CN106770016A - 单粒稻谷种子的蛋白质定量分析nir透射光谱测量方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法，包括以下步骤：收集稻谷种子，NIR光谱采集，单粒糙米粗蛋白含量的测定，光谱分析和定量模型的建立。本发明的优点在于：采用NIR透射光谱，并根据单粒稻谷种子的特点设计特殊的NIR透射光谱测量载物台，由此获得准确可靠的单粒种子NIR光谱信息，从而成功建立稳定的单粒稻谷种子粗蛋白含量的定量模型；此模型准确度高，对于在实际应用中在线实时分析活体单粒稻谷种子粗蛋白含量具有重要的意义与应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及农业技术领域，尤其涉及一种单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法。
背景技术
稻米是禾本科植物，为世界上的主要粮食作物之一，营养成分较多，属于直接经济作物；蛋白质为稻米的主要营养成分，是评价其品质优劣的重要指标。育种行业中，为了能够更加精确获得具有最优性状的种子，已经开始在单粒种子水平上研究个体的性状差异；该研究的缺点是不仅工作量大且一般的化学分析为有损检测，无法满足单粒活体分析。
近红外光是指波数在4000-12500cm-1范围内的电磁波，因其具有无损、快速、多成分、无污染的分析特点，能够弥补上述单粒种子性状分析的缺点。目前，单粒大豆、玉米、小麦等种子的相关内含物的近红外光谱定量模型均已成功建立，在育种行业发挥了举足轻重的作用，但分析完整稻谷种子内含物的报道则较少，原因为稻谷种子由种壳和糙米两部分组成，相互之间物质含量差别较大，且相应的光谱信息重叠严重，目前还没有基于近红外光谱快速准确预测单粒水稻种子的方法及模型建立。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种准确度高，且对活体单粒稻谷种子粗蛋白含量的在线实时分析具备重要意义与价值的单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法，包括如下步骤：
(1)收集稻谷种子
收集单粒稻谷种子，将其放置干燥器中过夜；
(2)NIR光谱采集
将种子、种壳和去除种壳的糙米分别放置于NIR透射光谱仪的NIR透射光谱测量载物台上进行光谱采集；其中NIR透射光谱测量载物台为自制的适用于单粒稻谷种子的NIR透射光谱测量载物台；
(3)单粒糙米粗蛋白含量的测定
对糙米进行压碎、过筛处理，再于烘箱中烘干，最后采用杜马斯法测定单粒糙米粗蛋白的含量；
(4)光谱分析和定量模型的建立
对比步骤(2)中获取的种子、种壳和糙米的透射光谱，找出种壳吸光值较低而糙米吸光值变化较明显的波数范围后选择最佳波数范围，再于不同的光谱预处理方法下，结合步骤(3)中所得单粒糙米粗蛋白的含量，建立单粒稻谷种子粗蛋白的定量分析模型。
优选地，所述步骤(1)中单粒稻谷种子为来源相同且质量变化范围为27.6-41mg的单粒稻谷种子。
优选地，所述步骤(2)中采用傅里叶近红外光谱仪进行光谱采集，波数范围为5800-12500cm-1。
优选地，所述步骤(3)中单粒糙米粗蛋白含量的测定的具体方法为：将糙米压碎，过95-105目筛，于75-85℃烘箱过夜烘干，再秤取糙米粉4-6mg，采用元素分析仪测定其含氮量，再乘以糙米粉蛋白质的换算系数5.95获得其粗蛋白含量。
优选地，所述元素分析仪中氧化炉温度设置为1100-1200℃，还原炉设置为800-900℃，通氧时间为85-95s，仪器测定的标准品为苯磺酸。
优选地，所述步骤(4)中种壳吸光值较低而糙米吸光值变化较明显的波数范围为7450-12500cm-1，最佳波数范围为7450-9110cm-1；最佳波数范围的选择方式为：根据光谱信息和回归方程公式Y＝bX+a，得到7450-12500cm-1波数范围内蛋白的回归系数曲线，再根据回归曲线去除噪音较大的波数范围。
优选地，所述步骤(4)中采用软件Unscramble 9.7进行模型的建立。
优选地，所述步骤(4)中不同的光谱预处理方法分别为标准正态变化光谱预处理、多元散射校正光谱预处理、一阶导数光谱预处理和二阶导数光谱预处理。
优选地，所述步骤(2)中NIR透射光谱测量载物台包括光谱测量载物台；所述光谱测量载物台的上表面开有第一凹槽，第一凹槽内还设有带有透光孔的第二凹槽；
所述光谱测量载物台为一开口向下的圆柱形载物台，圆柱形载物台的顶面中心位置开有长方形的第一凹槽；所述第二凹槽位于第一凹槽底部的中心位置，为半椭圆形凹槽，透光孔位于第二凹槽底部的中心位置，为圆形且垂直贯穿于整个光谱测量载物台的透光孔。
优选地，所述光谱测量载物台的高度为9.5mm，厚度为4.5mm；所述光谱测量载物台顶面的圆直径为22.5mm，高度为4.5mm；所述第一凹槽的长度为13mm，宽度为5mm，深度为2.5mm；所述第二凹槽长轴直径为5mm，短轴直径为2mm，与单粒稻谷种子相配合；所述透光孔的直径为1.6mm，小于单粒稻谷种子的宽度。
本发明的优点在于：采用NIR透射光谱，并根据单粒稻谷种子的特点设计特殊的NIR透射光谱测量载物台，由此获得准确可靠的单粒种子NIR光谱信息，从而成功建立稳定的单粒稻谷种子粗蛋白含量的定量模型；此模型准确度高，对于在实际应用中在线实时分析活体单粒稻谷种子粗蛋白含量具有重要的意义与应用价值。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法的流程图；
图2是本发明实施例1提供的单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法的NIR透射光谱测量载物台的整体结构示意图；
图3是图2的左视图；
图4是图2的俯视图；
图5是图4的A-A剖视视图；
图6是本发明实施例1提供的单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法的单粒稻谷种子的种子、种壳和糙米的透射光谱对比图；
图7是本发明实施例1提供的单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法的7450-12500cm-1波数范围内单粒稻谷种子蛋白的回归系数曲线图；
图8是本发明实施例1提供的单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法的标准正态变化光谱预处理下单粒稻谷种子蛋白模型的建立结果图；
图9是本发明实施例1提供的单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法的标准正态变化光谱预处理下单粒稻谷种子蛋白模型的预测结果图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施举例
一种单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法，如图1所示，包括如下步骤：
(1)收集稻谷种子
收集质量变化范围为27.6-41mg的水稻9311的单粒稻谷种子，将其放置干燥器中过夜；
(2)NIR光谱采集
采用德国布鲁克MPA近红外光谱仪中进行光谱采集，其中波数范围为5800-12500cm-1，分辨率16cm-1，扫描次数64次；光谱采集过程中，先将种子、种壳和去除种壳的糙米分别放置于如图2-5所示自制的适用于单粒稻谷种子的NIR透射光谱测量载物台上，再进行光谱采集；
(3)单粒糙米粗蛋白含量的测定
将糙米压碎，过95-105目筛，于75-85℃烘箱过夜烘干，再秤取糙米粉4-6mg，采用元素分析仪测定其含氮量，再乘以糙米粉蛋白质的换算系数5.95获得其粗蛋白含量；其中元素分析仪中氧化炉温度设置为1100-1200℃，还原炉设置为800-900℃，通氧时间为85-95s，仪器测定的标准品为苯磺酸；
(4)光谱分析和定量模型的建立
对比步骤(2)中获取的种子、种壳和糙米的透射光谱，如图6所示，发现种壳的NIR透射光谱在7450-12500cm-1波数范围内吸光值无波动，糙米和种子的NIR透射光谱在该波数范围内均有相应的吸收峰，且种子的吸收峰要强于糙米，找出了种壳吸光值较低而糙米吸光值变化较明显的波数范围，即7450-12500cm-1；再根据光谱信息和回归方程公式Y＝bX+a，得到如图7所示的7450-12500cm-1波数范围内单粒稻谷种子蛋白的回归系数曲线，再根据回归曲线去除噪音较大的波数范围(曲线比较尖锐说明噪音多，信息少，应留取信息量多的波长)作为选择最佳波数范围，即7450-9110cm-1，再采用软件Unscramble 9.7，于不同的光谱预处理方法(标准正态变化光谱预处理、多元散射校正光谱预处理、一阶导数光谱预处理和二阶导数光谱预处理)下，结合步骤(3)中所得单粒糙米粗蛋白的含量，进行单粒稻谷种子粗蛋白的定量分析模型的建立与预测；
表1不同光谱预处理下单粒稻谷种子蛋白定量模型
表1对比了不同光谱预处理方法下单粒稻谷种子粗蛋白含量定量模型以及相应的预测结果，可知：二阶导数光谱预处理下，模型结果最差，可能原因为二阶导数降低了光谱的信噪比；而在标准正态变化和多元散射校正光谱预处理下，模型结果最好；其中在标准正态变化光谱预处理下，主成分数为5时，模型的决定系数(R2)为95.3，交互验证均方根(RMSECV)为0.295，预测均方根(RMSEP)为0.249，模型的相关性极好，其相应建模结果和预测结果图分别如图8、图9所示；此模型准确度高，对于在实际应用中在线实时分析活体单粒稻谷种子粗蛋白含量具有重要的意义与应用价值。
进一步地，如图2-5所示，上述NIR透射光谱测量载物台1为根据单粒稻谷种子的特点设计的特殊的NIR透射光谱测量载物台，配合德国布鲁克MPA近红外光谱仪使用，可获得准确可靠的单粒种子NIR光谱信息，包括安装于MPA近红外光谱仪的检测器与光信号发射器之间的光谱测量载物台1，光谱测量载物台1的上表面开有第一凹槽2，第一凹槽2内还设有带有透光孔4的第二凹槽3；其中，光谱测量载物台1用于承载单粒稻谷种子，光信号发射器位于光谱测量载物台1的下方发射光信号，检测器则位于光谱测量载物台1的上方接收穿过单粒稻谷种子的光信号，用于后续的信号分析与检测；
光谱测量载物台1具体为一开口向下的圆柱形载物台，圆柱形载物台的顶面中心位置开有长方形的第一凹槽2，第一凹槽2的长度、宽度均小于光谱测量载物台1顶面的圆直径，第一凹槽2的深度小于光谱测量载物台1顶面的高度；第二凹槽3位于第一凹槽2底部的中心位置，为半椭圆形凹槽，与单粒稻谷种子相配合，且保证其短轴直径略小于单粒稻谷种子的1/2高度；透光孔4位于第二凹槽3底部的中心位置，为圆形且垂直贯穿于整个光谱测量载物台1的透光孔，透光孔4的直径略小于第二凹槽3的短轴直径，并且小于单粒稻谷种子的宽度；使用时，将单粒稻谷种子置于半椭圆形的第二凹槽上，由于其与单粒稻谷种子的外形相配合且短轴直径略小于单粒稻谷种子的1/2高度，能将种子完全契合地固定于第二凹槽中，同时又不阻碍其下方光信号对整个种子照射及穿透，再结合透光孔的位置及尺寸设计，本装置又能完全保证测量时不会“漏光”，检测器只能接收到透过种子的光信号，这样可以减少单粒稻谷种子NIR透射光谱测量误差并提高灵敏度。
具体地，光谱测量载物台1的高度为9.5mm，厚度为4.5mm；光谱测量载物台1顶面的圆直径为22.5mm，高度为4.5mm；第一凹槽2的长度为13mm，宽度为5mm，深度为2.5mm；第二凹槽3长轴直径为5mm，短轴直径为2mm；透光孔4的直径为1.6mm。
此外，光谱测量载物台1为黑色金属光谱测量载物台，采用金属材质，使本装置的牢固性性也大大提高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)收集稻谷种子
收集单粒稻谷种子，将其放置干燥器中过夜；
(2)NIR光谱采集
将种子、种壳和去除种壳的糙米分别放置于NIR透射光谱仪的NIR透射光谱测量载物台上进行光谱采集；其中NIR透射光谱测量载物台为自制的适用于单粒稻谷种子的NIR透射光谱测量载物台；
(3)单粒糙米粗蛋白含量的测定
对糙米进行压碎、过筛处理，再于烘箱中烘干，最后采用杜马斯法测定单粒糙米粗蛋白的含量；
(4)光谱分析和定量模型的建立
对比步骤(2)中获取的种子、种壳和糙米的透射光谱，找出种壳吸光值较低而糙米吸光值变化较明显的波数范围后选择最佳波数范围，再于不同的光谱预处理方法下，结合步骤(3)中所得单粒糙米粗蛋白的含量，建立单粒稻谷种子粗蛋白的定量分析模型。
2.根据权利要求1所述的单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法，其特征在于，所述步骤(1)中单粒稻谷种子为来源相同且质量变化范围为27.6-41mg的单粒稻谷种子。
3.根据权利要求1所述的单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法，其特征在于，所述步骤(2)中采用傅里叶近红外光谱仪进行光谱采集，波数范围为5800-12500cm-1。
4.根据权利要求1所述的单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法，其特征在于，所述步骤(3)中单粒糙米粗蛋白含量的测定的具体方法为：将糙米压碎，过95-105目筛，于75-85℃烘箱过夜烘干，再秤取糙米粉4-6mg，采用元素分析仪测定其含氮量，再乘以糙米粉蛋白质的换算系数5.95获得其粗蛋白含量。
5.根据权利要求4所述的单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法，其特征在于，所述元素分析仪中氧化炉温度设置为1100-1200℃，还原炉设置为800-900℃，通氧时间为85-95s，仪器测定的标准品为苯磺酸。
6.根据权利要求1所述的单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法，其特征在于，所述步骤(4)中种壳吸光值较低而糙米吸光值变化较明显的波数范围为7450-12500cm-1，最佳波数范围为7450-9110cm-1；最佳波数范围的选择方式为：根据光谱信息和回归方程公式Y＝bX+a，得到7450-12500cm-1波数范围内蛋白的回归系数曲线，再根据回归曲线去除噪音较大的波数范围。
7.根据权利要求1所述的单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法，其特征在于，所述步骤(4)中采用软件Unscramble 9.7进行模型的建立。
8.根据权利要求1所述的单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法，其特征在于，所述步骤(4)中不同的光谱预处理方法分别为标准正态变化光谱预处理、多元散射校正光谱预处理、一阶导数光谱预处理和二阶导数光谱预处理。
9.根据权利要求1所述的单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法，其特征在于，所述步骤(2)中NIR透射光谱测量载物台包括光谱测量载物台；所述光谱测量载物台的上表面开有第一凹槽，第一凹槽内还设有带有透光孔的第二凹槽；
所述光谱测量载物台为一开口向下的圆柱形载物台，圆柱形载物台的顶面中心位置开有长方形的第一凹槽；所述第二凹槽位于第一凹槽底部的中心位置，为半椭圆形凹槽，透光孔位于第二凹槽底部的中心位置，为圆形且垂直贯穿于整个光谱测量载物台的透光孔。
10.根据权利要求9所述的单粒稻谷种子的蛋白质定量分析NIR透射光谱测量方法，其特征在于，所述光谱测量载物台的高度为9.5mm，厚度为4.5mm；所述光谱测量载物台顶面的圆直径为22.5mm，高度为4.5mm；所述第一凹槽的长度为13mm，宽度为5mm，深度为2.5mm；所述第二凹槽长轴直径为5mm，短轴直径为2mm，与单粒稻谷种子相配合；所述透光孔的直径为1.6mm，小于单粒稻谷种子的宽度。
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