CN106701646B - 一株四环素降解菌及其在畜禽粪便堆肥化处理中的应用 - Google Patents

一株四环素降解菌及其在畜禽粪便堆肥化处理中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及养殖废弃物处理领域，具体而言，涉及一株四环素降解菌及其在畜禽粪便堆肥化处理中的应用。该蜡样芽孢杆菌可用于四环素降解，通过外部扩繁培养获得菌体数量为1.0×109～10CFU/mL的降解菌菌液，按照一定比例的固液比将菌液用于畜禽粪便堆肥化处理中，可有效降解其中的四环素残留物，有利于降低甚至消除畜禽粪便堆肥产品施用于土壤后的生态风险。

Description

一株四环素降解菌及其在畜禽粪便堆肥化处理中的应用
技术领域
本发明涉及养殖废弃物处理领域，具体而言，涉及一株四环素降解菌，经鉴定为蜡样芽孢杆菌，及其在畜禽粪便堆肥化处理中的应用。
背景技术
四环素类抗生素在我国兽药抗生素中生产和使用比例均高于其他兽药抗生素，但其中30～90％的四环素类抗生素不能被动物完全吸收，将以原型或母体化合物的形式排出体外，在畜禽粪便中产生大量残留。畜禽粪便应用过程中，残留的兽药抗生素可通过土壤的吸附、迀移、降解和植物吸收，以各种途径进入到环境介质如土壤、水体及大气中；也可在食物链累积迀移，最终通过摄食进入人体，构成对人类健康的潜在危害。基于上述生态安全威胁，有关畜禽粪便中残留四环素类抗生素的降解及消除方法与途径越来越受到人们的重视，已成为当前研究的重点和热点。
四环素是四环素类抗生素的主要种类之一，目前已有多篇文章和专利报道了对其进行降解的方法，主要包括光电催化、理物-化学氧化、水解、矿物降解和微生物降解等方法。其中，微生物降解因其条件简单、容易控制、专一性较强且不会引起二次污染的特点成为四环素主要降解途径，也是最经济有效的方法。微生物降解的主要功能物为降解微生物，在与抗生素的交互作用中，降解微生物可通过各类生物酶的作用将抗生素降解转化为能源物质或对自身无毒害作用的其他代谢产物，从而降低甚至消除抗生素的生态风险。因此，筛选到合适的高效的降解菌株显得尤为重要，微生物降解是一种很有潜力的处理有机污染物的方法，在工业生产的各个方面具有很高的推广价值。目前报道的四环素降解微生物种类仍然较少，亟需补充新的菌种资源，且现有菌种的应用方法略显单一，降解效率难再提高。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一株四环素降解细菌，该菌的四环素降解功能此前未见报道；进一步将该降解菌与堆肥化处理相结合应用于畜禽粪便处理中，完善优化堆肥化处理工艺和条件，可显著提高四环素降解效率，最终减少甚至消除堆肥产品四环素残留。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一株四环素降解菌，所述四环素降解菌经鉴定为蜡样芽孢杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.13546；保藏时间为：2017年01月09日。
筛选该菌的样品为新鲜鸡粪，培养于以四环素作为唯一碳源的培养基中，培养条件为30℃，170r/min摇床培养，通过多次转接和耐受驯化，最终获得能以四环素作为唯一碳源生长的降解菌菌液，应用连续梯度稀释涂布的方法，吸取0.1mL降解菌菌液涂布于LB平板上，置于微生物培养箱中培养48h，培养温度为30℃，获得降解菌单菌落并进行划线纯化。经生理生化及16S rRNA基因测序鉴定，本发明所述四环素降解菌为蜡样芽孢杆菌，拉丁学名为Bacillus cereus，菌株名为TC-1，该菌是一种好氧、中温和产芽孢的革兰氏阳性杆菌，具有很强的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等活性，能产生抗菌素，目前已有大量研究报道了该菌在降解环境污染物如有机磷农药、苯酚和芘污染物上的作用及对重金属镉、铬和铅等的强耐受性。
有关所述降解菌在四环素降解方面的研究未见报道。目前报道的四环素降解菌主要包括缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)和人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)、无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)和酵母菌Trichosporonmycotoxinivorans等。本发明筛选获得的蜡样芽孢杆菌TC-1能以四环素作为唯一碳源生长，具有降解性能，有利于丰富四环素降解菌资源库，为四环素污染的治理提供有效的生物降解方法。
上述的经过分离纯化的蜡样芽孢杆菌，其为革兰氏阳性细菌，菌落大，表面粗糙，扁平，不规则。菌体细胞杆状，(1.0～1.2)×(3.0～5.0)微米。产芽孢，芽孢圆形或柱形，中生或近中生，1.0～1.5微米，无荚膜，运动。
平板菌落形态：在普通琼脂平板培养基上，30℃，培养24h，可形成圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落(似蜡烛样颜色)直径5-7mm。在LB平板上菌落为灰白色，不透明，表面较粗糙，似毛玻璃状或融蜡状，菌落较大。
含有所述的蜡样芽孢杆菌的菌剂也属于本申请要求保护的范围。对于该菌株而言，是只要能够加入到含有四环素的有机物中即可发挥净化的效果。然而在实际应用的过程中，考虑到其可能需要运输及分解效率等原因，有必要将其扩大培养制成微生物菌剂的形式以扩大其应用范围。
含有上述四环素降解菌的微生物菌剂，优选的，所述微生物菌剂为液体菌剂，且在该液体菌剂中，活菌的数量是1×109-10CFU/mL。
该液体菌剂中，培养液可优选为LB液体培养基、或者进一步添加葡萄糖、硫胺素、生物素和烟酸等营养物。
本发明基于上述的液体微生物菌剂提供了一种制备方法，包括以下步骤：
将如上所述四环素降解菌的菌种接种于LB液体培养基中进行培养，得到培养液；
将所述培养液中的细菌培养物离心后用无菌水重悬，得到液体菌剂。
优选的，所述培养的培养条件为：
28℃～32℃，150r/min～190r/min摇床培养10h～16h后转接至新鲜LB培养基中，摇床培养60h～80h，获得所述培养液。
如上所述的四环素降解菌或如上所述的微生物菌剂在畜禽粪便堆肥化处理中的应用。
一种畜禽粪便堆肥化处理的方法，将如上所述的微生物菌剂加入堆肥原料中进行堆肥化处理；所述堆肥原料包括畜禽粪便、蘑菇渣和米糠。
优选的，所述畜禽粪便包括鸡粪、猪粪、牛粪、羊粪、鸭粪等；最优选采用鸡粪和猪粪；
优选的，将鸡粪或猪粪、蘑菇渣和米糠按照比例(3～7)：(2～6)：1，更优选5：4：1混合使用；
优选的，如上所述的方法，加入所述微生物菌剂后，所述堆肥原料的水分含量控制在55wt％～60wt％得到堆体，所述微生物菌剂中的四环素降解菌在所述堆体中的初始含量为1.0×108～9CFU/g。
优选的，如上所述的方法，所述堆肥化处理在密闭式堆肥反应器中进行，每隔2～3d翻堆一次所述堆体，正压鼓风，堆体维持高温55～65℃达5～8d，降温至45℃以下后干燥所述堆体水分含量至30wt％～40wt％。
优选的，如上所述的方法，所述堆肥化处理在槽式堆肥工艺条件下进行，供氧方式采用翻堆和曝气两种方式相结合。
优选的，如上所述的方法，所述堆肥化处理具体包括：
调整所述堆肥原料的混合比例使所述堆体的碳氮比为28～32：1，将混合均匀的堆体推入堆肥槽进行堆肥化处理，堆肥化过程维持26～30d后将堆体移出堆肥槽，干燥所述堆体水分含量至30wt％～40wt％；
或；
调整所述堆肥原料的混合比例使所述堆体的碳氮比为28～32：1，将混合均匀的堆体推入堆肥槽进行堆肥化处理，堆肥化过程维持19～23d后再次在堆体中添加所述菌剂并调节堆体含水量至55wt％～60wt％，继续处理5～9d后移出堆肥槽，干燥所述堆体水分含量至30wt％～40wt％。
为提高堆肥化处理效率，在原料混合物期间即接种降解菌，可有效降解堆体有机残体，释放养分，加快腐熟。在堆肥化处理高温期结束时，再次接种降解菌，保障对未完全降解的残留四环素的降解效率，减少甚至消除鸡粪或猪粪堆肥化处理产品中的残留四环素含量。制成的堆肥产品堆肥化处理周期短、腐熟度好、四环素残留显著减少，应用于土壤中可改善土壤团粒结构和作物根部环境，增强根系对养分的吸收，从而达到省时、高效、安全的效果。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
提供了一株可应用于降解四环素类抗生素的菌株，该菌株具有较为宽泛的生长条件，可有效地实现消除残留四环素类抗生素的危害的目的，为生物降解四环素类抗生素提供了一种新的途径。
本申请提供的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，菌株名为TC-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏时间为：2017年01月09日，保藏编号CGMCC NO.13546。经保藏中心于2017年01月09日检测为存活菌株。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
本发明处理目标物为新鲜鸡粪，堆肥化处理添加的有机物料为蘑菇渣和米糠，所用鸡粪中四环素初始含量为60mg/Kg。四环素降解菌发酵液中的降解菌数量为1.0×109CFU/mL。
堆肥化处理过程在密闭式堆肥反应器(VTD-100)中进行，具体步骤和工艺条件如下：
(1)将水分含量为80％的鸡粪125kg、含水率为15％的蘑菇渣100kg、含水率为8％的米糠25kg用搅拌机混合均匀，此时混合堆料的水分含量约46％左右；分成2份，每份为125kg。
(2)其中一份添加上述四环素降解菌发酵液8L，与堆料进一步混合均匀后装入堆肥反应器(VTD-100)，每箱装堆料44kg，共装3箱。
(3)另外一份作对照，添加清水8L，与堆料进一步混合均匀，然后装入堆肥反应器(VTD-100)，同样每箱装堆料44kg，共装3箱。
(4)堆肥反应器按相同的反应条件进行堆肥化试验：每隔2-3d翻堆一次堆体，正压鼓风，堆体维持高温55～65℃达5d以上，降温至45℃以下后干燥所述堆体水分含量至30wt％～40wt％。堆肥化处理进行28d。
堆肥化处理结束时，取样分析其中四环素残留量，结果见表1。本发明的应用方法堆肥产品中四环素残留量显著低于对照，对四环素的降解率达98.8％，而对照堆肥处理的降解率为80.6％。
表1四环素降解菌在鸡粪堆肥化处理中的应用结果
实施例2
本发明处理目标物为新鲜猪粪，堆肥化处理添加的有机物料为蘑菇渣和米糠，所用猪粪中四环素初始含量为78mg/Kg。四环素降解菌发酵液中的降解菌数量为1.0×109CFU/mL。
堆肥化处理过程在密闭式堆肥反应器(VTD-100)中进行，具体步骤和工艺条件如下：
(1)将水分含量为78％的猪粪125kg、含水率为15％的蘑菇渣100kg、含水率为8％的米糠25kg用搅拌机混合均匀，此时混合堆料的水分含量约46％左右；分成2份，每份为125kg。
(2)其中一份添加上述四环素降解菌发酵液8L，与堆料进一步混合均匀后装入堆肥反应器(VTD-100)，每箱装堆料44kg，共装3箱。
(3)另外一份作对照，添加清水8L，与堆料进一步混合均匀，然后装入堆肥反应器(VTD-100)，同样每箱装堆料44kg，共装3箱。
(4)堆肥反应器按相同的反应条件进行堆肥化试验：每隔2-3d翻堆一次堆体，正压鼓风，堆体维持高温55～65℃达5d以上，降温至45℃以下后干燥所述堆体水分含量至30wt％～40wt％。堆肥化处理进行28d。
(5)堆肥化处理结束时，取样分析其中四环素残留量，结果见表2。本发明的应用方法堆肥产品中四环素残留量显著低于对照，对四环素的降解率达97.9％，而对照堆肥处理的降解率为82.4％。
表2四环素降解菌在猪粪堆肥化处理中的应用结果
实施例3
本发明处理目标物为新鲜鸡粪，堆肥化处理添加的有机物料为蘑菇渣和米糠，所用鸡粪中四环素初始含量为60mg/Kg。四环素降解菌发酵液中的降解菌数量为1.0×109CFU/mL。
堆肥化处理过程采用槽式堆肥工艺进行，该工艺的供氧方式采用翻堆和曝气两种方式相结合。
以不添加四环素降解菌的常规堆肥为对照，按常规调整堆料的混合比例，使堆料C/N为30：1，含水率为55％左右。按1000kg堆料再添加清水50kg，进一步混合均匀，混合均匀的物料推入堆肥槽进行堆肥化处理。第28d将堆料移出堆肥槽，取样检测四环素残留量：12.32mg/Kg，降解率为79.5％。
同样按常规调整堆料的混合比例，使堆料C/N为30：1，含水率为55％左右。按1000kg堆料添加本发明的四环素降解菌发酵液50L，进一步混合均匀。混合均匀的物料推入堆肥槽进行堆肥化处理。按与对照相同的堆肥工艺参数进行。至第28d将堆料移出堆肥槽，取样检测四环素残留量结果：1.45mg/Kg，降解率达97.6％。
表3四环素降解菌在鸡粪堆肥化处理中的应用结果
实施例4
本发明处理目标物为新鲜猪粪，堆肥化处理添加的有机物料为蘑菇渣和米糠，所用猪粪中四环素初始含量为78mg/Kg。四环素降解菌发酵液中的降解菌数量为1.0×109CFU/mL。
堆肥化处理过程采用槽式堆肥工艺进行，该工艺的供氧方式采用翻堆和曝气两种方式相结合。
以不添加四环素降解菌的常规堆肥为对照，按常规调整堆料的混合比例，使堆料C/N为30：1，含水率为55％左右。按1000kg堆料再添加清水50kg，进一步混合均匀，混合均匀的物料推入堆肥槽进行堆肥化处理。第28d将堆料移出堆肥槽，取样检测四环素残留量：11.26mg/Kg，降解率为85.6％。
同样按常规调整堆料的混合比例，使堆料C/N为30：1，含水率为55％左右。按1000kg堆料添加本发明的四环素降解菌发酵液50L，进一步混合均匀。混合均匀的物料推入堆肥槽进行堆肥化处理。按与对照相同的堆肥工艺参数进行。至第28d将堆料移出堆肥槽，取样检测四环素残留量结果：0.83mg/Kg，降解率达98.9％。
表4四环素降解菌在猪粪堆肥化处理中的应用结果
实施例5
本发明处理目标物为新鲜鸡粪，堆肥化处理添加的有机物料为蘑菇渣和米糠，所用猪粪中四环素初始含量为60mg/Kg。四环素降解菌发酵液中的降解菌数量为1.0×109CFU/mL。
堆肥化处理过程采用槽式堆肥工艺进行，该工艺的供氧方式采用翻堆和曝气两种方式相结合。
开始试验前，以不添加四环素降解菌的常规堆肥为对照，按常规调整堆料的混合比例，使堆料C/N为30：1，含水率为55％左右。按1000kg堆料再添加清水50kg，进一步混合均匀，混合均匀的物料推入堆肥槽进行堆肥化处理。第28d将堆料移出堆肥槽，取样检测四环素残留量：12.30mg/Kg，降解率为79.5％。
同样按常规调整堆料的混合比例，使堆料C/N为30：1，含水率为55％左右。按1000kg堆料添加本发明的四环素降解菌发酵液50L，进一步混合均匀。混合均匀的物料推入堆肥槽进行堆肥化处理。按与对照相同的堆肥工艺参数进行。至第21d时，再次添加四环素降解菌发酵液10L，混合均匀继续处理7d后移出堆肥槽，取样检测四环素残留量结果：0.085mg/Kg，降解率达99.9％。
表5四环素降解菌在鸡粪堆肥化处理中的应用结果
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (11)

1.一株四环素降解菌，其特征在于，所述四环素降解菌经鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.13546；保藏时间为：2017年01月09日。
2.含有权利要求1所述的四环素降解菌的微生物菌剂。
3.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为液体菌剂，且在该液体菌剂中，活菌的数量是1×109-10CFU/mL。
4.一种如权利要求2或3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1所述四环素降解菌的菌种接种于LB液体培养基中进行培养，得到培养液；
将所述培养液中的细菌培养物离心后用无菌水重悬，得到液体菌剂。
5.如权利要求4所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述培养的培养条件为：
28℃～32℃，150r/min～190r/min摇床培养10h～16h后转接至新鲜LB培养基中，摇床培养60h～80h，获得所述培养液。
6.权利要求1所述的四环素降解菌或权利要求2或3所述的微生物菌剂在畜禽粪便堆肥化处理中的应用。
7.一种畜禽粪便堆肥化处理的方法，其特征在于，将权利要求2或3所述的微生物菌剂加入堆肥原料中进行堆肥化处理；所述堆肥原料包括畜禽粪便、蘑菇渣和米糠。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，加入所述微生物菌剂后，所述堆肥原料的水分含量控制在55wt％～60wt％得到堆体，所述微生物菌剂中的四环素降解菌在所述堆体中的初始含量为1.0×108～9CFU/g。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述堆肥化处理在密闭式堆肥反应器中进行，每隔2～3d翻堆一次所述堆体，正压鼓风，堆体维持高温55～65℃达5～8d，降温至45℃以下后干燥所述堆体水分含量至30wt％～40wt％。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述堆肥化处理在槽式堆肥工艺条件下进行，供氧方式采用翻堆和曝气两种方式相结合。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述堆肥化处理具体包括：
调整所述堆肥原料的混合比例使所述堆体的碳氮比为28～32：1，将混合均匀的堆体推入堆肥槽进行堆肥化处理，堆肥化过程维持26～30d后将堆体移出堆肥槽，干燥所述堆体水分含量至30wt％～40wt％；
或；
调整所述堆肥原料的混合比例使所述堆体的碳氮比为28～32：1，将混合均匀的堆体推入堆肥槽进行堆肥化处理，堆肥化过程维持19～23d后，再次在堆体中添加所述菌剂并调节堆料含水量至55wt％～60wt％，继续处理5～9d后移出堆肥槽，干燥所述堆体水分含量至30wt％～40wt％。
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