CN106674224A - mPEG4‑阿巴卡韦及其制备方法和应用 - Google Patents

mPEG4‑阿巴卡韦及其制备方法和应用 Download PDF

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王菁
梁兰
李姣
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    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/02—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6
    • C07D473/16—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 two nitrogen atoms

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Abstract

本发明属于医药化工领域，具体涉及mPEG4‑阿巴卡韦及其制备方法和应用。本发明提供了一种新的化合物，以阿巴卡韦和四甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯为原料制备得到mPEG4‑阿巴卡韦，该化合物细胞的毒性较小，能有效的抑制艾滋病病毒感染引起的细胞病变。本发明的新的化合物能应用在制备抗艾滋病的药物中，具有良好的应用开发前景，该化合物的开发，将为艾滋病患者带来福音。

Description

mPEG4-阿巴卡韦及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药化工领域，涉及一种新的化合物及其制备方法和应用，具体为mPEG4-阿巴卡韦及其制备方法和应用。
背景技术
阿巴卡韦化学名称为(1S，4R)-4-[2-氨基-6-(环丙氨基)-9H-嘌呤-9-基]-2-环戊烯基-1-甲醇。是GlaxoSmith Kline公司研发的抗艾滋病药物，其硫酸盐的片剂和口服液(商品名Ziagen)于1999年在美国上市，具有良好的抗HIV活性，交叉耐药性较小，与拉米夫定(1amivudine，3TC)、齐多夫定(zidovuding，AZT)联用可发挥协同作用，是当今抗艾滋病“鸡尾酒疗法”的重要成分之一，其结构式如下：
申请号为200780036250.9的专利公布了一种制备阿巴卡韦的方法，该方法在水和醇混合物中使用无机碱，除去的式(II)的N-酰化的{(1S，4R)-4-[2-氨基-6-(环丙基氨基)-9H-嘌呤-9-基]-环戊-2-烯基}甲醇的氨基保护基团以得到阿巴卡韦或其盐的方法。
申请号为201410027146.5的专利公布了一种阿巴卡韦的制备方法，该方法以(1S，4R)-4-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)环戊-2-烯-1-基甲醇或其盐酸盐与环丙胺反应后进一步与酸的醇类溶剂发生成盐反应，制备得到阿巴卡韦盐。
申请号为200810123861.3的专利公布了一种阿巴卡韦的手性碳环中间体的 合成方法，该方法先由2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮制备得到中间体1，将1摩尔的中间体1溶于500毫升到2000毫升的有机溶剂中，将上述有机溶液加至枯草杆菌蛋白酶交联酶晶体的磷酸缓冲溶液中；保持体系在15到35度之间，机械搅拌，搅拌速度为每分钟100到500转之间，搅拌5到10小时；停止反应，过滤，回收枯草杆菌蛋白酶交联酶晶体；用1000毫升到2000毫升的另一种有机溶剂萃取滤液3到6次；合并有机相，干燥剂干燥；减压蒸馏或者柱层析得目标化合物。
申请号为200610027649.8的专利公布了一种制备光学纯阿巴卡韦的方法，该方法以(1S，4R)-4-氨基-2-环戊烯基-1-甲醇和2，5-二氨基-4，6-二氯嘧啶为起始原料，能够得到99.9％ee值的光学纯阿巴卡韦。
可见，目前多为制备阿巴卡韦、阿巴卡韦中间体和光学纯对映体的方法，本申请的化合物为一种新的化合物，其细胞的毒性较小，为艾滋病药物的开发开拓出的新的前景。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新的化合物，所述化合物以阿巴卡韦和四甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯为原料制备得到，为mPEG4-阿巴卡韦，该化合物细胞的毒性较小，能有效的抑制艾滋病病毒感染引起的细胞病变。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
具有式I的化合物，所述化合物的结构式如下所示：
上述化合物I的分子量为450.53。
本发明的目的之二在于提供一种制备式I所示化合物的方法，以阿巴卡韦(式Ia)和四甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯(式Ib)为原料，以DMF为溶剂，在碱存在下反应得含有式I所示化合物的混合液：
所述阿巴卡韦和四甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯均可以通过市售得到，或采用本领域技术人员所熟知的方法制得。
DMF化学名称为N，N-二甲基甲酰胺，中文别名为富马酸二甲酯，是一种用途极广的化工原料，也是一种用途很广的优良的溶剂，DMF在加氢、脱氢、脱水和脱卤化氢的反应中具有催化作用，使反应温度降低，产品纯度提高。
进一步，所述阿巴卡韦与四甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯的摩尔比为15～30∶28～40。
进一步，所述阿巴卡韦与DMF的质量体积比为3～10∶120～200(g/mL)。
进一步，所述阿巴卡韦与所述碱的质量比为1∶1～1.3。
进一步，所述方法还包括步骤：将所述混合液用乙酸乙酯提取，再经干燥、过滤、浓缩和分离得固体产品。
作为一种优选，在所述混合液用乙酸乙酯提取前，所述混合液需冷却至室温，加入适量水介质并搅拌混合均匀。
作为一种优选，将所述混合液用乙酸乙酯提取，混合有机层用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，残留物用硅胶柱分离得油状固体产品。
进一步，所述碱为碱金属碱或碳酸盐。
作为一种优选，所述碱为K2CO3。
进一步，所述反应的温度为80～120℃，所述反应的时间为5～9h。
作为一种优选，所述反应加热升温至100℃保温反应7h。
抑制C8166细胞病变的方法，通过将化合物I或含有化合物I的组合物体 外处理HIV-1RF致C8166细胞合胞体的形成来抑制抑制C8166细胞的病变。
C8166是HIV-1的敏感宿主细胞，HIV-1感染C8166细胞后会诱导巨大细胞(合胞体)的形成，最终导致细胞死亡。
本发明的目的之三在于提供一种具有式I的化合物在制备抗艾滋病的药物中的应用。
本发明的目的还在于提供一种抗艾滋病的药物，所述药物包括具有式I的化合物和药学上可接受的载体或助剂。
上述药学上可接受的载体或助剂，是指可以与本发明化合物一起给予患者的载体或助剂，不会破坏本发明化合物的药理学活性，并且当以足够递送治疗数量的抗病毒剂的剂量给予时，其是无毒的。例如：稀释剂、赋形剂和水等，填充剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供了一种新的化合物，所述化合物以阿巴卡韦和四甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯为原料制备得到，该化合物细胞的毒性较小，能有效的抑制艾滋病病毒感染引起的细胞病变。
2)本发明的新的化合物能应用在制备抗艾滋病的药物中，具有良好的应用开发前景，该化合物的开发，将为艾滋病患者带来福音。
具体实施方式
以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
以下实施例中阿巴卡韦采用文献(中国医药工业杂志，2007，38(1)，1-3)方法制备；三甘醇单甲醚甲苯磺酸酯及四甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯购自北京键凯科技有限公司；本发明中式I所示化合物mPEG4-阿巴卡韦的待试药物为化合物GQ-80503，批号：080503。
实施例1制备式I所示化合物mPEG4-阿巴卡韦的方法
取5.1 g 19.5 mmol的阿巴卡韦、12.7 g 35.1 mmol的四甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯和5.4 g 39.0 mmol 的K2CO3溶于150 mL DMF中，加热升温至100℃保温反应7h；冷却至室温，加入200 mL蒸馏水搅拌混合均匀；用120 mL×4乙酸乙酯提取，混合有机层用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，残留物用硅胶柱分离得油状固体产品3.9 g，收率44.4%，HPLC纯度98.5%。ESI-MS: 451[M+H]+
实施例2制备式I所示化合物mPEG4-阿巴卡韦的方法
取42.6 mmol的阿巴卡韦、60.1mmol的四甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯和81.8 mmol的K2CO3溶于300mL DMF中，加热升温至100℃保温反应7h；冷却至室温，加入400mL蒸馏水搅拌混合均匀；用120 mL×4乙酸乙酯提取，混合有机层用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，残留物用硅胶柱分离得油状固体产品8.4g, 收率47.7%，HPLC纯度98.6%。
对比实施例制备化合物mPEG3-阿巴卡韦的方法
取20.3 mmol的阿巴卡韦、31.8 mmol的三甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯和39.0 mmol的K2CO3溶于150 mL DMF中，加热升温至100℃保温反应7h；冷却至室温，加入200 mL蒸馏水搅拌混合均匀；用120 mL×4乙酸乙酯提取，混合有机层用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，残留物用硅胶柱分离得油状固体产品及化合物II 3.2 g，反应见下式：
。
实施例3式I所示化合物GQ-80503在细胞培养内的抗HIV-1活性
1、材料和方法
1.1试验材料
1.1.1药物
待试药物：
化合物GQ-80503，批号：080503，水不溶，DMSO可溶解，试验时用DMSO溶解配成适当浓度后用培养基稀释，立即加入细胞培养。
阳性对照药：
拉米夫定(3-TC)，购自葛兰素史克市售药品，片剂，规格0.1g，避光、密闭、干燥处保存。
化合物II：为对比实施例制得产品。
1.1.2病毒
HIV-1实验病毒株选用HIV-1RF，由南开大学惠赠。按常规方法培养制备HIV-1病毒。HIV-1感染性滴定按常规方法进行。病毒小量分装于冻存管，-80℃保存。
1.1.3细胞
C8166细胞来自美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)。细胞培养基：RPMI-1640完全培养基，含有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，10mM HEPES，50μM2-巯基乙醇，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素。
细胞按常规方法进行复苏，传代：从液氮中复苏细胞，用RPMI-164培养基洗去冻存液，加入含10％FCS的完全培养基10ml，混匀，37℃ 5％CO2培养。每隔3天对细胞传一次代。实验前1天传一次代，使所用细胞处于对数生长期。
1.1.4主要试剂
RPMI-1640、胎牛血清、硫酸链霉素(Streptomycin sulfate)、氨苄青霉素、硫酸卡那霉素、HEPES(N-2，2-Hydroxyothyl piperazine-N′-2-ethanesufonic acid)、MTT(3，(4，5-dimethylthiazol-2-yl，噻唑蓝)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)、DMF(N，N’-Dimethyl formamine，N，N-二甲基甲酰胺)、Triton X-100、青霉素(Penicillin)、谷氨酰胺(Glutamine)、碳酸氢钠、碳酸钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、二甲基亚砜(DMSO)。
1.1.5主要仪器
酶标仪(Biotek ELX800)、离心机(Thermo IEC CL40)、二级生物安全柜(ThermoForma Class II，A2)、CO2培养箱(Thermo)、加样枪(Thermo Finnpipeette F2)。
1.2试验方法
1.2.1 GQ-80503对C8166细胞的毒性试验
4×105/ml C8166细胞悬液100μl与不同的待测药物溶液混合，设3个重复孔。同时设置不含药物的对照孔，37℃，5％CO2培养3天，采用MTT比色法检测细胞毒性。ELx800ELISA仪测定OD值，测定波长为570nm，参考波长为630nm。计算得到CC50值(50％Cytotoxicconcentration)，即对50％的正常T淋巴细胞系C8166产生毒性时的药物浓度。
1.2.2 GQ-80503对HIV-1RF致C8166细胞病变的抑制试验
将8×105/ml C8166细胞50μl/孔接种到含有100μl/孔倍比稀释药物的96孔细胞培养板上，然后加入50μl的HIV-1IIIB稀释上清，1300TCID50/孔。设3个重复孔。同时设置不含药物的正常细胞对照孔。RAL为阳性药物对照，化合物II也为药物对照。37℃，5％CO2培养3天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体的形成。EC50(50％Effective Concentration)为抑制合胞体形成50％时的药物浓度。
2结果
2.1化合物GQ-80503对C8166细胞的毒性试验结果
C8166是HIV-1的敏感宿主细胞，HIV-1感染C8166细胞后会诱导巨大细胞(合胞体)的形成，最终导致细胞死亡。本实验旨在用MTT比色法检测GQ-80503对C8166细胞的细胞毒性作用。结果表明：GQ-80503对C8166细胞毒性小，阳性对照化合物3-TC较GQ-80503毒性大，化合物II对C8166细胞毒性最大。结果如表1所示。
表1 GQ-80503、3-TC和化合物II对C8166细胞的毒性作用
2.2化合物GQ-80503对HIV-1RF诱导C8166细胞病变的抑制试验结果
根据HIV感染宿主细胞时所用辅助受体的不同，可将HIV分为X4嗜性和R5嗜性。一般X4嗜性为合胞体诱导型(SI)，R5嗜性为合胞体非诱导型(NSI)。本实验选取X4型实验株HIV-1RF，选择病毒敏感表达CXCR4辅助受体的C8166细胞。采用合适M.O.I的游离HIV-1颗粒感染C8166细胞，培养3-4天后，HIV感染细胞会融合形成合胞体细胞。在倒置显微镜下观察和计数含有不同稀释浓度的药物和不含待测药物培养孔中的合胞体细胞数。计算出抑制率和EC50。
本实验选用X4嗜性B亚型的HIV-1实验株HIV-1RF感染C8166细胞，在药物存在或不存在下培养3天后，在倒置显微镜下计数HIV-1诱导细胞形成合胞体细胞的数量，观察GQ-80503抗HIV-1作用。结果表明，GQ-80503对HIV-1RF诱导C8166细胞形成合胞体有很好的抑制作用，阳性对照化合物3-TC、化合物II对HIV-1RF诱导C8166细胞形成合胞体的抑制作用不强。结果如表2所示。
表2 GQ-80503、3-TC和化合物II对HIV-1RF诱导C8166细胞病变的抑制试验
由表1和表2可知，GQ-80503对C8166细胞的毒性较小，同时对HIV-1RF诱导的C8166细胞有很好的保护细胞不受HIV导致病变的作用，具有良好的应用开发前景。该化合物的开发，将为艾滋病患者带来福音。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.具有式I的化合物，其特征在于，所述化合物的结构式如下所示：
2.制备式I所示化合物的方法，其特征在于，以阿巴卡韦(式Ia)和四甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯(式Ib)为原料，以DMF为溶剂，在碱存在下反应得含有式I所示化合物的混合液：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述阿巴卡韦与四甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯的摩尔比为15～30∶28～40。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述阿巴卡韦与DMF的质量体积比为3～10∶120～200(g/mL)。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述阿巴卡韦与所述碱的质量比为1∶1～1.3。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：将所述混合液用乙酸乙酯提取，再经干燥、过滤、浓缩和分离得固体产品。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述碱为碱金属碱或碳酸盐。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应的温度为80～120℃，所述反应的时间为5～9h。
9.具有式I的化合物在制备抗艾滋病的药物中的应用。
10.抗艾滋病的药物，其特征在于，所述药物包括具有式I的化合物和药学上可接受的载体或助剂。
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