CN106840823A - 用于血小板膜表面活化分子检测的水性胶快速分离方法 - Google Patents

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李勇
王红梅
段生宝
丁少华
蒙青林
魏双施
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Abstract

本发明公开了一种用于血小板膜表面活化分子检测的水性胶快速分离方法，包括步骤为：将待检血小板与荧光标记的抗体混合，加入到水性胶层析介质上得到混合液，再对所述混合液离心分层，弃去上层，加入缓冲液重悬后检测得到结果。通过上述水性胶层析与低速离心相结合的方式，本发明可将反应液中未结合血小板的抗体以及其他可溶性蛋白分子与血小板‑抗体复合物分离开来，避免了传统方法操作过程中需要多次洗涤的繁琐实验程序，极大地简化了操作步骤，节约了操作时间，提高了检测效率。

Description

用于血小板膜表面活化分子检测的水性胶快速分离方法
技术领域
本发明属于医学检测领域，特别是涉及一种用于血小板膜表面活化分子检测的水性胶快速分离方法。
背景技术
随着社会经济的发展，心血管疾病的发病人数持续增加，死亡率居各种疾病之首。因此，研究心血管疾病的早期预警和预防技术成为目前临床医学研究中的重要问题。
血小板活化在心血管疾病的发生发展中起着非常重要的作用。血小板在正常血液循环中处于静息状态。当血管内皮损伤或在某些生理病理刺激因子作用下, 血小板发生粘附、变形、聚集和释放等活化反应。心脑血管疾病的主要病理基础是动脉粥样硬化，由于动脉粥样硬化的发生，血管内皮细胞损伤胶原暴露，促使血小板黏附，同时血管内的脂质斑块造成局部血流动力学改变，产生高切变可激活血小板，而且脂质斑块易发生溃破，脂质暴露于血液也可引起血小板活化。
静息血小板膜表面有多种糖蛋白（GP）。主要有GPⅡb/Ⅲa复合物、GPⅠb/Ⅸ复合物、GPⅣ等，它们在维持血小板的完整及功能方面起着非常重要的作用。血小板有多种细胞器，最重要的是各种颗粒成分如α颗粒，致密颗粒与溶酶体等。α颗粒是血小板中可分泌蛋白质的主要贮存部位，含有血小板第4因子（PF4）、β-血小板球蛋白（β-TG）、血小板促生长因子（PDGF）、凝血酶敏感蛋白（TSP）、纤维连接蛋白（FN）、纤维蛋白原（Fg）等。α颗粒膜表面存在P-选择素和GPⅡb /Ⅲa复合物。溶酶体膜表面存在糖蛋白CD63。血小板活化时颗粒内容物和特异膜蛋白释放入血浆中或出现在血小板膜表面，成为识别活化血小板的特异分子标志物。临床上常用的血小板活化分子标志物包括血栓素A2 （TXA 2）、血小板膜糖蛋白（GPⅡb/Ⅲa）、β-TG、PF4以及P-选择素等。其中P-选择素，GPⅡb/Ⅲa 应用广泛，常作为测定血小板活化程度的敏感与特异性高的指标。
现有的检测血小板膜表面活化分子的方法多使用流式细胞术，用荧光标记的抗体与待检样本中的血小板膜表面分子结合，通过多次洗涤除去未结合的抗体，然后用流式细胞仪检测荧光强度，从而判断血小板的活化程度。其中的洗涤过程操作繁琐费时，在临床应用时受到一定限制。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种用于血小板膜表面活化分子检测的水性胶快速分离方法，简化操作步骤，得到可靠的检测结果。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种用于血小板膜表面活化分子检测的水性胶快速分离方法，其特征在于，包括步骤为：将待检血小板与荧光标记的抗体混合，加入到水性胶层析介质上得到混合液，再对所述混合液离心分层，弃去上层，加入缓冲液重悬后检测得到结果。
在本发明一个较佳实施例中，所述荧光标记的抗体为荧光标记抗-CD63、荧光标记抗-GPⅡb/Ⅲa、荧光标记抗-P-选择素的混合物。
在本发明一个较佳实施例中，所述水性胶层析介质的组成为聚蔗糖、明胶和水，其中所述聚蔗糖的浓度为5-100g/L，所述明胶的浓度为1-10g/L。
在本发明一个较佳实施例中，所述离心时的转速为1500-2000g。
在本发明一个较佳实施例中，所述离心时间为5分钟。
在本发明一个较佳实施例中，所述离心次数为一次。
在本发明一个较佳实施例中，所述弃去上层后残余液体不超过5μL。
在本发明一个较佳实施例中，所述缓冲液为生理盐水或磷酸盐缓冲液。
在本发明一个较佳实施例中，所述结果的检测是采用流式细胞仪进行检测。
本发明的有益效果是：本发明的用于血小板膜表面活化分子检测的水性胶快速分离方法，可以通过一次离心将反应液中未结合血小板的抗体以及其他可溶性蛋白分子与血小板-抗体复合物分离开来，避免了传统方法操作过程中需要多次洗涤的繁琐实验程序，极大地简化了操作步骤，节约了操作时间，提高了检测效率，结果可靠。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1是本发明用于血小板膜表面活化分子检测的水性胶快速分离方法一较佳实施例的流程示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
请参阅图1，提供一种用于血小板膜表面活化分子检测的水性胶快速分离方法，具体见下。
所述水性胶快速分离方法采用的试剂与仪器有：荧光标记抗-CD63、荧光标记抗-GPⅡb/Ⅲa、荧光标记抗-P-选择素、生理盐水、水性胶层析介质，水浴锅，离心机，流式细胞仪。
其中所述水性胶层析介质的组成及其制备方法在专利号为ZL201310710675.0的发明专利中已经公开，该专利已获得专利权。在本实施例中所述水性胶层析介质是将5g聚蔗糖和0.1g明胶溶于100mL的水中得到。
所述用于血小板膜表面活化分子检测的水性胶快速分离方法的步骤为：
（1）血小板结合荧光标记单抗：取全血或富血小板血浆，加适量PE标记抗-CD63、FITC标记抗-GPⅡb/Ⅲa、APC标记抗-P-选择素，37℃避光孵育20min得到混合液；
（2）将孵育后的混合液转移至水性胶层析介质上层，进行离心分层，其中离心时的转速为1500g，离心时间为5分钟；
（3）弃去包括水性胶层析介质的上层，再加2mL生理盐水重悬，用流式细胞仪检测。
同时用传统洗涤方法做平行对照试验，并比较两种方法检测结果的一致性。
水性胶快速分离方法和传统洗涤方法的检测结果一致，测得的血小板膜表面活化分子相当，说明本分离方法是成立的，通过水性胶层析介质的分离，绝大部分未结合的荧光标记单抗被去除。
本发明建立了一种新的水性胶快速分离方法用于血小板膜表面活化分子检测，本试验过程中血小板与抗血小板膜表面活化分子抗体混合液孵育后加到水性胶体上，由于使血小板沉降需要的离心力一般小于1500g，而抗体等蛋白质复合物沉降分离需要至少3000g的离心力，所以通过低速离心后，血小板-抗体复合物沉降到试管底部，而游离抗体仍留在水性胶上层，弃去水性胶后即可达到将两者分离的目的，从而代替传统方法中繁琐的洗涤过程，极大地简化了操作步骤，节约了时间，提高了检测效率，保证了结果的可靠性。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种用于血小板膜表面活化分子检测的水性胶快速分离方法，其特征在于，包括步骤为：将待检血小板与荧光标记的抗体混合，加入到水性胶层析介质上得到混合液，再对所述混合液离心分层，弃去上层，加入缓冲液重悬后检测得到结果。
2.根据权利要求1所述的水性胶快速分离方法，其特征在于，所述荧光标记的抗体为荧光标记抗-CD63、荧光标记抗-GPⅡb/Ⅲa、荧光标记抗-P-选择素的混合物。
3.根据权利要求1所述的水性胶快速分离方法，其特征在于，所述水性胶层析介质的组成为聚蔗糖、明胶和水，其中所述聚蔗糖的浓度为5-100g/L，所述明胶的浓度为1-10g/L。
4.根据权利要求1所述的水性胶快速分离方法，其特征在于，所述离心时的转速为1500-2000g。
5.根据权利要求1所述的水性胶快速分离方法，其特征在于，所述离心时间为5分钟。
6.根据权利要求1所述的水性胶快速分离方法，其特征在于，所述离心次数为一次。
7.根据权利要求1所述的水性胶快速分离方法，其特征在于，所述弃去上层后残余液体不超过5μL。
8.根据权利要求1所述的水性胶快速分离方法，其特征在于，所述缓冲液为生理盐水或磷酸盐缓冲液。
9.根据权利要求1所述的水性胶快速分离方法，其特征在于，所述结果的检测是采用流式细胞仪进行检测。
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