱的富集纯化方法
2.2.1硅胶层析柱
（1）预实验的考察：
洗脱剂的考察筛选：取硅胶G板按操作画好线，将对照品士的宁和马钱子碱溶液准备好，用微量进样器进行点样，进样量为10μl；展开剂分别是氯仿:甲醇为10:1和乙酸乙酯:甲醇为10:1；将点好的硅胶G板在展开槽内饱和10min，再浸入下端开始展开最终达到8cm处取出，晾干，喷上显色剂碘化铋钾试液，观察结果；继续更换展开剂为乙酸乙酯:石油醚为1:1，石油醚:甲醇为1:1，最终展开剂为二氯甲烷:甲醇为10:1效果最佳。因此最后确立洗脱剂为二氯甲烷:甲醇10:1。
（2）硅胶层析柱的纯化步骤
1.1样品处理：将酸水提取物粉碎称取10g，同时称取硅胶10g一起放入蒸发皿内，加入二氯甲烷搅拌使其混合均匀，放置在通风橱内，挥干。
1.2装柱：称取100g硅胶，将硅胶通过干法装柱。
1.3上样：将处理好的样品倒入柱内用洗耳球不断敲击柱璧，减少柱内硅胶间隙。
1.4冲洗：洗脱剂为二氯甲烷:甲醇=10:1，现用现配。开始冲洗，始终保持洗脱剂不低于硅胶顶部。洗脱流速控制在70滴/分，每洗脱50ml进行收集更换并编号，最终洗脱5倍柱体积2500ml。
1.5处理：将所收集的不同时间编号的收集液在薄层板上点样进行观察，发现从中间6号开始出现斑痕然后到37号开始消退，说明我们收集的洗脱液从6号到37号即冲洗一个柱体积后开始收集，直到冲洗完3个柱体积。将硅胶层析柱用二氯甲烷冲洗2倍柱体积硅胶柱内剩余其他的成分洗出。进一步通过高效液相进行验证。
1.6高效液相测定：将之前的收集液按照编号顺序部分合并浓缩后用微孔滤膜0.45μm过滤直接作为供试品进行测量，对照品为之前配制的。色谱条件：色谱柱：ODS250mm×4.6mm，5μm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；流动相：0.05%磷酸溶液（A）：乙腈（B）为12:88。
1.7测量结果：以士的宁、马钱子的含量为评价指标
表8 硅胶层析柱洗脱测量结果
通过上述数据分析可知：10g酸水提取物中应含有马钱子碱1031.2mg，士旳宁1054.7mg，而两种生物碱经硅胶柱洗脱后的富集总量还不到10%，纯化效果较差。
2.2.2离子交换树脂层析柱
（1）离子交换树脂预处理：分别称取3种Na型阳离子树脂1#（001×2.5型），2#(001×7型)，3#(001×15型)约200g至900ml烧杯中，加入去离子水浸泡过夜，洗至去离子水近无色；然后加入6倍量树脂体积7%盐酸溶液浸泡1h并不断搅拌，用去离子水洗至中性；加入6倍量体积的8%氢氧化钠浸泡1h并不断搅拌，用去离子水洗至中性；最后加入5倍量树脂体积的7%盐酸溶液，用去离子水洗至中性。
（2）装柱：湿法装柱。
（3）上样：称取马钱子酸水提取物20g，研磨。加入已配好的pH=1的HCl溶液，超声20min。用注射器吸取一定溶液，用三通器进行逆向上样，有一部分没有溶解用盐酸溶液将其冲入柱内。
（4）冲洗：用蒸馏水冲洗4倍柱体积约2000ml，将冲洗液浓缩、烘干、称重并编号，分别用含量为1%NaCl、3%NaCl、5%NaCl的30%、50%、70%乙醇溶液，依次冲洗，将每次的洗脱液浓缩烘干，称量，由于浓缩之后浓缩物较少，所以直接在蒸发皿中加入甲醇超声溶解，少量多次，最终定容至50ml，烘干蒸发皿称重。
（5）色谱条件：色谱柱：ODS250mm×4.6mm，5μm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；流动相：采用0.05%磷酸溶液（A）：乙腈（B）为12:88。
（6）测定结果：
表9 离子交换树脂层析柱洗脱测量结果
士的宁mg/ml 马钱子碱mg/ml 取样量g 士旳宁mg/g 马钱子碱mg/g 洗脱膏量mg 士旳宁的量mg 马钱子碱的量mg
对照品 0.262 0.342
1# 水 0.0061 0.0892 0.498 0.615 8.952 498 0.306 4.458
1%NaCl30%醇 0.3739 0.3070 0.059 316.83 260.20 59 18.693 15.352
1%NaCl50%醇 2.0456 1.3107 0.14 730.59 468.09 14 102.28 65.533
1%NaCl70%醇 1.7788 1.2692 0.138 644.49 459.87 138 88.940 63.462
3%NaCl30%醇 0.7468 0.5763 0.125 298.71 230.52 125 37.339 28.815
3%NaCl50%醇 2.0997 1.3807 0.15 699.91 460.24 150 104.99 69.036
3%NaCl70%醇 0.6473 0.4560 0.066 490.34 345.46 66 32.362 22.800
5%NaCl30%醇 2.3502 1.5288 0.181 649.22 422.31 181 117.51 76.438
5%NaCl50%醇 0.7891 0.4965 0.13 303.51 190.98 130 39.456 24.827
5%NaCl70%醇 0.5419 0.4443 0.112 241.92 198.34 112 27.095 22.214
总量 568.97 392.935
2# 水 0.0091 0.0117 0.501 0.910 1.169 501 0.456 0.586
1%NaCl30%醇 0.0279 0.0449 0.039 35.846 57.679 39 1.398 2.249
1%NaCl50%醇 0.6201 0.3918 0.046 673.98 425.89 46 31.003 19.591
1%NaCl70%醇 1.0258 0.6071 0.101 507.82 300.52 101 51.290 30.353
3%NaCl30%醇 0.7777 0.6052 0.265 146.73 114.19 265 38.883 30.260
3%NaCl50%醇 2.4618 1.4082 0.161 764.53 437.33 161 123.09 70.410
3%NaCl70%醇 0.8017 0.4556 0.08 501.06 284.75 80 40.085 22.780
5%NaCl30%醇 2.1717 1.4093 0.179 606.62 393.67 179 108.59 70.467
5%NaCl50%醇 0.4949 0.3556 0.116 213.34 153.25 116 24.747 17.777
5%NaCl70%醇 0.6038 0.3607 0.09 335.44 200.39 90 30.190 18.035
总量 449.73 282.508
3# 水 0.0142 0.0073 0.495 1.433 0.732 495 0.709 0.362
1%NaCl30%醇 0.1664 0.1863 0.054 154.07 172.53 540 8.320 9.317
1%NaCl50%醇 2.2419 1.6373 0.168 667.24 487.30 168 112.09 81.866
1%NaCl70%醇 2.5132 1.4877 0.191 657.89 389.46 191 125.66 74.387
3%NaCl30%醇 0.9040 1.0651 0.266 169.932 200.21 266 45.202 53.256
3%NaCl50%醇 3.4117 1.9213 0.227 751.48 423.19 227 170.59 96.064
3%NaCl70%醇 0.6296 0.3519 0.077 408.82 228.47 77 31.479 17.592
5%NaCl30%醇 1.13768 1.0884 0.269 211.47 202.31 269 56.885 54.421
5%NaCl50%醇 2.0341 1.0431 0.177 574.61 294.66 177 101.71 52.155
5%NaCl70%醇 0.0476 0.0529 0.044 54.068 60.057 44 2.379 2.643
总量 655.02 442.063
分析可知，3#即001×15型离子交换树脂的生物碱富集总量相对较高，但相对于20g酸水提取物中应含有的总量（马钱子碱2062.4mg，士旳宁2109.4mg）而言，马钱子碱洗脱率最高为21%，士的宁为31%。且对于不同型号的离子交换树脂柱来说，各浓度的洗脱液均不能有效富集大部分生物总碱，需配制不同浓度洗脱液，进行多次冲洗才能提高总碱的富集量。
2.2.3 大孔吸附树脂层析柱
（1）大孔吸附树脂预处理：将四种不同型号的大孔吸附树脂记为L（LSA-10），H（HPD-500），A（AB-8），D（D101），分别称取200g至1000ml烧杯内加入约500ml的乙醇溶液浸泡过夜。
（2）装柱：将预处理的树脂分别通过湿法装柱将它们装进玻璃柱。
（3）洗柱子：用蒸馏水开始冲洗，冲洗至滴出液无醇味即可。
（4）上样：将之前的酸水提取物粉碎研磨分别各称取20g，加蒸馏水搅拌溶解，倒入玻璃柱内。
（5）洗脱剂浓度的考察：分别用水，30%，40%，50%，60%，70%，80%的乙醇溶液作为洗脱液，洗脱4倍柱体积，洗脱液流速为1.0ml/min。将每次的洗脱液浓缩烘干，称量，由于浓缩之后浓缩物较少，所以直接在蒸发皿中加入甲醇超声溶解，少量多次，最终定容至50ml，烘干蒸发皿称重。将处理完的溶液对应编号，分别为A水，A30%醇，A40%醇，A50%醇，A60%醇，A70%醇，A80%醇，其余类似。
（6）色谱柱：ODS250mm×4.6mm，5μm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；流动相：采用0.05%磷酸溶液（A）：乙腈（B）为12:88。
（7）测定结果：
表10 大孔吸附树脂层析柱洗脱测量结果
士的宁mg/ml 马钱子碱mg/ml 取样量g 士旳宁mg/g 马钱子碱mg/g 洗脱膏量g 士旳宁的量mg 马钱子碱的量mg
对照品 0.262 0.342
A水 0.01029 0 0.157 3.277 0.000 1.610
A30% 1.41525 1.36328 0.74 95.625 92.114 7.895 755 727
A40% 2.90696 0.83542 0.26 559.031 160.658 1.867 1043 299
A50% 0.33625 1.66344 0.0752 19.192 94.945 0.876 195 965
A60% 0.05581 0.03418 0.399 6.994 4.283 0.399 2.8 1.7
A70% 0.01935 0.04673 0.102 9.485 22.907 0.102 0.96 2.34
A80% 0.00435 0.00565 0.035 6.214 8.071 0.035 0.217 0.28
总量 12.784 1997 1995
D水 0.00233 0 0.576 0.202 0.000 7.645 1.5
D30% 0.18581 0.14134 0.391 23.761 18.074 9.380 223 169
D40% 0.57337 0.20757 0.085 337.276 122.100 1.484 501 181
D50% 0.06148 0.05387 0.044 69.864 61.216 0.858 59.9 53
D60% 0.00786 0.00752 0.389 1.010 0.967 0.389 0.39 0.38
D70% 0.00744 0.00778 0.104 3.577 3.740 0.104 0.37 0.39
D80% 0.00484 0.00594 0.024 10.083 12.375 0.024 0.24 0.29
总量 19.884 786.4 404.06
H水 0.00517 0 0.407 0.635 0.000 11.168 7.1
H30% 0.6973 0.2355 0.509 68.497 23.134 3.172 217.272 73.381
H40% 1.2467 0.8794 0.227 274.604 193.700 1.813 497.857 351.178
H50% 0.06021 0.04481 0.041 73.427 54.646 0.902 66 49
H60% 0.18507 0.08371 0.392 23.606 10.677 0.392 9.3 4.2
H70% 0.02138 0.01812 0.099 10.798 9.152 0.099 1.07 0.9
H80% 0.00443 0.0072 0.031 7.145 11.613 0.031 0.22 0.36
总量 17.577 798.819 479.019
L水 0 0 0.192 0.000 0.000 2.618 0 0
L30% 0.3961 0.46889 0.308 64.302 76.119 9.807 630.61 746.50
L40% 0.85951 0.31633 0.116 370.478 136.349 1.912 708.35 260.70
L50% 0.70947 0.63607 0.119 298.097 267.256 1.059 315.68 283.02
L60% 0.04801 0.12126 0.407 5.898 14.897 0.407 2.40 6.06
L70% 0.00294 0.0097 0.109 1.349 4.450 0.109 0.15 0.49
L80% 0.00356 0.00918 0.029 6.138 15.828 0.029 0.18 0.46
总量 15.941 1657 1297
分析可知， 大孔吸附树脂整体对马钱子总碱的富集效果较好，相对于20g酸水提取物中应含有的总量（马钱子碱2062.4mg，士旳宁2109.4mg），D型大孔吸附树脂洗脱效果最差，马钱子碱洗脱率为19%，士的宁洗脱率为37%，这一结果与离子交换树脂的最好洗脱效果相当；AB-8对马钱子碱和士旳宁的洗脱率最高，马钱子碱洗脱率为96.7%，士的宁洗脱率为94.7%，且马钱子总碱的洗脱量多集中在30%-50%的乙醇溶液。
进一步分析AB-8型大孔吸附树脂的最佳洗脱浓度，见下表。可知，实验中30%-50%的乙醇洗脱溶液已几乎可以得到大部分的生物碱，并且通过药膏的重量可以看出杂质去除率已达到一半以上，故洗脱液的最佳浓度为30%-50%的乙醇溶液。
表11 AB-8型大孔吸附树脂层析柱洗脱处理结果
AB-8型大孔吸附树脂 马钱子碱含量mg 士的宁碱含量mg 药膏重量g
乙醇溶液洗脱前 2.062 2.109 20
30%-50%乙醇溶液洗脱后 1.991 1.993 10.638
洗脱率 96.56% 94.49% 53.19%
综上，通过对马钱子来源、提取方法和提取溶剂进行筛选，再进一步采用Box-Behnken响应面法进行优化，确立了以马钱子碱和士旳宁的含量为总生物碱指标的最佳提取工艺：pH值为1的盐酸溶液与制马钱子粗粉10：1混合加热回流提取1.5h，过滤浓缩提取液得到样品；通过实验筛选出富集纯化效果最好的层析柱：采用AB-8型大孔吸附树脂，经30%~50%的乙醇溶液洗脱后得到总生物碱的富集量达90%以上。
以上是通过具体实施方式对本发明的内容做进一步说明，但不应理解为本发明上述主题的范围仅限于此，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种马钱子总碱的提取及纯化方法，其特征在于，主要包括以下步骤：（1）通过 Box-Behnken 响应面法设计优化酸水回流提取马钱子总碱工艺，得到液料比、提取时间、pH值等参数的回归模型，并据此分析预测最佳的提取工艺条件；（2）称取马钱子制品，用粉碎机粉碎，将粗粉装入圆底烧瓶，以6-12倍量加入酸水溶液，在步骤（1）得到的最佳工艺条件下加热回流1-2h，过滤提取液，浓缩成膏；（3）将步骤（2）中所得的膏状提取物粉碎研磨，搅拌溶解于蒸馏水中，倒入装填有大孔吸附树脂的玻璃柱内，用洗脱液进行洗脱，洗脱4倍柱体积，洗脱液流速为1. 0ml/min，浓缩烘干，得到马钱子总碱的纯化物。
2.根据权利要求1中所述的马钱子总碱的提取及纯化方法，其特征在于，所述酸水pH为1-3，优选盐酸溶液。
3.根据权利要求2中所述的马钱子总碱的提取及纯化方法，其特征在于，以马钱子碱含有量的 40%、士的宁含有量的 60%为综合效应值，步骤（1）中所述液料比、提取时间、pH值等参数的回归模型为：
相关系数r=0.9257，整体模型达到显著水平 (P<0.05)。
4.根据权利要求3中所述的马钱子总碱的提取及纯化方法，其特征在于，所述最佳提取工艺条件为：酸水与制马钱子最优液料比为10：1，提取时间1.5h，pH值为1。
5.根据权利要求1中所述的马钱子总碱的提取及纯化方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂型号为LSA-10、HPD-500、AB-8、D101，优选AB-8型大孔吸附树脂。
6.根据权利要求5中所述的马钱子总碱的提取及纯化方法，其特征在于，所述洗脱液为乙醇溶液，优选乙醇浓度为30%-50%的溶液。
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