CN106755466A - 一种特异性dna甲基化谱其建立方法及应用 - Google Patents

一种特异性dna甲基化谱其建立方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性DNA甲基化谱其建立方法及应用，属于生物工程技术领域，以动脉粥样硬化患者和与之匹配的正常人的血液标本为研究对象，提取血液中单个核细胞的DNA和RNA，同时筛选与动脉粥样硬化相关的基因，用巢氏降落式甲基化特异性PCR的方法检测血液中单个核细胞多个基因启动子区CpG岛甲基化的改变，以高频率的基因CpG岛甲基化事件作为一种表遗传学标志，建立了由ABCA1、ACAT1、TIMP‑1三个基因组成的动脉粥样硬化特异性疾病DNA甲基化谱。该方法简单易行，取材方便，灵敏度和特异性均与影像学诊断的结果高度吻合，在动脉粥样硬化性疾病的早期诊断与预后评估中具有极大的应用价值。

Description

一种特异性DNA甲基化谱其建立方法及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种特异性DNA甲基化谱其建立方法及应用。
背景技术
动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种由遗传和环境等多因素共同参与的慢性复杂性病变，其所致的心脑血管疾病严重危害了人类身体健康。近年来，随着人们生活水平的提高、饮食习惯的改变、工作压力的增加以及社会环境的变迁等因素影响，AS发病率呈明显上升的趋势，且发病年龄日趋年青化，AS所致的心脑血管疾病有可能成为世界范围内的首要致死致残的原因之一，因而早期发现、预防和控制动脉粥样硬化的发生和发展是目前临床科学的重要目标之一。但AS的早期分子诊断、机制及方法尚未完全阐明。目前，血管造影和颈动脉超声是诊断AS的重要手段，能够显示血管直径、血管狭窄程度和斑块晚期病变，长期以来都被作为冠状动脉、颈动脉以及周围动脉病变等解剖学诊断的金标准。但超声检测仅仅对已经发生了动脉结构改变的动脉粥样硬化有诊断意义，很难直接观察到尚未发生结构及电生理改变的动脉粥样硬化的病变；而血管造影虽然能较为直观的观察到已经发生的病变，但造影具有创伤性，尤其是那些对造影剂过敏、肾脏功能不好的患者无法适用。因此，寻找一种动脉粥样硬化发生发展的早期分子诊断标志物及简单易行、快捷无创的检测手段将对动脉粥样硬化的预防和诊断有着重要的意义。
DNA甲基化是指以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，经DNA甲基转移酶的调节，将供体的甲基转移到5’端CpG二核苷酸的胞嘧啶上，使之变为5-甲基胞嘧啶，其本质是DNA基因碱基序列本身没有改变而其功能发生的变化，是除遗传学调控基因表达外又一重要调控方式，主要受环境因素的影响，是联系遗传和环境因素的纽带。在细胞转化过程中，DNA甲基化现象比临床症状改变更早，是在疾病未出现临床症状前DNA甲基化已发生了典型改变。DNA甲基化模式改变，包括DNA甲基化程度升高和降低，高甲基化抑制基因的表达，而低甲基化则可促进基因的表达。在肿瘤的研究中发现，DNA甲基化异常是引起肿瘤的一个重要因素，已经在部分肿瘤的早期预测、分类及预后评估中进行了应用，而AS也属于多因素复杂性疾病，其发生发展的相关机制如血管平滑肌细胞增殖及表型转化、脂质浸润及内皮细胞损伤等都与其调控因子启动子区的CpG岛甲基化异常有关。在人类和ApoE基因敲除鼠的动脉粥样硬化斑块中存在广泛的基因组甲基化水平降低，使部分染色体发生微卫星不稳定，导致平滑肌细胞增生；AS病人的主动脉等组织中雌激素受体α基因的DNA甲基化水平升高；另外，在AS发生发展中，ATP结合盒转运子A1(ABCA1)、胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)等基因也存在DNA甲基化修饰状态的改变。由此可见，多个基因启动子区的甲基化改变是AS发生中的普遍现象，基因DNA异常甲基化有可能是动脉粥样硬化形成的早期生物学标志物，以高频率的基因CpG岛甲基化事件作为一种表遗传学标志，在AS的早期诊断与预后评估中具有重要的潜在价值。
以往对AS的研究中，大多局限于观察单个或少数基因甲基化与AS的关系，其基因表型和疾病表型间的复杂关系并不能通过将单个基因的独立作用进行简单的加和来充分解释，仅依靠单个或少数基因的异常甲基化状况不能准确判断AS的发展状况，因此，如能从多基因水平寻找出AS表遗传标志物，即建立AS早期诊断的特异性甲基化谱，对复杂疾病筛查的实际临床应用具有重要意义。但目前国内外尚无对AS特异的DNA甲基化谱的研究及其作为表遗传学标志与AS发生发展之间的关系的研究的公开报道，因此，找到有效的早期诊断方法和干预手段，指导AS的靶向性治疗及潜在的干预靶点，对提高人们生活水平和质量有不可估量的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性DNA甲基化谱其建立方法及应用，该方法该方法取材来自血液，患者普遍容易接受，简单易行，容易推广。
其具体技术方案为：
一种特异性DNA甲基化谱，包括TIMP-1、ACAT1、ABCA1三个基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。
一种特异性DNA甲基化谱的建立方法，包括以下步骤：
(1)筛选与动脉粥样硬化相关的候选基因；
(2)筛选动脉粥样硬化患者和与之匹配的正常人的血液标本,检测血脂水平并提取血液中单个核细胞的DNA,确定DNA的纯度和浓度；
(3)将提取的DNA进行重亚硫酸盐修饰,用巢氏降落式甲基化特异性PCR(ntMS-PCR)检测ABCA1、ACAT1、PPARα、PDGFβ、5-LO、LRP1、LCAT、TIMP-1、MMP-9、ICAM-1、VEGF、NFκB12个基因的启动子区CpG岛甲基化的改变；
(4)提取血液中单个核细胞的RNA并将其逆转录成cDNA,荧光Real-Time PCR法测血液单个核细胞中ABCA1、ACAT1、PPARα、5-LO、TIMP-1基因mRNA的表达；
(5)建立由ABCA1、ACAT1、TIMP-1三基因组成的动脉粥样硬化特异性DNA甲基化谱；
(6)分析比较多个基因甲基化改变与颈动脉多普勒超声相比诊断动脉粥样硬化的特异性、敏感性等指标并进行评价。
进一步，动脉粥样硬化患者血液中单个核细胞中ACAT1、PPARα基因DNA启动区甲基化程度降低，而ABCA1、TIMP-1、5-LO基因DNA启动子区甲基化程度升高。
进一步，动脉粥样硬化患者血液中单个核细胞中ACAT1、PPARα基因mRNA表达减少,而ABCA1、TIMP-1、5-LO基因mRNA表达增加。
进一步，ABCA1、ACAT1、TIMP-1三个基因联合组成的谱特异性和灵敏度均与影像学诊断的结果一致。
本发明所述特异性DNA甲基化谱在动脉粥样硬化性疾病早期诊断过程中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明筛选ACAT1、ABCA1、PPARα、TIMP-1和5-LO作为建立动脉粥样硬化早期诊断的候选基因。
2、本发明建立了由TIMP-1、ACAT1、ABCA1这三个基因组成了AS特异性的DNA甲基化谱。
3、本发明的由TIMP-1、ACAT1、ABCA1这三个基因组成了AS特异性的DNA甲基化谱敏感度和特异度与影像学诊断的结果高度吻合。
4、本发明的方法取材来自血液，患者普遍容易接受，简单易行，容易推广。
附图说明
图1动脉粥样硬化患者和正常对照组血脂水平。TG，甘油三脂；TC，胆固醇；HDL，高密度脂蛋白；LDL，低密度脂蛋白；与对照组比较，**P<0.01，*P<0.05；
图2为MMP9、5-LO、ICAM-1、ACAT1、LRP1及PDGF-β启动子区CpG Island Searcher在线预测各基因启动子区CpG岛；
图3为PPAR-α、NFkappaB、ABCA1、TIMP-1、VEGF和LCAT启动子区CpG IslandSearcher在线预测各基因启动子区CpG岛；
图4基因组DNA电泳图。Marker，DNA分子量标准；DNA，基因组DNA；
图5为ACAT1、TIMP-1、ABCA1、5-LO、PPAR-α和VEGF启动子区甲基化电泳图。
图6为ICAM-1、MMP9、LRP1、PDGF-β、LCAT和NFkappaB启动子区甲基化电泳图。
图7为ACAT1、TIMP-1、ABCA1、5-LO、PPAR-α和VEGF启动子区甲基化统计图。M：甲基化，U：非甲基化。与对照组比较，**P<0.01，*P<0.05。
图8为ICAM-1、MMP9、LRP1、PDGF-β、LCAT和NFkappaB启动子区甲基化统计图。M：甲基化，U：非甲基化。与对照组比较，**P<0.01，*P<0.05。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1材料
1.1主要试剂
AxyPrep血基因组DNA制备试剂盒、AxyPrep血RNA小量制备试剂盒是美国Axygen公司产品；DNA修饰试剂盒(EZ DNA Methylation-Gold Kit)是美国Zymo公司产品；逆转录试剂盒、2×EcoTaq PCR SuperMix购自北京全式金公司；MaximaTMSYBR Green/ROX qPCRMaster Mix购自美国Fermentas公司。
1.2主要仪器
PCR仪、核酸分析仪、凝胶成像系统购自百乐公司，低温冰箱购自三洋公司，ADVIA-2400型全自动生化分析仪购自德国SIEMENS公司，高速低温离心机购自德国Heraeus公司。
2方法
2.1临床标本的选择
选择2011.5月至2013.9月在宁夏医科大学总医院心内科就诊者和体检者，以年龄30-60岁人群为研究对象，所有研究对象在抽血前回答流行病学调查问卷，所有标本取材前均通过宁夏医科大学总医院伦理委员会审核，家属知情同意。入选者在空腹状态下抽取10ml静脉血，其中5.0ml静脉血，经3000r/min，4℃，离心10min，取上清，当日用全自动生化分析仪检测临床生化指标：甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白；另外5.0ml的EDTA抗凝血，用于DNA和RNA的提取。
AS组：根据入选者的临床症状和血脂指标，并经颈动脉多普勒超声确诊为动脉粥样硬化患者200例。对照组：选取200例无既往动脉粥样硬化史，无临床症状，血脂正常，且经颈动脉超声证实无粥样硬化斑块的正常检者，年龄、性别与AS组匹配。排除标准：上述两组中均排除以下患者：两周内接受过降脂药物治疗者或其他服用有可能对本次研究有潜在影响的药物者；孕妇及哺乳期妇女；恶性肿瘤、严重肝肾功能不全者、感染性疾病和其他等可能对研究有潜在影响的疾病。
2.2基因的筛选
在NCBI和OMIM内输入关键词动脉粥样硬化，再结合文献报道，筛选和AS相关的基因约118个，然后在UCSC(http://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)寻找这些基因启动子区序列，经CpG Island Searcher(http://cpgislands.usc.edu/)在线预测各基因的启动子区CPG岛情况；再根据各基因的主要表达场所，排除不在血液循环中表达的基因；再根据基因的功能筛选出和AS发生发展密切相关的基因。
2.3血脂水平的测定
将分离好的血清用ADVIA-2400型全自动生化分析仪检测两组的血脂水平：胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白。其中，血清TC和TG的检测运用终点法，HDL采用选择性遮蔽法检测，LDL的检测则采用直接清除法检测。
2.4巢式降落式甲基化PCR(ntMS-PCR)检测基因启动子区DNA甲基化
甲基化特异性PCR(MSP)法的原理是重亚硫酸盐可以使CpG位点中未甲基化的胞嘧啶(C)经脱氨基作用转化为尿嘧啶(U)，甲基化的胞嘧啶不变，是一种基于亚硫酸氢化修饰基础上的甲基化检测方法，用特殊设计的DNA序列的引物可以区分甲基化片段和未甲基化片段。巢式降落式甲基化特异性PCR(nested touchdown methylation-spciic PCR，ntMS-PCR)，是针对经亚硫酸氢钠修饰后的DNA序列设计一对非特异的外引物，即是巢氏，该引物避开CG二核苷酸，既能与DNA的甲基化片段结合，也能与非甲基化片段结合。操作时首先用外引物对修饰后的DNA样本进行扩增，然后再用第一轮PCR产物作为模板加入特异性的甲基化和非甲基化引物继续第二轮扩增。降落PCR(TD-PCR)的方法，是在PCR扩增开始时先在Tm值允许范围内选择高于Tm值的退火温度，每个循环都依次降低温度，最终使退火温度低于非特异性杂交的Tm值，此时扩增目的片段的数量已占绝对优势，可对非特异性扩增产生竞争性抑制，从而提高PCR的特异性和效率。
2.4.1外周血DNA提取及质量鉴定
按照试剂盒说明书提取外周血DNA，取出DNA溶液5μL，与1μL电泳加样缓冲液混匀后加入到1％琼脂糖凝胶加样孔中，电泳25min在紫外凝胶成像分析仪中观察。按照1:10比例用TE缓冲液稀释待测的DNA样品，用TE溶液调零(紫外分光光度计波长260nm处)，调零后分别测定各个DNA样品在260nm处的OD值。DNA样品纯度判断依据OD260/OD280，OD260/OD280是指DNA在260nm和280nm的OD值的比值，用于判断DNA样品纯度。
OD260/OD280为1.8-2.0之间的DNA溶液可用于后续实验。DNA样品浓度计算公式如下：
DNA＝10×OD260×稀释倍数(μg/mL)。
2.4.2基因组DNA的甲基化处理
按照试剂盒说明书对基因组DNA进行甲基化处理。先将130μL CT转换试剂加入PCR管，再加入20μL DNA溶液，将样品管放入热循环仪(PCR仪)上，98℃10min，64℃2.5h；加入600μL M-Binding Buffer到Zymo-spin旋转柱中混匀，12000g，离心30s，弃上清；加100μLM-Wash Buffer离心30s；加200μL M-Desulphonation Buffer室温放置15-20min后，12000g，离心30s；重复该步骤1-2次；将旋转柱放到另一个新的1.5mL的离心管中，直接加10μL M-Elution Buffer到柱中，12000g离心，30s，洗脱DNA-20℃保存备用。
2.4.3 ntMS-PCR检测DNA甲基化
在UCSC(http://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)网站中寻找基因启动子区序列，使用在线甲基化引物设计软件(htty://www.urogene.org/methprimer)，设计各基因的引物，每个基因共设计三对引物，分别设计一对外引物和两对内引物，即甲基化引物和非甲基化引物。向反应体系中依次加入：Mix 12.5μL，Up引物1μL，DNA模板4μL，去离子水6.5μL，总体积25μL。扩增条件：外引物：95℃预变性5min；95℃30s，72℃30s，每个循环降0.5℃，循环20次；再以恒定的退火温度下进行94℃变性30s，56℃30s，72℃30s，20次循环；最后72℃继续延伸7min。将外引物扩增的产物加入到第二轮扩增中为模板进行继续扩增，本试验中直接取外引物PCR产物2μL做模板进行第二轮扩增。第二轮内引物扩增反应条件：95℃预变性5min；然后采用降落式PCR程序，95℃30s，64℃30s，72℃30s，每个循环降0.5℃，20次循环；再于恒定的退火温度下进行94℃，30s，56℃，30s，72℃，30s，共20次循环；72℃再延伸7min。取5μL PCR扩增产物，在2％琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像仪紫外线照像分析各个条带的光密度值(OD值)，按如下公式计算结果：甲基化％＝甲基化(OD值)/[甲基化(OD值)+非甲基化(OD值)]。
2.5荧光Real-Time PCR法测mRNA的表达
2.5.1外周血RNA提取
按照RNA提取试剂盒说明书提取外周血单个核细胞的RNA。取200-400μl抗凝血与1-2ml Buffer RL充分混匀后在冰上孵育10-15min，在这期间涡旋混匀两次，直至悬液透明，然后4℃，3000g,离心5min，弃上清，留下离心管底部的细胞团块；加入0.5-1ml BufferRL，轻轻振荡使白细胞重悬，冰上孵育5min；4℃，3000g，离心5min，弃上清；再向沉淀中加400μl Buffer R-I，涡旋震荡15-30s充分混匀；加入200μl Buffer R-II，涡旋混匀后4℃，12000g，离心10min；将上清转移到另一2ml离心管内，加入250μl异丙醇，颠倒混匀后转移到吸附柱内，6000g，4℃，离心1min，弃滤液；再加700μl Buffer W1A到吸附柱内，12000g离心，1min，弃滤液；加入700μl Buffer W2，12000g离心，1min，取Buffer TE 80μl加入到吸附柱内，室温下静置1min，12000g离心，1min，洗脱RNA，为避免RNA降解，-80℃保存待用。
2.5.2逆转录成cDNA
在经DEPC处理的PCR管中依次加入总RNA5μL，OligodT(0.5μg/μL)1μL，2×TSReaction Mix 10μL，TransScript RT/RI Enazyme Mix 1μL，最后加入去离子水补足至总体积20μL，放于-80℃保存。
2.5.3 PCR扩增
在Genbank中寻找各基因序列，使用primer5.0设计引物，反应体系：SYBR GreenqPCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，DEPC水8.5μL，cDNA模板2μL，终体积为25μL。反应条件：94℃预变性3min；94℃45s，根据各个基因的引物的Tm，按照每个引物的Tm值温度退火45s，72℃延伸45s，扩增40个循环。
2.5.4结果计算
实验结果的计算按照如下公式：检测目的基因的相对表达量＝2－△△Ct，其中，ΔΔCt＝[CtGI(检测样品)-CtGAPDH(检测样品)]-[CtGI(校正样本)–CtGAPDH(校正样本)]。GI是指所测目的基因，Ct是指检测到的反应体系中荧光信号强度，校正样本指的是所有被选做能够代表1倍所测目的基因表达量的样本。应用这一方法能直接获得目的基因相对于管家基因的定量结果。
3.统计学处理
数据以均数±标准差表示。两样本均数间比较采用两样本独立t检验，应用ROC曲线分析多个基因甲基化改变，颈动脉多普勒超声相比诊断AS的特异性、敏感性等指标进行评价。以P<0.05为差异有显著性。灵敏性是指实际有病者按照某种诊断方法被正确地诊断为有病的概率，又被称为真阳性率。特异性是指实际上没病者根据某个诊断方法被正确地诊断为无病的概率，又称真阴性率。
4结果
4.1对照组和AS组的血脂水平
全自动生化仪分别检测入选的400例样本，对照组和AS组血脂水平变化可见AS组中甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白含量与对照相比，AS患者甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白含量分别升高了2.4倍、1.1倍和1.3倍，差异具有显著性(P<0.05)；而与对照组相比，HDL浓度降低，差异具有显著性(P<0.05)(见图1)。
4.2 AS相关基因的初步筛选
在NCBI和OMIM内输入关键词动脉粥样硬化，再结合文献报道，筛选和AS发生发展相关的基因约118个，然后在UCSC(http://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)在线寻找这些基因启动子区序列，CpG Island Searcher(http://cpgislands.usc.edu/)在线预测启动子区CpG岛，并选择和AS密切相关，初步确定候选基因12个(ABCA1，ACAT1，PPARα，PDGFβ，5-LO，LRP1，LCAT，TIMP-1，MMP-9，ICAM-1，VEGF and NFκB)(见图2，图3)。
4.3基因组DNA质量
将提取的DNA加入至1％的琼脂糖凝胶中电泳30min后，关闭电源取出凝胶，紫外凝胶成像分析仪下拍照，得到理想的DNA条带(图4)，用核酸分析仪检测DNA浓度，测量三次后取均值，浓度在1.78×103g/mL左右；OD260/OD280均在1.81左右，介于1.7～1.9之间，DNA可用于后续实验。
4.4 DNA甲基化水平显著改变的动脉粥样硬化相关基因
采用ntMS-PCR分别检测ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)、胆固醇酰基转移酶(ACAT1)、氧化物酶体增殖物激活受体(PPARα)、5-脂氧合酶(5-LO)、基质金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP-1)、低密度脂蛋白受体蛋白1(LRP1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血小板源性生长因子β(PDGFβ)、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、卵磷脂胆固醇酯酰转移酶(LCAT)和核转录因子(NFκB)的启动子区DNA甲基化水平。对照组和AS组各个基因均能够扩增出DNA甲基化特异性PCR产物和非甲基化特异性PCR产物，目的条带单一，无非特异性条带(见图5、图6)。在AS患者外周血中ACAT1(P<0.01)、ABCA1(P<0.01)、PPARα(P<0.05)、TIMP-1(P<0.01)和5-LO(P<0.05)的甲基化水平变化十分明显，与对照组相比具有统计学差异；而PDGFβ、LRP1、LCAT、TIMP-1、MMP-9、ICAM-1、VEGF和NFκB基因的DNA甲基化水平在两组间差异没有显著性(P>0.05)(见图7、图8)。表明ACAT1、ABCA1、PPARα、TIMP-1和5-LO基因的甲基化改变可能参与疾病的发生发展，提示ACAT1、ABCA1、PPARα、TIMP-1和5-LO基因可能是建立AS特异性DNA甲基化谱的候选基因。
4.5建谱基因的mRNA的表达
用real-time PCR检测ACAT1、ABCA1、PPARα、TIMP-1和5-LO在对照组和AS组中mRNA表达。与对照组相比，AS组中TIMP-1、ABCA1的启动子区DNA甲基化升高，而其mRNA的表达水平明显下降；和对照组相比，AS组中ACAT1、5-LO和PPARα的甲基化水平降低，而mRNA的表达量则明显升高(表1)。结果证实了，DNA甲基化降低可以导致基因的mRNA表达升高；相反，甲基化升高则可使其mRNA的表达减少，说明基因表达符合甲基化调控的规律，这在基因的表达调控中起着重要的作用。
表1 DNA甲基化谱相关基因的mRNA表达
与对照组比较，**P<0.01，*P<0.05。
4.6特异性DNA甲基化谱的建立
根据不同组中基因甲基化频率的改变，我们将甲基化程度明显变化的ACAT1、ABCA1、PPARα、TIMP-1和5-LO作为候选基因。对照组和AS组中ACAT1、ABCA1、PPARα、TIMP-1和5-LO五个基因DNA甲基化对AS诊断的敏感性和特异性分析发现，TIMP-1、ACAT1、ABCA1、5-LO和PPARα诊断的特异度分别为84％、84％、78％、60％、72％，敏感度依次为78％、68％、62％、48％、44％，其中TIMP-1、ACAT1、ABCA1在对照组和AS组的差异P<0.01，5-LO和PPARα两个基因P<0.05(表2)。
表2各基因在对照组和AS组的特异度和灵敏度
AUC：曲线下面积；PPV：阳性预测值；NPV：阴性预测值
TIMP-1、ACAT1、ABCA1诊断的敏感性和特异性相对较好，在多种候选基因中优化选择TIMP-1、ACAT1、ABCA1这3个相关程度高的基因，可以做到在检测较少指标的同时保持标志物的敏感性和特异性。将三个选定的基因TIMP-1、ACAT1、ABCA1的联合使用，其中，ACAT1+TIMP-1、ABCA1+TIMP-1、ACAT1+ABCA1两两组合诊断AS的特异度为78％、94％、74％，敏感度分别为82％、76％、76％。联合检测TIMP-1、ACAT1、ABCA1的特异度和敏感度达到了90％和88％(表3)。
表3多基因对AS的诊断效果
4.7特异性DNA甲基谱诊断AS的可靠性分析
为了验证TIMP-1、ACAT1和ABCA1甲基化谱的诊断效果，另外选取400例样本(AS患者200例，正常人200例)进行TIMP-1、ACAT1、ABCA1三个基因的甲基化改变与颈动脉多普勒超声相比，并根据我们制定的用基因DNA甲基化谱(TIMP-1、ACAT1和ABCA1)检测AS结果的标准，联合检测的200例AS患者中阳性176例，阴性24例；检测200例正常者假阳性60例，阴性140例，统计分析后，诊断的灵敏度88％，特异度70％。
5结论
ACAT1、PPARα、TIMP-1、ABCA1、5-LO基因启动子区DNA甲基化是AS早期的、频发的事件，由TIMP-1、ACAT1、ABCA1构成的AS特异性DNA甲基化谱对AS的诊断特异性和灵敏性均较高，DNA甲基化谱评估和诊断AS是可靠的。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 宁夏医科大学
<120> 一种特异性DNA甲基化谱其建立方法及应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 116
<212> DNA
<213> 人工序列
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tgccaggtag cctctgtttg aatcccggcc atgccctgtg atcttaggaa aattctacag 60
ttcctctacg ccccatattt cctcatccgt aaaacgggaa taagaaccgg taccca 116
<210> 2
<211> 128
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agcctctggg caacatggtg aaaacccgtc tctactaaaa tacaaaagat tagccaggct 60
tggcagcgtg cgcctgtaat cccagctact cgtgaggctg aggcgaactc aggaggcaga 120
ggttgcag 128
<210> 3
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaattccact ggtgcccttg gctgccggga acgtggacta gagagtctgc ggcgcagccc 60
cgagcccagc gcttcccgcg cgtcttaggc cggcgggccc gggcggggga aggggacgca 120
gaccgcggac cctaagacac c 141

Claims (6)

1.一种特异性DNA甲基化谱，其特征在于，包括TIMP-1、ACAT1、ABCA1三个基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。
2.一种特异性DNA甲基化谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)筛选与动脉粥样硬化相关的候选基因；
(2)筛选动脉粥样硬化患者和与之匹配的正常人的血液标本,检测血脂水平并提取血液中单个核细胞的DNA,确定DNA的纯度和浓度；
(3)将提取的DNA进行重亚硫酸盐修饰,用巢氏降落式甲基化特异性PCR检测ABCA1、ACAT1、PPARα、PDGFβ、5-LO、LRP1、LCAT、TIMP-1、MMP-9、ICAM-1、VEGF、NFκB 12个基因的启动子区CpG岛甲基化的改变；
(4)提取血液中单个核细胞的RNA并将其逆转录成cDNA,荧光Real-Time PCR法测血液单个核细胞中ABCA1、ACAT1、PPARα、5-LO、TIMP-1基因mRNA的表达；
(5)建立由ABCA1、ACAT1、TIMP-1三基因组成的动脉粥样硬化特异性DNA甲基化谱；
(6)分析比较多个基因甲基化改变与颈动脉多普勒超声相比诊断动脉粥样硬化的特异性、敏感性等指标并进行评价。
3.根据权利要求2所述的特异性DNA甲基化谱的建立方法，其特征在于，动脉粥样硬化患者血液中单个核细胞中ACAT1、PPARα基因DNA启动区甲基化程度降低，而ABCA1、TIMP-1、5-LO基因DNA启动子区甲基化程度升高。
4.根据权利要求2所述的特异性DNA甲基化谱的建立方法，其特征在于，动脉粥样硬化患者血液中单个核细胞中ACAT1、PPARα基因mRNA表达减少，而ABCA1、TIMP-1、5-LO基因mRNA表达增加。
5.根据权利要求2所述的特异性DNA甲基化谱的建立方法，其特征在于，ABCA1、ACAT1、TIMP-1三个基因联合组成的谱特异性和灵敏度均与影像学诊断的结果一致。
6.权利要求1所述特异性DNA甲基化谱在动脉粥样硬化性疾病早期诊断过程中的应用。
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