CN106823001A - 一种用于牙根再生的生物支架材料、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种用于牙根再生的生物支架材料、制备方法，及其在牙根再生或骨再生方面、在药物缓慢释放和控制释放方面的应用，属于医学材料技术领域。该支架材料源于天然牙本质，经微选择性酸蚀和控温煅烧处理后，去除了有机物，保留了天然牙本质中的磷灰石无机成分，并在材料表面形成了功能化的微米级管状结构，不仅能增强细胞在材料表面粘附，同时也能促进细胞突起长入材料内部，进而在牙根再生过程中促进有序牙本质小管的形成。该支架材料具有良好的生物相容性和生物学功能，可作为药物和基因载体，在牙根再生过程中实现药物和基因缓释功能。

Description

一种用于牙根再生的生物支架材料、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于医学材料技术领域，具体涉及一种用于牙根再生的生物支架材料、制备方法，及其在牙根再生或骨再生方面、在药物缓慢释放和控制释放方面的应用。
背景技术
由于牙周炎、龋病、创伤等原因导致的牙缺失是目前口腔临床最常见的临床表现之一。牙缺失不仅严重破坏口腔咀嚼功能，同时还影响发音、面部形态等，进而严重影响患者的身心健康。如何对缺失牙进行最佳修复治疗一直是口腔医学领域所探讨的重要问题。
目前口腔临床常用的修复缺失牙的方法包括活动义齿、固定义齿和种植义齿修复。其中活动义齿常引起异物感，摘戴频繁，易存留食物，难保持口腔清洁。固定义齿修复需要磨除基牙部分牙体组织，不仅对基牙造成永久性损伤，同时也带来牙髓感染风险。对于牙列末端牙缺失的患者，一般不适合进行固定义齿修复。种植义齿是在牙槽骨中植入钛金属种植体，并以此为人工牙根进行义齿修复。这虽然是目前临床最理想的修复方式，但种植义齿要求牙槽骨有足够的剩余骨量，骨量不足的患者无法种植或需要植骨后再种植。更重要的是，种植体与牙槽骨间的结合方式为骨结合，缺乏天然牙的牙周膜结构。这不仅导致应力集中，同时也使种植体缺乏天然牙根所具备的分散和感知咀嚼压力、促进牙槽骨改建等生理功能。因此，研究一种新的义齿修复方法，既能恢复牙的咀嚼功能，又能模拟天然牙根的组织结构，重建牙与牙周的关系，恢复牙的各种生理作用，进而实现功能性修复，是目前口腔医学研究的热点问题。
鉴于牙根是牙行使生理功能的关键部位，近年来，通过组织工程构建仿生牙根，并进一步在仿生牙根上进行缺牙修复，从而重建牙的生理功能成为缺失牙功能性修复的新策略。在组织工程构建仿生牙根过程中，支架材料的结构与性能决定了再生牙根的组织结构与生物学特性。目前，最常用的支架材料包括处理的牙本质基质(TDM)、人工合成的羟基磷灰石和磷酸三钙复合物等。研究发现这些支架材料可以诱导形成牙根样结构，并可以此牙根为基础实现后期的义齿修复。然而这些支架材料仍存在不同的缺陷，如：异体来源的TDM免疫原性及是否导致疾病传染有待验证；TDM虽然保留了天然牙本质中部分活性蛋白成分，但这些蛋白数量少，且诱导干细胞定向分化的功能较弱；由羟基磷灰石和磷酸三钙等无机物形成的牙根再生支架材料缺乏负载活性成分的功能，无法维持干细胞活性，且不具备促进细胞黏附和分化功能的微观结构。这些缺陷一方面导致上述支架材料在应用于牙根再生时成功率低，另一方面，即使支架材料成活，所形成的硬组织数量也往往有限，且大部分为骨样组织，而非真正的牙本质与牙骨质。在天然牙根中，牙本质由有序的牙本质小管和细胞外矿化间质构成，小管内容纳成牙本质细胞突起。牙本质是构成牙根的主要硬组织，它决定了牙根的机械性能。因此，目前尚没有一种理想的支架材料能够实现具有仿生意义的牙根再生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于牙根再生的生物支架材料、制备方法，及其在牙根再生或骨再生方面、在药物缓慢释放和控制释放方面的应用。该支架材料源于天然牙本质，经微选择性酸蚀和控温煅烧处理后，去除了有机物，保留了天然牙本质中的磷灰石无机成分，并在材料表面形成了功能化的微米级管状结构，不仅能增强细胞在材料表面粘附，同时也能促进细胞突起长入材料内部，进而在牙根再生过程中促进有序牙本质小管的形成，可负载药物活性物质，且无免疫原性。
本发明所述的一种可用于牙根再生的生物支架材料的制备方法，其步骤如下：
(1)取供体牙，截取牙根中上部分，去除牙髓组织；
(2)将步骤(1)中得到的牙根自牙髓腔侧向外磨除部分牙本质，并按照牙根外形均匀磨除部分牙根外表面组织，得到由牙本质构成的厚度为0.5～2毫米、长度为5～20毫米的支架材料；
(3)将步骤(2)得到的支架材料置于水中，超声处理20～40分钟，取出后干燥；
(4)将步骤(3)中得到的支架材料置于质量分数为10％～30％的甲酸水溶液中，迅速将整个体系置于5Kpa负压下抽吸1～3分钟；
(5)取出步骤(4)处理后的支架材料，迅速将其表面的液体吹去，室温放置10～30分钟；
(6)将步骤(5)得到的支架材料置于水中，超声处理10～20分钟，取出后干燥；
(7)重复步骤(4)～(6)0～4次；
(8)将步骤(7)得到的支架材料于600～800℃下煅烧2～4小时，然后降至室温；
(9)将步骤(8)得到的支架材料置于水中，超声处理3～5秒，取出后干燥，从而得到可用于牙根再生的生物支架材料。
上述方法中，步骤(1)的供体可以是人、牛、猪、猴、狗、羊。步骤(8)中煅烧时的升温速度为3～10℃/分钟，降温时自然冷却至室温。
上述用于牙根再生的生物支架材料可直接用于牙根再生和骨再生；也可以作为载体，在牙根再生与骨再生过程中用于负载细胞和药物，并可用于药物缓慢释放和控制释放(如实施例1中附图3、图5所示)。支架材料负载的药物可以是脱氧核糖核酸、核糖核酸、肽、蛋白质中的一种或一种以上。其中脱氧核糖核酸和核糖核酸可以是具有诱导组织再生作用的脱氧核糖核酸和核糖核酸片段，也可以是脱氧核糖核酸和核糖核酸与各自载体形成的复合物，如：质粒、脱氧核糖核酸脂质体复合物、核糖核酸生物材料复合物等。脱氧核糖核酸进入细胞后，在细胞内表达脱氧核糖核酸编码的蛋白质。核糖核酸进入细胞后参与细胞增殖、凋亡、代谢和组织形成等各种调节途径。肽可以是具有诱导组织再生作用的寡肽或多肽。蛋白质可以是具有诱导组织再生作用的简单蛋白质或结合蛋白质，例如球蛋白、糖蛋白。药物可以在体内环境中随着组织液的流动和材料的降解而被缓慢释放，从而延长药物的作用时间。所述的药物还可以是具有诱导组织再生作用的无机物、有机物或各自相应的盐。无机物及其相应的盐可以是无机化合物或络合物，如氢氧化钙(Ca(OH)2)、磷酸铵((NH4)3PO4)。有机物及其相应的盐例如辛伐他汀(C25H38O5)，阿伦膦酸钠(C4H12NNaO7P2)。
上述药物可以通过侧链、吸附力、共价键或离子键结合到支架材料表面。例如，将支架材料直接浸入药物的水溶液，通过物理吸附和电荷作用使药物结合于支架材料表面，药物进入材料中后借助材料内部的管状结构实现缓释效果。又例如，首先将支架材料浸入多聚乙烯亚胺溶液中，通过电荷吸附作用使带正电的多聚乙烯亚胺连接到支架材料表面，形成侧链后再通过电荷吸附作用在支架材料表面连接带负电的脱氧核糖核酸、核糖核酸等药物，从而增加支架材料的载药量。再例如，首先将支架材料浸入聚谷氨酸溶液中，通过电荷吸附作用在支架材料表面连接带负电的多聚谷氨酸，形成侧链后再通过电荷吸附作用在支架材料表面连接带正电的蛋白质等药物活性物质。
本发明首次提出了一种用于牙根再生的天然纯无机生物支架材料。这种支架材料是天然牙本质经微选择性酸蚀和煅烧处理后，形成的功能化生物支架材料。制备支架材料所用的天然牙本质可以来自于废弃的人、牛、猪、猴、羊、狗等哺乳动物的牙齿，具有充足的来源。与现有的牙根再生材料相比，该材料的特点在于：(1)具有功能化的天然微米级管状结构。通过微选择性酸蚀和煅烧处理，本发明所述的支架材料内牙本质小管直径平均被扩大2～3倍，最大可达9.1微米。这种扩大的牙本质小管使支架材料表面具有功能化的图案结构，不仅能增强细胞在材料表面粘附，同时也能促进细胞长入牙本质小管内部，形成类似于成牙本质细胞突的结构(如实施例1中附图4所示)，进而在牙根再生过程中促进有序牙本质小管的形成。(2)具有载药和缓释功能。功能化扩大的牙本质小管其容积和小管内表面积明显增加。这使牙本质小管内可吸附大量药物，并借助其管状结构延缓药物释放。(3)生物相容性良好且成分天然。本发明描述的支架材料来源于天然牙本质，经煅烧后去除了具有免疫原性的有机物，而保留的无机物则为牙本质中的磷灰石，其化学成分与晶型结构均属天然生物来源。这使支架材料具有良好的生物相容性和生物功能。
本发明所涉及的技术具有以下特点：(1)首创微选择性酸蚀技术处理牙本质支架材料。即利用负压抽吸的方法，将酸吸入微米级牙本质小管内，然后去除牙本质表面的酸。存留在牙本质小管内的酸与牙本质小管壁充分反应，而牙本质表面所受的影响大大减小，进而实现了牙本质小管从微观上被选择性纵向扩大的目的。(2)煅烧结合超声去除牙本质及牙本质小管内的有机物。牙本质是以胶原支架为基础完成矿化的。矿化的牙本质中胶原蛋白和非胶原蛋白与磷灰石嵌合，因而利用酶消化或碱处理等办法无法完全去除牙本质中的有机成分。本发明所描述的支架材料制备方法中利用煅烧结合超声去除牙本质中的有机物，一方面煅烧能保证材料中天然磷灰石的结构与成分不变，另一方面超声可去除煅烧后有机物产生的灰烬，进而达到完全清除有机物的目的。(3)控温煅烧防止材料变形。本发明描述的方法中将煅烧温度在升温时每分钟升高3～10℃，降温时自然冷却至室温，这种控温煅烧在防止支架材料因温度变化过快而导致形变或表面出现裂纹过程中发挥了关键作用。
附图说明
图1为本发明实施例1构建的牛乳牙来源的牙本质支架材料图片；显示支架材料形状规则，在制备过程中因酸蚀和煅烧而尺寸变小；图A为支架材料表面，显示材料长度为1.0cm；图B为支架材料横断面，显示材料最大外径为4.3mm，最小外径为3.3mm，厚度平均为0.5mm。
图2为本发明实施例1构建的牛乳牙来源的牙本质支架材料扫描电镜图；如图显示，牙本质小管直径被扩大，材料表面形成多孔结构，牙本质小管最大直径达9.1微米。
图3为本发明实施例1构建的牛乳牙来源的牙本质支架材料表面细胞生长情况；将细胞悬液滴加到材料表面并培养48小时后，进行扫描电镜观察，如图显示，细胞在材料表面伸展良好，形成多个细胞突起，可见突起长入材料内部。
图4为本发明实施例1构建的牛乳牙来源牙本质支架材料的牙本质小管内细胞生长情况；将细胞悬液滴加到材料表面并培养48小时后，进行扫描电镜观察，如图显示，扩大的牙本质小管内形成细胞突起。
图5为本发明实施例1构建的牛乳牙来源的牙本质支架材料对牛血清白蛋白的释放曲线；将10μL、1mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到干燥后的牙本质支架材料上，待材料完全吸附牛血清蛋白溶液后，于37℃下进行缓释实验。如图显示，支架材料对牛血清白蛋白具有缓释作用，6天后蛋白完全释放。
图6为本发明实施例2构建的猪乳牙来源的牙本质支架材料图片；显示支架材料形状规则，在制备过程中因酸蚀和煅烧而尺寸变小；图A为支架材料表面，显示材料长度为1.1cm；图B为支架材料横断面，显示材料最大外径为4.8mm，最小外径为3.6mm，厚度平均为0.6mm。
图7为本发明实施例2构建的猪乳牙来源的牙本质支架材料扫描电镜图；如图显示，牙本质小管直径被扩大，材料表面形成多孔结构，牙本质小管最大直径达6.9微米。
图8为本发明实施例2构建的猪乳牙来源的牙本质支架材料表面细胞生长情况；如图显示，细胞黏附于多孔结构表面，伸展良好，形成多个细长突起。
图9为本发明实施例3构建的人恒牙来源的牙本质支架材料扫描电镜图；如图显示，牙本质小管直径被扩大，材料表面形成多孔结构，牙本质小管最大直径达7.3微米。
图10为本发明实施例4构建的猪牙来源的牙本质支架材料扫描电镜图；如图显示，牙本质小管直径被扩大，材料表面形成多孔结构，牙本质小管最大直径达6.8μm。
具体实施方式
下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1：牛牙来源的牙本质支架材料的制备。
(1)取牛乳切牙，截取牙根上1/3部分，去除牙髓组织；
(2)沿牙根牙髓腔内侧向外磨除牙髓和部分前期牙本质，并按照牙根外形磨除牙骨质和部分牙本质，得到由牙本质构成的厚度为1mm、长度为1.1cm的支架材料；
(3)将支架材料置于水中，在超声振荡器中处理30分钟，60℃下干燥。
(4)将干燥后的支架材料置于质量分数20％的甲酸水溶液中，迅速将整个体系置于5Kpa负压下抽吸3分钟。
(5)取出步骤(4)处理后的支架材料，迅速将其表面的酸吹去，室温放置10分钟。
(6)将支架材料置于水中，于超声振荡器中处理20分钟，60℃下干燥。
(7)重复步骤(4)～(6)3次。
(8)将得到的支架材料于800℃下煅烧3小时，每分钟升温3℃。煅烧后自然降至室温。
(9)将煅烧后的支架材料置于水中，在超声振荡器中处理3秒钟，60℃下干燥，得到用于牙根再生的牙本质支架材料。
实施例2：猪牙来源的牙本质支架材料的制备。
(1)取猪下颌侧切牙，截取牙根上1/3部分，去除牙髓组织；
(2)沿牙根牙髓腔内侧向外磨除牙髓和部分前期牙本质，并按照牙根外形磨除牙骨质和部分牙本质，得到由牙本质构成的厚度为1.5mm、长度为1.2cm的支架材料；
(3)将支架材料置于水中，在超声振荡器中处理30分钟，80℃下干燥。
(4)将干燥后的支架材料置于质量分数20％的甲酸水溶液中，迅速将整个体系置于5Kpa负压下抽吸1分钟。
(5)取出步骤(4)处理后的支架材料，迅速将其表面的酸吹去，室温放置15分钟。
(6)将支架材料置于水中，于超声振荡器中处理20分钟，80℃下干燥。
(7)重复步骤(4)～(6)3次。
(8)将得到的支架材料于800℃下煅烧3小时，每分钟升温10℃。煅烧后自然降至室温。
(9)将煅烧后的支架材料置于水中，在超声振荡器中处理3秒钟，80℃下干燥，得到用于牙根再生的牙本质支架材料。
实施例3：人牙来源的牙本质支架材料的制备。
(1)取人下颌第一前磨牙，截取牙根上1/2部分，去除牙髓组织；
(2)沿牙根牙髓腔内侧向外磨除牙髓和部分前期牙本质，并按照牙根外形磨除牙骨质和部分牙本质，得到由牙本质构成的厚度为0.5mm、长度为5mm的支架材料；
(3)将支架材料置于水中，在超声振荡器中处理20分钟，50℃下干燥。
(4)将干燥后的支架材料置于质量分数10％的甲酸水溶液中，迅速将整个体系置于5Kpa负压下抽吸2分钟。
(5)取出步骤(4)处理后的支架材料，迅速将其表面的酸吹去，室温放置30分钟。
(6)将支架材料置于水中，于超声振荡器中处理10分钟，50℃下干燥。
(7)将得到的支架材料于600℃下煅烧2小时，每分钟升温5℃。煅烧后自然降至室温。
(8)将煅烧后的支架材料置于水中，在超声振荡器中处理3秒钟，50℃下干燥，得到用于牙根再生的牙本质支架材料。
实施例4：猪牙来源的牙本质支架材料的制备。
(1)取猪下颌侧切牙，截取牙根上1/3部分，去除牙髓组织；
(2)沿牙根牙髓腔内侧向外磨除牙髓和部分前期牙本质，并按照牙根外形磨除牙骨质和部分牙本质，得到由牙本质构成的厚度为2mm、长度2cm的支架材料；
(3)将支架材料置于水中，在超声振荡器中处理40分钟，60℃下干燥。
(4)将干燥后的支架材料置于质量分数30％的甲酸水溶液中，迅速将整个体系置于5Kpa负压下抽吸2分钟。
(5)取出步骤(4)处理后的支架材料，迅速将其表面的酸吹去，室温放置10分钟。
(6)将支架材料置于水中，于超声振荡器中处理20分钟，60℃下干燥。
(7)重复步骤(4)～(6)4次。
(8)将得到的支架材料于800℃下煅烧4小时，每分钟升温3℃。煅烧后自然降至室温。
(9)将煅烧后的支架材料置于水中，在超声振荡器中处理5秒钟，60℃下干燥，得到用于牙根再生的牙本质支架材料。

Claims (9)

1.一种可用于牙根再生的生物支架材料的制备方法，其步骤如下：
(1)取供体牙，截取牙根中上部分，去除牙髓组织；
(2)将步骤(1)中得到的牙根自牙髓腔侧向外磨除部分牙本质，并按照牙根外形均匀磨除部分牙根外表面组织，得到由牙本质构成的厚度为0.5～2毫米、长度为5～20毫米的支架材料；
(3)将步骤(2)得到的支架材料置于水中，超声处理20～40分钟，取出后干燥；
(4)将步骤(3)中得到的支架材料置于质量分数10％～30％的甲酸水溶液中，迅速将整个体系置于5Kpa负压下抽吸1～3分钟；
(5)取出步骤(4)处理后的支架材料，迅速将其表面的液体吹去，室温放置10～30分钟；
(6)将步骤(5)得到的支架材料置于水中，超声处理10～20分钟，取出后干燥；
(7)重复步骤(4)～(6)0～4次；
(8)将步骤(7)得到的支架材料于600～800℃下煅烧2～4小时，然后降至室温；
(9)将步骤(8)得到的支架材料置于水中，超声处理3～5秒，取出后干燥，从而得到可用于牙根再生的生物支架材料。
2.如权利要求1所述的一种可用于牙根再生的生物支架材料的制备方法，其特征在于：步骤(1)的供体是人、牛、猪、猴、狗或羊。
3.如权利要求1所述的一种可用于牙根再生的生物支架材料的制备方法，其特征在于：步骤(8)中的煅烧时的升温速度为3～10℃/分钟，降温时自然冷却至室温。
4.一种可用于牙根再生的生物支架材料，其特征在于：是由权利要求1～3任何一项所述的方法制备得到。
5.权利要求4所述的一种可用于牙根再生的生物支架材料在牙根再生或骨再生方面的应用。
6.权利要求4所述的一种可用于牙根再生的生物支架材料在药物缓慢释放和控制释放方面的应用。
7.如权利要求6所述的一种可用于牙根再生的生物支架材料在药物缓慢释放和控制释放方面的应用，其特征在于：药物是脱氧核糖核酸、核糖核酸、肽、蛋白质中的一种或一种以上。
8.如权利要求6所述的一种可用于牙根再生的生物支架材料在药物缓慢释放和控制释放方面的应用，其特征在于：药物是具有诱导组织再生作用的无机物、有机物或各自相应的盐。
9.如权利要求8所述的一种可用于牙根再生的生物支架材料在药物缓慢释放和控制释放方面的应用，其特征在于：药物是氢氧化钙、磷酸铵辛伐他汀或阿伦膦酸钠。
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