CN106834507A - Dmd基因捕获探针及其在dmd基因突变检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了DMD基因捕获探针及其在DMD基因突变检测中的应用。本发明公开的DMD基因捕获探针的制备方法包括：制备N个亚探针，连接N个亚探针，得到DMD基因捕获探针；N为大于等于2的一个自然数；N个亚探针满足N个亚探针能覆盖DMD基因的全部序列；在DMD基因上任何两个相邻的亚探针均满足上游亚探针的下游有一个或多个核苷酸与下游亚探针的上游重叠；N个亚探针的长度均为50‑150bp。利用本发明的DMD基因捕获探针对DMD基因进行检测不仅可以检测DMD基因是否存在缺失/重复扩增突变，还可以精确定位断裂点区域以及片段大小，还可以检测待测样本的DMD基因点突变。

Description

DMD基因捕获探针及其在DMD基因突变检测中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，DMD基因捕获探针及其在DMD基因突变检测中的应用。
背景技术
DMD基因是假肥大型肌营养不良综合征致病基因(DMD/BMD)，位于X染色体Xp21.2区域，是目前已知的最大的人类基因，含有79个外显子，基因突变概率较高，在新生儿男婴中达到约1:3500。DMD基因含有多种突变类型，单个或多个外显子缺失突变最为常见，约占60～70％，单个或多个外显子重复扩增突变，约占5～10％，点突变包括单个或数个核苷酸置换、缺失或插入等，约占DMD所有突变的25％～35％。DMD基因庞大，突变发生率高，突变类型多样，各种各样的突变加在一起据统计达到四、五千种之多，这就给临床上DMD基因检测带来了很大的困难。
传统的DMD基因突变检测方法，对于不同的突变类型需要选择不同的检测技术，对于点突变，需要应用Sanger测序进行检测，对于外显子重复或缺失突变，需要应用微阵列比较基因组杂交技术(a-CGH)、MLPA或多重PCR等技术进行检测，上述检测策略和方法检测效率低，而且不能确定外显子缺失的精确位点与片段大小，因此，本领域需要能同时检测DMD多种突变类型的更准确和效率更高的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测DMD基因全基因的突变。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了DMD基因捕获探针。所用DMD基因的序列为人类参考基因组版本Hg19(更新日期为2015年8月6日)的chrX:31137345-33357726。
本发明所提供的DMD基因捕获探针，按照捕获探针的制备方法制备，所述捕获探针的制备方法包括：制备N个亚探针，连接所述N个亚探针，得到DMD基因捕获探针；N为大于等于2的一个自然数；
所述N个亚探针满足所述N个亚探针能覆盖所述DMD基因的全部序列。
上述DMD基因捕获探针中，所述亚探针均可为单链DNA。
上述DMD基因捕获探针中，在所述DMD基因上任何两个相邻的亚探针均可满足上游亚探针的下游有一个或多个核苷酸与下游亚探针的上游重叠。在所述DMD基因上任何两个相邻的亚探针具体均可满足上游亚探针的下游有3个核苷酸与下游亚探针的上游重叠。
上述DMD基因捕获探针中，所述N个亚探针的长度均可为50-150bp。所述N个亚探针的长度具体均可为60bp。所述N个亚探针可为38954个亚探针。
上述DMD基因捕获探针中，所述N个亚探针的序列均可满足：
第1条亚探针的序列为DMD基因的第1-60位；
第2条亚探针的序列为DMD基因的第58-117位；
第3条亚探针的序列为DMD基因的第115-174位；
……
第n条亚探针的序列为DMD基因的第【57(n-1)+1】-【57(n-1)+60】位；
……
第38953条亚探针的序列为DMD基因的第2220265-2220324位；
第38954条亚探针的序列为DMD基因的第2220322-2220381位；
其中，n为1-38954中的任一个自然数。
上述DMD基因捕获探针中，所述连接所述N个亚探针可包括下述A1)和A2)：
A1)连接所述N个亚探针，得到长链DNA和/或环状DNA；
A2)将所述长链DNA和/或所述环状DNA进行扩增，得到所述DMD基因捕获探针。
所述制备方法在连接所述N个亚探针前还可包括对所述N个亚探针进行磷酸化修饰。
对所述N个亚探针进行磷酸化修饰具体可为在所述N个亚探针的5′端进行磷酸化修饰。所述磷酸化修饰可利用T4多聚核苷酸激酶或NEB的T4多聚核苷酸激酶试剂盒进行。利用NEB的T4多聚核苷酸激酶试剂盒进行所述磷酸化修饰的反应体系可为：所述N个亚探针10μl、10×反应缓冲液5μl、10mM ATP 5μl、T4多聚核苷酸激酶2.5μl和H20 27.5μl。所述反应体系中所述N个亚探针的浓度可为5ng/μl。所述反应体系中10×反应缓冲液、ATP和T4多聚核苷酸激酶均为NEB的T4多聚核苷酸激酶试剂盒中试剂。所述磷酸化修饰的反应条件可为37℃30min。
所述连接所述N个亚探针可利用ssDNA连接酶或epicentre的ssDNA连接试剂盒(CircLigaseTM II ssDNA Ligase，epicentre)进行。所述连接的反应体系可为：所述N个亚探针的磷酸化产物或所述N个亚探针20μl、CircLigase II 10×ReactionBuffer 5μl、50mMMnCl2 2.5μl、5M Betaine 10μl、CircLigase II ssDNA Ligase(100U)2.5μl和H2O 10μl。所述连接的反应条件可为60℃60min。
步骤A2)中，在进行将所述长链DNA或所述环状DNA进行扩增时还可包括利用生物素对扩增产物进行标记。
进行所述扩增可采用随机引物进行。所述随机引物可为由A、C、G和T这四个核苷酸随机组成的长度均为6bp的46条单链DNA所形成的混合物。所述随机引物中所有单链DNA的摩尔数均可相同。
将所述长链DNA和/或所述环状DNA进行扩增以及利用生物素对扩增产物进行标记可利用Qiagen公司的全基因组扩增试剂盒进行。利用Qiagen公司的全基因组扩增试剂盒进行反应的反应体系可为：所述长链DNA和/或所述环状DNA 10μl、2×反应缓冲液25μl、Bio-16-dUTP 5μl、Replig_Enzyme 1μl和H2O 9μl。其中，2×反应缓冲液中含有所述随机引物。利用Qiagen公司的全基因组扩增试剂盒进行反应的反应温度可为37℃。利用Qiagen公司的全基因组扩增试剂盒进行反应的时间可不小于16小时。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述N个亚探针。
为解决上述技术问题，本发明还提供了DMD基因突变检测系统。
本发明所提供的DMD基因突变检测系统，包括所述DMD基因捕获探针或所述N个亚探针。
上述系统可由所述DMD基因捕获探针或所述N个亚探针与检测基因突变所需的仪器和/或试剂组成。所述检测基因突变所需的试剂不包括所述DMD基因捕获探针或所述N个亚探针。所述检测基因突变所需的仪器和/或试剂可为构建全基因组文库所需的仪器和/或试剂，和/或，捕获DMD基因所需的仪器和/或试剂，和/或，进行测序所需的仪器和/或试剂。
所述捕获DMD基因所需的仪器和/或仪器可为MyOne磁珠和/或迈基诺基因科技股份有限公司的缓冲液HY、2X结合缓冲溶液、WB1缓冲液、WB3缓冲液和/或稀释缓冲溶液。
所述进行测序所需的仪器和/或试剂可为利用二代测序所需的仪器和/或试剂。所述二代测序可为利用Illumina测序平台或其他测序平台进行的测序，如IlluminaHiSeq2000、Illumina HiSeq2500、Hiseq4000、Nextseq500或X Ten。
所述系统可为仅包括相关试剂的试剂或试剂盒。所述系统也可为含有所述DMD基因捕获探针或所述N个亚探针的生物芯片。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述捕获探针的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明还提供了DMD基因突变检测方法。
本发明所提供的DMD基因突变检测方法，包括利用所述DMD基因捕获探针捕获待测样本的DMD基因，然后对捕获的DMD基因进行测序，根据所述待测样本的测序结果确定所述待测样本的DMD基因的突变。
上述DMD基因突变检测方法中，所述确定所述待测样本的DMD基因的突变可将所述待测样本的测序结果与对照样本的DMD基因的检测结果进行比较确定；所述对照样本的DMD基因未发生突变。
所述对照样本的DMD基因的检测结果的检测方法可包括：利用所述DMD基因捕获探针捕获对照样本的DMD基因，然后对捕获的DMD基因进行测序，得到所述对照样本的测序结果。
上述DMD基因突变检测方法中，所述对捕获的DMD基因进行测序可利用现有技术中的测序方法(如二代测序的方法，但不仅限于二代测序的方法)进行，只要能达到对捕获的DMD基因测序的目的即可。所述二代测序可为利用Illumina测序平台或其他测序平台进行的测序，如Illumina HiSeq2000、Illumina HiSeq2500、Hiseq4000、Nextseq500或X Ten。
所述DMD基因突变检测方法可为非诊断目的的DMD基因突变检测方法。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
X1、所述DMD基因捕获探针或所述N个探针在检测DMD基因突变中的应用；
X2、所述DMD基因捕获探针或所述N个探针在制备检测DMD基因突变产品中的应用；
X3、所述DMD基因捕获探针或所述N个探针在诊断或辅助诊断假肥大型肌营养不良综合征中的应用；
X4、所述DMD基因捕获探针或所述N个探针在制备诊断或辅助诊断假肥大型肌营养不良综合征产品中的应用；
X5、所述系统在检测DMD基因突变中的应用；
X6、所述系统在制备检测DMD基因突变产品中的应用；
X7、所述系统在诊断或辅助诊断假肥大型肌营养不良综合征中的应用；
X8、所述系统在制备诊断或辅助诊断假肥大型肌营养不良综合征产品中的应用；
X9、所述DMD基因突变检测方法在诊断或辅助诊断假肥大型肌营养不良综合征中的应用。
实验证明，利用本发明的DMD基因捕获探针及DMD基因突变检测方法可以实现对检测待测样本DMD基因的突变进行检测：利用本发明的DMD基因捕获探针检测待测样本的DMD基因缺失/重复扩增突变的结果与利用MLPA的检测结果完全一致，利用本发明的DMD基因捕获探针检测待测样本的DMD基因点突变，其结果与利用Sanger测序对突变位点上下游引物对待测样本进行PCR扩增的PCR产物进行测序的结果完全一致。与现有的MLPA技术只能检测DMD基因外显子是否存在缺失/重复扩增突变相比，利用本发明的DMD基因捕获探针及DMD基因突变检测方法对DMD基因进行检测不仅可以检测DMD基因是否存在缺失/重复扩增突变，还可以精确定位断裂点区域以及片段大小，还可以检测待测样本的DMD基因的点突变。因此，与现有技术中的方法(MLPA、Sanger等)相比，本发明的DMD基因捕获探针与DMD基因突变检测方法具有一次检测多种突变类型以及检测DMD基因全基因所有突变的优势，且准确性高，避免假阴性、假阳性出现，能提高临床DMD基因突变检测的效率与准确性。另外，本发明的DMD基因捕获探针对DMD基因的捕获均达到了92％以上覆盖，在没有缺失的情况下最高达到了99.92％；其捕获效率均在40％以上，从至少覆盖到4X、10X和20X的参数来看，平均覆盖比例分别达到92％、90％和84％以上,覆盖率根据缺失情况表现不同，探针的整体均一性非常好，具有很好的稳定性。表明，本发明的DMD基因捕获探针可以用于捕获DMD基因及DMD基因突变位点的检测。
附图说明
图1为临床样本DMD基因突变检测高通量测序图谱。
图2与图3为样本C161206C01401的MLPA检测结果图。
图4与图5为样本C161201C02901的MLPA检测结果图。
图6与图7为样本C161001C04601的MLPA检测结果图。
图8与图9为样本C161027C03701的MLPA检测结果图。
图10与图11为样本C161105C03201的MLPA检测结果图。
图12为Sanger测序验证待测样本DMD基因点突变。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、DMD基因捕获探针的制备
1、单链亚探针的序列设计及制备
所用DMD基因的序列为人类参考基因组版本Hg19(更新日期为2015年8月6日)的chrX:31137345-33357726。根据DMD基因序列设计DMD基因捕获单链亚探针的序列，每条单链亚探针的长度为60bp，各单链亚探针的序列如下：
第1条单链亚探针的序列为DMD基因的第1-60位(即chrX:31137345-31137404)；
第2条单链亚探针的序列为DMD基因的第58-117位；
第3条单链亚探针的序列为DMD基因的第115-174位；
……
第n条单链亚探针的序列为DMD基因的第【57(n-1)+1】-【57(n-1)+60】位；
……
第38953条单链亚探针的序列为DMD基因的第2220265-2220324位；
第38954条单链亚探针的序列为DMD基因的第2220322-2220381位(即chrX:33357667-33357726)。
其中，n为1-38954中的任一个自然数。
利用原位合成的方法，根据序列分别为上述各探针序列在芯片合成寡核苷酸探针，得到捕获DMD基因的38954条单链亚探针。
利用35％的氨水，将固定在芯片上的38954条单链亚探针洗脱下来，收集到离心管中，利用真空浓缩仪浓缩后，加入超纯水溶解，成为一个DMD基因的38954条单链亚探针的混池；调整探针浓度到50ng/μl。
2、可以捕获DMD基因全基因的DMD基因捕获探针的制备
1)单链亚探针的5′磷酸化修饰：利用NEB的T4多聚核苷酸激酶试剂盒进行。5′磷酸化修饰的反应体系如下：
组分 体积(μl)
38954条单链亚探针的混池(50ng/μl) 10
10×反应缓冲液(Reaction Buffer) 5
10mM ATP 5
T4Polynucleotide Kinase(T4多聚核苷酸激酶) 2.5
27.5
总反应体积50μl，该反应体系中，除38954条单链亚探针的混池和H2O外的试剂均为T4多聚核苷酸激酶试剂盒中试剂。混合均匀后，恒温加热器或PCR仪器上37℃恒温孵育30min。反应结束后，利用微量PCR产物回收试剂盒按照其操作流程进行产物纯化回收，洗脱体积20μl，得到磷酸化产物；
2)连接反应：将步骤1)得到的磷酸化产物，利用商业的ssDNA连接试剂盒(CircLigaseTM II ssDNA Ligase，epicentre)连接，连接反应体系如下：
组分 体积(μl)
步骤1)得到的磷酸化产物 20
CircLigase II 10×Reaction Buffer 5
2.5
5M Betaine 10
CircLigase II ssDNA Ligase(100U) 2.5
10
总反应体积为50μl，该反应体系中，除步骤1)得到的磷酸化产物和H2O外的试剂均为ssDNA连接试剂盒中试剂。混合均匀后，60℃反应1小时。反应产物利用微量DNA回收试剂盒按照其操作流程进行产物纯化回收，回收产物，得到连接产物(长链DNA和环状DNA)。通过凝胶电泳，鉴别连接产物片段，结果显示得到了成功连接的连接产物。
3)标记生物素与扩增：利用Qiagen公司的全基因组扩增试剂盒，反应体系如下：
组分 体积(μl)
步骤2)得到的连接产物 10
2×反应缓冲液(2×Reaction Buffer) 25
Bio-16-dUTP 5
Replig_Enzyme 1
9
总体积50μl，该反应体系中，除步骤2)得到的连接产物和H2O外的试剂均为全基因组扩增试剂盒中试剂，其中，2×反应缓冲液中含有随机引物，随机引物为由A、C、G和T这四个核苷酸随机组成的长度均为6bp的46条单链DNA所形成的混合物，该混合物中所有单链DNA的摩尔数均相同。混合均匀后，37度恒温孵育16小时以上。反应产物采用DNA回收试剂盒，按照试剂盒的标准操作流程，进行DNA纯化，得到DMD基因捕获探针。采用Nanodrop2000进行定量，并将DMD基因捕获探针稀释到150ng/μl，形成最终的DMD基因捕获探针溶液。
实施例2、DMD基因突变检测方法的建立
1.待测样本全基因组文库构建
1.1超声片段化：将起始量为0.5-3μg的待测样本全基因组DNA，用1×low TEBuffer(Thermo)稀释到30ng/μL。采用Covaris S2超声仪进行超声片段化，按标准设定Covaris系统的值,6次循环×60s，水浴温度:5℃,占空比:20％，强度:5,模式:Frequencysweeping，得到片段化的DNA。
1.2末端补平：分别取100μL步骤1.1的片段化的DNA、8μL dNTPs、2μL EndPolishing酶I(10U/μL，Agilent)和16μL End Polishing酶II(5U/μL，Agilent),加水到总体积为200μL，25℃孵育30min后，用PureLink PCR纯化试剂盒(Invitrogen)进行纯化，得到末端补平的DNA。
1.3连接P1和P2接头：分别取SOLiD接头1(PleA)50μmol/L和接头2(P2eA)50μmol/L各26μL(Applied Biosystems)、步骤1.2的末端补平的DNA 48μL、T4DNA连接酶10μL(50U)，加水到总体积为200μL，室温孵育15min。然后利用PureLink PCR纯化试剂盒(Thermo)进行纯化，得到连接接头的DNA。
1.4DNA片段回收：采用预制的2％SizeSelect Gel(Applied Biosystems),放到E-Gel iBase上。将连接接头的DNA分3份各20μL加入上样孔，分子量对照用0.2μg的50bpladder，无样品孔及回收孔分别用20μL、25μL水填满,电泳约12min,吸出进入样品回收孔的150～200bp之间的DNA片段，得到回收的纯化DNA片段。
1.5缺口平移：步骤1.4的回收的纯化DNA片段需要采用切口平移法进行文库模板量的平衡的线性扩增。每100μL步骤1.4的回收的纯化DNA片段加400μL的master mix(Agilent),按程序进行反应:72℃20min,95℃5min；然后95℃15s，54℃15s，70℃1min进行10到12个循环；70℃再延伸5min；4℃保存。然后利用PureLink PCR纯化试剂盒(Thermo)进行纯化并定量至35ng/μL，得到待测样本全基因组文库，取1μL待测样本全基因组文库进行Flash Gel(2.2％,Lonza公司)电泳,约10min。
2.DMD基因全基因捕获
将步骤1中得到的1μg(50ng/ul，20ul)待测样本全基因组文库与5μL实施例1的DMD基因捕获探针溶液混合，在PCR仪上95℃孵育7分钟，65℃孵育2分钟，加入65℃预热的缓冲液HY 23μL，65℃杂交22小时，然后加入64μL 2X结合缓冲溶液混合后，得到混合液，将混合液转移至含有50μL MyOne磁珠(Thermo)的管中，旋转1h，然后将MyOne磁珠用WB1缓冲液常温清洗15min，然后用WB3缓冲液65℃洗3次，每次15分钟，得到捕获DMD基因的MyOne磁珠。
将上述捕获DMD基因的MyOne磁珠用稀释缓冲溶液重悬，得到得到磁珠悬液，然后以磁珠悬液中磁珠上捕获的DMD基因为模板、用扩增引物(Illumina测序通用引物)进行PCR扩增，扩增程序为：98℃30s，1个循环；98℃25s,65℃30s,72℃30s，15个循环；72℃5min，1个循环。将PCR产物用SPRI珠子(Beckman Coulter,USA)进行纯化，得到捕获的DMD基因全基因。
其中，缓冲液HY、2X结合缓冲溶液、WB1缓冲液、WB3缓冲液和稀释缓冲溶液分别为迈基诺基因科技股份有限公司产品。
3.测序与分析
将步骤2中得到的捕获的DMD基因全基因通过Illumina HiSeq2000进行高通量测序,得到测序的数据，然后对测序数据进行分析。测序数据分析的过程包括单核苷酸位点变异(SNV)分析过程、插入缺失标记分析(InDel分析)流程和外显子大片段缺失/重复分析流程。
单核苷酸位点变异(SNV)分析过程包括如下步骤：
(1)测序仪(IlluminaHiSeq2000)获取原始短序列；
(2)去除测序数据中的接头和低质量数据；
(3)把短序列(用SOAPaligner软件)定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数：soap2.20-a-b-t-v3-142-s63-m100-x400,其中序列错配数为3)；
(4)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等；
(5)过滤低质量值(质量值>＝20)和低覆盖度(深度>＝10)的单核苷酸；
(6)利用CCDS、人类基因组数据库(NCBI36.3)、dbSNP(v130)信息对单核苷酸变异进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核苷酸功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测单核苷酸影响蛋白功能预测；
(7)根据疾病样品和正常样品信息,选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的单核苷酸变异作为候选的单核苷酸变异，在候选的单核苷酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的单核苷酸变异。同时过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的单核苷酸变异作为最后疾病相关的候选单核苷酸变异位点；
插入缺失标记分析(InDel分析)流程包括如下步骤：
(1)把去除接头序列和低质量的测序数据用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)比对到人类基因组上(所以到参数：bwaaln-L-l 31 –I10-k 2-t 7 -e 40)；
(2)用GATK软件找出序列中所含有的插入/缺失(InDel)的信息；
(3)利用CCDS、人类基因组数据库(NCBI36.3)、dbSNP(v130)信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸插入/氨基酸缺失/移码突变)；
(4)根据疾病样品和正常样品信息，选出检测样品所共有的而在正常组中不存在的InDel作为候选的InDels，在候选的InDels中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的InDel,最后筛选出疾病相关的候选InDels；
外显子大片段重复/缺失分析流程包括如下步骤：
(1)测序仪(Illumina HiSeq2000)获取原始短序列；
(2)去除测序数据中的接头和低质量数据；
(3)把短序列(用SOAPaligner软件)定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数：soap2.20 -a -b -t -v 3 -l 42 -s 63 -m 100 -x 400,其中序列错配数为3)；
(4)统计目标区域覆盖大小，然后根据每个目标区域位点的位置信息为横坐标，每个位置相应的覆盖度为纵坐标作图，通过每个位点的读取深度，进行位点统计分析得出重复扩增和缺失的分析图，同时通过末端配对作图法(paired-endmapping，PEM)得到相关的断裂点位置。
实施例3、利用实施例1的DMD基因捕获探针与实施例2的DMD基因突变检测方法检测临床样本的DMD基因突变
经知情同意，选择DMD基因存在外显子缺失/重复扩增突变的5例患者的DNA样本(经MLPA检测验证，图2-图11)作为待测样本，利用MLPA检测阴性的DNA样本作为正常对照(阴性对照)，应用实施例2的DMD基因突变检测方法检测DMD基因突变。MLPA检测DMD基因是否存在外显子缺失/重复扩增突变所用试剂盒为MLPA P052检测试剂盒(HRC-Holland)。
结果显示，5例MLPA检测阳性的样本高通量测序图见图1，数据分析结果见表1和表3。图1中，阴性对照是指MLPA检测阴性的样本的高通量测序图。结果发现待测样本中有3例外显子缺失突变和2例外显子重复扩增突变，阴性对照中不含有缺失突变和重复扩增突变。通过利用本发明的DMD基因捕获探针和DMD基因突变检测方法进行检测的结果与MLPA验证结果的比较，发现结果一致，无差异。说明利用本发明的DMD基因捕获探针和DMD基因突变检测方法检测DMD全基因突变效果可靠。另外，现有的MLPA技术只能检测DMD基因外显子是否存在缺失/重复扩增突变，而本发明的DMD基因突变检测方法还能精确定位断裂点区域以及片段大小。
表1、DMD外显子缺失/重复扩增突变检测
另选取4个样本经实施例2的方法检测为DMD基因点突变样本，其检测结果如表2和表3所示。这四个样本中均不存在缺失/重复扩增突变。
利用MLPA P052检测试剂盒对这四个样本进行检测也均未检测到任何缺失/重复扩增突变。
根据实施例2的方法的检测结果在各突变位点上下游设计引物，对相应样本的基因组DNA进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行Sanger测序，结果发现，各PCR扩增产物的Sanger测序结果(图12)与利用实施例2的方法检测的点突变的结果完全一致。
表2.DMD基因点突变检测
因此，与现有技术中的方法(MLPA、Sanger等)相比，本发明的DMD基因捕获探针与DMD基因突变检测方法具有一次检测多种突变类型以及检测DMD基因全基因所有突变的优势，且准确性高，避免假阴性、假阳性出现，能提高临床DMD基因突变检测的效率与准确性。
表3、测序数据
表3中参数说明：
A.测序数据量是指完成DMD基因捕获的样本进行测序时产生的总的测序数据；
B.覆盖率：覆盖目的碱基数/目的碱基数；
C.目的碱基数：指探针设计所要覆盖到的目的区域的总碱基数；
D.覆盖目的碱基数：指经过富集测序后，能够成功比对到设计所要覆盖的碱基区域的碱基数；
E.捕获效率(有效数据量)：覆盖目的碱基数/测序数据量
F.测序平均深度：指目的区域测序时，平均所读取到的次数；
G.平均覆盖4X比例：指最少读到4次以上的碱基数占比；
H.平均覆盖10X比例：指最少读到10次以上的碱基数占比；
I.平均覆盖20X比例：指最少读到20次以上的碱基数占比；
探针质量评估：
DMD基因捕获探针对DMD基因的捕获均达到了92％以上覆盖，最高达到了99.92％；其捕获效率均在40％以上，从至少覆盖到4X、10X和20X的参数来看，平均覆盖比例分别达到92％、90％和84％以上，探针的整体均一性非常好，具有很好的稳定性。表明，本发明的DMD基因捕获探针可以用于捕获DMD基因及DMD基因突变位点的检测。

Claims (10)

1.DMD基因捕获探针，所述捕获探针的制备方法包括：制备N个亚探针，连接所述N个亚探针，得到DMD基因捕获探针；N为大于等于2的一个自然数；
所述N个亚探针满足所述N个亚探针能覆盖所述DMD基因的全部序列。
2.根据权利要求1所述的DMD基因捕获探针，其特征在于：在所述DMD基因上任何两个相邻的亚探针均满足上游亚探针的下游有一个或多个核苷酸与下游亚探针的上游重叠。
3.根据权利要求1或2所述的DMD基因捕获探针，其特征在于：所述N个亚探针的长度均为50-150bp。
4.根据权利要求1-3中任一所述的DMD基因捕获探针，其特征在于：所述N个亚探针的长度均为60bp。
5.根据权利要求1-4中任一所述的DMD基因捕获探针，其特征在于：所述N个亚探针的序列均满足：
第1条亚探针的序列为DMD基因的第1-60位；
第2条亚探针的序列为DMD基因的第58-117位；
第3条亚探针的序列为DMD基因的第115-174位；
……
第n条亚探针的序列为DMD基因的第【57(n-1)+1】-【57(n-1)+60】位；
……
第38953条亚探针的序列为DMD基因的第2220265-2220324位；
第38954条亚探针的序列为DMD基因的第2220322-2220381位；
其中，n为1-38954中的任一个自然数。
6.权利要求1-5中任一所述的N个亚探针。
7.DMD基因突变检测系统，包括权利要求1-5中任一所述的DMD基因捕获探针或所述的N个亚探针。
8.权利要求1-5中任一所述捕获探针的制备方法。
9.DMD基因突变检测方法，包括利用权利要求1-5中任一所述DMD基因捕获探针捕获待测样本的DMD基因，然后对捕获的DMD基因进行测序，确定所述待测样本的DMD基因的突变。
10.下述任一应用：
X1、权利要求1-5中任一所述DMD基因捕获探针或所述N个探针在检测DMD基因突变中的应用；
X2、权利要求1-5中任一所述DMD基因捕获探针或所述N个探针在制备检测DMD基因突变产品中的应用；
X3、权利要求1-5中任一所述DMD基因捕获探针或所述N个探针在诊断或辅助诊断假肥大型肌营养不良综合征中的应用；
X4、权利要求1-5中任一所述DMD基因捕获探针或所述N个探针在制备诊断或辅助诊断假肥大型肌营养不良综合征产品中的应用；
X5、权利要求7所述系统在检测DMD基因突变中的应用；
X6、权利要求7所述系统在制备检测DMD基因突变产品中的应用；
X7、权利要求7所述系统在诊断或辅助诊断假肥大型肌营养不良综合征中的应用；
X8、权利要求7所述系统在制备诊断或辅助诊断假肥大型肌营养不良综合征产品中的应用；
X9、权利要求9所述方法在诊断或辅助诊断假肥大型肌营养不良综合征中的应用。
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