CN106659684A - 含肽的卟啉脂质纳米囊泡 - Google Patents
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Abstract
本文提供了包含磷脂单层、卟啉‑磷脂结合物和包封疏水核的肽的纳米囊泡,其中所述肽包含能够形成至少一种两亲性α‑螺旋的氨基酸序列;所述卟啉‑磷脂结合物包含优选地在sn‑1或sn‑2位置共价连接到一种磷脂的脂质侧链的一种卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物;卟啉‑磷脂结合物对磷脂的摩尔%为35%或更小;所述纳米囊泡的直径为35nm或更小。
Description
相关申请
本申请要求美国临时申请No.62/014,964的优先权。
技术领域
本发明涉及纳米囊泡,并且更具体地涉及包含磷脂、卟啉-磷脂结合物和包封疏水核的肽的纳米囊泡。
背景技术
近年来,已开发了用于多种应用,如生物传感器、诊断生物探针和靶向药物递送的多功能纳米颗粒。很大程度上,由于需要改善诊断和治疗中的生物学特异性驱使这些努力。卟啉(是来自叶绿素的颜料)和它们的衍生物已证明对于光动力学治疗(PhotodynamicTherapy,PDT)和癌症荧光成像是特别成功的(1-4)。然而,它们在生理条件下在水溶液中较差的溶解度妨碍了它们的临床应用(5)。已进行了不断的努力来将这些疏水性光敏剂包封或连接到多种纳米颗粒,包括脂质体、聚合物、金和二氧化硅纳米颗粒以改善它们的系统递送效率(6-8)。然而,包封方法对于携带卟啉分子具有限制,例如,脂质体仅可以携带小于15摩尔%以保持纳米结构稳定(6)。
最近,我们已开发了通过甚至100%卟啉-磷脂结合物自组装的卟啉体(nanophysome)纳米结构(9)。在脂质体-样双层膜中充分布置的具有高卟啉分子密度的稳定纳米结构(100-150nm直径)为卟啉体提供了超出卟啉单体的新型生物光子学(biophotonic)功能。其纳米结构-依赖性“超”-吸收(“super”-absorption)(消光系数ξ680=2.9×109M-1cm-1)和光活性(photoactivity)的“超”淬灭(“super”-quenching)以极高的效率将光能转化为热,从而为它们提供了对于有机纳米颗粒来说前所未有的理想光热和光声性质。受体-介导的纳米颗粒吸收有利于卟啉体胞内内化和纳米结构破环,从而导致卟啉对于无创荧光成像和有效PDT的光活性恢复(10)。另外,对于无创PET成像,可以将放射性铜-64(64Cu)直接引入到预先形成的卟啉体的卟啉-脂质构建块(building block)中(11-12)。因此,卟啉-组装的纳米颗粒的固有多模态性特性(multimodal nature)为癌症治疗诊断学和临床转化提供了很大可能。
尺寸范围在100-150nm的卟啉体通过提高的渗透性和保留(EPR)作用在恶性肿瘤中显示出优先积累,但是在肿瘤内可能会遇到对于足够渗透的扩散障碍。近期研究已证明与较大的对应物相比,小于40nm的纳米颗粒在渗透深入至纤维性肿瘤方面表现的更有效(13-15)。例如,Cabral等人比较了不同尺寸负载药物的聚合物胶束(直径30、50、70和100nm)在高度和较差可渗透性肿瘤中的积累和有效性。所有聚合物胶束渗透小鼠中高度可渗透肿瘤,但仅30nm胶束可以较差渗透可渗透胰腺肿瘤以实现抗肿瘤作用(14)。因此,尺寸较小(<30nm)的卟啉纳米颗粒的开发具有提高它们通过肿瘤间质(interstitium)的扩散输送的可能,特别是在低渗透性肿瘤中,从而允许有效渗透和积累以实现治疗相关浓度。然而,由于表面弯曲所导致的生长不稳定性,通过卟啉-脂质自组装产生较小卟啉体的尝试仍具有挑战。
此外,本申请人提及了先前的PCT专利公开No.11/044671、12/167350、13/053042、13/082702、13/159185、14/000062和09/073984,所有以上专利作为参考并入本文。
发明内容
在一个方面,提供了包含磷脂单层、卟啉-磷脂结合物和包封疏水核的肽的纳米囊泡,其中
所述肽包含能够形成至少一种两亲性α-螺旋的氨基酸序列;
所述卟啉-磷脂结合物包含优选地在sn-1或sn-2位置共价连接到一种磷脂的脂质侧链的一种卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物;
卟啉-磷脂结合物相对于磷脂的摩尔%为35%或更小;
所述纳米囊泡的直径为35nm或更小。
在一个方面,提供了在受试者中的靶区域上成像的方法,包括:提供本文所述的纳米囊泡;将所述纳米囊泡施用至所述受试者;和对所述靶区域成像。
在一个方面,提供了本文所述的纳米囊泡对受试者中靶区域,优选地肿瘤进行成像的用途。
在一个方面,提供了对受试者中靶区域实施光动力的方法,包括:提供本文所述的纳米囊泡;向所述受试者施用所述纳米囊泡;和在所述靶区域用光的波长照射所述纳米囊泡,其中所述光的波长激活了卟啉-磷脂结合物以产生单线态(singlet)氧。
在一个方面,提供了将疏水性试剂递送至受试者的方法,包括提供本文所述的纳米囊泡,其中所述疏水核包含所述试剂;和向所述受试者施用所述纳米囊泡。
在一个方面,提供了本文所述的纳米囊泡用于递送对受试者中靶区域进行成像的疏水性试剂的用途,其中所述疏水核包含所述试剂。
附图说明
在参考附图的下列详细说明中,本发明优选实施方式的这些和其它特征将变得更显而易见,其中:
图1(a)在0.1μm过滤后,具有不同pyro初始输入(pyro脂质(pyrolipid)/总磷脂=5%、10%、30%和50%)的制剂的直径尺寸(体积分布峰值)。(b)每种制剂的卟啉荧光猝灭效率。淬灭%=(1-FIPBS中完整/FI通过Triton破坏)×100%。
图2显示了USPV的体积尺寸分布和TEM图。
图3 USPV的UV-vis和CD光谱。
图4显示了(a)卟啉体和(b)在PBS中完整的或通过Triton X-100破坏的USPV的荧光光谱和单线态氧产生。
图5显示了(a)通过细胞溶解测定所测量的U87细胞中卟啉体相对于USPV的细胞吸收。(b)用卟啉体和USPV(10μM pyro脂质,孵育3h)孵育的细胞的共聚焦成像。
图6显示了USPV、PEG-USPV和叶酸盐-PEG-USPV的血液清除曲线。
图7显示了在相同pyro脂质浓度(200nmol)下注射(a)卟啉体和(b)USPV的具有9Lluc神经胶质瘤的小鼠的生物发光图像(左图)和原位荧光图像(中间图)和白光照片(右图)。
图8显示了(a)来自具有9Lluc神经胶质瘤的小鼠的脑的白光图像(white image)(左)和离体荧光图像(右),(b)确认肿瘤区域(白色虚线围绕(squired)区域)的相应H&E结果。(c)来自9Lluc小鼠的冷冻组织切片的显微图像(左图,蓝色:DAPI,红色:pyro)以及显示肿瘤和对侧健康脑的相同区域的相应H&E结果(右图)。
图9显示了(a)USPV-DiR-BOA的体积尺寸分布。(b)USPV-DiR-BOA的UV-Vis吸光度,(c)荧光光谱和(d)PBS中完整的或被Triton X-100破坏的USPV-DiR-BOA的单线态氧产生。
图10显示了(a)静脉注射后24h,注射了USPV-DiR-BOA的具有U87神经胶质瘤的小鼠的白光照片和相应原位荧光图像。获得pyro通道(Ex:575-605nm,Em:680-750nm)和DiR-BOA通道(Ex:725-755nm,Em:780-950nm)。(b)使用深红色长通(Ex:660nm,Em:689-900nm)激光探针获得的代表性体内荧光显微图像。通过除去颅骨,检查了肿瘤和对侧脑。(c)主要器官的离体荧光成像。图像中的器官列出如下:A:肌肉,B:具有肿瘤的脑,C:肺,D:心脏,E:脾,F:肾,G:肝。
图11显示a)64Cu-USPV使得能够对卵巢癌转移进行PET成像;转移肿瘤和淋巴结的离体生物发光图像b)和荧光图像c);通过泛细胞角蛋白(pancytokeratin)(AE1/AE3)染色图像d)和H&E染色图像e)确认转移组织。
图12显示(a)具有表达GFP的深度肿瘤的脑的Maestro成像和荧光分子断层术(FMT)成像结果。在注射后24h进行成像。(b)脑横切面的图示。(c)通过GFP通道、pyro通道和DiR-BOA通道的荧光成像结果。
图13显示了组织学和肿瘤切片显微成像结果。
图14显示了在图像-引导的肿瘤去除之后,具有多病灶的脑的白光图像、生物发光图像和荧光图像。
图15显示了USPV-PDT治疗期间的温度监控。
图16显示了激光对照组以及使用不同光剂量的USPV-PDT治疗组中肿瘤区域和周围脑的H&E和TUNEL结果。
图17显示了使用不同光剂量的USPV-PDT治疗组中肿瘤和周围脑的TUNEL定量结果。
图18显示了兔HNC模型中USPV-实现的(USPV-enabled)原发瘤和淋巴引流(lymphatic drainage)的无创检测;a)HNC兔中USPV的药物动力学曲线(n=4);b)静脉注射64Cu-USPV后24h,HNC兔的代表性PET/CT 3D图像(红色箭头:肿瘤,白色箭头:局部淋巴结);c)通过PET体积分析定量的肌肉、肿瘤和淋巴结中的64Cu-USPV的分布。吸收表示为标准吸收值(SUV)。USPV的肿瘤和淋巴结吸收显著高于肌肉吸收(n=4,P<0.05);d)通过γ-计数测量的HNC兔(n=5)和健康兔(n=3)的主要器官中64Cu-USPV的分布;e)PET/CT成像后,HNC兔的切除的肿瘤、局部淋巴结以及其它主要器官的离体荧光。LN代表淋巴结,SG代表唾液腺。
图19显示了2D PET/CT成像的代表性轴位视图、矢状位视图和冠状位视图,显示了肿瘤(红色箭头)和局部淋巴结(白色箭头)。
图20显示了静脉注射64Cu-USPV 24h之后,肿瘤(a)和转移性淋巴结(b)的代表性H&E、泛细胞角蛋白染色和荧光显微成像。(比例尺:100mm)。
图21显示了USPV-实现的荧光-导向的肿瘤和转移性淋巴结切除。静脉注射USPV后24h,兔中HNC肿瘤的体内荧光成像:a)切开前,皮肤完整;b)手术期间,除去皮瓣时;c)术后,手术床非荧光确认程序完成;d)切除的肿瘤组织切片的代表性H&E,泛细胞角蛋白染色和荧光显微成像;e)除去皮瓣时,哨位(sentinel)淋巴结的术中荧光成像;f)通过USPV荧光绘制的淋巴网络图。跟踪从哨位淋巴结至局部淋巴结的淋巴流获得了一系列放大图像(位置1-5);g)通过USPV检测的切除的怀疑的淋巴结的组织切片的代表性H&E,泛细胞角蛋白染色和荧光显微成像。
图22显示了HNC兔中USPV-实现的PDT。a)静脉注射USPV之后24h,2-步PDT激光辐照的图示;USPV-PDT前后兔的代表性照片(b)和轴向CT图像(c);d)通过体积CT测量确定的平均肿瘤生长曲线;从原始肿瘤区切除的组织的代表性H&E和泛细胞角蛋白染色(e);和USPV-PDT之后34天切除的淋巴结(f)。所有组织显示无恶性肿瘤。
图23显示了激光辐照期间肿瘤的温度变化。在激光对照组和USPV-PDT组的激光辐照期间,通过热感相机监控温度。
图24显示了激光治疗后通过CT成像监控肿瘤尺寸变化。激光或USPV施用之后显示的具有肿瘤的兔的激光对照组和USPV对照组的代表性CT矢向图像。
图25显示了代表性CT矢向图像,其显示了治疗后USPV对照、激光对照和USPV-PDT组的兔的局部淋巴结。
图26显示了对USPV-PDT的毒性的评价。a)USPV施用前和USPV-PDT治疗后1周和3周,兔的血液测定(n=4);b)来自USPV-PDT兔的主要器官,包括心、肺、肝、脾、肾上腺和肌肉的代表性H&E染色切片,表明肿瘤摘除之后对健康组织无副作用。
具体实施方式
在以下说明中,描述了多个细节以透彻理解本发明。然而,应理解可以在没有这些细节的情况下实践本发明。
在本发明中,我们引入了含有疏水性药物核的新型超小卟啉囊泡(USPV),其被包埋卟啉脂质的磷脂单层包膜并受ApoA-1模拟肽网络限制。我们证明由肽网络形成的α-螺旋结构在限制尺寸和稳定颗粒方面起到至关重要的作用。在功能上类似于卟啉体,具有卟啉-脂质封装密度(packing density)的35%的USPV具有固有的多模态性(multimodal)生物光子学性质。超小尺寸的纳米结构(<30nm)驱使了足够的吸收提高(消光系数ξ680=7.8×107M-1cm-1)和有效的光学性质淬灭,这导致了卟啉荧光的沉默和单线态氧的产生。因此,完整的USPV是光动力学无活性的,而当纳米结构破坏时,它将成为PDT活性的。同时,USPV的疏水核可以有效负载疏水性生物活性药物,并且其有利的血液循环特性(小鼠中10h和兔中27h的循环半衰期)使其成为温和的药物递送系统而无需PEG化。使用临床相关的小鼠正位的神经胶质瘤肿瘤模型和兔正位的头颈癌(HNC)兔模型,我们已证明USPV有利于药物负载稳定和肿瘤特异的递送。64Cu标记的USPV使得能够追踪纳米颗粒及其药物负载的体内去向。通过术前PET和术中荧光成像,可以将原发瘤、转移瘤和淋巴结以及肿瘤至局部淋巴结的淋巴引流清楚成像。此外,在全身施用后24h,高密度填充的卟啉的有效光学性质活化使得能够在神经胶质瘤小鼠和HNC兔中实施准确荧光-引导肿瘤切除和有效PDT。应注意本工作明显不同于我们先前报道的处于其纳米结构的卟啉体(20nm相对于100nm,单层相对于双分子层,疏水核相对于水性核,a-螺旋肽相对于PEG涂覆)和纳米结构-依赖性功能(快速相对于缓慢胞内运输,光动力学疗法相对于光热疗法)。
在一个方面,提供了包含磷脂单层、卟啉-磷脂结合物和包封疏水核的肽的纳米囊泡,其中所述肽包含能够形成至少一种两亲性α-螺旋的氨基酸序列;所述卟啉-磷脂结合物包含优选地在sn-1或sn-2位置共价连接到一种磷脂的脂质侧链的一种卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物;卟啉-磷脂结合物相对于磷脂的摩尔%为35%或更小;所述纳米囊泡的直径为35nm或更小。
适合的骨架肽可以选自由以下各项组成的组中:A、H、L和M类螺旋或其片段。适合的骨架肽还可以包括A、H、L和M类两亲性α-螺旋的反向肽序列或其片段,这是因为形成两亲性α-螺旋的性质是由肽序列内氨基酸残基的相对位置决定的。
在一个实施方式中,所述骨架肽具有包含脱脂蛋白的连续氨基酸的氨基酸序列,优选地选自由以下各项组成的组中:apoB-100、apoB-48、apoC、apoE和apoA。
在本发明中使用的“氨基酸”以及在本说明书和权利要求中使用的该术语包括已知的天然存在的蛋白质氨基酸,其通过它们常见的三字母缩写和单字母缩写表示。一般地,参见Synthetic Peptides:A User′s Guide,G A Grant主编,W.H.Freeman&Co.,New York,1992,该文献的教导内容作为参考并入本文,包括11至24页中描述的正文和表格。如上所述,术语“氨基酸”还包括天然存在的蛋白质氨基酸的立体异构体和修饰、非蛋白质氨基酸、翻译后修饰的氨基酸,酶促合成的氨基酸、衍生化氨基酸、设计成模拟氨基酸的构建体或结构等。一般地,在以上引用的Synthetic Peptides:A User's Guide;Hruby V J,Al-obeidiF and Kazmierski W:Biochem J268:249-262,1990;和Toniolo C:Int J PeptideProtein Res 35:287-300,1990中描述了修饰和非常规氨基酸;以上文献的教导内容作为参考并入本文。
“α-螺旋”在本文中用于表示蛋白质二级结构中常见的基序。α螺旋(α-螺旋)是类似弹簧的卷曲构象,其中每个主链的N-H基为之前4个残基的氨基酸的主链C=O基提供了氢键。通常,由天然存在的氨基酸组成的α螺旋将是右旋的,但是左旋构象也是已知的。
“两亲性的”是描述具有亲水和疏水性质的化合物的术语。两亲性α螺旋是生物活性肽和蛋白质中常见的二级结构基序,并且表示具有沿该螺旋长轴取向的相对的极性和非极性面的α螺旋。
小的两亲性螺旋肽的实例包括WO 09/073984中描述的那些。
用于检测和表征具有假定两亲性螺旋结构的蛋白结构域的方法如Segrest,J.P.et al.in PROTEINS:Structure,Function,and Genetics(1990)8:103-117中所述,该文献的内容作为参考并入本文。Segrest等人已鉴别出7种不同种类的两亲性螺旋,并且还已鉴别出与每个种类有关的肽/蛋白。在7种不同的种类中,存在四种脂质-相关的两亲性螺旋种类(A、H、L和M)。其中,表示脱脂蛋白类的A类具有对于形成磷脂类颗粒最优的性质。
如本文所使用的,“磷脂”是具有包含磷酸酯基的亲水性头部基团和疏水性脂质尾的脂质。
在一些实施方式中,卟啉-磷脂结合物相对于磷脂的摩尔%为35%或更小,30%或更小,25%或更小或者20-30%。
在一些实施方式中,所述纳米囊泡为基本球形的并且直径为35nm或更小,直径为25nm或更小,直径为20-30nm之间或直径为约25nm。
在一些实施方式中,所述卟啉-磷脂结合物中的卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物选自由以下各项组成的组中:血卟啉、原卟啉、四苯基卟啉、焦脱镁叶绿酸(pyropheophorbide)、细菌叶绿素、叶绿素a、苯并卟啉衍生物、四羟基苯基二氢卟酚、紫红素、苯并二氢卟酚、萘并二氢卟酚、胆绿素(verdin)、玫红素(rhodin)、酮二氢卟酚、氮杂二氢卟酚、菌绿素、甲苯基卟啉(tolyporphyrin)、苯并菌绿素、扩展卟啉和卟啉异构体。优选地,所述扩展卟啉为德克萨卟啉(texaphyrin)、萨普卟啉(sapphyrin)或六元卟啉(hexaphyrin),并且所述卟啉异构体为卟啉烯(porphycene)、反转卟啉(invertedporphyrin)、酞菁或萘酞菁(naphthalocyanine)。
在一些实施方式中,所述卟啉-磷脂结合物中的卟啉为焦脱镁叶绿酸-a酸。
在一些实施方式中,所述卟啉-磷脂结合物中的卟啉为细菌叶绿素衍生物。
在一些实施方式中,所述卟啉-磷脂结合物中的磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇。优选地,所述磷脂包含12至22个碳的酰基侧链。
在一些实施方式中,所述卟啉-磷脂结合物中的磷脂为1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油基(glycero)-3-磷酸胆碱或者1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。
在一些实施方式中,所述卟啉-磷脂结合物为pyro-脂质(pyro-lipid)。
在一些实施方式中,所述卟啉-磷脂结合物为氧-细菌叶绿素-脂质。
在一些实施方式中,所述卟啉通过0至20个碳的碳链接头结合至磷脂上的甘油基。
在一些实施方式中,所述卟啉-磷脂结合物包含其中螯合的金属,可选地金属的放射性同位素,所述金属优选地选自由以下各项组成的组中:Zn、Cu、Mn、Fe和Pd。
在一些实施方式中,所述磷脂为阴离子磷脂。优选地,所述磷脂选自由以下各项组成的组中:磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰甘油及其组合。在一些实施方式中,所述磷脂选自由以下各项组成的组中:1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸(DPPA)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二山嵛酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DBPC)、1,2-二花生四烯基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DAPC)、1,2-双二十四烷酰基(dilignoceroyl)-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DLgPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-[磷-外消旋-(1-甘油)](DPPG)及其组合。
在一些实施方式中,所述肽选自由以下各项组成的组中:A、H、L和M类两亲性α-螺旋、其片段以及包含所述A、H、L和M类两亲性α-螺旋的反向肽序列的肽或其片段。
优选地,所述肽由脱辅基蛋白的连续氨基酸组成,优选地选自由以下各项组成的组中:apoB-100、apoB-48、apoC、apoE和apoA。
在一些实施方式中,所述肽选自由以下各项组成的组中:2F(DWLKAFYDKVAEKLKEAF)、4F(DWFKAFYDKVAEKFKEAF)和上述的反向序列。在一个实施方式中,所述肽是R4F肽(Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD)。
在一些实施方式中,至少一种两亲性α-螺旋或肽的长度在6至30个氨基酸之间,8至28个氨基酸之间,10至24个氨基酸之间,11至22个氨基酸之间,14至21个氨基酸之间,16至20个氨基酸之间或者长度为18个氨基酸。
可以将多种疏水性生物活性剂或治疗剂、药物物质或药物包封在USPV核内。
在一些实施方式中,所述疏水核包含疏水性诊断剂或治疗剂,优选地,紫杉醇、多西他赛、1,1'-双十八烷基-3,3,3′,3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物双-油酸酯(DiR-BOA)。
术语“治疗剂”是本领域承认的并且表示作为生物学、生理学或药理学活性物质的任何化学部分。在熟知的参考文献中描述了治疗剂(也称为“药物”)的实例,如MerckIndex、the Physicians'Desk Reference和The Pharmacological Basis ofTherapeutics,并且它们无限制地包括药剂;维生素;矿物质补充剂;用于疾病或病的治疗、预防、诊断、治愈或缓和的物质;影响身体结构或功能的物质;或者前体药物,在置于生理环境中后,它们成为生物学活性的或更加活性的。可以使用多种形式的治疗剂,其一旦施用于受试者,则能够从受试者组合物中释放到邻近组织或流体中。
“诊断”或“诊断剂”是可以用于诊断的任何化学部分。例如,诊断剂包括成像剂,如含有放射性同位素,如铟或锝的那些;含碘或钆的造影剂;酶,如辣根过氧化物酶、GFP、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶;荧光物质,如铕衍生物;发光物质,如N-甲基吖啶鎓(N-methylacrydium)衍生物等。
在一些实施方式中,所述纳米囊泡是无PEG的。
在一些实施方式中,所述纳米囊泡还包含PEG,优选地PEG-脂质,进一步优选地PEG-DSPE。
在一些实施方式中,所述纳米囊泡还包含靶向分子。
在一些实施方式中,所述纳米囊泡还包含靶向分子,优选地抗体、肽、适体或叶酸。
“靶向分子(targeting molecule)”是例如,通过结合至靶细胞表面上的受体或其它分子,可以将纳米囊泡导向至特定靶标的任何分子。靶向分子可以是蛋白质、肽、核酸分子、糖类或多糖、受体配体或其它小分子。可以通过靶向分子的选择来调节特异性程度。例如,抗体通常显示出高特异性。这些可以是多克隆、单克隆、片段、重组或单链的,它们中许多是可商购的或使用标准技术易得的。
在一个方面,提供了在受试者中的靶区域上成像的方法,包括:提供本文所述的纳米囊泡;将所述纳米囊泡施用至所述受试者;和对所述靶区域成像。
在一个方面,提供了本文所述的纳米囊泡对受试者中靶区域,优选地肿瘤进行成像的用途。
在一个方面,提供了对受试者中靶区域实施光动力学的方法,包括a.提供本文所述的纳米囊泡;向所述受试者施用所述纳米囊泡;和在所述靶区域用光的波长照射所述纳米囊泡,其中所述光的波长激活了卟啉-磷脂结合物以产生单线态氧。
在一些实施方式中,所述靶区域是肿瘤。
在一个方面,提供了将疏水性试剂递送至受试者的方法,包括:提供本文所述的纳米囊泡,其中所述疏水核包含所述试剂;和向所述受试者施用所述纳米囊泡。
在一个方面,提供了本文所述的纳米囊泡用于递送对受试者中靶区域进行成像的疏水性试剂的用途,其中所述疏水核包含所述试剂。
当与常规卟啉体相比时,USPV的可能优势包括在具有卟啉体功能(光热、光声、PET、MRI、CT等)的同时,更小,对于体内稳定性的PEG化更少的或没有需要,提高的单线态氧和荧光激活和/或在核(例如,药物、CT造影剂等)内部引入疏水性有效载荷(payload)和在表面上引入siRNA的能力。
通过以下实施例,进一步说明了本发明的优势。仅出于说明的目的提供了在本文中描述的实施例以及它们的具体细节,并且不应将这些视为对本发明的权利要求的限制。
实施例
方法和材料
材料
1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)、二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基(聚乙二醇)(DSPE-PEG2000)和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-叶酸酯(聚乙二醇)(叶酸酯-DSPE-PEG2000)购自Avanti Polar Lipids Inc.(AL,USA)。胆甾醇油酸酯(CO)购自Sigma-Aldrich Co.(MO,美国)。根据先前报道的方案(16)制备1,1'-双十八基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物双-油酸酯(DiR-BOA)和卟啉-脂质(焦脱镁叶绿酸-脂质缩写为pyro-脂质)。ApoA-1模拟R4F肽(R4F)、Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD购自GL Biochem Ltd.(上海,中国)。细胞培养基伊格氏最低必须培养基(EMEM)得自ATCC(美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection),Manassas,VA)。胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)溶液和Hoechst 33258均购自Gibco-InvitrogenCo.(CA,美国)。
超小卟啉囊泡(USPV)的制备和表征
USPV的合成
通过在氮气下,在氯仿中蒸发脂质混合物制备脂质膜。USPV的脂质混合物由0.9μmol卟啉-脂质、2.1μmol DMPC和0.3μmol胆固醇油酸酯组成。对于负载物质的颗粒,将用作模型药物的3mol%DiR-BOA加入至脂质混合物,对于聚乙二醇化的USPV制剂(PEG-USPV),将1%DSPE-PEG2000加入到脂质混合物中,并且对于叶酸酯受体-靶向的USPV(叶酸酯-PEG-USPV),将1%叶酸酯-DSPE-PEG2000加入到脂质混合物中。用1.0mL PBS缓冲液(150mM,pH7.5)使完全干燥的脂质膜水化,并在40℃以低频率(30s开/30s关)超声30个循环。将R4F肽(2.3mg,5mg/ml)滴定至再水化溶液中,并且一旦加入肽溶液,混浊的乳液变透明。将混合物在4℃保持震荡过夜。随后,将溶液以12,000rpm离心20分钟,用0.1μm膜(Sigma-Aldrich)过滤上清液。
USPV的尺寸和形态
通过动态光散射(ZS90Nanosizer,Malvern Instruments)测量USPV的尺寸分布和ζ电位。使用Hitachi(日本)H-7000电子显微镜的透射电子显微镜术(TEM)用于确定颗粒形态和尺寸。
USPV的激发和发射
用PBS稀释USPV作为完整/淬灭样品,或者用0.5%Triton X-100在PBS中的溶液稀释作为破坏/未淬灭的样品。通过UV/Vis分光光度计Cary 50(Agilent,Mississauga,ON)测量完整和破坏的USPV的吸收光谱,并且通过使用Fluoromax-4荧光计(Horiba Jobin Yvon,美国)(激发:420nm,发射:600-800nm,狭缝宽度:5nm)测量它们的荧光。通过下式计算荧光猝灭效率:(1-FI完整/FI破坏)×100%,FI完整和FI破坏分别代表完整样品和破坏样品的荧光强度。
USPV的单线态氧(1O2)产生
使用SOSG测定测量USPV(完整和破坏两种)的1O2产生。简要地,SOSG(1O2传感器绿色试剂(1O2sensor green reagent),Molecular Proves,Inc.)溶液是在甲醇中新鲜配制的(5mM)并与USPV(完整样品在PBS中,破坏样品在0.5%Triton X-100中)混合(最终pyro浓度为1μM)以获得6μM的最终SOSG浓度。用0.5J/cm2至10J/cm2的光通量(light fluence),在671nm下用发光二极管阵列处理样品,然后通过在504nm激发和在525nm采集来测量SOSG荧光。在该发射窗内,没有卟啉荧光贡献。
定量细胞吸收研究和共聚焦显微镜检查
将U87GFP和U87luc细胞在具有10%FBS的伊格氏最低必须培养基(EMEM,)中培养。为了比较USPV相对于卟啉体的细胞吸收,对U87神经胶质瘤细胞进行定量细胞吸收研究。简要地,培育前24h,将U87GFP细胞以106个细胞/孔接种到6-孔板中,并在37℃,在10mM卟啉浓度下与卟啉体和USPV培育3h。用PBS漂洗3次后,将细胞胰蛋白酶解并将混悬液以4000rpm离心5分钟。然后,将细胞颗粒在500μL裂解缓冲液中再悬浮并在冰上培育1h。将溶液以10,000rpm离心10min,并收集上清液用于通过荧光分光光度计的卟啉荧光测量以定量卟啉分子的细胞吸收。为了进一步检验USPV相对于卟啉体的荧光激活,在细胞培育之后实施共聚焦成像以监控卟啉荧光随时间的变化。培育前24h,将5×104个细胞/孔接种到8-孔盒式载玻片(chamber slide)中。在37℃,在10μM卟啉浓度下,将细胞与卟啉体和USPV培育3h,用PBS漂洗3次,并在新鲜细胞培养基中再培育。在更换培养基后立即和3h、6h通过共聚焦显微镜检查(Olympus FluoView 1000,Laser 633nm,Em at)对细胞成像。
USPV作为神经胶质瘤肿瘤治疗的治疗诊断剂的评价。
动物准备和肿瘤模型
按照University Health Network指南,进行所有动物试验。对具有正位9Lluc胶质肉瘤、U87GFP和U87luc神经胶质瘤的裸鼠进行动物研究。Nu/nu雌性裸小鼠购自HarlanLaboratory并且在University Health Network的动物研究中心中保留。为了建立模型,分别通过腹膜内注射氯胺酮(ketamine)、赛拉嗪(xylazine)和乙酰丙嗪(acepromazine)(80mg/kg、5mg/kg和2.5mg/kg)使动物麻醉。使用Dremel工具,在左半球制备直径1mm的钻孔,暴露硬膜但保持完整。将3uL培养基中的5×104个U87细胞或1×104个9L细胞注射至左半球。通过磁共振成象(MRI),每周监控肿瘤尺寸。当肿瘤达到4-5mm直径时,在接种后约18天进行实验。
血液清除研究
将USPV、PEG-USPV和叶酸酯-PEG-USPV以2.5mg/kg的剂量(n=4)静脉内注射至BALB/c小鼠。在注射之前和之后(5min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h和48h),顺序地从小鼠腿静脉采集血液。将血液置于室温30min以分离血浆,然后以12,000rpm的速度离心10min。通过荧光分光光度计(HORIBA Scientific Inc.)测量上清液的荧光以计算血液中卟啉的量(激发420nm,发射675nm,狭缝宽度:5nm)。然后,通过Graphpad 分析每个时间点的卟啉的量以计算颗粒的半衰期。
体内和离体荧光成像
为了研究USPV体内特异性肿瘤吸收和图像-导向的药物递送能力,在全身施用后进行荧光成像。在USPV施用前,对具有肿瘤的小鼠饲喂低-荧光饮食(Harlan产品号No.TD.97184)3天。然后,以10mg/kg卟啉含量的剂量通过尾静脉注射USPV-DiR-BOA。使用Maestro成像系统(CRI,USA),对pyro信号使用575-605nm激发/680-750nm发射滤片,对DiR-BOA信号使用725-755nm激发/780nm长通发射滤片,采集荧光图像。在注射后24h,在具有或不具有头皮以及具有颅骨开孔的情况下,体内进行荧光成像。将动物处死后,收获脑和主要器官,包括心脏、肺、肝、脾、肾、肾上腺和肌肉并进行离体荧光成像。还对具有肿瘤的脑进行FMT(荧光分子断层术,PerkinElmer VisEn FMT 2500LX Quantitative TomographySystem,VisEn Medical Inc,Bedford,MA)成像和体内共聚焦显微镜成像(Leica FCM1000,Technology,Ex:660nm,Em 689-900nm)。对于具有9Lluc-和U87luc神经胶质瘤的小鼠,成像前10min腹膜内注射荧光素酶溶液。还进行了体内和离体生物发光成像。
光动力学疗法
对具有U87GFP肿瘤的小鼠,研究了USPV的PDT效力。包括四组:没有任何治疗的空白对照组;单独的PDT激光;单独的USPV注射;USPV加PDT激光治疗。当肿瘤直径达到1至1.5mm时,以5mg/kg(根据卟啉含量计算)的剂量将USPV静脉内注射至动物。注射后24h,用2%(v/v)异氟烷麻醉小鼠,并用671nm激光(DPSS LaserGlow Technologies,Toronto,加拿大)辐照肿瘤。激光强度测量为50mW/cm2,斑点大小直径9mm,并且治疗区域直径为3.5mm。在本研究中,应用了37.5J/cm2和50J/cm2的光剂量。使用红外热感相机(Mikroshot,LUMASENSETechnologies)监控单独激光组和PDT处理组的肿瘤温度变化,并且每个处理组使用n=5计算(用于平均值和标准偏差)。
组织学分析
为了限定肿瘤边缘,在离体荧光成像后将脑在液氮中冷冻,然后使用LeicaCM3050S低温恒温器将其切成5μm厚的切片。在University Health Network的病理研究项目实验室,通过标准方法进行H&E染色。以20×放大,通过亮场显微术观察切片并照相。为了评价治疗效力,收获来自每个处理组的脑并在处理后24h,在10%甲醛中固定。实施H&E染色和TUNEL染色,随后根据上述相同标准规程进行分析。
组织切片显微成像
用含DAPI的封固溶液(mounting solution)封固冷冻切片,并通过OlympusFV1000激光共聚焦扫描显微镜(Olympus,Tokyo,日本)和Quorum WaveFX转盘式共聚焦显微镜(Yokogawa,日本)以激发波长405nm(DAPI通道)、491nm(GFP通道)和633nm(Cy5.5通道)进行成像。
VX-2颊癌兔模型
使用其它处所述的方法,开发了VX-2颊鳞状细胞癌模型(17,18)。简要地,在无菌条件下从刚安乐死的兔收获肿瘤,并将其置于Hanks平衡盐溶液(HBSS,Sigma)中,用无菌HBSS清洗2次,切成小块,并在存储在-80℃直至使用。为了获得单个肿瘤细胞的混悬液,将肿瘤块融化、切碎并挤压通过70μm细胞过滤器(cell strainer)。将300μL高密度单细胞混悬液(~5×106个/mL)注入到麻醉的新西兰白兔(2.8-3.3kg)的颊肌(颊区域)。
HNC兔的药物动力学研究
肿瘤诱导后约2周,当肿瘤尺寸达到1.5-2.0cm时,通过导管在耳缘静脉向兔静脉内注射64Cu-USPV(对于卟啉,0.33mg/kg,~5mCi)。在注射后5分钟以及0.5、1、4、8、21、30h采集动脉血(n=4)。在γ计数器(Wizard 1480:PerkinElmer Inc.,MA,美国)上,作为浓度的函数确定了血浆的放射性。通过log-线性回归确定了清除半衰期。
HNC兔的PET/CT成像
在64Cu-USPV(对于卟啉,0.33mg/kg,~5mCi)注射后24h,将兔麻醉并在MicroPET系统(Focus 220:Siemens,Munich,德国)上进行PET成像,并在注射5mL Omnipaque 350(GEHealthcare,Mississauga ON)后在microCT系统(Locus Ultra:GE Healthcare,英国)上进行CT成像。使用Amira(FEI Visualization Sciences Group,Bordeaux,法国)记录(register)并合并PET/CT图像。通过Inveon Research Workplace(Siemens,Munich,德国)在合并的CT图像上绘出感兴趣区(volume),并根据记录图像定量64Cu-USPV的标准吸收值(SUV)。
HNC兔上USPV的生物分布和离体荧光成像
在PET/CT成像后,切除兔器官,包括肿瘤、淋巴结、唾液腺、肺、心、肝、肌肉、脾和肾,称重并在γ计数器上测量放射性。对于每只兔,将器官吸收计算为每样品的总动物质量的百分比的注射剂量的百分比(SUV)。使用Maestro(Caliper Life Sciences,MA,美国),以黄色滤片设置(激发:575-605nm;发射:≥645nm检测,200ms暴露时间)进行离体荧光成像。
兔组织病理和显微成像
将冷冻组织切片固定并分别用DAPI、H&E和泛细胞角蛋白染色处理。在扫描激光共聚焦显微镜(TISSUEscope 4000,Huron Technologies)上采集染色切片的高分辨率图像。
术中荧光成像
在静脉注射4mg/kg USPV后24h,使用内部荧光成像内镜系统(650±20nm激发,700±25nm发射)对VX-2兔进行实时荧光导向的手术。通过荧光导向,切除肿瘤和怀疑的淋巴结直至在动物手术床上留下非荧光结节(nodule)。
HNC兔上的PDT
治疗研究中包括4组VX-2兔:空白对照(n=3);单独PDT激光(n=3);单独USPV注射(n=3);USPV加PDT激光治疗(n=4)。当肿瘤尺寸达到~300mm3时,对USPV组和USPV-PDT组(4mg/kg卟啉剂量),对兔静脉内注射USPV。对于PDT治疗,在注射后24h将兔麻醉并进行两步PDT程序。第一步是以125J/cm2的光剂量,200mW的激光功率和直径15mm的辐照面积将激光辐照(671nm)直射在肿瘤外表面。使用红外热感相机监控激光辐照期间肿瘤的温度变化。第二处理步骤包括将光缆(9mm漫射光纤(diffuse laser fiber))插入到肿瘤中,从而以120J/cm2的光剂量和100mW的激光功率从肿瘤内部辐照。治疗后,将兔置于标准护理规程并使用microCT扫描持续监控肿瘤生长。当肿瘤尺寸达到5000mm3时,对兔进行终末手术(Terminal surgeries)。在所有4只USPV-PDT兔中,在治疗后约30天,发现无肿瘤。在PDT后34-36天,将它们安乐死以进一步评价治疗效力。
为了评价治疗毒性,分别在注射后24h,PDT之前,PDT治疗后1周和3周,对所有治疗的兔进行综合的生物化学和血液学血液检查。在终末手术之后,在治疗后24h,收获来自肿瘤区域以及其它主要器官的组织,进行H&E和泛细胞角蛋白染色,并通过AperioImageScope成像以确定恶性肿瘤的残留。两位有经验的病理学家对于恶性肿瘤鉴别以及肿瘤根除确认评价所有组织病理学切片。
统计分析
使用学生t检验(双尾)确定TUNEL和毒性研究中不同组之间差异的统计学显著性。认为P-值小于0.05是显著的。
结果与讨论
USPV的合成和表征
我们产生了具有胆甾醇油酸酯疏水核的超小卟啉运载体(USPV),其被卟啉脂质以及DMPC的磷脂单层包膜并受18个氨基酸的ApoA-1模拟肽限制。我们发现USPV的结构和光物理性质取决于卟啉-脂质相对于DMPC的比值。如图1所示,提高卟啉脂质相对于DMPC的比值导致卟啉荧光猝灭升高和颗粒尺寸增加。当该比值大于30%时,实现高荧光猝灭(>95%)并且颗粒尺寸仍控制在30nm以下。选择具有30%mol卟啉-脂质/70%mol DMPC的USPV作为最佳USPV用于进一步应用研究,这是因为它对于稳定且单分散的USPV含有最大的卟啉脂质,具有良好的尺寸(<30nm,图2),并且显示出有效的荧光猝灭。
USPV的吸收和圆二色(CD)光谱
基于焦脱镁叶绿酸-脂质(pyro-脂质)的吸光光谱,估计的USPV消光系数ε680为7.8×107cm-1M-1。这种提高的光吸收表明了USPV中高密度的卟啉环境。CD光谱确认了USPV的α螺旋结构(图3)。
荧光和单线态氧的产生
通过在相同卟啉浓度下,将PBS中完整颗粒的荧光和单线态氧的产生与Triton X-100中其结构破坏样品相比较,研究了USPV的光学性质。如图4所示,与对于卟啉体所观察到的类似,高密度卟啉环境极大地限制了USPV的荧光产生和单线态氧产生。当与纳米结构-破坏的样品相比时,USPV荧光淬灭100倍。一旦在宽范围光通量(0.5-10J/cm2)下进行PDT激光(671nm)辐照,与纳米结构-破坏的样品相比,USPV显示出2-3倍更少的单线态氧产生。因此,完整的USPV是光动力学无活性的,而当纳米结构破坏时,它将成为PDT活性的。
USPV的细胞吸收以及体外荧光激活
为了研究小型颗粒是否对胞内吸收有利,通过测量细胞溶解缓冲液中的卟啉荧光信号,在U87神经胶质瘤细胞中检查了USPV和卟啉体的细胞吸收。与卟啉体相比,通过相同浓度卟啉培育之后,在U87细胞中,USPV10显示出约10倍更高的吸收(图5a)。通过共聚焦研究,进一步评价了细胞中卟啉荧光激活。与细胞中卟啉体破环(它是耗时的方法,通过细胞中卟啉荧光逐渐未淬灭所证实)不同,在与USPV培育3h之后U87细胞中立即观察到强烈的卟啉荧光(图5b),并且荧光信号不会随时间进一步显著提高。总之,这些数据表明小型USPV不但有利于细胞内化,而且还有利于细胞中光学性质激活。
血液清除
为了检查USPV的药物动力学曲线,对健康小鼠进行血液清除研究。本研究包括3组:USPV、PEG-USPV(聚乙二醇化USPV)和活性靶向FR-USPV(叶酸酯受体-靶向USPV)。使用荧光测量,在施用后不同时间点测量了血清中卟啉的浓度。如图6所示,不考虑PEG化,USPV和PEG-USPV具有类似且良好的缓慢循环半衰期(分别地,对于USPV 9.9h,对于USPV-PEG9.5h),表明不需要PEG化来改善体内循环,而PEG化对于大多数脂质体结构来说是改善它们体内稳定性所必不可少的。有趣地,与我们先前的观测结果(卟啉体制剂中叶酸酯-脂质的加入缩短了颗粒体内循环时间)相反(10),FR-USPV显示出显著延长的缓慢半衰期(叶酸酯-USPV的13.3h相对于FR-卟啉体的<4h)。由于EPR作用在纳米颗粒肿瘤积累中起重要作用,因此该延长的循环将有益于来自血液循环的纳米颗粒直接向组织的渗透,并且提高了颗粒在靶向患病区域中的保留。因此,与叶酸酯-卟啉体相比,对于FR-阳性癌症类型,预期FR-USPV将具有更有效的靶向递送和更有效的光学性质(荧光和单线态氧的产生)激活。
USPV的肿瘤-特异性积累
我们最近开发了亚40nm卟啉脂质纳米盘(nanodisc)并且证明与较大尺寸的卟啉体(130nm)相比,在扩散通过肿瘤富含胶原蛋白的基质中,小型纳米盘显示出扩散系数提高5倍(19)。在本发明中,我们研究了小型USPV相对于卟啉体的体内递送优势。以200nmol的卟啉浓度,对具有9Lluc神经胶质瘤的小鼠注射USPV(21nm)和卟啉体(130nm),并且施用后24h,在麻醉下除去小鼠颅骨以暴露出肿瘤用于原位荧光图像。如图7中列所示,通过荧光成像,USPV和卟啉体可以清楚显示肿瘤与周围健康的脑,这与BLI成像所限定的肿瘤位点匹配良好(图7,左列)。然而,来自施用USPV的肿瘤的荧光信号比施用卟啉体的要强的多,这表明超小USPV(<30nm)对提高肿瘤-特异性积累的益处。通过离体脑组织成像(图8a)进一步证明了USPV在9Lluc神经胶质瘤肿瘤中的肿瘤积累特异性,其中脑中荧光核与H&E组织学切片所示的肿瘤区域匹配良好(图8b)。我们使用冷冻脑组织切片的共聚焦成像在显微水平进一步验证了USPV的肿瘤-特异性吸收,其中仅在肿瘤边缘区域观察到了强烈的卟啉信号,但是在对侧脑区域中未观察到(图8c)。
USPV用于药物递送的可能
由于USPV具有包含被脂质单层包围的疏水核的核-壳纳米结构,因此其具有负载和安全递送疏水性生物活性化合物的有利可能。在本研究中,将近红外荧光疏水性染料DiR-BOA用作药物替代物以检验USPV的药物负载能力和递送性能。通过在USPV制剂(0.9μmol卟啉-脂质,2.1μmol DMPC和0.3μmol CO)中加入0.5mol DiR-BOA,将DiR-BOA成功负载到颗粒中,负载效率85%。由于在30天内观察了最小尺寸变化和可忽略的DiR-BOA渗漏,因此尺寸22.5nm的所得USPV(DiR-BOA)(图9a)在4℃,在PBS中相当稳定。然后,我们研究了USPV(DiR-BOA)在具有正位U87神经胶质瘤的小鼠中的体内行为。注射USPV(DiR-BOA)24h后,在麻醉的情况下,对小鼠进行颅骨去除手术,并且使用CRI MaestroTM成像系统分别在卟啉通道(Ex:615nm,Em:680-750nm)和NIR药物替代物通道(Ex:750nm,Em:780-950)进行荧光成像。如图10a所示,卟啉和DiR-BOA信号高度集中在肿瘤中,其清楚显示了肿瘤边缘,同时免去了附近健康的脑。另外,很好地共定位了这两种荧光信号,这表明USPV(DiR-BOA)使得能够选择性地在肿瘤中稳定且有效地递送药物替代物。更有趣地,这种高效递送使得能够使用深红色长通滤片,通过体内荧光共聚焦显微镜检查在显微水平上荧光检测肿瘤细胞,同时免去非荧光的对侧脑细胞(图10b)。为了进一步验证USPV的肿瘤-特异性积累,当处死动物时,通过荧光成像检查了其组织生物分布。如图10c所示,仅神经胶质瘤肿瘤和肝显示出强烈的卟啉和DiR-BOA荧光信号,而其它器官显示出可忽略的荧光,从而证明了USPV(DiR-BOA)极高的肿瘤-特异性吸收。与大部分纳米颗粒递送类似,USPV的高肝脏吸收可能是由于它们的肝胆清除(hepatobillary clearance)所造成的。但是与包括卟啉体的大部分纳米颗粒递送不同,USPV的脾吸收要低得多,这可能受益于其超小尺寸,而这种超小尺寸有助于从网状内皮系统的滤出中“逃离”。在所有检测组织中卟啉荧光和DiR-BOA荧光之间良好的相关性(图10c)进一步证明了在全身递送中结构完整的USPV(DiR-BOA)在各种组织中的积累。总之,这些数据表明1)USPV为癌疗法提供了高度肿瘤选择性的且有效的药物递送系统,同时预先渗漏和脱靶效应最低;2)由于稳定的递送性质,USPV的卟啉信号(如荧光)可以用于追踪药物递送以指导治疗计划。
用于PET成像的USPV的固有64Cu-标记
由于卟啉是多种金属的强螯合剂,从而形成了高度稳定的金属复合物(20)。我们先前的研究证明了放射性铜64(64Cu)对卟啉体的卟啉-脂质的稳定螯合作用,这使得能够对纳米颗粒的体内去向进行PET成像(11-12)。使用类似的标记方法,我们以高64Cu标记效率(>95%)成功地将64Cu掺入了预先形成的USPV并随后研究了其递送行为。如图11所示,64Cu-USPV能够选择性地挑出卵巢癌转移,其中转移肿瘤显示出超亮的PET信号,而周围组织,如输卵管显示出最低的信号。通过离体组织卟啉荧光成像进一步确认了PET成像-实现的肿瘤-特异性挑选,其与来自肿瘤细胞的生物发光信号良好相关。通过组织学分析进一步鉴别出转移组织。因此,USPV固有64Cu标记使得能够无创且准确追踪纳米颗粒递送并且另外由于其肿瘤-优先积累而检测肿瘤,因此显示出临床应用转化的巨大前景。
另外,USPV可以容易地与其它金属螯合。例如,对于MRI,顺磁Mn3+离子的插入可以产生对比度(21),并且在USPV中掺入钯(Pd)可以进一步改善单线态氧的产生以使PDT效力最大(22)。
USPV用于荧光-导向的肿瘤切除术(FGR)的可能
肿瘤的手术去除仍是临床实践中神经胶质瘤治疗的主流,并且结局影响患者的存活。手术程序中的主要挑战在于确定阳性边缘。不充分的手术将导致肿瘤局部复发和抢救疗法失败,而过度切除将导致重要神经功能的损失。因此,手术期间准确限定切除边缘对于脑是必不可少的。我们已证明在全身施用后24h,USPV(DiR-BOA)通过固有卟啉荧光和DiR-BOA信号显示肿瘤和限定肿瘤区与周围健康脑的能力。然后,我们研究了其在荧光-导向的神经胶质瘤手术中的潜在应用。为了模拟临床情况,使用了正位U87GFP神经胶质瘤小鼠模型,其具有深度植入脑内部的肿瘤(距顶部表面5mm)。如图12a所示,在USPV(DiR-BOA)注射24h后,使用Maestro成像系统从完整脑的顶部表面未观察到固有卟啉荧光和DiR-BOA荧光,但是通过FMT成像可以清楚检测到两种荧光信号。在图12b中所示的横切过程后,通过除去脑的顶部部分暴露出神经胶质瘤肿瘤。由于底部部分含有该实体瘤整体,因此将具有最少肿瘤残余的顶部部分认为是手术床。如图12c所示,由于与肿瘤细胞的GFP荧光良好相关,因此卟啉和DiR-BOA信号能够准确显像并限定肿瘤组织。然后,采集卟啉荧光组织并送去进行组织学分析和冷冻组织切片。如图13所示,H&E染色显示了该组织的癌细胞形态。同时,冷冻组织切片在显微水平显示了GFP信号(来自肿瘤细胞)和卟啉信号(来自USPV),进一步确认了USPV显示肿瘤用于成像-导向的手术的能力。此外,USPV的卟啉荧光可以鉴别出尺寸范围在4mm至小于1mm的通过小鼠脑分散的U87luc肿瘤的多个病灶,这些甚至通过MRI扫描也不能检测。如图14所示,移除的荧光病灶清楚地显示出肿瘤细胞的固有生物发光信号。总的来说,这些结果证明了USPV对于肿瘤鉴别的高特异性和灵敏度,从而为荧光-导向的神经胶质瘤手术提供了优良的工具。
USPV作为可激活光动力学纳米信标的可能
由于在完整纳米结构中USPV的荧光和单线态氧的产生高度淬灭并且在肿瘤中积累后可以快速恢复。我们广泛研究了USPV对于体内PDT的潜在应用。USPV的荧光激活可以用作评价纳米结构破坏和单线态氧激活的有用指示物。如先前所提到的,在注射后24h,神经胶质瘤肿瘤显示出显著提高的卟啉荧光。然后,我们选择该时间点用于激光辐照。简要地,在USPV注射24h后,以4mg/kg卟啉剂量,以50J/cm2或37.5J/cm2的光通量,通过小皮肤切口跨颅应用激光辐照(671nm,50mW/cm2)。通过热感相机实时监控激光辐照期间的肿瘤温度。治疗后24h,处死动物并将脑组织制备用于组织学分析和TUNEL染色。将仅接受激光辐照的具有神经胶质瘤肿瘤的小鼠和仅接受USPV的具有神经胶质瘤肿瘤的小鼠分别用作激光对照和USPV对照。对于所有激光治疗组,未观察到肿瘤温度显著提高(稳定保持在27℃左右),表明无有助于治疗的光热效应(图15)。在以50J/cm2或37.5J/cm2的光通量的USPV-PDT之后,肿瘤组织在H&E染色中显示出致密的细胞核和细胞结构损失,而来自USPV的肿瘤组织和激光对照保持不受影响(图16),表明USPV-实现了有效的PDT以及单独的USPV和激光辐照的非侵害性。TUNEL染色进一步确认USPV-PDT引起了明显的细胞凋亡,对于50J/cm2组,75.4%的TUNEL-阳性细胞,对于37.5J/cm2组,82.1%的TUNEL-阳性细胞(图17),而对于对照组未观察到显著的细胞凋亡。另外,USPV-PDT组的周围脑组织中无可观察的组织学变化和细胞凋亡,这表明USPV-PDT所引起的副作用可忽略。因此,USPV能够以极低的光剂量进行肿瘤-特异性PDT同时保持正常健康,因而提供了安全的PDT治疗规程。
USPV对于大型动物兔模型中头颈癌(HNC)控制的临床前应用。
HNC患者的低存活率可归因于疾病诊断晚以及复发率高。目前的HNC分级面临对于适当治疗控制,诊断的准确度不够且灵敏度低。具有PET固有多模态性(multimodalities)、荧光成像和PDT的USPV可以提供提高HNC分级准确性以及改革HNC管理的巨大可能。使用在肿瘤诱导后可以一致地发展向局部淋巴结的转移的临床相关VX-2颊癌兔模型,我们研究了USPV对于HNC诊断和管理的能力。
USPV-PET使得能够在HNC兔模型中检测原发瘤和哨位淋巴结
将VX-2兔中64Cu-USPV的血液清除曲线对二室模型进行拟合,其显示出最长达27.7h的有利的缓慢半衰期(图18a)。因此,静脉注射64Cu-USPV(0.34mg/kg卟啉,~5mCi)后24h,对VX2兔进行PET成像以将其生物半衰期与放射性核素半衰期(64Cu t1/2=12.7h)相匹配。如PET/CT共配准图像(co-registered)(图18b,图19)所示,肿瘤和哨位淋巴结(SLN)具有高对比度,清楚可辨。与渲染图像(rendered image)一致,肿瘤和SLN显示出与周围肌肉相比显著更高的根据PET兴趣体积(volume-of-interest)(VOI)测量定量的标准吸收值(SUV),其分别为3.58±0.53、2.57±0.53和0.35±0.02(n=5,P<0.05,图18c)。
通过γ-计数法进一步评价了主要器官中64Cu-USPV的分布,其显示了具有肿瘤和健康兔中USPV类似的分布图案(图18d)。肝的相对较高的标准吸收值(SUV)(对于具有肿瘤和健康的兔分别为9.34±0.92SUV和10.54±1.68SUV)可能是由于64Cu-USPV的肝胆清除造成的。然而,考虑到肝距头颈区相对远的位置,这种高吸收将不会影响HNC检测。根据γ-计数,肿瘤和SLN的平均吸收分别为3.14±0.26SUV和2.21±0.26SUV(图18d,n=5),这与它们从PET图像VOI定量获得的相应SUV一致(图18c)。具有肿瘤的兔的SLN显示出比健康的兔显著更高的吸收(0.87±0.13SUV,n=3,P<0.01),这可能是由于淋巴流升高以及存在通过H&E分析和泛细胞角蛋白(PanCK)染色所鉴别的转移性病变所造成的(图20)。因此,64Cu-USPV能够描绘来自健康个体的恶性SLN。
以下切除组织的离体荧光成像进一步确认了具有肿瘤的兔的肿瘤和引流SLN中USPV显著较高的积累和荧光激活(图18e)。尽管64Cu-USPV的积累相对较高,但是唾液腺中观察到的荧光信号是可忽略的(图18e),这可能是由于尽管USPV像其它PET图像试剂(例如,18F-FDG)一样在唾液腺中非特异性地积累,但是它保持完整且无荧光的事实。这些结果表明通过进行PET和荧光成像,USPV能够为转移性淋巴结的精确检测提供补充信息,并且可以在唾液腺低背景荧光条件下,潜在地用于图像-导向的淋巴结切除术。
原发瘤和转移性疾病的荧光-导向的切除术
通过利用USPV在肿瘤和转移性淋巴结中的选择性荧光激活,我们评价了USPV作为荧光术中指导在具有肿瘤的兔中用于原发瘤和SLN的手术切除术的能力。如图21a所示,与周围组织相比,在体内荧光成像系统下肿瘤(具有完整皮肤)对于显像是充分荧光的。在手术探索期间,一旦提起皮瓣,则肿瘤暴露并且通过卟啉荧光清楚显示(图21b)。通过荧光导向,手术除去检查周围所有怀疑的恶性肿瘤。手术床显示出可忽略的荧光信号,表明肿瘤完全切除(图21c)。通过组织学分析确认切除的组织是恶性的(图21d)。组织的组织学切片中的卟啉荧光与癌细胞形态以及阳性PanCK染色对应良好,这表明USPV荧光在细胞水平以显著的特异性和准确性突出显示了原发瘤(图21d)。同样地,USPV荧光还描绘了体内引流SLN(图21e)。值得注意地,通过荧光信号精巧地绘制了从原发瘤至SLN以及至局部淋巴结的淋巴网络(图21f)。按照淋巴网络的取向(放大图像,图21f中的位置1-5),鉴别了继发性阳性淋巴结(secondary positive lymph node)和淋巴扩散图案。组织学研究确认了淋巴结中的转移,并且在PanCK阳性区中观察到了强烈的卟啉荧光,这表明了转移性区域中USPV的吸收(图21g)。总之,USPV荧光不但清楚地描绘了原发瘤和恶性淋巴结,而且还描绘了区域淋巴网络,这可以潜在地有助于HNC患者的结节分级,并且在切除术和病理学分析之前显示恶性淋巴结。
USPV-实现的PDT诱导的细胞凋亡
对HNC兔评价了USPV-PDT的长期治疗效果。将平均肿瘤尺寸300mm3的具有肿瘤的兔分为4组,其包括空白对照(n=3)、仅激光的对照(n=3),仅USPV的对照(n=3)和USPV-PDT组(n=4)。如图22a所示,在USPV注射后24h,将两步激光辐照策略用于PDT以辐照整个肿瘤区域。激光治疗期间无明显温度升高,这确认了无治疗的热效应,从而排除了热效应可能对邻近健康组织造成无意的副作用的担心(图23)。从PDT后24h开始,USPV-PDT在肿瘤周围造成疤痕,直至治疗后26天。最终,在治疗后34天,所有USPV-PDT兔无明显肿瘤(图22b)。通过3D重建microCT图像的体积测量定量确定治疗后的肿瘤体积。USPV-PDT组显示在治疗后第1周内,肿瘤尺寸轻微增加,这可能归因于预期的炎症反应以及由PDT所造成的水肿(图22c)。然而,从PDT后6天开始,肿瘤尺寸逐渐减小直至PDT后34天检测不到肿瘤。相反,接受单独的激光辐照或USPV施用的对照组显示出指数肿瘤生长,这类似于空白对照,表明它们均不会引起任何治疗作用(图22d,图24)。对于空白对照、激光对照和USPV对照,对照组分别在第6、8和9天达到终点(肿瘤体积>5000mm3)(图5d)。通过病理学分析进一步确认USPV-PDT使得能够完全肿瘤切除,这表明除了其阴性PanCK染色外,在终末手术中从原始肿瘤区域切除的组织未显示出病理细胞形态(图22e)。值得注意地,尽管未接受直接激光辐照,但是USPV-PDT组的淋巴结显示从PDT后14天开始,尺寸逐渐减小(图25)。在PDT后34天,发现来自USPV-PDT组的所有淋巴结无转移,如通过病理和PanCK染色分析所显示的(图22f)。这些结果强烈表明对于通过手术难接近的或邻近于重要解剖结构,如口咽、鼻咽、下咽部的HNC亚型以及对于复发病例,USPV-PDT可以用作放疗和化疗的替代方法以提高治疗效力并降低长期毒性。USPV-PDT似乎是非常有效的,高度局部化的并且使得能够保留健康组织功能。
USPV是安全的多功能纳米平台
通过定期血液测试评价了USPV-PDT对兔的毒性(图26a)。除碱性磷酸酶(ALP)外,治疗后兔的肝功能维持正常而无显著变化,所述碱性磷酸酶在治疗后1周,在正常范围内适度降低(从68.1±8.66至43.5±9.67U/L)并随时间返回基线水平(正常范围12-98U/L)。治疗后,红细胞水平保持稳定,这表明内源卟啉(亚铁原卟啉(heme))对生理调控无干扰。白细胞计数也保持不受影响,这表明USPV未引起免疫原性作用。对USPV-PDT兔的死后组织学分析在心、肺、肝、脾、肾上腺或肌肉中未显示出异常细胞形态(图26b)。这些结果表明USPV-实现的PDT治疗是安全的治疗方法。
总之,本文描述了具有疏水核的多模态性治疗诊断卟啉运载体,其被卟啉脂质类磷脂单层包膜并受α螺旋结构限制。在完整USPV中高密度堆积的卟啉导致它们的光活性显著淬灭,包括荧光和单线态氧的产生,而当纳米结构破坏时,它们成为光动力活性的。USPV对于药物递送具有多种有利特征,如疏水性药物-负载能力,超小尺寸(<30nm)和优良的血液循环特性(小鼠中10h的循环半衰期,兔中27h)而无需PEG化。我们验证了USPV是肿瘤-特异性递送的稳定药物递送平台。USPV的固有64Cu标记使得能够无创追踪药物递送,因此为理性剂量学和治疗计划提供了有用的方式。在临床相关淋巴转移兔模型中,我们证明USPV有利于精确检测原发瘤和转移性结节,并且使得能够通过术前PET和术中荧光成像对从肿瘤至局部淋巴结的淋巴引流显像。对转移性淋巴途径的理解可以允许以更高的灵敏度鉴别未知的原发和复发肿瘤以改善治疗结局。此外,在神经胶质瘤小鼠和HNC兔模型中,在肿瘤积累后,高密度堆积的卟啉的有效光学性质激活允许精确的荧光-导向的肿瘤切除术和有效的PDT,从而提供了原发瘤的完全根除并且阻止肿瘤转移而不会损害邻近重要结构。因此,USPV的固有多模态性和良好的递送特征为癌症治疗诊断学和临床转化提供了很大可能,从而通过整合PET/CT和荧光成像提高癌症诊断,并且通过调整通过荧光-导向的手术性和选择性PDT的治疗改善癌症的治疗效力和特异性。
尽管已描述了本发明的优选实施方式,但是本领域技术人员将理解在不背离本发明的精神或所附权利要求的范围的情况下,可以对其作出改变。本文所公开的所有文档,包括以下参考文献列表中的那些作为参考并入本文。
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Claims (36)
1.一种包含磷脂单层、卟啉-磷脂结合物和包封疏水核的肽的纳米囊泡,其中
所述肽包含能够形成至少一种两亲性α-螺旋的氨基酸序列;
所述卟啉-磷脂结合物包含优选地在sn-1或sn-2位置共价连接到一种磷脂的脂质侧链的一种卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物;
卟啉-磷脂结合物相对于磷脂的摩尔%为35%或更小;
所述纳米囊泡的直径为35nm或更小。
2.根据权利要求1所述的纳米囊泡,其中卟啉-磷脂结合物相对于磷脂的摩尔%为35%或更小、30%或更小、25%或更小、或者20-30%。
3.根据权利要求1-5中任一项所述的纳米囊泡,其中所述纳米囊泡为基本球形的并且直径为30nm或更小、直径为25nm或更小、直径为20-30nm之间或直径为约25nm。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的纳米囊泡,其中所述卟啉-磷脂结合物中的卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物选自由以下各项组成的组中:血卟啉、原卟啉、四苯基卟啉、焦脱镁叶绿酸、细菌叶绿素、叶绿素a、苯并卟啉衍生物、四羟基苯基二氢卟酚、紫红素、苯并二氢卟酚、萘并二氢卟酚、胆绿素、玫红素、酮二氢卟酚、氮杂二氢卟酚、菌绿素、甲苯基卟啉、苯并菌绿素、扩展卟啉和卟啉异构体。
5.根据权利要求4所述的纳米囊泡,其中所述扩展卟啉为德克萨卟啉、萨普卟啉或六元卟啉,并且所述卟啉异构体为卟啉烯、反转卟啉、酞菁或萘酞菁。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的纳米囊泡,其中所述卟啉-磷脂结合物中的卟啉为焦脱镁叶绿酸-a酸。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的纳米囊泡,其中所述卟啉-磷脂结合物中的卟啉为细菌叶绿素衍生物。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的纳米囊泡,其中所述卟啉-磷脂结合物中的磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇。
9.根据权利要求8所述的纳米囊泡,其中所述磷脂包含12至22个碳的酰基侧链。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡,其中所述卟啉-磷脂结合物中的磷脂为1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱或者1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。
11.根据权利要求1-3中任一项所述的纳米囊泡,其中所述卟啉-磷脂结合物为pyro-脂质。
12.根据权利要求1-3中任一项所述的纳米囊泡,其中所述卟啉-磷脂结合物为氧-细菌叶绿素-脂质。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡,其中卟啉通过0至20个碳的碳链接头结合至磷脂上的甘油基。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的纳米囊泡,其中所述卟啉-磷脂结合物包含其中螯合的金属,可选地金属的放射性同位素。
15.根据权利要求14所述的纳米囊泡,其中所述金属选自由以下各项组成的组中:Zn、Cu、Mn、Fe和Pd。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的纳米囊泡,其中磷脂是阴离子磷脂。
17.根据权利要求16所述的纳米囊泡,其中所述磷脂选自由以下各项组成的组中:磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰甘油、以及它们的组合。
18.根据权利要求16所述的纳米囊泡,其中所述磷脂选自由以下各项组成的组中:1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸(DPPA)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二山嵛酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DBPC)、1,2-二花生四烯基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DAPC)、1,2-双二十四烷酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DLgPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-[磷-外消旋-(1-甘油)](DPPG)以及它们的组合。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的纳米囊泡,其中所述肽选自由以下各项组成的组中:A、H、L和M类两亲性α-螺旋、它们的片段、以及包含所述A、H、L和M类两亲性α-螺旋的反向肽序列的肽或它们的片段。
20.根据权利要求19所述的纳米囊泡,其中所述肽由脱辅基蛋白的连续氨基酸组成,所述脱辅基蛋白优选地选自由以下各项组成的组中:apoB-100、apoB-48、apoC、apoE和apoA。
21.根据权利要求19所述的纳米囊泡,其中所述肽选自由以下各项组成的组中:2F(DWLKAFYDKVAEKLKEAF)、4F(DWFKAFYDKVAEKFKEAF)、和上述各项的反向序列。
22.根据权利要求19所述的纳米囊泡,其中所述肽为R4F肽(Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD)。
23.根据权利要求20或21所述的纳米囊泡,其中至少一种两亲性α-螺旋或肽的长度在6至30个氨基酸之间、8至28个氨基酸之间、10至24个氨基酸之间、11至22个氨基酸之间、14至21个氨基酸之间、16至20个氨基酸之间或长度为18个氨基酸。
24.根据权利要求1-24中任一项所述的纳米囊泡,其中疏水核包含疏水性诊断剂或治疗剂。
25.根据权利要求25所述的纳米囊泡,其中所述疏水核包含紫杉醇、多西他赛、1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物双-油酸酯(DiR-BOA)。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的纳米囊泡,其中所述纳米囊泡是无PEG的。
27.根据权利要求1-25中任一项所述的纳米囊泡,还包含PEG,优选地PEG-脂质,进一步优选地PEG-DSPE。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的纳米囊泡,还包含靶向分子。
29.一种对受试者中靶区域成像的方法,包括:
a.提供权利要求1-28中任一项所述的纳米囊泡;
b.将所述纳米囊泡施用至所述受试者;和
c.对所述靶区域成像。
30.根据权利要求29所述的方法,其中所述靶区域为肿瘤。
31.权利要求1-28中任一项所述的纳米囊泡对受试者中靶区域,优选地肿瘤进行成像的用途。
32.一种对受试者中靶区域实施光动力学的方法,包括:
a.提供权利要求1-28中任一项所述的纳米囊泡;
b.将所述纳米囊泡施用至所述受试者;和
c.在所述靶区域用光的波长照射所述纳米囊泡,其中所述光的波长激活了卟啉-磷脂结合物以产生单线态氧。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述靶区域为肿瘤。
34.一种向受试者递送疏水性试剂的方法,包括:
a.提供权利要求1-23中任一项所述的纳米囊泡,其中疏水核包含所述试剂;和
b.将所述纳米囊泡施用至所述受试者。
35.根据权利要求28所述的方法,其中所述靶区域为肿瘤。
36.权利要求1-23中任一项所述的纳米囊泡用于递送对受试者中靶区域进行成像的疏水性试剂的用途,其中疏水核包含所述试剂。
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