CN106879578A - 一种负载锌掺杂氧化铜多刺抗菌材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种氧化石墨烯负载锌参杂氧化铜多刺抗菌材料及其制备方法，属于生物功能材料制备领域；本发明通过超声化学过程中产生的热量促进Zn‑CuO纳米晶体在氧化石墨烯上形成、沉淀和生长形成表面多刺的锌掺杂氧化铜纳米粒子，该掺杂的纳米颗粒单分散性好且结构刚性强；氧化石墨烯复合材料可以通过多刺结构刺破细菌膜层，破坏膜层的渗透平衡并促进细胞质内脂质分子的破坏性泄漏从而造成细菌凋亡；通过多刺锌掺杂氧化铜纳米颗粒和氧化石墨烯纳米片复合抗菌能力，本材料能够加速细菌细胞溶解并在10 min内可以产生高达99%的灭菌效率。

Description

一种负载锌掺杂氧化铜多刺抗菌材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种负载锌掺杂氧化铜多刺抗菌材料及其制备方法和应用，属于生物功能材料制备领域。
背景技术
近年来，由于细菌和耐药机制的多样性，细菌感染仍然是威胁公众健康的主要问题之一。其中大肠杆菌（革兰氏阴性菌）和金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）已经表现出显著增加的抵抗现有抗生素类药物的抗药性。氧化石墨烯（GO）是一种具有强氧化性和高亲水性的片层状材料。因其具有较好的生物相容性、较大的比表面积、良好的电导率以及高化学和热稳定性而被认为是极具前景的二维材料。同时，Fan等人研究报道称基于氧化石墨烯的抑菌纸表现出对哺乳动物有最小的细胞毒性（W. Hu, C. Peng, W. Luo, D. Li and C.Fan, ACS nano, 2010, 4, 4317）。Elimelech等人提出氧化石墨烯锋利的边缘和较高的膜压力（F. Perreault, S. Nejati and M. Elimelech, ACS nano, 2015, 9, 7226），细菌与之接触时便会凋亡（V. T. Pham, V. K. Truong, M. D. Quinn, V. A. Baulin and E.P. Ivanova, ACS nano, 2015, 9, 8458）。尽管氧化石墨烯在抗菌方面表现出一定的潜力，但氧化石墨烯在应对耐多药微生物时表现不足，单纯氧化石墨烯的抑菌效果也不尽如人意。
在目前已知的诸多抗菌材料中，金属氧化物，如氧化镁、氧化钛和氧化钙等由于其价格合理和效果良好因而在临床及保健品中已有所应用。但纳米金属氧化物抗菌剂在体内的一般作用机制是未知的，其中增强的金属离子释放、诱导的氧化应激、活性氧（ROS）的释放、静电相互作用等等正在研究中。同时有研究发现，掺杂金属氧化物如锌掺杂的氧化铜（Zn-CuO）由于其增加晶体结构的缺陷促进其高效产生活性氧并成为一种较有前景的高效抗菌剂。Gedanken等人研究表明新型锌掺杂氧化铜纳米复合材料对根除多重耐药性细菌（Eradication of Multi-Drug Resistant Bacteria by a Novel Zn-doped CuONanocomposite，Small, 2013, 9, 4069-4076.）和抗生物膜、抗菌活性的抗变形链球菌有较好的效果（A Zn-Doped CuO Nanocomposite Shows Enhanced Antibiofilm andAntibacterial Activities Against Streptococcus Mutans Compared to NanosizedCuO ，Adv. Funct. Mater., 2014, 24, 1382-1390），从而证实了锌掺杂氧化铜的高效抗菌性能。
在此，本专利提出一种抗菌性能显著增强的氧化石墨烯负载的多刺锌掺杂氧化铜纳米复合材料（Zn-CuO@GO）的制备方法，通过超声化学原位生成多刺颗粒负载于氧化石墨烯上，使得氧化石墨烯从原有二维转变为三维立体结构，并保留了锌掺杂氧化铜的多刺结构。同时，掺杂后的纳米复合材料大大提升了对抗耐药的细菌菌株的能力，材料可以通过多刺结构刺破细菌膜层，破坏膜层的渗透平衡并促进细胞质内脂质分子的破坏性泄漏从而造成细菌凋亡。通过多刺锌掺杂氧化铜纳米颗粒和氧化石墨烯纳米片联合抗菌作用，本材料能够加速细菌细胞凋亡并在10 min内可以产生高达99%的灭菌效率。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种制备氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的方法。本材料表面刺状物可以刺破细菌膜层，同时氧化石墨烯的引入大大增加了材料的抗菌性能，促使细菌细胞质的泄漏，从而极大地提高抗菌效率。
本发明是通过以下技术手段实现上述技术目的的。
S1：将醋酸铜和醋酸锌充分溶解于双蒸馏水中，所述醋酸铜和醋酸锌总浓度为0.01-0.02mol/L；
S2：向步骤S1中加入乙醇，获得一定乙醇/水体积比的溶液；
S3：向步骤S2中加入一定量的氧化石墨烯，随后超声处理得到分散均匀的溶液；
S4：向步骤S3中缓慢滴入（28-30 %）氨水调节溶液的pH值至8，调节超声波功率为500-750W，超声反应40-60min，后经离心、双蒸馏水和乙醇逐次洗涤、真空干燥后即可得到所述多刺纳米复合材料。
进一步的，步骤S1所述醋酸铜和醋酸锌的摩尔比为3:1。
进一步的，步骤S2中所述乙醇与双蒸馏水的体积比为9:1。
进一步的，步骤S3中所述加入的氧化石墨烯与醋酸锌的质量比为1：11-2。
本发明的有益效果：
本发明通过超声化学在氧化石墨烯表面原位生成多刺颗粒，制备过程绿色环保，使得氧化石墨烯从原有二维转变为三维立体结构，并保留了锌掺杂氧化铜的多刺结构。相较于单一氧化石墨烯，掺杂后的纳米复合材料大大提升了对抗耐药的细菌菌株的能力，复合材料可以通过锌掺杂氧化铜多刺结构和氧化石墨烯片状边缘刺破细菌膜层，破坏膜层的渗透平衡并促进细胞质内脂质分子的破坏性泄漏从而造成细菌凋亡。通过多刺锌掺杂氧化铜纳米颗粒和氧化石墨烯纳米片复合抗菌作用，本材料能够加速细菌细胞凋亡并在10 min内可以产生高达99%的灭菌效率。
附图说明
图1为醋酸锌与氧化石墨烯质量比11：1（A、a）和5.5：1(B、b)时的透射电镜图及其局部放大图；图中A、B为透射电镜图，a、b为局部放大图。
图2为实施例1所制备的氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料（A）、氧化石墨烯（B）和锌掺杂氧化铜多刺纳米颗粒（C）的XRD图。
图3为实施例1所制备的氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的XPS图。
图4为未处理时大肠杆菌（A、a）和金黄色葡萄球菌(B、b)的扫描电镜图（A、B）及其局部放大图 (a、b)。
图5为实施例1所制备氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料对大肠杆菌（A、a）和金黄色葡萄球菌(B、b)作用后的扫描电镜图（A、B）及其局部放大图(a、b)。
图6为实施例1所制备氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作用后的透射电镜图（TEM）。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
上述技术方案中所述的氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的抗菌性能测试具体为：
实施例1：
一、氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的制备：
将0.15g醋酸铜和0.055g醋酸锌充分溶解于10毫升双蒸馏水。随后加入90毫升乙醇，获得 体积比9：1的乙醇/水的溶液。加入0.005 g氧化石墨烯，超声波（20 kHz，750W）处理5分钟后，缓慢滴入0.8毫升的氨水（28-30 %）调节反应pH至8。超声反应1小时后，将获得纳米复合材料的离心，并用双蒸馏水和乙醇逐次洗涤后真空干燥。
图1为醋酸锌与氧化石墨烯质量比11：1（A、a）和5.5：1(B、b)时的透射电镜图及其局部放大图；图中A、B为透射电镜图，B、b为局部放大图。由图A可知，制备的锌掺杂氧化铜纳米颗粒均匀生长在氧化石墨烯上且其表面分布有明显的刺状物。
图2为实施例1所制备的氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料（A）、氧化石墨烯（B）和锌掺杂氧化铜多刺纳米颗粒（C）的XRD图。从图中可以看出氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料兼有氧化铜的和氧化锌的晶格特征，表明复合成功。
图3为氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的XPS图。从图中可以看出，与XRD数据一致，该多氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料同时兼有锌元素和铜元素，进一步表明氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的成功形成及其结构的完整性。
二、氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的抗菌性能
（1）菌落计数
将大肠杆菌(购于ATCC 25922)或金黄色葡萄球菌(购于ATCC 29213)保持37 ℃置于营养液中培养，当菌落形成单位达到108时离心收集，并用pH为6的0.85%氯化钠溶液洗涤两次。向细菌悬浮液中加入纳米复合材料（1 mg/ mL）37℃ 搅拌反应至多3 h（200 转每分钟）。在不同时间段（0, 10min, 30min, 1h, 2h, and 3h）取出100 μL，用8倍生理盐水稀释后均匀涂布在预先制备好的LB-琼脂平板上并且在37 ℃生长24 h，接着计算存活细菌的数量。其中初始细菌数量用N0表示，存活细菌数量用N表示。
结果表明：氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料能够加速细菌细胞溶解并在10 min内可以产生高达99%的灭菌效率。
表1中为本实施例1所述氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作用后的菌落计数结果。
表1. 本实施例所制备材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作用后的菌落计数结果
（2）氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的相互作用：
将多刺锌掺杂氧化铜纳米颗粒与大肠杆菌或金黄色葡萄球菌一起培养30min后，通过4%多聚甲醛溶液将细菌固定（30 min，37 ℃）。随后通过梯度脱水（30%，50%，60%，70%， 80%，90%，100%乙醇各10min），将细菌样本滴在铜箔上用扫描电镜观察形态。
结果表明：细菌与氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料接触后细菌膜完整性被破坏，且多刺锌掺杂氧化铜纳米颗粒可以有效陷入细菌膜层中造成细胞质的泄漏和随后细菌的凋亡。
图4为未处理时大肠杆菌（A、a）和金黄色葡萄球菌(B、b)的扫描电镜图（A、B）及其局部放大图 (a、b)。
图5为实施例1所制备氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料对大肠杆菌（A、a）和金黄色葡萄球菌(B、b)作用后的扫描电镜图（A、B）及其局部放大图(a、b)。由图A可知，纳米复合材料可以有效刺入并陷入大肠杆菌膜层中，从而达到迅速灭菌的效果。由图B可知，即使金黄色葡萄球菌有两层膜层，该纳米复合材料依然可以刺入细胞膜并造成细菌的凋亡。
图6为氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作用后的透射电镜图（TEM）。与扫描电镜结果一致，该纳米复合材料可以有效地将其表面的刺状物刺入细菌膜层，破坏细菌膜，造成细胞质的泄漏和细菌的凋亡。
实施例2：
一、氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的制备：
将0.15g醋酸铜和0.055g醋酸锌充分溶解于10毫升双蒸馏水。随后加入90毫升乙醇，获得 体积比9 ：1的乙醇/水的溶液。加入0.01 g氧化石墨烯，超声波（20 kHz，600W）处理5分钟后，缓慢滴入0.8毫升的氨水（28-30 %）调节反应pH至8。超声反应50分钟后，将获得纳米复合材料的离心，并用双蒸馏水和乙醇逐次洗涤后真空干燥。
二、氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的抗菌性能
（1）菌落计数
将大肠杆菌或金黄色葡萄球菌保持37 ℃置于营养液中培养，当菌落形成单位达到108时离心收集，并用pH为6的0.85%氯化钠溶液洗涤两次。向细菌悬浮液中加入纳米复合材料（1 mg/ mL）37℃ 搅拌反应至多3 h（200 转每分钟）。在不同时间段（0, 10min, 30min,1h, 2h, and 3h）取出100 μL，用8倍生理盐水稀释后均匀涂布在预先制备好的LB-琼脂平板上并且在37 ℃生长24 h，接着计算存活细菌的数量。其中初始细菌数量用N0表示，存活细菌数量用N表示。
结果表明：氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料能够加速细菌细胞溶解并在30 min内可以产生高达99%的灭菌效率。
表2中为本实施例2所述氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作用后的菌落计数结果。
表2. 本实施例所制备材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作用后的菌落计数结果
（2）氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的相互作用：
将多刺锌掺杂氧化铜纳米颗粒与大肠杆菌或金黄色葡萄球菌一起培养30min后，通过4%多聚甲醛溶液将细菌固定（30 min，37 ℃）。随后通过梯度脱水（30%，50%，60%，70%， 80%，90%，100%乙醇各10min），将细菌样本滴在铜箔上用扫描电镜观察形态。
结果表明：细菌与氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料接触后细菌膜完整性被破坏，且多刺锌掺杂氧化铜纳米颗粒可以有效陷入细菌膜层中造成细胞质的泄漏和随后细菌的凋亡。
实施例3：
一、氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的制备：
将0.15g醋酸铜和0.055g醋酸锌充分溶解于10毫升双蒸馏水。随后加入90毫升乙醇，获得 体积比9:1的乙醇/水的溶液。加入0.02 g氧化石墨烯，超声波（20 kHz，500W）处理5分钟后，缓慢滴入0.8毫升的氨水（28-30 %）调节反应pH至8。超声反应40分钟后，将获得纳米复合材料的离心，并用双蒸馏水和乙醇逐次洗涤后真空干燥。
二、氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的抗菌性能
（1）菌落计数
将大肠杆菌或金黄色葡萄球菌保持37 ℃置于营养液中培养，当菌落形成单位达到108时离心收集，并用pH为6的0.85%氯化钠溶液洗涤两次。向细菌悬浮液中加入纳米复合材料（1 mg/ mL）37℃ 搅拌反应至多3 h（200 转每分钟）。在不同时间段（0, 10min, 30min,1h, 2h, and 3h）取出100 μL，用8倍生理盐水稀释后均匀涂布在预先制备好的LB-琼脂平板上并且在37 ℃生长24 h，接着计算存活细菌的数量。其中初始细菌数量用N0表示，存活细菌数量用N表示。
结果表明：氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料能够加速细菌细胞溶解并在60 min内可以产生高达99%的灭菌效率。
表3中为本实施例3所述氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作用后的菌落计数结果。
表3. 本实施例所制备材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作用后的菌落计数结果
（2）氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的相互作用：
将多刺锌掺杂氧化铜纳米颗粒与大肠杆菌或金黄色葡萄球菌一起培养30min后，通过4%多聚甲醛溶液将细菌固定（30 min，37 ℃）。随后通过梯度脱水（30%，50%，60%，70%， 80%，90%，100%乙醇各10min），将细菌样本滴在铜箔上用扫描电镜观察形态。
结果表明：细菌与氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料接触后细菌膜完整性被破坏，且多刺锌掺杂氧化铜纳米颗粒可以有效陷入细菌膜层中造成细胞质的泄漏和随后细菌的凋亡。

Claims (10)

1.一种氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料，其特征在于，所述纳米颗粒表面为刺状结构。
2.一种氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将醋酸铜和醋酸锌充分溶解于双蒸馏水中；
S2：向步骤S1中加入乙醇，获得一定乙醇/水体积比的溶液；
S3：向步骤S2中加入一定量的氧化石墨烯，随后超声处理得到分散均匀的溶液；
S4：向步骤S3中缓慢滴入氨水调节溶液的pH值，调节超声波功率，超声反应一段时间，后经离心、双蒸馏水和乙醇逐次洗涤、真空干燥后即可得到所述多刺纳米复合材料。
3.根据权利要求2所述的一种氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述醋酸铜和醋酸锌总浓度为0.01-0.02mol/L。
4.根据权利要求3所述的一种氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的制备方法，其特征在于，所述醋酸铜和醋酸锌的摩尔比为3:1。
5.根据权利要求2所述的一种氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述乙醇与双蒸馏水的体积比为9:1。
6.根据权利要求2所述的一种氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述加入的氧化石墨烯与醋酸锌的质量比为1：11-2。
7.根据权利要求2所述的一种氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述超声波功率为500-750W，所述超声反应的时间为40-60min。
8. 根据权利要求2所述的一种氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述氨水的质量浓度为28-30 %，所述调节pH为8 。
9.权利要求1所述的一种氧化石墨烯负载锌掺杂氧化铜多刺纳米复合材料在抗菌杀菌中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的菌为大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。
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