CN106831832A - 一种两亲性荧光分子开关、其制备方法和应用 - Google Patents
一种两亲性荧光分子开关、其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种两亲性荧光分子开关，其为亲水基‑六芳基联咪唑‑荧光团，其中六芳基联咪唑为光致变色单元，用于控制荧光团的发光与淬灭，所述荧光团用于发出荧光，所述荧光团与六芳基联咪唑通过非共轭的烷基链相连，所述亲水基用于增加所述荧光分子开关的亲水性和自组装性能，本发明通过合成四(四乙二醇单甲醚)‑六芳基联咪唑‑氟化硼二吡咯，对该两亲性荧光分子开关进行自组装并用于超分辨成像系统成像，得到了更高的分辨率，观察到更加精细的结构；同时制样过程简单，仪器要求较低，有望能观察到自组装体组装的动态过程。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，更具体地，涉及一种单波长控制的荧光分子开关、其制备方法和应用。
背景技术
光致变色材料是指受到不同波段光源激发后能够可逆改变其光学性质，发生颜色变化的一类材料。由于该类材料在压力传感、永电体，分子电子技术、荧光传感、可擦除存储和光学透镜等领域具有广泛的潜在应用，从而引起了人们广泛的研究兴趣。近两年，以光致变色材料为基础，设计合成荧光分子开关并用于纳米材料的超分辨成像技术已经被报道。这一技术中，使用光来调控探针的荧光开关行为。光作为一种极为便利的手段，相对于化学试剂具备有更加广阔的应用前景。因此，以光致变色材料(螺吡喃)为基础的荧光分子开关受到了极大的关注。在螺吡喃作为探针的体系中，需要用到两束光的同时激发来实现荧光分子开关的激发与调控功能，而这使得超分辨成像无论是光路系统还是操作流程都变的比较复杂。
另外，荧光染料常用来标记两亲性聚合物并采用荧光成像观察聚合物自组装过程形成的微纳米结构形貌，由于荧光染料通常为油溶性，通常借助于聚合物的两亲性来实现荧光染料和聚合物的充分掺杂和混合，但是现有技术采用荧光染料标记聚合物时，由于现有的荧光染料均为亲油性，与两亲性的聚合物进行掺杂时可能由于染料分布不均一，导致成像时损失结构图像信息。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种两亲性荧光分子开关、其制备方法和应用，其目的在于通过合成两亲性的荧光分子开关亲水基-六芳基联咪唑-荧光团，将其自组装成微纳米结构，并进行超分辨荧光成像，由此解决现有技术的荧光染料或荧光分子开关不能自组装，从理论上，标记聚合物进行荧光成像时可能由于荧光染料标记不均一而损失结构图像信息的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种两亲性荧光分子开关，所述两亲性荧光分子开关为亲水基-六芳基联咪唑-荧光团，其中六芳基联咪唑为光致变色单元，用于控制荧光团的发光与淬灭，所述荧光团用于发出荧光，所述荧光团与六芳基联咪唑通过非共轭的烷基链相连，所述亲水基用于增加所述荧光分子开关的亲水性和自组装性能。
优选地，所述荧光团为氟化硼二吡咯，所述荧光分子开关的化学名称为亲水基-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯，所述亲水基用R表示，所述荧光分子开关具有式(I)的结构通式：
其中，所述亲水基R为
优选地，所述亲水基R为
优选地，所述荧光分子开关通过波长为400nm～500nm的可见光控制其开关行为。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的两亲性荧光分子开关的制备方法，包括如下步骤：
(1)将化合物A、联硼酸频那醇酯和乙酸钾按照摩尔比1:1.5:5.4混合均匀，加入催化剂剂量的PdCl2，分散在二氧六环中，在氮气保护下加热至90℃反应24h，反应完成后分离提纯得到白色固体B，所述A和B的分子结构如式(A)和式(B)；
(2)在氮气保护下，将四溴苯甲醛和2,4-二甲基吡咯按照摩尔比1:2.1溶解在四氢呋喃里，当完全溶解后，缓慢滴入三氟乙酸，在室温下搅拌过夜，然后将二氯二氰基苯醌的四氢呋喃溶液加入至搅拌过夜的反应液中，反应4小时后，加入12ml三乙胺，搅拌混匀，在冰水浴条件下加入三氟化硼乙醚，反应两小时后，分离提纯获得红色固体C，其分子结构如式(C)所示；
(3)将C和B按照质量比1:1.54均匀分散在二氧六环中，加入0.5mol/l的碳酸钾溶液，反应系统减压并导入氮气，抽排三次，加热到90℃反应1天，反应结束后，分离纯化有机相得到红色固体状化合物D，其分子结构如式(D)所示；
(4)在保护气氛下，将4,4-二羟基苯偶酰和碳酸钾按照质量比1:2.85分散在丁酮中得到反应液，然后将3,6,9,12-四甲氧基四甘1-(4-甲基苯磺酰)醚E的丁酮溶液滴加至上述反应液中，反应液搅拌并加热到95℃回流3小时，分离纯化有机相得到黄色油状物4,4-二甲氧基四甘醇苯偶酰F，所述E和F的分子结构如式(E)和式(F)所示；
(5)将D、F和乙酸铵按照质量比1:1.95:3.25混合并溶解在二氯甲烷中，并加入乙酸作为催化剂，反应液冻融四次，最终处于低气压状态，将反应液加热到110℃条件下搅拌2天，反应结束后，分离纯化得到深红色固体G，其分子结构如式(G)所示；
(6)将K3Fe(CN)6和KOH的混合水溶液滴加至G的二氯甲烷中，遮光并剧烈搅拌，反应过程中用薄层色谱监测，反应结束后，反应液水洗三次并收集有机相，用硫酸钠干燥，抽滤，减压旋干，用薄层色谱分离，最终得到红黑色固体H，即为式(I)所示的四(四乙二醇单甲醚)-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯，其中R为
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的两亲性荧光分子开关的应用，应用于自组装形成微纳米结构，并对该结构进行超分辨荧光成像，包括如下步骤：
(1)将所述两亲性荧光分子开关自组装形成微纳米结构的观测样品母液；
(2)用单波长光照射步骤(1)所述的样品母液，并采集样品图像；
(3)将步骤(2)获得的图像进行重构，获得所述两亲性荧光分子开关的自组装微纳米结构的图像。
优选地，步骤(1)所述自组装形成微纳米结构的观测样品母液的具体步骤为：将所述两亲性荧光分子开关溶解在乙醇中，制得浓度为1ug/ml～50ug/ml的母液，向所述母液中滴加高纯水，混合均匀，得到混合液，将该混合液在旋转蒸发仪上进行旋蒸，制得所述两亲性荧光分子开关的观测样品母液。
优选地，所述观测样品母液中两亲性荧光分子开关微球的尺寸为80～4000nm。
优选地，所述观测样品母液中两亲性荧光分子开关微球的尺寸为200～500nm。
优选地，所述超分辨荧光成像的分辨率为54.3nm。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果。
(1)本发明通过合成两亲性荧光分子开关R-六芳基联咪唑-荧光团，其中R为亲水基，其中六芳基联咪唑为光致变色单元，用于控制荧光团的发光与淬灭，所述荧光团用于发出荧光，所述荧光团与六芳基联咪唑通过非共轭的烷基链相连，所述亲水基用于增加所述荧光分子开关的亲水性和自组装性能。对该两亲性荧光分子开关进行自组装并用于超分辨成像系统成像，得到的图像更接近该微纳米结构的真实形貌；同时，两亲性荧光分子开关由于自身的两亲性，在用于标记聚合物并通过超分辨成像观测聚合物的形貌时，有望实现该两亲性荧光分子开关与聚合物良好的互溶掺杂，克服现有技术的通过掺杂油溶性分子开关实现聚合物纳米结构的表征时，由于掺杂本身存在着染料分布的不均一性的缺陷，导致可能存在成像结构上的损失的技术缺陷。
(2)本发明标记用的荧光分子开关具有用单波长光控制的性能，在此步骤中只需用单波长光照射观测样品，采集样品图像，使得操作步骤简单，且使超分辨成像系统中光路简单，有效的降低超分辨成像系统的成本。通过单波长可见光间歇性刺激该两亲性荧光探针，控制荧光分子开关的亮暗来实现超分辨成像的成像效果良好。
(3)相比于普通的荧光成像，实验表明基于本发明的两亲性分子开关的超分辨成像可以提供更高的分辨率，从而我们可以观察到更加精细的结构；同时制样过程简单，仪器要求较低，还有望能观察到自组装体组装的动态过程。
附图说明
图1为本发明提供的单波长控制的两亲性荧光分子开关的结构通式，其中R亲水基；
图2为本发明的四(四乙二醇单甲醚)-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯的荧光开关原理示意图；
图3为本发明的四(四乙二醇单甲醚)-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯的合成路线图；
图4为实施例1合成产物的核磁碳谱图；
图5为实施例1合成产物的氢谱图；
图6为实施例1合成的四(四乙二醇单甲醚)-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯在不同条件下自组装体的透射电镜图；
图7为实施例1合成的四(四乙二醇单甲醚)-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯的明场，荧光和超分辨成像；
图8为实施例1合成的四(四乙二醇单甲醚)-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯自组装体的超分辨图像分辨率与普通荧光成像分辨率对比图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的一种两亲性荧光分子开关，其为亲水基-六芳基联咪唑-荧光团，其中六芳基联咪唑为光致变色单元，用于控制荧光团的发光与淬灭，所述荧光团用于发出荧光，所述荧光团与六芳基联咪唑通过非共轭的烷基链相连，所述亲水基用于增加所述荧光分子开关的亲水性和自组装性能。
其中，荧光团优选为氟化硼二吡咯，所以该荧光分子开关的化学名称为亲水基-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯，亲水基用R表示，则该荧光分子开关具有式(I)的结构通式(图1)：
其中，亲水基R可以为优选为即该两亲性荧光分子开关优选为四(四乙二醇单甲醚)-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯。该荧光分子开关通过波长为400nm～500nm的可见光控制其开关行为。
本发明提供了两亲性荧光分子开关四(四乙二醇单甲醚)-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯的制备方法，如图3所示，包括如下步骤：
(1)将化合物A、联硼酸频那醇酯和乙酸钾按照摩尔比1:1.5:5.4混合均匀，加入催化剂剂量的PdCl2，分散在干燥的二氧六环中，在氮气保护下加热至90℃反应24h，反应完成后分离提出得到白色固体B；
(2)在氮气保护下，将四溴苯甲醛和2,4-二甲基吡咯按照摩尔比1:2.1溶解在四氢呋喃里，当完全溶解后，缓慢滴入三氟乙酸，在室温下搅拌过夜，然后将二氯二氰基苯醌的四氢呋喃溶液加入至搅拌过夜的反应液中，反应4小时后，加入12ml三乙胺，搅拌混匀，在冰水浴条件下加入三氟化硼乙醚，反应两小时后，分离提纯获得红色固体C；
(3)将C和B按照质量比1:1.54均匀分散在二氧六环中，加入0.5mol/l的碳酸钾溶液，反应系统减压并导入氮气，抽排三次，加热到90℃反应1天，反应结束后，分离纯化有机相得到红色固体状化合物D；
(4)在保护气氛下，将4,4-二羟基苯偶酰和碳酸钾按照质量比1:2.85分散在丁酮中得到反应液，然后将3,6,9,12-四甲氧基四甘1-(4-甲基苯磺酰)醚E的丁酮溶液滴加至上述反应液中，反应液搅拌并加热到95℃回流3小时，分离纯化有机相得到黄色油状物4,4-二甲氧基四甘醇苯偶酰F；
(5)将D、F和乙酸铵按照质量比1:1.95:3.25混合并溶解在二氯甲烷中，并加入乙酸作为催化剂，反应溶液冻融四次，最终处于低气压状态，将反应液加热到110℃条件下搅拌2天，反应结束后，分离纯化得到深红色固体G；
(6)将K3Fe(CN)6和KOH的混合水溶液滴加至G的二氯甲烷中，遮光并剧烈搅拌，反应过程中用薄层色谱监测，反应结束后，反应液水洗三次并收集有机相，用硫酸钠干燥，抽滤，减压旋干，用薄层色谱分离，最终得到红黑色固体，即为本发明的四(四乙二醇单甲醚)-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯H，其中R为
上述合成步骤中A～H的分子结构式如图3所示。
其中，步骤(3)选择的溶剂二氧六环是在大量实验的基础上选择得出的，实验中曾尝试过很多种类的有机溶剂，但是发现只有二氧六环可以合成出产物D。
将本发明的两亲性荧光分子开关四(四乙二醇单甲醚)-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯应用于自组装形成微纳米结构，并对该结构进行超分辨荧光成像，包括如下步骤：
(1)将所述两亲性荧光分子开关自组装形成微纳米结构的观测样品母液；
(2)用单波长光照射步骤(1)所述样品母液，并采集样品图像；
(3)将步骤(2)获得的图像进行重构，获得所述两亲性荧光分子开关的自组装微纳米结构的图像。
其中，步骤(1)所述自组装形成微纳米结构的观测样品母液的具体步骤为：将所述两亲性荧光分子开关溶解在乙醇中，制得浓度为1ug/ml～50ug/ml的母液，向所述母液中滴加高纯水，混合均匀，得到混合液，将该混合液在旋转蒸发仪上进行旋蒸，通过控制液体挥发速度，制得具有不同形貌不同尺寸的所述两亲性荧光分子开关的观测样品母液。
六芳基联咪唑(HABI)是一种典型的热致褪色型的光致变色材料，拥有快速的褪色机理、有色自由基重构和强的抗疲劳性，氟化硼二吡咯及其衍生物具有高的荧光量子产率、光稳定性好、易被修饰，本发明把氟化硼二吡咯作为荧光团，和光致变色材料六芳基联咪唑连接，反应形成荧光分子开关。先前使用的螺吡喃，二芳烯类探针的光致变色均需要双波长激光调控，且其中有一束为紫外光，而根据附图2中的原理图可知，此类探针的光致变色可由单波长的可见光调控，既能简化超分辨成像系统，也能减小激光对样品的损伤。
如图1所示，本发明提供的单波长控制的两亲性荧光分子开关的化学名称为R-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯，R为亲水基，荧光团和六芳基联咪唑通过非共轭的烷基链相连，荧光团在单波长光的激发下发出荧光，六芳基联咪唑为光致变色单元，六芳基联咪唑在上述同样的单波长光激发下，生成两个可逆的自由基，自由基通过能量共振将荧光团发出的荧光转移，实现荧光团的淬灭，当单波长光被移除后，通过暗态热褪色作用，两个可逆的自由基生成六芳基联咪唑，使得荧光团-六芳基联咪唑恢复到未被单波长光激发的状态。通过控制六芳基联咪唑的光致变色过程实现荧光分子开关的荧光开关行为。图2为四(四乙二醇单甲醚)-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯的荧光分子开关行为原理图。
本发明在该油溶性染料中通过共价键引入亲水基R，R为 优选为即四乙二醇单甲醚链，使该分子具有两亲性，从而可以组装形成各种尺寸的微纳米结构。本发明提供的两亲性荧光分子开关四(四乙二醇单甲醚)-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯，荧光团即为该自组装超分子的一部分，故荧光团在该超分子自组装形成的微纳米结构中一定能均匀分布，荧光成像中，微纳米结构图像信息将无损读出，本发明将其自组装超分辨荧光成像，其超分辨荧光成像的分辨率为54.3nm。
本发明的两亲性荧光分子开关由于本身具有两亲性，根据相似易溶的原理，将该两亲性荧光分子开关用于标记聚合物时，有望实现其与聚合物的良好互溶掺杂，进而在进行超分辨成像时得到完整的图像信息。
此外，由于标记用的荧光分子开关具有用单波长光控制的性能，在此步骤中只需用单波长光照射观测样品，采集样品图像，使得操作步骤简单，且使超分辨成像系统中光路简单，有效的降低超分辨成像系统的成本。
以下为实施例：
实施例1
一种两亲性荧光分子开关，其为四(四乙二醇单甲醚)-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯，具有如图1所示的结构，其中R为四(四乙二醇单甲醚)，其制备方法，如图3所示，包括如下步骤：
(1)在一个250mL圆底烧瓶中，将化合物A(3.35g,7.153mmol)、联硼酸频那醇酯(2.72g,10.73mmol)、乙酸钾(2.81g,38.61mmol)和催化剂Pd(dppf)Cl2(0.26g,0.36mmol)分散在100mL干燥的二氧六环中，在氮气保护下加热至90℃反应24h。当反应完成后，冷却至室温，将反应液小心倒入饱和食盐水中，用二氯甲烷萃取，然后用去离子水水洗，并用无水硫酸钠干燥，抽滤，加入适量硅胶粉减压旋干，将得到的粉末用硅胶层析柱提纯，其展开剂为乙酸乙酯和二氯甲烷混合溶液，体积比为4:96，最终得到1.88g白色固体B，产率51％。
(2)在氮气保护下，四溴苯甲醛(2.2g，12mmol)和2,4-二甲基吡咯(2.38g，25mmol)溶解在350ml干燥的四氢呋喃里，当完全溶解后，缓慢滴入30ul三氟乙酸，反应液在室温下搅拌过夜。称量2.9g二氯二氰基苯醌，溶解在干燥的四氢呋喃中配成溶液，在持续搅拌的条件下把配好的溶液倒入上述反应液。反应4小时后，在反应液中加入12ml三乙胺。再搅拌15分钟后，在冰水浴条件下缓慢加入12ml三氟化硼乙醚，反应两小时后，反应液水洗三次并用二氯甲烷萃取，有机相用硫酸钠干燥，抽滤，加入适量硅胶粉减压旋干，将得到的粉末用硅胶层析柱提纯，二氯甲烷作为流动相，最终获得1.1g红色固体C，产率23％。
(3)在100ml的双口瓶，将0.26g c和0.4g b分散在20ml二氧六环，加入0.5mol/l的碳酸钾溶液6ml，反应系统减压并导入氮气，抽排三次。反应液加热到90℃反应1天。反应结束后，水洗三次并分离有机层。用无水硫酸镁干燥，抽滤，收集有机相。在旋转蒸发仪下，将溶剂旋干，残余物直接用于柱层析分离纯化过程中。淋洗剂为二氯甲烷：石油醚＝80:20，最终得到0.27g红色强固体状化合物D，产率60％。
(4)在100ml双口烧瓶中，0.4g 4,4-二羟基苯偶酰和1.14g碳酸钾分散在30ml丁酮中，反应系统用氮气保护，3,6,9,12-四甲氧基四甘1-(4-甲基苯磺酰)醚E1.5g溶解在10ml丁酮中，转移到恒压滴液漏斗中，缓慢滴入反应液。反应液搅拌并加热到95℃回流3小时，得到淡黄色乳液，反应通过薄层色谱法监测，反应结束后，反应液冷却到室温，用200ml二氯甲烷稀释并用水洗涤三次，有机相用无水硫酸镁干燥，抽滤，收集有机相。在旋转蒸发仪下，将溶剂旋干，残余物直接用于柱层析分离纯化过程中。淋洗剂为二氯甲烷：甲醇＝100:1得到黄色油状物4,4-二甲氧基四甘醇苯偶酰F 0.55g，产率为53％。
(5)在一个100ml密封管中，0.2g d，0.39g 4,4-二甲氧基四甘醇苯偶酰F和0.65g乙酸铵溶解在30ml二氯甲烷中，并加入0.1ml乙酸作为催化剂，反应溶液冻融四次，最终处于低气压状态。将反应液加热到110℃条件下搅拌2天。反应结束后，反应液用二氯甲烷稀释并水洗三次。有机相用无水硫酸镁干燥，抽滤，收集有机相。在旋转蒸发仪下，将溶剂旋干，残余物直接用于柱层析分离纯化过程中。淋洗剂为而二氯甲烷：甲醇＝99:1，最终得到0.27g深红色固体G，产率为50％。
(6)在一个150ml双口烧瓶中，0.27g上一步产物G分散在30ml二氯甲烷中，对反应溶液进行遮光并剧烈搅拌，同时，由2.32g K3Fe(CN)6和0.79g KOH溶解于蒸馏水配置的25ml水溶液通过恒压滴液漏斗缓慢滴入反应液，大约20分钟滴完。反应过程中用薄层色谱监测，反应结束后，反应液水洗三次并收集有机相，用硫酸钠干燥，抽滤，减压旋干，用薄层色谱分离，最终得到红黑色固体H 150mg，产率为56％。
将红黑色固体H进行表征分析，其NMR核磁碳谱和氢谱分析结果如图4和图5所示，证实其为四(四乙二醇单甲醚)-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯。
实施例2
本发明提供的用两亲性荧光分子开关四(四乙二醇单甲醚)-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯进行自组装，用超分辨手段研究组装结构的形貌，包括如下步骤：
(1)将四(四乙二醇单甲醚)-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯溶解在不同浓度的乙醇中，制得浓度为1ug/ml～50ug/ml的母液，向所述母液中滴加高纯水，混合均匀，得到混合液，将该混合液在旋转蒸发仪上进行旋蒸，通过控制液体挥发速度，制得具有不同形貌的所述两亲性荧光分子开关的自组装微纳米结构的观测样品母液。
(2)让步骤(1)所得到的样品母液静置，然后用单波长光照射所述样品母液，并采集样品图像。
(3)将步骤(2)获得的图像进行重构，从而获得所述两亲性荧光分子开关的自组装微纳米结构的图像。
对该两亲性荧光分子开关进行自组装并用于超分辨成像系统成像得到的图像更接近该微纳米结构的真实形貌，因为一般通过掺杂油溶性分子开关也能实现相应的纳米结构的表征，然而在理论上掺杂本身存在着染料分布的不均一性的缺陷，因此可能存在着结构上的损失。本发明的两亲性荧光分子开关由于本身具有两亲性，根据相似易溶的原理，将该两亲性荧光分子开关用于标记聚合物时，有望实现其与聚合物的良好互溶掺杂，进而在进行超分辨成像时得到完整的图像信息。
此外，由于标记用的荧光分子开关具有用单波长光控制的性能，在此步骤中只需用单波长光照射观测样品，采集样品图像，使得操作步骤简单，且使超分辨成像系统中光路简单，有效的降低超分辨成像系统的成本。
本发明提供的用四(四乙二醇单甲醚)-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯进行自组装得到微纳米结构并进行超分辨成像，用于成像的光学成像仪器包括一个内置的光学显微镜，一个油浸附件，一个照相机，两个电子遮光器，一个分色镜和一个远程过滤器。成像时用波长为405nm功率为0.1Kw/cm2激光器发射激光，激发测试样品，采集测试样品200张。关闭激光器，在荧光回复过程中再采图600张。反复该过程直到采集5000张，其中每张照片的采集时间为20ms。然后对图像进行重构，得到纳米结构的超分辨图像。
图6为四(四乙二醇单甲醚)-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯在不同条件下自组装体的透射电镜图，如图6所示，该两亲性分子会形成纳米微球，比如胶束或囊泡。实验发现母液浓度和旋蒸时间对形成纳米微球的尺寸有重要影响，当浓度[c]＝5ug/ml，t＝0.5h，我们获得了平均直径为80纳米的均一微球(a-c)；当浓度【c】＝15ug/ml，t＝1h，纳米微球粒径会变大，均一度略微减小，平均粒径为150nm，如图(e-g)；当浓度【c】＝30ug/ml，t＝2h，如图(i-k)，纳米微球粒径增至500nm，且纳米微球粒径分布较宽，最大微球为800nm，最小的仅为150nm，当浓度【c】＝50ug/ml,我们获得了微米级别的囊泡(2-4um)，如图(m-o)，透射电镜显示最大的囊泡包括小的纳米粒子(o)。
利用该分子具有荧光分子可逆开关能力，我们用荧光显微镜进一步对自组装微球进行了超分辨成像。并与透射电镜、扫描电镜的成像结果进行了对比。在超分辨过程中，荧光猝灭和恢复分别是通过405nm激光器和热褪色过程控制的。激光器的开和关的时间比为1:3，每一帧超分辨图像由5000张荧光图重构而成，每张图片的曝光时间为20ms。实验中光学图像共采集了明场图和荧光图，计算过程中用了palmer重构方法。
我们把该两亲性荧光分子开关自组装体按微球粒径分为三类：粒径小于100nm，200～500nm，2～4um，并分别收集了他们的明场图(图7第一列)和荧光图(图7第二列)，并对荧光图进行重构得到了超分辨图(图7第三列)。从附图7中我们以看到，微球粒径小于100nm时，从明场中我们几乎观察不到任何清晰的结构，由于衍射极限的原因，荧光图中我们只可以分辨出荧光信号和束斑大于200nm，而重构出的超分辨图中我们可以看到更加精细的微球，粒径大约为90nm，而这个结果和透射电镜观察到的一致。而对于粒径在200nm～500nm的微球，我们从明场和荧光图中可以看到为实心微球，而重构图能清晰看出为空心微球。而对于大的微球，从明场和荧光图中我们就可以看到微球中包含小的纳米粒子，但重构图能得到更加精细的结构。因此证明了通过单波长可见光间歇性刺激该两亲性荧光探针，控制荧光开关分子的亮暗来实现超分辨成像的成像效果良好。
如附图8所示，a图为明场图，b图为荧光图，c图为超分辨成像图，如d图结果所示，通过metlab计算b图和c图划线部分的分辨率分别为266.1nm，54.3nm，即分辨率提高了4倍。相比于普通的荧光成像，实验表明基于该两亲性分子开关的的超分辨成像可以提供更高的分辨率，从而我们可以观察到更加精细的结构。同时制样过程简单，仪器要求较低。还有望能观察到自组装体组装的动态过程。
上述实验结果对两亲性嵌段聚合物的自组装结构进行了超分辨成像，得到了令人满意的结果。虽然，这一实验结果的分辨率可能和电子显微镜有一定的差距，但是超分辨成像凭借本身成像速度快，无须繁琐的制样，对样品损害小等特点弥补着分辨率方面的不足。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种两亲性荧光分子开关，其特征在于，所述两亲性荧光分子开关为亲水基-六芳基联咪唑-荧光团，其中六芳基联咪唑为光致变色单元，用于控制荧光团的发光与淬灭，所述荧光团用于发出荧光，所述荧光团与六芳基联咪唑通过非共轭的烷基链相连，所述亲水基用于增加所述荧光分子开关的亲水性和自组装性能。
2.如权利要求1所述的两亲性荧光分子开关，其特征在于，所述荧光团为氟化硼二吡咯，所述荧光分子开关为亲水基-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯，所述亲水基用R表示，所述荧光分子开关具有式(I)的结构通式：
其中，所述亲水基R为
3.如权利要求2所述的荧光分子开关，其特征在于，所述亲水基R为
4.如权利要求1～3任意一项所述的荧光分子开关，其特征在于，所述荧光分子开关通过波长为400nm～500nm的可见光控制其开关行为。
5.如权利要求3所述的两亲性荧光分子开关的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将化合物A、联硼酸频那醇酯和乙酸钾按照摩尔比1:1.5:5.4混合均匀，加入催化剂剂量的PdCl2，分散在二氧六环中，在氮气保护下加热至90℃反应24h，反应完成后分离提纯得到白色固体B，所述A和B的分子结构如式(A)和式(B)；
(2)在氮气保护下，将四溴苯甲醛和2,4-二甲基吡咯按照摩尔比1:2.1溶解在四氢呋喃里，当完全溶解后，缓慢滴入三氟乙酸，在室温下搅拌过夜，然后加入二氯二氰基苯醌的四氢呋喃溶液，反应4小时后，加入三乙胺，搅拌混匀，在冰水浴条件下加入三氟化硼乙醚，反应两小时后，分离提纯获得红色固体C，其分子结构如式(C)所示；
(3)将所述C和所述B按照质量比1:1.54均匀分散在二氧六环中，加入0.5mol/l的碳酸钾溶液，反应系统减压并导入氮气，抽排三次，加热到90℃反应1天，反应结束后，分离纯化后得到红色固体状化合物D，其分子结构如式(D)所示；
(4)在保护气氛下，将4,4-二羟基苯偶酰和碳酸钾按照质量比1:2.85分散在丁酮中得到反应液，然后将3,6,9,12-四甲氧基四甘1-(4-甲基苯磺酰)醚E的丁酮溶液滴加至上述反应液中，反应液搅拌并加热到95℃回流3小时，分离纯化有机相得到黄色油状物4,4-二甲氧基四甘醇苯偶酰F，所述E和F的分子结构如式(E)和式(F)所示；
(5)将所述D、F和乙酸铵按照质量比1:1.95:3.25混合并溶解在二氯甲烷中，并加入乙酸作为催化剂，反应液冻融四次，最终处于低气压状态，将该反应液加热到110℃条件下搅拌2天，反应结束后，分离纯化得到深红色固体G，其分子结构如式(G)所示；
(6)将K3Fe(CN)6和KOH的混合水溶液滴加至所述G的二氯甲烷中，遮光并剧烈搅拌，反应过程中用薄层色谱监测，反应结束后，反应液水洗三次并收集有机相，用硫酸钠干燥，抽滤，减压旋干，用薄层色谱分离，最终得到红黑色固体H，即为式(I)所示的四(四乙二醇单甲醚)-六芳基联咪唑-氟化硼二吡咯，其中R为
6.一种如权利要求3所述的两亲性荧光分子开关的应用，其特征在于，应用于自组装形成微纳米结构，并对该结构进行超分辨荧光成像，包括如下步骤：
(1)将所述两亲性荧光分子开关自组装形成微纳米结构的观测样品母液；
(2)用单波长光照射步骤(1)所述的样品母液，并采集样品图像；
(3)将步骤(2)获得的图像进行重构，获得所述两亲性荧光分子开关的自组装微纳米结构的图像。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述自组装形成微纳米结构的观测样品母液的具体步骤为：将所述两亲性荧光分子开关溶解在乙醇中，制得浓度为1ug/ml～50ug/ml的母液，向所述母液中滴加高纯水，混合均匀，得到混合液，将该混合液在旋转蒸发仪上进行旋蒸，制得所述两亲性荧光分子开关的观测样品母液。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述观测样品母液中两亲性荧光分子开关微球的尺寸为80～4000nm，优选为200～500nm。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述超分辨荧光成像的分辨率为54.3nm。
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