JP2017524678A - ペプチド含有ポルフィリン脂質ナノ小胞 - Google Patents

Abstract

リン脂質の単層、ポルフィリン−リン脂質結合体およびペプチドを封入する疎水性コアを含む、ナノ小胞であって、ペプチドは、少なくとも１つの両親媒性α−ヘリックスを形成できるアミノ酸配列を含み、ポルフィリン−リン脂質結合体は、好ましくは１つのリン脂質のｓｎ−１またはｓｎ−２の位置において脂質側鎖に共有結合している１つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含み、リン脂質に対するポルフィリン−リン脂質結合体のモル％は３５％以下であり、ナノ小胞は直径が３５ｎｍ以下である、ナノ小胞が本明細書に提供される。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、米国仮出願第６２／０１４，９６４号に対する優先権を主張する。

本発明は、ナノ小胞、より具体的には、リン脂質、ポルフィリン−リン脂質結合体およびペプチド封入疎水性コアを含むナノ小胞に関する。

近年、バイオセンサー、診断用ナノプローブ、および標的薬物送達などの多くの用途向けに多機能ナノ粒子が開発されている。この試みは、診断および治療における生物学的特異性を改善する必要性によって、かなりの程度まで推進されている。クロロフィルからの色素であるポルフィリンおよびそれらの誘導体は、がんの光線力学療法（ＰＤＴ）および蛍光イメージングにおいて特に成功していることが証明されている（非特許文献１〜４）。しかしながら、生理学的状態での水溶液へのそれらの難溶性はそれらの臨床用途を妨げる（非特許文献５）。これらの疎水性光増感剤を、リポソーム、高分子、金およびシリカのナノ粒子を含む、様々なナノ粒子に封入または付着させて、それらの全身送達効率を改善するための試みが続けられている（非特許文献６〜８）。しかしながら、封入法はポルフィリン分子を担持することに制限を有する。例えば、ナノ構造を安定に保つためにリポソームは１５モル％未満しか担持することができない（非特許文献６）。

最近、本発明者らは、１００％のポルフィリン−リン脂質結合体でも自己集合するポルフィゾーム（ｐｏｒｐｈｙｓｏｍｅ）ナノ構造を開発した（非特許文献９）。リポソーム様二分子膜内に完全に配置される高密度のポルフィリン分子を有する安定なナノ構造（直径１００〜１５０ｎｍ）は、ポルフィリンモノマーよりも、ポルフィゾームに新たなバイオフォトニック機能を与える。感光性のそのナノ構造に依存する「超」吸収（吸光係数ε_６８０＝２．９×１０^９Ｍ^−１ｃｍ^−１）および「超」クエンチングは極めて高い効率で光エネルギーを熱に変換し、有機ナノ粒子にとって前例のない理想的な光熱および光音響特性を与える。受容体媒介性ナノ粒子の取り込みは、ポルフィゾーム細胞内内在化およびナノ構造破壊を促進し、非侵襲的な蛍光イメージングおよび有効なＰＤＴのためのポルフィリンの感光性の回復をもたらす（非特許文献１０）。さらに、放射性銅６４（^６４Ｃｕ）が、非侵襲性ＰＥＴイメージングのために予め形成されたポルフィゾームのポルフィリン−脂質構成要素内に直接組み込まれ得る（非特許文献１１〜１２）。したがって、ポルフィリンで構築されたナノ粒子の固有の多様性は、がんの診断および臨床解釈について高い可能性を与える。

１００〜１５０ｎｍのサイズ範囲のポルフィゾームは、増強した浸透性および保持（ＥＰＲ）効果によって悪性腫瘍において優先的な蓄積を示すが、腫瘍内での十分な浸透について拡散障害に遭遇する可能性がある。最近の研究により、４０ｎｍ未満のナノ粒子は、それらのより大きな対応物よりも、線維腫において深く浸透することについて効果的であることが実証された（非特許文献１３〜１５）。例えば、Ｃａｂｒａｌらは、高浸透性腫瘍および低浸透性腫瘍の両方において、異なるサイズの薬物負荷高分子ミセル（３０、５０、７０および１００ｎｍの直径を有する）の蓄積および有効性を比較した。全てのポリマーミセルはマウスにおいて高浸透性腫瘍に浸透したが、３０ｎｍのミセルだけが、抗腫瘍効果を達成するために低浸透性膵臓腫瘍に浸透できた（非特許文献１４）。したがって、より小さなサイズ（＜３０ｎｍ）を有するポルフィリンナノ粒子の開発は、特に低い浸透性を有する腫瘍において、腫瘍間質を通るそれらの拡散輸送を高める可能性を有し、治療的に関連した濃度に到達する効果的な浸透および蓄積を可能にする。しかしながら、ポルフィン（ｐｈｏｐｈｙｒｉｎ）−脂質の自己集合によってより小さなポルフィゾームを作り出す試みは、表面曲率の結果として不安定性の増加に起因して困難なままである。

さらに、出願人は、以前の特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６および特許文献７を参照し、それらの全ては参照により本明細書に組み込まれる。

ＰＣＴ特許公報第１１／０４４６７１号 ＰＣＴ特許公報第１２／１６７３５０号 ＰＣＴ特許公報第１３／０５３０４２号 ＰＣＴ特許公報第１３／０８２７０２号 ＰＣＴ特許公報第１３／１５９１８５号 ＰＣＴ特許公報第１４／００００６２号 ＰＣＴ特許公報第０９／０７３９８４号

Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ ＴＪ， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ． （Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９０（１２）：８８９−９０５ （ｉｎ ｅｎｇ） Ｅｔｈｉｒａｊａｎ Ｍ， Ｃｈｅｎ Ｙ， Ｊｏｓｈｉ Ｐ， ＆ Ｐａｎｄｅｙ ＲＫ （２０１１） Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ． （Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ ４０（１）：３４０−３６２ （ｉｎ ｅｎｇ） Ｓｔｅｆｆｌｏｖａ Ｋ， Ｃｈｅｎ Ｊ， ＆ Ｚｈｅｎｇ Ｇ （２００７） Ｋｉｌｌｅｒ ｂｅａｃｏｎｓ ｆｏｒ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ． （Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １４（２０）：２１１０−２１２５ （ｉｎ ｅｎｇ） Ｚｈｅｎｇ Ｇ， ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ ａｓ ａｎ ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｉｎｇｌｅｔ ｏｘｙｇｅｎ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． （Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０４（２１）：８９８９−８９９４ （ｉｎ ｅｎｇ） Ｊｏｓｅｆｓｅｎ ＬＢ ＆ Ｂｏｙｌｅ ＲＷ （２０１２） Ｕｎｉｑｕｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ ａｎｄ ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ ｉｎ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ， ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ． （Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ２（９）：９１６−９６６ （ｉｎ ｅｎｇ） Ｃｈｅｎ Ｂ， Ｐｏｇｕｅ ＢＷ， ＆ Ｈａｓａｎ Ｔ （２００５） Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｓｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ． （Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ ２（３）：４７７−４８７ （ｉｎ ｅｎｇ） Ｋｏｍａｔｓｕ Ｔ， Ｍｏｒｉｔａｋｅ Ｍ， Ｎａｋａｇａｗａ Ａ， ＆ Ｔｓｕｃｈｉｄａ Ｅ （２００２） Ｓｅｌｆ−ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ｌｉｐｉｄ−ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ｂｉｌａｙｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｉｎ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｆｏｒｍ： ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ａｎｄ ｄｉｏｘｙｇｅｎ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ． （Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８（２３）：５４６９−５４８０ （ｉｎ ｅｎｇ） Ｇｈｏｒｏｇｈｃｈｉａｎ ＰＰ， ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ−ｅｍｉｓｓｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅｓ： ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｓｏｆｔ ｍａｔｔｅｒ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｏｐｔｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ． （Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０２（８）：２９２２−２９２７ （ｉｎ ｅｎｇ） Ｌｏｖｅｌｌ ＪＦ， ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｐｏｒｐｈｙｓｏｍｅ ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ｂｉｌａｙｅｒｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ａｓ ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃ ｃｏｎｔｒａｓｔ ａｇｅｎｔｓ． （Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ｎａｔ Ｍａｔｅｒ １０（４）：３２４−３３２ （ｉｎ ｅｎｇ） Ｊｉｎ ＳＣ， Ｃｕｉ Ｌ， Ｗａｎｇ Ｆ， Ｃｈｅｎ Ｊ， ＆ Ｚｈｅｎｇ Ｇ （２０１４） Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｐｏｒｐｈｙｓｏｍｅ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ． Ａｄｖ． Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｍａｔｅｒ Ｌｉｕ ＴＷ， ＭａｃＤｏｎａｌｄ ＴＤ， Ｓｈｉ Ｊ， Ｗｉｌｓｏｎ ＢＣ， ＆ Ｚｈｅｎｇ Ｇ （２０１２） Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ ｃｏｐｐｅｒ−６４−ｌａｂｅｌｅｄ ｏｒｇａｎｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ｒａｄｉｏｔｒａｃｅｒｓ． （Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ５１（５２）：１３１２８−１３１３１ （ｉｎ ｅｎｇ） Ｌｉｕ ＴＷ， ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｉｎｈｅｒｅｎｔｌｙ ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｄｒｉｖｅｎ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｅｓ． （Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） ＡＣＳ Ｎａｎｏ ７（５）：４２２１−４２３２ （ｉｎ ｅｎｇ） Ｐｌｕｅｎ Ａ， ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ｈｏｓｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ： ｃｒａｎｉａｌ ｖｓ． ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｔｕｍｏｒｓ． （Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９８（８）：４６２８−４６３３ （ｉｎ ｅｎｇ） Ｃａｂｒａｌ Ｈ， ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂ−１００ ｎｍ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｍｉｃｅｌｌｅｓ ｉｎ ｐｏｏｒｌｙ ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｔｕｍｏｕｒｓ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｓｉｚｅ． （Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｇ） Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ ６（１２）：８１５−８２３ （ｉｎ ｅｎｇ） Ｓｙｋｅｓ ＥＡ， Ｃｈｅｎ Ｊ， Ｚｈｅｎｇ Ｇ， ＆ Ｃｈａｎ ＷＣ （２０１４） Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ ｏｎ Ａｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ． （Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｅｎｇ） ＡＣＳ Ｎａｎｏ （ｉｎ Ｅｎｇ）

一態様において、リン脂質の単層、ポルフィリン−リン脂質結合体およびペプチド封入疎水性コアを含むナノ小胞であって、
ペプチドは、少なくとも１つの両親媒性α−ヘリックスを形成できるアミノ酸配列を含み、
ポルフィリン−リン脂質結合体は、好ましくは、１つのリン脂質のｓｎ−１またはｓｎ−２の位置において脂質側鎖に共有結合している１つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含み、
リン脂質に対するポルフィリン−リン脂質結合体のモル％は３５％以下であり、
ナノ小胞は、直径が３５ｎｍ以下である、
ナノ小胞が提供される。

一態様において、対象における標的領域上でイメージングする方法であって、本明細書に記載されているナノ小胞を提供する工程と、ナノ小胞を対象に投与する工程と、標的領域をイメージングする工程とを含む、方法が提供される。

一態様において、対象における標的領域、好ましくは腫瘍上でイメージングを実施するための本明細書に記載されているナノ小胞の使用が提供される。

一態様において、対象における標的領域上で光線力学療法を実施する方法であって、本明細書に記載されているナノ小胞を提供する工程と、ナノ小胞を対象に投与する工程と、ある波長の光で標的領域においてナノ小胞を照射する工程であって、その波長の光はポルフィリン−リン脂質結合体を活性化して一重項酸素を生成する、工程とを含む、方法が提供される。

一態様において、疎水性薬剤を対象に送達する方法であって、本明細書に記載されているナノ小胞を提供する工程であって、疎水性コアがその薬剤を含む、工程と、ナノ小胞を対象に投与する工程とが提供される。

一態様において、対象における標的領域上でイメージングを実施して疎水性薬剤を送達するための本明細書に記載されているナノ小胞の使用であって、疎水性コアがその薬剤を含む、使用が提供される。

本発明の好ましい実施形態のこれらおよび他の特徴は、参照が添付の図面によりなされる以下の詳細な説明においてより明らかになるであろう。

（ａ）０．１μｍの濾過後の種々のピロ（ｐｙｒｏ）初期投入（ピロ脂質／総リン脂質＝５％、１０％、３０％および５０％）による製剤の直径（体積分布ピーク）のサイズ。（ｂ）各製剤についてのポルフィリン蛍光消光効率。クエンチング％＝（１−ＦＩ_{ＰＢＳ中のインタクト}／ＦＩ_{トリトンにより破壊された}）×１００％。 ＵＳＰＶの体積およびＴＥＭ画像によるサイズ分布を示す。 ＵＳＰＶのＵＶ−ｖｉｓおよびＣＤスペクトル。 ＰＢＳ中のインタクトまたはトリトンＸ−１００によって破壊された、（ａ）ポルフィゾームおよび（ｂ）ＵＳＰＶの蛍光スペクトルおよび一重項酸素生成を示す。 （ａ）細胞溶解アッセイによって測定した、Ｕ８７細胞におけるポルフィゾーム対ＵＳＰＶの細胞取り込みを示す。（ｂ）ポルフィゾームおよびＵＳＰＶとインキュベートした細胞の共焦点イメージング（１０μＭのピロ脂質、３時間のインキュベーション）。 ＵＳＰＶ、ＰＥＧ−ＵＳＰＶおよび葉酸−ＰＥＧ−ＵＳＰＶの血中クリアランスプロファイルを示す。 同じピロ脂質濃度（２００ｎｍｏｌ）で（ａ）ポルフィゾームおよび（ｂ）ＵＳＰＶを注射した９Ｌ^ｌｕｃ神経膠腫保有マウスの生物発光画像（左パネル）およびインサイチュ蛍光画像（中央パネル）および白色光写真（右パネル）を示す。 （ａ）９Ｌ^ｌｕｃ神経膠腫保有マウス由来の脳の白色光画像（左）およびエキソビボ蛍光画像（右）、（ｂ）腫瘍領域（白色の点線で囲んだ領域）を確認する対応するＨ＆Ｅの結果、（ｃ）９Ｌ^ｌｕｃマウス由来の凍結した組織切片の顕微鏡画像（左パネル、青：ＤＡＰＩ、赤：ピロ）ならびに腫瘍および対側の健常な脳の同じ領域を示す対応するＨ＆Ｅの結果（右パネル）を示す。 （ａ）ＵＳＰＶ−ＤｉＲ−ＢＯＡの体積によるサイズ分布、（ｂ）ＵＳＰＶ−ＤｉＲ−ＢＯＡのＵＶ−Ｖｉｓ吸光度、（ｃ）蛍光スペクトルおよび（ｄ）ＰＢＳ中のインタクトまたはトリトンＸ−１００により破壊された、ＵＳＰＶ−ＤｉＲ−ＢＯＡの一重項酸素生成を示す。 （ａ）静脈内注射の２４時間後にＵＳＰＶ−ＤｉＲ−ＢＯＡを注射したＵ８７神経膠腫保有マウスの白色光写真および対応するインサイチュ蛍光画像を示す。ピロチャネル（Ｅｘ：５７５−６０５ｎｍ、Ｅｍ：６８０−７５０ｎｍ）およびＤｉＲ−ＢＯＡチャネル（Ｅｘ：７２５−７５５ｎｍ、Ｅｍ：７８０−９５０ｎｍ）の両方を獲得した。（ｂ）ディープレッドロングパス（Ｅｘ：６６０ｎｍ、Ｅｍ６８９−９００ｎｍ）レーザープローブで得た代表的なインビボ蛍光顕微鏡画像。頭蓋を除去して、腫瘍および対側の脳の両方を検査した。（ｃ）主要器官のエキソビボ蛍光イメージング。画像の器官は以下のように記載している。Ａ：筋肉、Ｂ：腫瘍を有する脳、Ｃ：肺、Ｄ：心臓、Ｅ：脾臓、Ｆ：腎臓、Ｇ：肝臓。 ａ）卵巣がん転移の^６４Ｃｕ−ＵＳＰＶにより可能なＰＥＴイメージング；転移腫瘍およびリンパ節のエキソビボ生物発光画像ｂ）および蛍光画像ｃ）；パンサイトケラチン（ＡＥ１／ＡＥ３）染色画像ｄ）およびＨ＆Ｅ染色画像ｅ）によって転移組織を確認した。 （ａ）深部腫瘍発現ＧＦＰを有する脳のＭａｅｓｔｒｏイメージングおよび蛍光分子トモグラフィー（ＦＭＴ）イメージング結果を示す。イメージングは注射の２４時間後に実施した。（ｂ）脳断面の図示。（ｃ）ＧＦＰチャネル、ピロチャネルおよびＤｉＲ−ＢＯＡチャネルによる蛍光イメージング結果。 組織構造および腫瘍切片の顕微鏡イメージング結果を示す。 画像誘導腫瘍除去後の多焦点での脳の白色光画像、生物発光画像および蛍光画像を示す。 ＵＳＰＶ−ＰＤＴ処理の間の温度モニタリングを示す。 異なる光線量によるレーザー対照群およびＵＳＰＶ−ＰＤＴ処理群における腫瘍領域および周辺脳のＨ＆ＥおよびＴＵＮＥＬの結果を示す。 異なる光線量によるＵＳＰＶ−ＰＤＴ処理群における腫瘍および周辺脳のＴＵＮＥＬ定量的結果を示す。 ウサギＨＮＣモデルにおける原発性腫瘍およびリンパ排液のＵＳＰＶにより可能な非侵襲性検出を示す。ａ）ＨＮＣウサギにおけるＵＳＰＶの薬物動態プロファイル（ｎ＝４）；ｂ）^６４Ｃｕ−ＵＳＰＶの静脈内注射の２４時間後におけるＨＮＣウサギの代表的なＰＥＴ／ＣＴ ３Ｄ画像（赤色の矢印：腫瘍、白色の矢印：局所リンパ節）；ｃ）ＰＥＴ体積分析によって定量された筋肉、腫瘍およびリンパ節における^６４Ｃｕ−ＵＳＰＶの分布。取り込みは標準的な取り込み値（ＳＵＶ）として提示した。ＵＳＰＶの腫瘍およびリンパ節取り込みは筋肉取り込みより有意に高かった（ｎ＝４、Ｐ＜０．０５）；ｄ）γカウンティングによって測定したＨＮＣウサギ（ｎ＝５）および健常なウサギ（ｎ＝３）の主要器官における^６４Ｃｕ−ＵＳＰＶの分布；ｅ）ＰＥＴ／ＣＴイメージング後のＨＮＣウサギの切除した腫瘍、局所リンパ節および他の主要器官のエキソビボ蛍光。ＬＮはリンパ節を表し、ＳＧは唾液腺を表す。 腫瘍（赤色の矢印）および局所リンパ節（白色の矢印）を示す２Ｄ ＰＥＴ／ＣＴイメージングの代表的な軸方向、矢状方向および冠状方向の図を示す。 ^６４Ｃｕ−ＵＳＰＶの静脈内注射の２４時間後の腫瘍（ａ）および転移リンパ節（ｂ）の代表的なＨ＆Ｅ、パンサイトケラチン染色および蛍光顕微鏡イメージング（スケールバー：１００ｍｍ）を示す。 腫瘍および転移リンパ節のＵＳＰＶにより可能な蛍光誘導切除を示す。ＵＳＰＶの静脈内注射の２４時間後のウサギにおけるＨＮＣ腫瘍のインビボ蛍光イメージング：ａ）インタクトな皮膚の切開前；ｂ）皮弁除去時の手術の間；ｃ）処置の完了を確認する非蛍光の手術台での手術後；ｄ）切除した腫瘍の組織切片の代表的なＨ＆Ｅ、パンサイトケラチン染色および蛍光顕微鏡イメージング；ｅ）皮弁除去時の歩哨リンパ節の手術中の蛍光イメージング；ｆ）ＵＳＰＶ蛍光によってマッピングされたリンパ管網。歩哨リンパ節から局所リンパ節へのリンパ流入後に一連のズームイン画像（位置１〜５）を獲得した；ｇ）ＵＳＰＶによって検出した切除した疑わしいリンパ節の組織切片の代表的なＨ＆Ｅ、パンサイトケラチン染色および蛍光顕微鏡イメージング。 ＨＮＣウサギにおけるＵＳＰＶにより可能なＰＤＴを示す。ａ）ＵＳＰＶの静脈内注射の２４時間後における２ステップＰＤＴレーザー照射の図。ＵＳＰＶ−ＰＤＴ前後のウサギの代表的な写真（ｂ）および軸方向のＣＴ画像（ｃ）；ｄ）容積ＣＴ測定によって決定された平均腫瘍成長曲線；ＵＳＰＶ−ＰＤＴの３４日後における元の腫瘍領域（ｅ）およびリンパ節（ｆ）から切除された組織の代表的なＨ＆Ｅおよびパンサイトケラチン染色。全ての組織は悪性腫瘍を示さなかった。 レーザー照射の間の腫瘍の温度変化を示す。温度はレーザー対照群およびＵＳＰＶ−ＰＤＴ群のレーザー照射の間に熱カメラによってモニターした。 レーザー処理後のＣＴイメージングによる腫瘍サイズの変化のモニタリングを示す。レーザーまたはＵＳＰＶ投与後に示された腫瘍を有するレーザー対照およびＵＳＰＶ対照群のウサギの代表的なＣＴ矢状画像。 処理後のＵＳＰＶ対照、レーザー対照およびＵＳＰＶ−ＰＤＴ群のウサギの局所リンパ節を示す代表的なＣＴ矢状画像を示す。 ＵＳＰＶ−ＰＤＴの毒性の評価を示す。ａ）ＵＳＰＶ投与前ならびにＵＳＰＶ−ＰＤＴ処理の１週間および３週間後のウサギの血液アッセイ（ｎ＝４）；ｂ）ＵＳＰＶ−ＰＤＴウサギ由来の心臓、肺、肝臓、脾臓、副腎および筋肉を含む、主要器官の代表的なＨ＆Ｅ染色切片であり、腫瘍切除後に健常な組織に対する副作用がないことを示す。

以下の詳細において、多くの特定の詳細が本発明の完全な理解を提供するために記載されている。しかしながら、本発明はこれらの特定の詳細を用いずに実施されてもよいことは理解される。

ここで、本発明者らは、ポルフィリン脂質が埋め込まれたリン脂質単層によって封入され、アポＡ−１模倣ペプチド網によって拘束された、疎水性薬物コアを含有する新規の超小型ポルフィリン小胞（ＵＳＰＶ）を導入した。本発明者らは、ペプチド網によって形成されたα−ヘリックス構造が、サイズを抑制し、粒子を安定化するのに本質的な役割を果たすことを実証した。機能的にはポルフィゾームのように、３５％のポルフィリン−脂質充填密度を有するＵＳＰＶは固有の多様な生物発光（ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃ）特性を有する。超小型ナノ構造（＜３０ｎｍ）は、十分な吸収増大（吸光計数ε_６８０＝７．８×１０^７Ｍ^−１ｃｍ^−１）ならびにポルフィリン蛍光および一重項酸素生成の停止を生じる効果的な光特性（ｐｈｏｔｏｐｒｏｐｅｒｔｙ）クエンチングを引き起こした。したがって、インタクトなＵＳＰＶは光線力学的に不活性であるが、ナノ構造が破壊された場合、ＰＤＴ活性になる。一方、ＵＳＰＶの疎水性コアは疎水性生物活性薬剤を効果的に負荷することができ、その良好な血液循環特性（マウスにおける１０時間の循環半減期およびウサギにおける２７時間の循環半減期）は、ＰＥＧ化の必要なしにそれを好適な薬物送達系として提示する。臨床関連マウス同所性神経膠腫腫瘍モデルおよびウサギ同所性頭頸部がん（ＨＮＣ）ウサギモデルを使用して、本発明者らは、ＵＳＰＶが薬物カーゴの安定で腫瘍特異的な送達を促進したことを実証した。^６４Ｃｕ標識ＵＳＰＶにより、ナノ粒子およびその薬物カーゴのインビボでの結末の追跡が可能となった。原発腫瘍、転移腫瘍およびリンパ節、ならびに腫瘍から局所リンパ節へのリンパ排液は、手術前ＰＥＴおよび手術中蛍光イメージングの両方で明確に可視化できた。さらに、全身投与の２４時間後の高密度充填ポルフィリンの効果的な光特性活性化は、神経膠腫マウスおよびＨＮＣウサギの両方において正確な蛍光誘導腫瘍切除および効果的なＰＤＴを可能にした。この研究は、本発明者らの以前に報告したポルフィゾームとはそのナノ構造（２０ｎｍ対１００ｎｍ、単層対二層、疎水性コア対水性コア、α−ヘリックスペプチド対ＰＥＧコーティング）およびナノ構造依存機能（急速対遅延細胞内移動、光線力学治療対光熱治療）において明確に異なることは留意すべきである。

一態様において、リン脂質の単層、ポルフィリン−リン脂質結合体およびペプチドを封入する疎水性コアを含むナノ小胞であって、ペプチドは少なくとも１つの両親媒性のα−ヘリックスを形成できるアミノ酸配列を含み、ポルフィリン−リン脂質結合体は、好ましくはｓｎ−１またはｓｎ−２の位置において、１つのリン脂質の脂質側鎖に共有結合している１つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含み、リン脂質に対するポルフィリン−リン脂質結合体のモル％は３５％以下であり、ナノ小胞は、直径が３５ｎｍ以下である、ナノ小胞が提供される。

適切なペプチド骨格は、クラスＡ、Ｈ、ＬおよびＭα−ヘリックスまたはそれらの断片からなる群から選択され得る。両親媒性α−ヘリックスを形成する特性は、ペプチド配列内のアミノ酸残基の相対位置によって決定されるので、適切なペプチド骨格はまた、クラスＡ、Ｈ、ＬおよびＭ両親媒性α−ヘリックスまたはそれらの断片の逆ペプチド配列を含んでもよい。

一実施形態において、ペプチド骨格は、好ましくは、アポＢ−１００、アポＢ−４８、アポＣ、アポＥおよびアポＡからなる群から選択されるアポリポタンパク質の連続アミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。

本発明において使用される「アミノ酸」、ならびに本明細書および特許請求の範囲において使用されるその用語は、それらの一般的な３文字の短縮形および一文字の短縮形により表される、既知の天然に存在するタンパク質アミノ酸を含む。概して、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｇ Ａ Ｇｒａｎｔ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２を参照のこと。それらの教示は、１１〜２４頁に記載の文章および表を含む参照により本明細書に援用される。上記のように、「アミノ酸」という用語はまた、天然に存在するタンパク質アミノ酸の立体異性体および修飾、非タンパク質アミノ酸、翻訳後修飾アミノ酸、酵素的に合成されたアミノ酸、誘導体化アミノ酸、アミノ酸を模倣するように設計された構築物または構造なども含む。修飾および異常アミノ酸は概して、上記で引用されているＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ；Ｈｒｕｂｙ Ｖ Ｊ、Ａｌ−ｏｂｅｉｄｉ ＦおよびＫａｚｍｉｅｒｓｋｉ Ｗ：Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２６８：２４９−２６２、１９９０；ならびにＴｏｎｉｏｌｏ Ｃ：Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ ３５：２８７−３００、１９９０に記載されており、それらの全ての教示は本明細書に参照により援用される。

本明細書において「α−ヘリックス」とは、タンパク質の二次構造における共通のモチーフを指すために使用される。アルファヘリックス（α−ヘリックス）は、全ての骨格Ｎ−Ｈ基が、４残基前のアミノ酸の骨格Ｃ＝Ｏ基との水素結合を与える、バネのようなコイル状構造である。典型的に、天然に存在するアミノ酸から作製されたアルファヘリックスは右巻きであるが、左巻きの構造も知られている。

「両親媒性」は、親水性および疎水性特性の両方を有する化学化合物を表す用語である。両親媒性アルファヘリックスは、生物学的に活性なペプチドおよびタンパク質においてしばしば見られる二次構造モチーフであり、ヘリックスの長軸に沿って配向される向かい合った極性面および非極性面を有するアルファヘリックスを指す。

小さい両親媒性ヘリックスペプチドの例には、国際公開第０９／０７３９８４号に記載されているものが含まれる。

推定上の両親媒性らせん構造を有するタンパク質ドメインを検出し、特徴付けるための方法は、Ｓｅｇｒｅｓｔ，Ｊ．Ｐ．ら ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （１９９０） ８：１０３−１１７に記載されており、その内容は本明細書に参照により援用される。Ｓｅｇｒｅｓｔらは、両親媒性ヘリックスの７つの異なるクラスを同定しており、各クラスに関連したペプチド／タンパク質を同定している。７つの異なるクラスのうち、４つの脂質関連両親媒性ヘリックスクラス（Ａ、Ｈ、ＬおよびＭ）が存在する。これらのうち、指定されたアポリポタンパク質クラスであるクラスＡは、リン脂質ベースの粒子を形成するのに最適な特性を有する。

本明細書において使用される場合、「リン脂質」は、リン酸基を有する親水性頭部基および疎水性脂質尾部を有する脂質である。

いくつかの実施形態において、リン脂質に対するポルフィリン−リン脂質結合体のモル％は、３５％以下、３０％以下、２５％以下、または２０から３０％である。

いくつかの実施形態において、ナノ小胞は実質的に球状であり、３５ｎｍ以下の直径、２５ｎｍ以下の直径、２０〜３０ｎｍの直径または約２５ｎｍの直径である。

いくつかの実施形態において、ポルフィリン−リン脂質結合体におけるポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体は、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン、テトラフェニルポルフィリン、ピロフェオホルビド（ｐｙｒｏｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ）、バクテリオクロロフィル、クロロフィルａ、ベンゾポルフィリン誘導体、テトラヒドロキシフェニルクロリン、プルプリン、ベンゾクロリン、ナフトクロリン、ベルジン、ロジン、ケトクロリン、アザクロリン、バクテリオクロリン、トリポルフィリン、ベンゾバクテリオクロリン、広義のポルフィリンおよびポルフィリン異性体からなる群から選択される。好ましくは、広義のポルフィリンは、テキサフィリン、サプフィリンまたはヘキサフィリンであり、前記ポルフィリン異性体は、ポルフィセン、転化されたポルフィリン、フタロシアニン、またはナフタロシアニンである。

いくつかの実施形態において、ポルフィリン−リン脂質結合体におけるポルフィリンは、ピロフェオホルビド−ａ酸である。

いくつかの実施形態において、ポルフィリン−リン脂質結合体におけるポルフィリンは、バクテリオクロロフィル誘導体である。

いくつかの実施形態において、ポルフィリン−リン脂質結合体におけるリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトールを含む。好ましくは、リン脂質は１２から２２個の炭素のアシル側鎖を含む。

いくつかの実施形態において、ポルフィリン−リン脂質結合体におけるリン脂質は、１−パルミトイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンまたは１−ステアロイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンである。

いくつかの実施形態において、ポルフィリン−リン脂質結合体はピロ脂質（ｐｙｒｏ−ｌｉｐｉｄ）である。

いくつかの実施形態において、ポルフィリン−リン脂質結合体は、オキシ−バクテリオクロロフィル−脂質である。

いくつかの実施形態において、ポルフィリンは、０から２０個の炭素の炭素鎖リンカーによってリン脂質においてグリセロール基に結合される。

いくつかの実施形態において、ポルフィリン−リン脂質結合体は、その中にキレート化された金属、任意に、好ましくはＺｎ、Ｃｕ、Ｍｎ、ＦｅおよびＰｄからなる群から選択される金属の放射性同位体を含む。

いくつかの実施形態において、リン脂質は、アニオン性リン脂質である。好ましくは、リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、リン脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジベヘノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、１，２−ジリグノセロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（１，２−ｄｉｌｉｇｎｏｃｅｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）（ＤＬｇＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ＤＰＰＧ）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、ペプチドは、クラスＡ、Ｈ、ＬおよびＭ両親媒性α−ヘリックス、それらの断片、ならびに前記クラスＡ、Ｈ、ＬおよびＭ両親媒性α−ヘリックスまたはそれらの断片の逆ペプチド配列を含むペプチドからなる群から選択される。

好ましくは、ペプチドは、アポＢ−１００、アポＢ−４８、アポＣ、アポＥおよびアポＡからなる群から選択される、アポタンパク質の連続するアミノ酸からなる。

いくつかの実施形態において、ペプチドは、２Ｆ（ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ）、４Ｆ（ＤＷＦＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＦＫＥＡＦ）、および前記の逆配列からなる群から選択される。一実施形態において、ペプチドはＲ４Ｆペプチド（Ａｃ−ＦＡＥＫＦＫＥＡＶＫＤＹＦＡＫＦＷＤ）である。

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの両親媒性α−ヘリックスまたはペプチドは、６から３０アミノ酸長、８から２８アミノ酸長、１０から２４アミノ酸長、１１から２２アミノ酸長、１４から２１アミノ酸長、１６から２０アミノ酸長または１８アミノ酸長である。

様々な疎水性生物活性もしくは治療剤、医薬物質、または薬物が、ＵＳＰＶのコア内に封入され得る。

いくつかの実施形態において、疎水性コアは、疎水性診断剤または治療剤、好ましくは、パクリタキセル、ドセタキセル、または１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨウ化物ビス−オレエート（ＤｉＲ−ＢＯＡ）を含む。

「治療剤」という用語は、当該分野で認識されており、生物学的、生理学的、または薬理学的に活性な物質である任意の化学的部分を指す。「薬物」とも称される、治療剤の例は、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、およびＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓなどの周知の文献に記載されており、それらには、限定されないが、医薬、ビタミン、ミネラルサプリメント、疾患もしくは病気の治療、予防、診断、治癒もしくは緩和のために使用される物質、身体の構造もしくは機能に影響を与える物質、または生理学的環境に置かれた後に生物学的に活性もしくはより活性になるプロドラッグが含まれる。対象に投与されると、対象組成物から隣接する組織または体液中に放出され得る種々の形態の治療剤が使用されてもよい。

「診断薬」または「診断剤」は、診断のために使用され得る任意の化学部分である。例えば、診断剤には、インジウムまたはテクネチウムなどの放射性同位体を含有するものなどの造影剤、ヨウ素またはガドリニウムを含有するコントラスト剤、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ＧＦＰ、アルカリホスファターゼ、またはβ−ガラクトシダーゼなどの酵素、ユーロピウム誘導体などの蛍光物質、Ｎ−メチルアクリジウム誘導体などの発光物質が含まれる。

いくつかの実施形態において、ナノ小胞はＰＥＧを含まない。

いくつかの実施形態において、ナノ小胞は、ＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ−脂質、さらに好ましくはＰＥＧ−ＤＳＰＥをさらに含む。

いくつかの実施形態において、ナノ小胞は、ターゲティング分子をさらに含む。

いくつかの実施形態において、ナノ小胞は、ターゲティング分子、好ましくは、抗体、ペプチド、アプタマーまたは葉酸をさらに含む。

「ターゲティング分子」は、例えば、標的細胞の表面上の受容体または他の分子と結合することによって、ナノ小胞を特定の標的に誘導できる任意の分子である。ターゲティング分子は、タンパク質、ペプチド、核酸分子、単糖類または多糖類、受容体リガンドまたは他の小分子であってもよい。特異性の程度はターゲティング分子の選択によって調節され得る。例えば、抗体は典型的に高い特異性を示す。それらは、ポリクローナル、モノクローナル、断片、組換え、または一本鎖であってもよく、それらの多くは市販されているか、または標準的な技術を使用して容易に得られる。

一態様において、対象における標的領域上でイメージングする方法であって、本明細書に記載されているナノ小胞を提供する工程と、ナノ小胞を対象に投与する工程と、標的領域をイメージングする工程とを含む、方法が提供される。

一態様において、対象における標的領域、好ましくは、腫瘍上でイメージングを実施するための本明細書に記載されているナノ小胞の使用が提供される。

一態様において、対象における標的領域上で光線力学療法を実施する方法であって、ａ．本明細書に記載されているナノ小胞を提供する工程と、ナノ小胞を対象に投与する工程と、ある波長の光で標的領域においてナノ小胞を照射する工程であって、その波長の光はポルフィリン−リン脂質結合体を活性化して一重項酸素を生成する、工程とを含む、方法が提供される。

いくつかの実施形態において、標的領域は腫瘍である。

一態様において、疎水性薬剤を対象に送達する方法であって、本明細書に記載されているナノ小胞を提供する工程であって、疎水性コアがその薬剤を含む、工程と、ナノ小胞を対象に投与する工程とを含む、方法が提供される。

一態様において、対象における標的領域上でイメージングを実施して疎水性薬剤を送達するための本明細書に記載されているナノ小胞の使用であって、疎水性コアがその薬剤を含む、使用が提供される。

従来のポルフィゾームと比較してＵＳＰＶの可能な利点は、ポルフィゾーム機能（光熱、光音響、ＰＥＴ、ＭＲＩ、ＣＴなど）を有しながら、より小さく、インビボでの安定性のためにＰＥＧ化をほとんどまたは全く必要とせず、増大した一重項酸素および蛍光活性、ならびに／またはコア内部に疎水性ペイロード（例えば、薬物、ＣＴコントラストなど）および表面上にｓｉＲＮＡを組み込む能力を含む。

本発明の利点はさらに以下の実施例によって例示される。本明細書に記載されている実施例およびそれらの特定の説明は例示のみで提示され、本発明の特許請求の範囲に対する限定と解釈されるべきではない。

方法および材料
材料
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−メトキシ（ポリエテングリコール）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）、および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−フォレート（ポリエチレングリコール）（葉酸−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．（ＡＬ、ＵＳＡ）から購入した。オレイン酸コレステリル（ＣＯ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．（ＭＯ、ＵＳＡ）から得た。１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨウ化物ビス−オレエート（ＤｉＲ−ＢＯＡ）およびポルフィリン−脂質（ピロ−脂質（ｐｙｒｏ−ｌｉｐｉｄ）と省略されるピロフェオホルビド（ｐｙｒｏｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ）−脂質）を以前に報告されたプロトコルによって調製した（１６）。アポＡ−１模倣Ｒ４Ｆペプチド（Ｒ４Ｆ）、Ａｃ−ＦＡＥＫＦＫＥＡＶＫＤＹＦＡＫＦＷＤは、ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｌｔｄ．（上海、中国）から購入した。細胞培養培地であるイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得た。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、トリプシン−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８は全てＧｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．（ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。

超小型ポルフィリン小胞（ＵＳＰＶ）調製および特性付け
ＵＳＰＶの合成
脂質膜を窒素下でクロロホルム中の液体混合物の蒸発によって調製した。ＵＳＰＶについての脂質混合物は、０．９μｍｏｌのポルフィリン−脂質、２．１μｍｏｌのＤＭＰＣおよび０．３μｍｏｌのオレイン酸コレステロールからなる。カーゴ負荷粒子について、モデル薬物として作用する３ｍｏｌ％のＤｉＲ−ＢＯＡを脂質混合物に加え、ＰＥＧ化ＵＳＰＶ製剤（ＰＥＧ−ＵＳＰＶ）について、１％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００を脂質混合物中に加え、葉酸受容体標的化ＵＳＰＶ（葉酸−ＰＥＧ−ＵＳＰＶ）について、１％の葉酸−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ_２０００を脂質混合物中に加えた。完全に乾燥させた脂質膜を１．０ｍＬのＰＢＳ緩衝液（１５０ｍＭ、ｐＨ７．５）で水和し、４０℃にて３０サイクル、低周波数（３０秒のオン／３０秒のオフ）で超音波処理した（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（登録商標））。Ｒ４Ｆペプチド（２．３ｍｇ、５ｍｇ／ｍｌ）を再水和した溶液中で滴定し、ペプチド溶液を添加すると、濁ったエマルションが透明になった。混合物を４℃にて一晩振盪し続けた。溶液を１２，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、続いて上清を０．１μｍの膜（Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で濾過した。

ＵＳＰＶのサイズおよび形態
ＵＳＰＶのサイズ分布およびζ電位は動的光散乱（ＺＳ９０ Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって測定した。日立（日本）Ｈ−７０００電子顕微鏡を備えた透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して、粒子の形態およびサイズを決定した。

ＵＳＰＶの励起および発光
インタクト／クエンチ試料としてＰＢＳまたは破壊／非クエンチ試料としてＰＢＳ中の０．５％のトリトンＸ−１００のいずれかでＵＳＰＶを希釈した。インタクトおよび破壊されたＵＳＰＶの吸収スペクトルを、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計Ｃａｒｙ ５０（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ）によって測定し、Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−４蛍光光度計（Ｈｏｒｉｂａ Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ、ＵＳＡ）（励起：４２０ｎｍ、発光：６００〜８００ｎｍ、スリット幅：５ｎｍ）を使用することによってそれらの蛍光を測定した。以下の式：（１−ＦＩ_{インタクト}／ＦＩ_破壊）×１００％（ＦＩ_{インタクト}およびＦＩ_破壊はそれぞれインタクト試料および破壊試料の蛍光強度を表す）によって蛍光クエンチング効率を算出した。

ＵＳＰＶの一重項酸素（^１Ｏ_２）生成
ＳＯＳＧアッセイを使用してＵＳＰＶ（インタクトおよび破壊の両方）の^１Ｏ_２生成を測定した。簡潔に述べると、ＳＯＳＧ（^１Ｏ_２センサグリーン試薬、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｖｅｓ，Ｉｎｃ．）溶液をメタノール（５ｍＭ）中で新たに調製し、６μＭの最終ＳＯＳＧ濃度となるように、ＰＢＳ中のインタクトまたは０．５％のトリトンＸ−１００中の破壊されたＵＳＰＶ（１μＭの最終ピロ濃度）と混合した。０．５Ｊ／ｃｍ^２から１０Ｊ／ｃｍ^２の光フルエンスで６７１ｎｍにて発光ダイオードのアレイを用いて試料を処理し、次いで５０４ｎｍでの励起および５２５ｎｍでの収集によってＳＯＳＧ蛍光を測定した。この発光ウインドウ内にポルフィリン蛍光の寄与はなかった。

定量的細胞取り込み研究および共焦点顕微鏡法
Ｕ８７^ＧＦＰおよびＵ８７^ｌｕｃ細胞を、１０％のＦＢＳを有するイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ、ＡＴＣＣ（登録商標））中で培養した。ＵＳＰＶ対ポルフィゾームの細胞取り込みを比較するために、定量的細胞取り込み研究をＵ８７神経膠腫細胞で実施した。簡潔に述べると、Ｕ８７^ＧＦＰ細胞を、インキュベーションの２４時間前に１０^６細胞／ウェルにて６ウェルプレートに播種し、１０μＭのポルフィリン濃度にてポルフィゾームおよびＵＳＰＶと３７℃で３時間インキュベートした。ＰＢＳで３回リンスした後、細胞をトリプシン処理し、懸濁液を４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、細胞ペレットを５００μＬの溶解緩衝液に再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。溶液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、蛍光分光計によりポルフィリンの蛍光測定のために上清を回収し、ポルフィリン分子の細胞取り込みを定量した。ポルフィゾームに対するＵＳＰＶの蛍光活性化をさらに調べるために、細胞インキュベーション後のポルフィリン蛍光変化を時間とともにモニターするために共焦点イメージングを行った。５×１０^４細胞／ウェルを、インキュベーションの２４時間前に８ウェルチャンバスライドに播種した。細胞を１０μＭのポルフィリン濃度にてポルフィゾームおよびＵＳＰＶと３７℃で３時間インキュベートし、ＰＢＳで３回リンスし、新たな細胞培養培地中で再インキュベートした。細胞を、培地交換の直後、および３時間後、６時間後に、共焦点顕微鏡法（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦｌｕｏＶｉｅｗ １０００、レーザー６３３ｎｍ、Ｅｍ）によって画像化した。

神経膠腫腫瘍治療のためのセラノスティクスとしてのＵＳＰＶの評価
動物準備および腫瘍モデル
全ての動物実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋのガイドラインを遵守して実施した。動物研究は、同所性９Ｌ^ｌｕｃ神経膠肉腫のＵ８７^ＧＦＰおよびＵ８７^ｌｕｃ神経膠腫保有ヌードマウスで行った。ｎｕ／ｎｕヌード雌性マウスは、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋの動物研究センター（Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ）にて維持した。モデルを確立するために、動物を、ケタミン、キシラジンおよびアセプロマジン（８０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇ）それぞれの腹腔内注射により麻酔する。Ｄｒｅｍｅｌツールを使用して左半球に直径１ｍｍのバリ穴を作製し、硬膜を露出させるがそれをそのまま残す。３μＬの培地中の５×１０^４個のＵ８７細胞または１×１０^４個の９Ｌ細胞を左半球に注射する。腫瘍サイズは、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）によって毎週モニターする。実験は、腫瘍が直径４〜５ｍｍに達した接種後約１８日に行った。

血中クリアランス研究
ＵＳＰＶ、ＰＥＧ−ＵＳＰＶおよび葉酸−ＰＥＧ＿ＵＳＰＶを、２．５ｍｇ／ｋｇの用量でＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内注射した（ｎ＝４）。注射前および注射後（５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間および４８時間）、連続して血液をマウスの下肢静脈から採取した。血液を室温で３０分間置き、血漿を分離し、次いで１２，０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離した。上清の蛍光をＳｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＨＯＲＩＢＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）により測定し、血中のポルフィリン量（励起４２０ｎｍ、発光６７５ｎｍ、スリット幅：５ｎｍ）を算出した。次いで各時点でのポルフィリン量をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）により分析し、粒子の半減期を計算した。

インビボおよびエキソビボでの蛍光イメージング
インビボでのＵＳＰＶの特定の腫瘍取り込みおよび画像誘導薬物送達能力を調べるために、全身投与の後、蛍光イメージングを実施した。腫瘍保有マウスに、ＵＳＰＶ投与前の３日間、低蛍光食餌（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｎｄ（登録商標）、製品番号ＴＤ．９７１８４）を与えた。次いでＵＳＰＶ−ＤｉＲ−ＢＯＡを、ポルフィリン含量に基づいて１０ｍｇ／ｋｇの用量にて尾静脈を介して注射した。ピロ（ｐｙｒｏ）シグナルについて５７５−６０５ｎｍの励起／６８０−７５０ｎｍの発光フィルタおよびＤｉＲ−ＢＯＡシグナルについて７２５−７５５ｎｍの励起／７８０ｎｍのロングパス発光フィルタでＭａｅｓｔｒｏイメージングシステム（ＣＲＩ、ＵＳＡ）を使用して蛍光画像を獲得した。注射の２４時間後に、頭皮を有するかまたは有さず、頭蓋を開いた状態でインビボで蛍光イメージングを実施した。動物を屠殺した後、脳ならびに心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、副腎および筋肉を含む主要器官を採取し、エキソビボで蛍光イメージングに供した。ＦＭＴ（蛍光分子トモグラフィー、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＶｉｓＥｎ ＦＭＴ ２５００ ＬＸ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ Ｓｙｓｔｅｍ、ＶｉｓＥｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）イメージングおよびインビボ共焦点顕微鏡イメージング（Ｌｅｉｃａ ＦＣＭ１０００、Ｃｅｌｌｖｉｚｉｏ（登録商標） Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、励起：６６０ｎｍ、発光：６８９−９００ｎｍ）も、腫瘍保有脳で実施した。９Ｌ^ｌｕｃ−およびＵ８７^ｌｕｃ神経膠腫保有マウスについて、ルシフェラーゼ溶液をイメージングの１０分前に腹腔内注射した。生物発光イメージングも、インビボおよびエキソビボの両方で実施した。

光線力学的療法
ＵＳＰＶのＰＤＴ有効性をＵ８７^ＧＦＰ腫瘍保有マウスについて調べた。４つの群が含まれた：何も処置をしていないブランク対照群；ＰＤＴレーザーのみ；ＵＳＰＶ注射のみ；ＵＳＰＶプラスＰＤＴレーザー治療。腫瘍が直径１〜１．５ｍｍに達したとき、ポルフィリン含量に基づいて計算して５ｍｇ／ｋｇの用量にてＵＳＰＶを動物に静脈注射した。注射後２４時間で、マウスを２％（ｖ／ｖ）イソフルランで麻酔し、腫瘍に６７１ｎｍレーザー（ＤＰＳＳ ＬａｓｅｒＧｌｏｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、カナダ）を照射した。レーザー強度は、処置領域として９ｍｍ直径および３．５ｍｍ直径のスポットサイズで５０ｍＷ／ｃｍ^２として測定された。３７．５Ｊ／ｃｍ^２および５０Ｊ／ｃｍ^２の光線量をこの研究において適用した。レーザーのみの群およびＰＤＴ処置の群についての腫瘍の温度変化を赤外線カメラ（Ｍｉｋｒｏｓｈｏｔ、ＬＵＭＡＳＥＮＳＥ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してモニターし、平均および標準偏差について各処置群においてｎ＝５で計算した。

組織学的分析
腫瘍境界を規定するために、エキソビボ蛍光イメージング後に脳を液体窒素中で凍結させ、次いでＬｅｉｃａ ＣＭ３０５０Ｓクライオスタットを使用して５μｍ厚さのスライドに切断した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ ＮｅｔｗｏｒｋのＰａｔｈｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて標準的な方法によってＨ＆Ｅ染色を実施した。切片を、２０倍の明視野顕微鏡によって観察し、撮影した。治療効果を評価するために、各処置群からの脳を採取し、処置の２４時間後に１０％ホルムアルデヒド中で固定した。Ｈ＆Ｅ染色およびＴＵＮＥＬ染色を行い、続いて上記と同じ標準プロトコルで分析した。

組織切片顕微鏡イメージング
凍結したスライドをＤＡＰＩ含有マウント溶液でマウントし、４０５ｎｍ（ＤＡＰＩチャネル）、４９１ｎｍ（ＧＦＰチャネル）および６３３ｎｍ（Ｃｙ５．５チャネル）の励起波長でＯｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００レーザー共焦点走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、東京、日本）およびＱｕｏｒｕｍ ＷａｖｅＦＸ Ｓｐｉｎｎｉｎｇ Ｄｉｓｋ Ｃｏｎｆｏｃａｌ（Ｙｏｋｏｇａｗａ、日本）によって画像化した。

ＶＸ−２口腔がんウサギモデル
他の文献（１７、１８）に記載されている方法を使用してＶＸ−２口腔扁平上皮細胞がんモデルを開発した。簡潔に述べると、新たに安楽死させたウサギから滅菌条件下で腫瘍を採取し、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、Ｓｉｇｍａ）に入れ、滅菌ＨＢＳＳで２回洗浄し、小切片に切断し、使用するまで−８０℃にて保存した。単一の腫瘍細胞懸濁液を得るために、腫瘍片を解凍し、細かく刻み、７０μｍのセルストレーナーを通して圧縮した。３００μＬの高密度単細胞懸濁液（約５×１０^６／ｍＬ）を、麻酔したニュージーランドホワイトウサギ（２．８〜３．３ｋｇ）の頬筋（頬の領域）に注射する。

ＨＮＣウサギに対する薬物動態研究
腫瘍サイズが１．５〜２．０ｃｍに達した腫瘍誘導の約２週間後、端部の耳静脈においてウサギにカテーテルを介して^６４Ｃｕ−ＵＳＰＶを静脈内注射した（ポルフィリンについて０．３３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍＣｉ）。動脈血を注射の５分、０．５時間、１時間、４時間、８時間、２１時間、３０時間後に採取した（ｎ＝４）。血漿の放射能をガンマカウンター（Ｗｉｚａｒｄ １４８０：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．、ＭＡ、ＵＳＡ）で濃度の関数として測定した。クリアランス半減期を対数線形回帰によって決定した。

ＨＮＣウサギのＰＥＴ／ＣＴイメージング
^６４Ｃｕ−ＵＳＰＶ（ポルフィリンについて０．３３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍＣｉ）の注射後２４時間に、ウサギを麻酔し、５ｍＬのオムニパーク（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ）３５０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ ＯＮ）の注射後、ＭｉｃｒｏＰＥＴシステムでのＰＥＴイメージング（Ｆｏｃｕｓ ２２０：Ｓｉｅｍｅｎｓ、ミュンヘン、ドイツ）、およびｍｉｃｒｏＣＴシステムでのＣＴイメージング（Ｌｏｃｕｓ Ｕｌｔｒａ：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）に供した。ＰＥＴ／ＣＴ画像を登録し、Ａｍｉｒａ（ＦＥＩ Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｇｒｏｕｐ、Ｂｏｒｄｅａｕｘ、フランス）を使用して統合した。対象のボリュームを、Ｉｎｖｅｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｗｏｒｋｐｌａｃｅ（Ｓｉｅｍｅｎｓ、ミュンヘン、ドイツ）を用いて、統合したＣＴ画像上に描き、^６４Ｃｕ−ＵＳＰＶの標準取り込み値（ＳＵＶ）を登録画像から定量した。

ＨＮＣウサギにおけるＵＳＰＶの生体内分布およびエキソビボ蛍光イメージング
ＰＥＴ／ＣＴイメージング後、腫瘍、リンパ節、唾液腺、肺、心臓、肝臓、筋肉、脾臓および腎臓を含むウサギの器官を切除し、秤量し、ガンマカウンターで放射能を測定した。器官取り込みを、各ウサギについて試料の全動物質量の百分率当たりの注射用量の百分率（ＳＵＶ）として計算した。イエローフィルター設定（励起：５７５−６０５ｎｍ；発光：≧６４５ｎｍ検出、２００ｍｓ曝露時間）でＭａｅｓｔｒｏ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いてエキソビボ蛍光イメージングを実施した。

ウサギの組織病理および顕微鏡イメージング
凍結した組織切片を固定し、ＤＡＰＩ、Ｈ＆Ｅ及びパン−サイトケラチン染色でそれぞれ処理した。染色切片の高解像度画像を走査レーザー共焦点顕微鏡（ＴＩＳＳＵＥｓｃｏｐｅ ４０００、Ｈｕｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で取得した。

術中蛍光イメージング
ＶＸ−２ウサギでのリアルタイム蛍光誘導手術を、４ｍｇ／ｋｇのＵＳＰＶの静脈内注射の２４時間後に、インハウス蛍光イメージング内視鏡システム（６５０±２０ｎｍ励起、７００±２５ｎｍ発光）を用いて実施した。非蛍光結節が動物の手術台に残るまで、蛍光で誘導して腫瘍および疑わしいリンパ節を解剖した。

ＨＮＣウサギでのＰＤＴ
４群のＶＸ−２ウサギを処置研究に含めた：ブランク対照（ｎ＝３）；ＰＤＴレーザーのみ（ｎ＝３）；ＵＳＰＶ注射のみ（ｎ＝３）；ＵＳＰＶプラスＰＤＴレーザー処置（ｎ＝４）。腫瘍サイズが約３００ｍｍ^３に達したとき、ＵＳＰＶ群およびＵＳＰＶ−ＰＤＴ群（４ｍｇ／ｋｇのポルフィリン用量）についてＵＳＰＶをウサギに静脈内注射した。ＰＤＴ処置のために、ウサギを麻酔し、注射後２４時間に２段階のＰＤＴ処置に供した。第１の段階は、１２５Ｊ／ｃｍ^２の光線量、２００ｍＷのレーザー出力および直径１５ｍｍの照射領域での腫瘍の外面上への直線レーザー照射（６７１ｎｍ）であった。レーザー照射の間の腫瘍の温度変化を、赤外線カメラを使用してモニターした。第２の処置段階は、１２０Ｊ／ｃｍ^２の光線量および１００ｍＷのレーザー出力で腫瘍の内部から照射するために腫瘍内への光ファイバーケーブル（９ｍｍの拡散レーザーファイバー）の挿入を含んだ。処置後、ウサギをケアの標準的なプロトコルに従って置き、腫瘍成長をｍｉｃｒｏＣＴ走査で連続的にモニターした。腫瘍サイズが５０００ｍｍ^３に達したとき、終末手術をウサギに実施した。４匹全てのＵＳＰＶ−ＰＤＴウサギは処置の約３０日後に腫瘍を含まないことが見出された。処置有効性のさらなる評価のためにＰＤＴの３４〜３６日後にそれらを安楽死させた。

処置の毒性を評価するために、処置したウサギの全ての包括的な生化学および血液学的血液試験を、注射の２４時間後、ＰＤＴ処置の直前、ＰＤＴ処置の１週間後および３週間後にそれぞれ行った。終末手術後、腫瘍領域および他の主要器官からの組織を処置の２４時間後に採取し、Ｈ＆Ｅおよびパンサイトケラチン染色に供し、Ａｐｅｒｉｏ ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅで画像化して、悪性腫瘍の残存を判定した。２人の経験豊富な病理学者が、悪性腫瘍の同定および腫瘍根絶の確認のために全ての組織病理スライドを評価した。

統計的分析
スチューデントのｔ検定（両側）を使用して、ＴＵＮＥＬおよび毒性研究における異なる群間の差の統計的有意性を決定した。０．０５未満のＰ値を有意とみなした。

結果および考察
ＵＳＰＶの合成および特性付け
本発明者らは、ＤＭＰＣを有するポルフィリン脂質のリン脂質単層によって封入され、１８アミノ酸のアポＡ−１模倣ペプチドによって拘束された、コレステリルオレイン酸の疎水性コアを有する超小型ポルフィリン小胞（ＵＳＰＶ）を作製した。本発明者らは、ＵＳＰＶの構造および光物理的特性が、ＤＭＰＣに対するポルフィリン−脂質の割合に依存することを見出した。図１に示すように、ＤＭＰＣに対するポルフィリン脂質の割合を増加させると、ポルフィリン蛍光クエンチングが増強され、粒子サイズが増大した。この割合が３０％を超えると、高い蛍光クエンチング（＞９５％）が達成され、粒子サイズは依然として３０ｎｍ以下に制御された。３０％モルのポルフィリン−脂質／７０％モルのＤＭＰＣを有するＵＳＰＶを、さらなる応用研究のための最適ＵＳＰＶとして選択した。なぜならそれは、安定した単分散ＵＳＰＶについての最大ポルフィリン脂質を含有し、良好なサイズ（＜３０ｎｍ、図２）を有し、効果的な蛍光クエンチングを示したからである。

ＵＳＰＶの吸収および円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル
ピロフェオホルビド−脂質（ピロ−脂質）の吸光度スペクトルに基づいて、推定ＵＳＰＶ吸光係数ε_６８０は７．８×１０^７ｃｍ^−１Ｍ^−１であった。この光吸収の増強はＵＳＰＶにおける高密度のポルフィリン環境を示す。ＣＤスペクトルにより、ＵＳＰＶのαヘリックス構造が確認された（図３）。

蛍光および一重項酸素生成
ＵＳＰＶの光学特性は、同じポルフィリン濃度にてＰＢＳ中のインタクトな粒子およびトリトンＸ−１００中のその構造破壊試料の蛍光および一重項酸素生成を比較することによって調べた。図４に示すように、ポルフィゾームについて観察されたものと同様に、高密度のポルフィリン環境は、ＵＳＰＶの蛍光生成および一重項酸素生成を極めて阻害した。ＵＳＰＶの蛍光は、ナノ構造破壊試料と比較して１００倍クエンチされた。広範囲の光フルエンス（０．５〜１０Ｊ／ｃｍ^２）でＰＤＴレーザー（６７１ｎｍ）を照射すると、ＵＳＰＶはナノ構造破壊試料と比較して一重項酸素生成が２〜３倍少なかった。したがって、インタクトなＵＳＰＶは光線力学的に不活性であるが、それは、ナノ構造が破壊されたときＰＤＴ活性になる。

ＵＳＰＶの細胞取り込みおよびインビトロ蛍光活性化
小型粒子が細胞内取り込みに有益であるかどうかを調べるために、細胞溶解緩衝液中でポルフィリン蛍光シグナルを測定することによって、ＵＳＰＶおよびポルフィゾームの細胞取り込みをＵ８７神経膠腫細胞において調べた。ポルフィゾームと比較して、ＵＳＰＶは、同じ濃度のポルフィリンによるインキュベーション後、Ｕ８７細胞において約１０倍高い取り込みを示した（図５ａ）。細胞におけるポルフィリン蛍光活性化を共焦点試験によってさらに評価した。時間がかかるプロセスであり、細胞内のポルフィリン蛍光が徐々にクエンチングしなくなることが証明されている細胞内のポルフィゾーム破壊とは異なり、ＵＳＰＶとの３時間のインキュベーションの直後にＵ８７細胞において強いポルフィリン蛍光を観察し（図５ｂ）、蛍光シグナルは時間とともにさらに著しく向上するとはなかった。全体として、これらのデータにより、小型ＵＳＰＶが細胞内局在化だけでなく、細胞内の光特性活性化も促進することが示唆された。

血中クリアランス
ＵＳＰＶの薬物動態プロファイルを調べるために、血中クリアランス研究を健常なマウスで実施した。３つの群をこの研究に含んだ：ＵＳＰＶ、ＰＥＧ−ＵＳＰＶ（ＰＥＧ化ＵＳＰＶ）および活性ターゲティングＦＲ−ＵＳＰＶ（葉酸受容体標的化ＵＳＰＶ）。血清中のポルフィリン濃度を、蛍光測定を使用して投与後の異なる時点で測定した。図６に示すように、ＰＥＧ化と関係なく、ＵＳＰＶおよびＰＥＧ−ＵＳＰＶの両方は、同様の好ましい遅い循環半減期（それぞれＵＳＰＶについて９．９時間およびＵＳＰＶ−ＰＥＧについて９．５時間）を有し、インビボ循環の改善のためにＰＥＧ化が必要ではないが、ＰＥＧ化はインビボでリポソーム構造の安定性を改善するためにほとんどのリポソーム構造に不可欠であることが示された。興味深いことに、ポルフィゾーム製剤中の葉酸−脂質の包含が粒子のインビボ循環時間を短くしたという本発明者らの以前の観察と相反して（１０）、ＦＲ−ＵＳＰＶは著しく延長した遅い半減期を示した（ＦＲ−ポルフィゾームについて４時間未満に対して葉酸−ＵＳＰＶについて１３．３時間）。ＥＰＲ効果がナノ粒子の腫瘍蓄積において重要な役割を果たすので、この長期にわたる循環は、組織への血液循環からの直接的なナノ粒子の浸潤に有益であり、ターゲティング疾患領域における粒子の保持を高める。したがって、より効果的なターゲティング送達およびより効果的な光特性（蛍光および一重項酸素生成）活性化が、葉酸−ポルフィゾームと比較してＦＲ陽性がん種におけるＦＲ−ＵＳＰＶについて予想される。

ＵＳＰＶの腫瘍特異的蓄積
本発明者らは、最近、４０ｎｍ以下のポルフィリン脂質ナノディスクを開発し、小型ナノディスクが、腫瘍のコラーゲンが豊富なマトリクスを通る拡散において、大型のポルフィゾーム（１３０ｎｍ）と比較して拡散係数の５倍の増加を示したことを実証した。ここで本発明者らは、ポルフィゾームよりも小型のＵＳＰＶのインビボ送達の利点を調べた。９Ｌ^ｌｕｃ神経膠腫を有するマウスに、２００ｎｍｏｌのポルフィリン濃度にてＵＳＰＶ（２１ｎｍ）およびポルフィゾーム（１３０ｎｍ）を注射し、マウス頭蓋を投与後２４時間に麻酔下で除去して、インサイチュで蛍光画像のために腫瘍を曝露した。図７、中央の列に示すように、ＵＳＰＶおよびポルフィゾームの両方は蛍光イメージングによって周囲の健常な脳から腫瘍を明確に描写することができ、これはＢＬＩイメージングによって画定された腫瘍部位（図７、左の列）と十分に一致する。しかしながら、ＵＳＰＶを投与した腫瘍からの蛍光シグナルは、ポルフィゾームを投与した腫瘍よりもはるかに強く、腫瘍特異的蓄積を増強する超小型ＵＳＰＶ（３０ｎｍ未満）の利点を示唆している。９Ｌ^ｌｕｃ神経膠腫腫瘍におけるＵＳＰＶの腫瘍蓄積の特異性はエキソビボ脳組織イメージングによってさらに実証され（図８ａ）、脳における蛍光コアはＨ＆Ｅ組織切片によって描かれた腫瘍領域と十分に並んだ（図８ｂ）。本発明者らはさらに、凍結した脳組織切片の共焦点イメージングを使用して顕微鏡レベルにおけるＵＳＰＶの腫瘍特異的取り込みを検証し、強いポルフィリンシグナルを、対側脳領域ではなく、腫瘍周辺領域においてのみ観察した（図８Ｃ）。

薬物送達のためのＵＳＰＶの可能性
ＵＳＰＶは、脂質単層で囲まれた疎水性コアを有するコア−シェルナノ構造を有するので、疎水性の生物活性化合物の負荷および安全な送達の好適な可能性を有する。この研究では、近赤外蛍光疎水性色素、ＤｉＲ−ＢＯＡを薬物代用物として使用して、ＵＳＰＶの薬物負荷能力および送達挙動を調べた。ＵＳＰＶ製剤（０．９μｍｏｌのポルフィリン−脂質、２．１μｍｏｌのＤＭＰＣおよび０．３μｍｏｌのＣＯ）中に０．５ｍｏｌのＤｉＲ−ＢＯＡを添加することにより、ＤｉＲ−ＢＯＡは、８５％の負荷効率で粒子にうまく負荷された。２２．５ｎｍのサイズを有する得られたＵＳＰＶ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）（図９ａ）は、最小のサイズ変化およびごく少量のＤｉＲ−ＢＯＡ漏出を３０日にわたって観察したので、４℃にてＰＢＳ中でかなり安定であった。次いで本発明者らは、同所性Ｕ８７神経膠腫保有マウスにおいてＵＳＰＶ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）のインビボでの挙動を調べた。ＵＳＰＶ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）を注射してから２４時間後のマウスを、麻酔下で頭蓋除去手術に供し、ＣＲＩ Ｍａｅｓｔｒｏ（商標）イメージングシステムを使用してポルフィリンチャネル（Ｅｘ：６１５ｎｍ、Ｅｍ：６８０−７５０ｎｍ）およびＮＩＲ薬物代用チャネル（Ｅｘ：７５０ｎｍ、Ｅｍ：７８０−９５０）においてそれぞれ蛍光画像化した。図１０ａに示すように、ポルフィリンおよびＤｉＲ−ＢＯＡシグナルの両方は腫瘍中に高濃度で存在しており、これにより、健常な脳を近くに保ちながら腫瘍境界が明確に描かれる。さらに、これらの２つの蛍光シグナルは十分に共局在化されており、これは、ＵＳＰＶ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）が、腫瘍内に選択的に薬物代用物の安定で、効果的な送達を可能にすることを示唆している。より興味深いことに、この非常に効果的な送達は、非蛍光対側脳細胞を保ちながら、ディープレッドロングパスフィルタを用いてインビボでの蛍光共焦点顕微鏡法によって顕微鏡レベルで腫瘍細胞の蛍光検出を可能にした（図１０ｂ）。ＵＳＰＶの腫瘍特異的蓄積をさらに検証するために、その組織の生体内分布を、動物の屠殺時に蛍光イメージングによって調べた。図１０ｃに示すように、神経膠腫腫瘍および肝臓のみが、ポルフィリンおよびＤｉＲ−ＢＯＡの強い蛍光シグナルを示したのに対して、他の器官は無視できるほどの蛍光を示し、このことはＵＳＰＶ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）の非常に高い腫瘍特異的取り込みを実証した。ほとんどのナノ粒子の送達と同様に、ＵＳＰＶの高い肝臓取り込みは、おそらく肝胆道クリアランスによるものであった。しかし、ポリフィゾームを含むほとんどのナノ粒子の送達と異なり、ＵＳＰＶの非常に低い脾臓取り込みは、細網内皮系による濾去からの「回避」に起因するその超小型のサイズの恩恵を受けているようである。検出した組織の全てにおけるポルフィリン蛍光とＤｉＲ−ＢＯＡ蛍光との間の十分な相関関係（図１０ｃ）はさらに、種々の組織における蓄積のための全身送達においてＵＳＰＶ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）が構造的にインタクトなままであることを実証した。全体として、これらのデータは、１）ＵＳＰＶが、最小限の前漏出（ｐｒｅ−ｌｅａｋａｇｅ）および標的外効果でがん療法のための高度な腫瘍選択性および効果的な薬物送達系を提供すること、２）安定な送達特性に起因して、蛍光などのＵＳＰＶのポルフィリンシグナルが、薬物送達を追跡して治療計画を導くために使用できることを示唆している。

ＰＥＴイメージングのためのＵＳＰＶの固有の^６４Ｃｕ標識
ポルフィリンは多くの金属にとっての重要なキレート剤であるので、非常に安定な金属錯体を形成する（２０）。本発明者らの研究により、ナノ粒子のインビボ結果のＰＥＴイメージングを可能にする、ポルフィゾームのポルフィリン−脂質に対する放射性銅６４（^６４Ｃｕ）の安定なキレート化を実証した（１１−１２）。同様の標識化アプローチを使用して、本発明者らは、高い^６４Ｃｕ標識効率（＞９５％）で^６４ＣｕをプリフォームＵＳＰＶ内に組み込むことに成功し、次にその送達挙動を調べた。図１１に示すように、^６４Ｃｕ−ＵＳＰＶは卵巣がん転移を選択的にピックアップすることを可能にし、転移腫瘍は非常に明るいＰＥＴシグナルを示したのに対して、卵管などの周囲組織は最小のシグナルを示した。ＰＥＴイメージングにより可能となる腫瘍特異的ピックアップは、腫瘍細胞からの生物発光シグナルと十分に相関した、エキソビボ組織ポルフィリン蛍光イメージングによってさらに確認された。転移組織は組織学的分析によってさらに識別された。したがって、本質的にＵＳＰＶの^６４Ｃｕ標識化により、ナノ粒子送達の非侵襲性および正確な追跡ならびにさらにその腫瘍優先的蓄積に起因する腫瘍の検出が可能となり、したがって臨床応用への転換のための大きな可能性が示される。

さらに、ＵＳＰＶは他の金属と容易にキレート化することができる。例えば、常磁性Ｍｎ^３＋イオンの挿入はＭＲＩについてコントラストを生じる可能性があり（２１）、ＵＳＰＶへのパラジウム（Ｐｄ）の組み込みは、ＰＤＴ効力を最大化するために一重項酸素の生成をさらに改善できる（２２）。

蛍光誘導腫瘍切除（ＦＧＲ）のためのＵＳＰＶの可能性
腫瘍の外科的除去は依然として臨床診療において神経膠腫治療の主流であり、結果は患者の生存に影響を与える。外科処置における主な課題は断端陽性を定義することである。不十分な手術は腫瘍の局所再発およびサルベージ療法の失敗をもたらし、過剰な切除は重要な神経機能の喪失につながる。したがって、切断縁の正確な描写は、手術の間、脳について不可欠である。本発明者らは、全身投与の２４時間後、固有のポルフィリン蛍光およびＤｉＲ−ＢＯＡシグナルによって腫瘍を可視化し、周囲の健常な脳から腫瘍領域を描写するためのＵＳＰＶ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）の能力を実証した。本発明者らは次に、蛍光誘導神経膠腫手術におけるその潜在的用途を調べる。臨床状況を模倣するために、脳内深く（上面から５ｍｍ）に腫瘍を播種した同所性Ｕ８７^ＧＦＰ神経膠腫マウスモデルを利用した。図１２ａに示すように、ＵＳＰＶ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）の注射から２４時間後、固有のポルフィリン蛍光もＤｉＲ−ＢＯＡ蛍光も、Ｍａｅｓｔｒｏイメージングシステムを使用してインタクトな脳の上面から観察されなかったが、両方の蛍光シグナルはＦＭＴイメージングによって明確に検出できた。図１２ｂに示した切断プロセスの後、神経膠腫腫瘍を脳の上部を除去することによって露出させた。底部が固形腫瘍実体を含んでいたので、最小の腫瘍残存を有するそのような上部を手術床とみなした。図１２ｃに示すように、ポルフィリンおよびＤｉＲ−ＢＯＡシグナルの両方は、腫瘍組織が腫瘍細胞のＧＦＰ蛍光と十分に相関したので、それらを正確に可視化し、定義することができた。次いでポルフィリン蛍光組織を収集し、組織学的分析および凍結組織切片のために送った。図１３に示すように、Ｈ＆Ｅ染色は組織のがん細胞形態を明らかにした。一方、凍結した組織スライドは、顕微鏡レベルでＧＦＰシグナル（腫瘍細胞から）およびポルフィリンシグナル（ＵＳＰＶから）の両方を示し、ＵＳＰＶがイメージング誘導手術のための腫瘍を描写する能力をさらに確証した。さらに、ＵＳＰＶのポルフィリン蛍光は、ＭＲＩ走査によっても検出できなかった、４ｍｍから１ｍｍ未満のサイズの範囲のマウスの脳にわたって散在しているＵ８７^ｌｕｃ腫瘍の多焦点を同定することができた。図１４に示すように、除去された蛍光焦点は腫瘍細胞の固有の生物発光シグナルを明確に示した。まとめると、これらの結果は、蛍光誘導神経膠腫手術のための良好な手段を提供する、腫瘍同定のためのＵＳＰＶの高い特異性および感度を実証した。

活性化可能な光線力学ナノビーコンとしてのＵＳＰＶの可能性
ＵＳＰＶの蛍光および一重項酸素生成の両方は、インタクトなナノ構造において高度にクエンチされ、腫瘍内蓄積後に迅速に回復され得る。本発明者らは、インビボでＰＤＴについてのＵＳＰＶの潜在的な用途を広範に調べた。ＵＳＰＶの蛍光活性化はナノ構造破壊および一重項酸素活性化の評価のための有用な指標として役立ち得る。前述のように、神経膠腫腫瘍は注射後２４時間でポルフィリン蛍光の有意な増加を示した。次いで本発明者らはレーザー照射のためにこの時点を選択した。簡潔に述べると、レーザー照射（６７１ｎｍ、５０ｍＷ／ｃｍ^２）は、４ｍｇ／ｋｇのポルフィリン用量でのＵＳＰＶ注射の２４時間後、５０Ｊ／ｃｍ^２または３７．５Ｊ／ｃｍ^２の光フルエンスで小さな皮膚切開を通して経頭蓋（ｔｒａｎｓ−ｃｒａｎｉｕｍ）により適用した。レーザー照射の間の腫瘍温度は熱カメラによってリアルタイムにモニターした。処置の２４時間後に、動物を屠殺し、脳組織を組織学的分析およびＴＵＮＥＬ染色のために調製した。レーザー照射のみを受けている神経膠腫腫瘍を有するマウスおよびＵＳＰＶのみを受けている神経膠腫腫瘍を有するマウスを、それぞれレーザー対照およびＵＳＰＶ対照とした。全てのレーザー処置群について腫瘍温度の有意な上昇はなく（約２７℃で一定のままであった）、光熱効果が処置に貢献しなかったことが示された（図１５）。５０Ｊ／ｃｍ^２または３７．５Ｊ／ｍ^２の光フルエンスのいずれかにおけるＵＳＰＶ−ＰＤＴ後の腫瘍組織はＨ＆Ｅ染色において濃縮した核および細胞構造の損失を示したのに対して、ＵＳＰＶおよびレーザー対照由来の腫瘍組織は影響を受けていないままであり（図１６）、ＵＳＰＶにより可能な効果的なＰＤＴならびにＵＳＰＶおよびレーザー照射のみの非侵襲性を示した。ＴＵＮＥＬ染色はさらに、ＵＳＰＶ−ＰＤＴが５０Ｊ／ｃｍ^２群について７５．４％のＴＵＮＥＬ陽性細胞で明らかな細胞アポトーシスを誘導し、３７．５Ｊ／ｃｍ^２群について８２．１％のＴＵＮＥＬ陽性を確認し（図１７）、対照群について有意な細胞アポトーシスは観察されなかった。さらに、ＵＳＰＶ−ＰＤＴ群の周辺脳組織において観察可能な組織学的変化およびアポトーシスは存在せず、ＵＳＰＶ−ＰＤＴによって引き起こされる副作用が無視できるほどであることを示している。したがって、ＵＳＰＶは、正常な健康状態を保ちながら、非常に低い光線量にて腫瘍特異的ＰＤＴを可能にし、それにより、安全なＰＤＴ治療プロトコルを提供する。

大型動物のウサギモデルにおける頭頸部がん（ＨＮＣ）管理のためのＵＳＰＶの前臨床適用
ＨＮＣ患者の低い生存率は遅い疾患の診断および高い再発率に起因する。現在のＨＮＣ病期診断は適切な治療管理のための診断の不十分な精度および低い感度に悩まされている。ＰＥＴ、蛍光イメージングおよびＰＤＴの固有の多様性を伴うＵＳＰＶは、ＨＮＣ病期診断の精度を高め、ＨＮＣ管理に革命をもたらす大きな可能性を提供し得る。腫瘍誘導後に局所リンパ節への転移を一貫して発生できる臨床的に関連するＶＸ−２口腔がんのウサギモデルを使用して、本発明者らは、ＨＮＣ診断および管理についてのＵＳＰＶの能力を調べた。

ＨＮＣウサギモデルにおける原発性腫瘍およびセンチネルリンパ節のＵＳＰＶ−ＰＥＴにより可能な検出
ＶＸ−２ウサギにおける^６４Ｃｕ−ＵＳＰＶの血中クリアランスプロファイルを２コンパートメントモデルに適合すると、最大で２７．７時間の遅い半減期を有利に示した（図１８ａ）。したがって、ＰＥＴイメージングを、その生物学的半減期および放射性核種半減期（^６４Ｃｕ ｔ１／２＝１２．７ｈ）を一致させるために^６４Ｃｕ−ＵＳＰＶ（０．３４ｍｇ／ｋｇのポルフィリン、約５ｍＣｉ）の静脈内注射の２４時間後にＶＸ２ウサギにおいて実施した。ＰＥＴ／ＣＴ共登録画像（図１８ｂ、図１９）に示されるように、腫瘍およびセンチネルリンパ節（ＳＬＮ）は高いコントラストで明確に識別可能であった。レンダリングされた画像と一致して、腫瘍およびＳＬＮは、周囲の筋肉のものと比較して対象のＰＥＴ容積（ＶＯＩ）測定値から定量された有意に高い標準取り込み値（ＳＵＶ）を示し、それらはそれぞれ３．５８±０．５３、２．５７±０．５３および０．３５±０．０２（ｎ＝５、Ｐ＜０．０５、図１８ｃ）であった。

主な器官中の^６４Ｃｕ−ＵＳＰＶの分布をガンマカウンティング法によりさらに評価した。これにより、腫瘍保有および健常なウサギにおけるＵＳＰＶの同様の分布パターンが明らかになった（図１８ｄ）。肝臓の比較的高い標準的な取り込み値（ＳＵＶ）（腫瘍保有および健常なウサギのそれぞれについて９．３４±０．９２ＳＵＶおよび１０．５４±１．６８ＳＵＶ）は、^６４Ｃｕ−ＵＳＰＶの肝胆道クリアランスに起因する可能性が高い。しかしながら、この高い取り込みは、頭頸部領域からの肝臓の相対的に離れた位置を考慮して、ＨＮＣ検出に影響を与えない。ガンマカウンティングからの腫瘍およびＳＬＮの平均取り込みは、それぞれ３．１４±０．２６ＳＵＶおよび２．２１±０．２６ＳＵＶであり（図１８ｄ、ｎ＝５）、それらは、ＰＥＴ画像ＶＯＩ定量から得たそれらの対応するＳＵＶと一致する（図１８ｃ）。健常なウサギの取り込みよりも有意に高い取り込みを示した腫瘍保有ウサギのＳＬＮ（０．８７±０．１３ＳＵＶ、ｎ＝３、Ｐ＜０．０１）は、Ｈ＆Ｅ分析およびパンサイトケラチン（ＰａｎＣＫ）染色によって識別された、上昇したリンパ液の流れおよび転移性病変の存在に起因する可能性が高い（図２０）。したがって、^６４Ｃｕ−ＵＳＰＶは健常なものから悪性のＳＬＮを描写することができた。

切除された組織の以下のエキソビボでの蛍光イメージングにより、腫瘍保有ウサギの腫瘍および排出ＳＬＮにおけるＵＳＰＶの有意に高い蓄積および蛍光活性化がさらに確認された（図１８ｅ）。^６４Ｃｕ−ＵＳＰＶの比較的高い蓄積にも関わらず唾液腺において無視できるほどの蛍光シグナルを観察し（図１８ｅ）、このことは、ＵＳＰＶが他のＰＥＴ画像剤（例えば^１８Ｆ−ＦＤＧ）のように唾液腺に非特異的に蓄積するが、インタクトで非蛍光のままであるという事実に起因する可能性が高い。これらの結果により、ＰＥＴと蛍光イメージングとを組み合わせることにより、ＵＳＰＶが、転移リンパ節の正確な検出のために補完的に情報を提供することができ、唾液腺の低いバックグラウンド蛍光でリンパ節の画像誘導切除のために利用できる可能性があることが示された。

原発性腫瘍および転移性疾患の蛍光誘導切除
腫瘍および転移リンパ節におけるＵＳＰＶの選択的蛍光活性化を利用して、本発明者らは、腫瘍を有するウサギにおける原発性腫瘍およびＳＬＮの外科的切除のための蛍光術中ガイダンスとしてＵＳＰＶの能力を評価した。図２１ａに示すように、腫瘍（皮膚はインタクトである）は、インビボでの蛍光イメージングシステム下で周辺組織と比較して可視化のために十分に蛍光性であった。外科的診査の間に皮弁を持ち上げると、腫瘍が露出し、ポルフィリン蛍光によって明確に描写された（図２１ｂ）。蛍光によって誘導して、検査の周囲の全ての疑わしい悪性腫瘍を外科的に除去した。手術床は無視できるほどの蛍光シグナルを示し、完全な腫瘍切除を示唆した（図２１ｃ）。切除された組織は組織学的分析によって悪性であることが確認された（図２１ｄ）。組織の組織学的スライドにおけるポルフィリン蛍光は、がん細胞形態および陽性ＰａｎＣＫ染色と十分に対応し、ＵＳＰＶ蛍光が細胞レベルでかなりの特異性および精度で原発性腫瘍を強調したことを示した（図２１ｄ）。同様に、ＵＳＰＶ蛍光はまた、インビボで排出ＳＬＮを描写した（図２１ｅ）。注目すべきことに、原発性腫瘍からＳＬＮおよび局所リンパ節までのリンパ管網は蛍光シグナルによって極めて詳細にマッピングされた（図２１ｆ）。リンパ管網の方向（拡大画像、図２１ｆの位置１〜５）に従って、二次陽性リンパ節およびリンパ管の広がりパターンを識別した。組織学的研究により、リンパ節における転移が確認され、ＰａｎＣＫ陽性領域において強いポルフィリン蛍光が観察され、転移領域におけるＵＳＰＶの取り込みが示唆された（図２１ｇ）。全体的に、ＵＳＰＶ蛍光は、原発性腫瘍および悪性リンパ節だけでなく、局所リン管網も明確に描写し、これにより、切除および病理学的分析の前にＨＮＣ患者のリンパ節分類に役立ち、悪性リンパ節を明らかにする可能性があり得る。

ＵＳＰＶにより可能なＰＤＴ誘導性アポトーシス
ＨＮＣウサギにおいてＵＳＰＶ−ＰＤＴの長期間の治療効果を評価した。３００ｍｍ^３の平均腫瘍サイズを有する腫瘍保有ウサギを、ブランク対照（ｎ＝３）、レーザーのみの対照（ｎ＝３）、ＵＳＰＶのみの対照（ｎ＝３）およびＵＳＰＶ−ＰＤＴ群（ｎ＝４）を含む４つの群に分類した。図２２ａに示すように、腫瘍全体の領域を照射するために２段階のレーザー照射戦略をＵＳＰＶ注射の２４時間後にＰＤＴについて使用した。レーザー処置の間、有意な温度増加がないことにより、熱的効果が隣接する健常組織に対して意図しない副作用を引き起こし得るという懸念を除いて、処置の熱的効果がないことが確認された（図２３）。ＵＳＰＶ−ＰＤＴは、ＰＤＴ後２４時間から開始して治療後２６日まで腫瘍周辺の瘢痕化を引き起こした。最終的に、全てのＵＳＰＶ−ＰＤＴウサギは処置の３４日後に触診可能な腫瘍を有さなかった（図２２ｂ）。治療後の腫瘍体積を３Ｄ再構成ｍｉｃｒｏＣＴ画像の体積測定によって定量的に測定した。ＵＳＰＶ−ＰＤＴ群は、治療後１週間以内にわずかな腫瘍サイズの増加を示し、これは、ＰＤＴによって引き起こされる予想される炎症反応および浮腫に起因する可能性が高い（図２２ｃ）。しかしながら、ＰＤＴ後３４日目に腫瘍が検出されなくなるまで、腫瘍サイズはＰＤＴ後６日目から徐々に低下した。対照的に、レーザー照射またはＵＳＰＶ投与単独のいずれかを受けた対照群はブランク対照と同様に指数関数的な腫瘍増殖を示し、それらのいずれもあらゆる治療効果を誘導しなかったことが示された（図２２ｄ、図２４）。対照群はそれぞれ、ブランク対照について６日目、レーザー対照について８日目、およびＵＳＰＶ対照について９日目にエンドポイント（腫瘍体積＞５０００ｍｍ^３）に達した（図５ｄ）。ＵＳＰＶ−ＰＤＴにより可能な完全な腫瘍アブレーションは、病理学的分析によってさらに確認された。このことは、終末外科手術において元の腫瘍領域から切除された組織が、その陰性ＰａｎＣＫ染色に加えて、病的細胞形態を示さなかったことにより実証された（図２２ｅ）。注目すべきことに、直接的なレーザー照射を受けなかったが、ＵＳＰＶ−ＰＤＴ群のリンパ節はＰＤＴの１４日後からサイズが徐々に減少したことが示された（図２５）。ＵＳＰＶ−ＰＤＴ群からの全てのリンパ節は、病変およびＰａｎＣＫ染色分析によって証明されるようにＰＤＴ後３４日で転移が認められなかった（図２２ｆ）。これらの結果は、中咽頭、鼻咽頭、下咽頭のような外科的にアクセスできない、または重要な解剖学的構造に隣接するＨＮＣサブタイプについて、および再発症例について、ＵＳＰＶ−ＰＤＴが、治療効果を増加させ、長期間の毒性を減少させるための放射線治療および化学療法に対する代替の手法として役立ち得ることを強く示唆している。ＵＳＰＶ−ＰＤＴは、非常に効果的であり、高度に局在化するように見え、健常な組織機能の維持を可能にする。

ＵＳＰＶは安全な多機能ナノプラットフォームである
ウサギに対するＵＳＰＶ−ＰＤＴの毒性を定期的に血液検査によって評価した（図２６ａ）。処置後のウサギの肝機能は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を除いて、有意な変化がなく正常を維持し、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）は、処置の１週間後に正常な範囲内（６８．１±８．６６〜４３．５±９．６７Ｕ／Ｌ）で中程度の減少を示し、時間と共にベースラインレベル（正常な範囲１２〜９８Ｕ／Ｌ）に戻った。赤血球レベルは治療後安定なままであり、内因性ポルフィリン（ｈｅｍｅ）の生理学的調節に干渉しないことを示している。白血球数もまた影響を受けないままであり、ＵＳＰＶによって免疫原性効果が引き起こされなかったことを示唆している。ＵＳＰＶ−ＰＤＴウサギに対する死後の組織学的分析は、心臓、肺、肝臓、脾臓、副腎または筋肉において異常な細胞形態を示さなかった（図２６ｂ）。これらの結果は、ＵＳＰＶにより可能なＰＤＴ治療が安全な治療手法であることを示唆している。

要約すると、本明細書には、ポルフィリン脂質ベースのリン脂質単層によって封入され、αヘリックス構造によって制限される疎水性コアを有する集学的セラノスティックポルフィリン小胞が記載されている。インタクトなＵＳＰＶに高密度に充填されたポルフィリンは、蛍光および一重項酸素生成を含む、それらの感光性の有意なクエンチングを引き起こすが、ナノ構造が破壊されると光線力学活性になる。ＵＳＰＶは、ＰＥＧ化を必要とすることなく、疎水性薬物負荷能力、超小型（＜３０ｎｍ）、および優れた血液循環特性（マウスにおいて１０時間の循環半減期、ウサギにおいて２７時間）などの、薬物送達についての多くの有益な特徴を有する。本発明者らは、ＵＳＰＶが腫瘍特異的送達のための安定な薬物送達プラットフォームであることを立証した。ＵＳＰＶの固有の^６４Ｃｕ標識により、薬物送達の非侵襲性追跡が可能となったので、合理的な線量測定および治療計画のための有用な手段を提供する。臨床的に関連するリンパ管転移ウサギモデルにおいて、本発明者らは、ＵＳＰＶが原発性腫瘍および転移リンパ節の正確な検出を容易にすることを実証し、術前ＰＥＴおよび術中蛍光イメージングの両方によって腫瘍から局所リンパ節へのリンパ排液を可視化することを可能にした。転移性リンパ管経路の洞察により、より高い感度で未知の原発性および再発性腫瘍の識別が可能となり、治療結果を改善することができる。さらに、腫瘍蓄積後の高密度に充填されたポルフィリンの効果的な光特性活性化により、神経膠腫マウスおよびＨＮＣウサギモデルの両方において正確な蛍光誘導腫瘍切除および有効なＰＤＴが可能となり、隣接する重要な構造を損傷させずに原発性腫瘍の完全な根絶および腫瘍転移の遮断を与えることができる。したがって、ＵＳＰＶの固有の多様的な性質および好適な送達特性は、ＰＥＴ／ＣＴおよび蛍光イメージングを組み入れることによってがん診断を向上させ、選択的ＰＤＴと共に蛍光誘導手術を用いてテラーリング（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ）治療によるがん治療効果および特異性を改善するためのがんセラノスティックおよび臨床解釈についての高い可能性を与える。

本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されているが、本発明の精神または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、変形が可能であることは、当業者には理解されるであろう。以下の参考文献リストの文献を含む、本明細書中に開示される全ての文献は、参考として援用される。

参考文献

Claims (36)

1. リン脂質の単層、ポルフィリン−リン脂質結合体およびペプチドを封入する疎水性コアを含む、ナノ小胞であって、
   前記ペプチドは、少なくとも１つの両親媒性α−ヘリックスを形成できるアミノ酸配列を含み、
   前記ポルフィリン−リン脂質結合体は、好ましくは１つのリン脂質のｓｎ−１またはｓｎ−２の位置において脂質側鎖に共有結合している１つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含み、
   リン脂質に対するポルフィリン−リン脂質結合体のモル％は３５％以下であり、
   前記ナノ小胞は直径が３５ｎｍ以下である、ナノ小胞。
2. 前記リン脂質に対するポルフィリン−リン脂質結合体のモル％は、３５％以下、３０％以下、２５％以下、または２０〜３０％である、請求項１に記載のナノ小胞。
3. 前記ナノ小胞は、実質的に球形であり、直径が３０ｎｍ以下、２５ｎｍ以下、２０〜３０ｎｍ、または約２５ｎｍである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノ小胞。
4. 前記ポルフィリン−リン脂質結合体における前記ポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体は、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン、テトラフェニルポルフィリン、ピロフェオホルビド、バクテリオクロロフィル、クロロフィルａ、ベンゾポルフィリン誘導体、テトラヒドロキシフェニルクロリン、プルプリン、ベンゾクロリン、ナフトクロリン、ベルジン、ロジン、ケトクロリン、アザクロリン、バクテリオクロリン、トリポルフィリン、ベンゾバクテリオクロリン、広義のポルフィリンおよびポルフィリン異性体からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ小胞。
5. 前記広義のポルフィリンは、テキサフィリン、サプフィリンまたはヘキサフィリンであり、前記ポルフィリン異性体は、ポルフィセン、転化されたポルフィリン、フタロシアニン、またはナフタロシアニンである、請求項４に記載のナノ小胞。
6. 前記ポルフィリン−リン脂質結合体における前記ポルフィリンは、ピロフェオホルビド−ａ酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ小胞。
7. 前記ポルフィリン−リン脂質結合体における前記ポルフィリンは、バクテリオクロロフィル誘導体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ小胞。
8. 前記ポルフィリン−リン脂質結合体における前記リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトールを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノ小胞。
9. 前記リン脂質は、１２から２２個の炭素のアシル側鎖を含む、請求項８に記載のナノ小胞。
10. 前記ポルフィリン−リン脂質結合体における前記リン脂質は、１−パルミトイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンまたは１−ステアロイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノ小胞。
11. 前記ポルフィリン−リン脂質結合体は、ピロ脂質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ小胞。
12. 前記ポルフィリン−リン脂質結合体は、オキシ−バクテリオクロロフィル−脂質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ小胞。
13. 前記ポルフィリンは、０から２０個の炭素の炭素鎖リンカーにより前記リン脂質におけるグリセロール基に結合される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノ小胞。
14. 前記ポルフィリン−リン脂質結合体は、その中にキレート化された金属、任意に金属の放射性同位体を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のナノ小胞。
15. 前記金属は、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｎ、ＦｅおよびＰｄからなる群から選択される、請求項１４に記載のナノ小胞。
16. 前記リン脂質は、アニオン性リン脂質である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のナノ小胞。
17. 前記リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載のナノ小胞。
18. 前記リン脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジベヘノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、１，２−ジリグノセロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＬｇＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホル−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ＤＰＰＧ）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載のナノ小胞。
19. 前記ペプチドは、クラスＡ、Ｈ、ＬおよびＭ両親媒性α−ヘリックス、それらの断片、ならびに前記クラスＡ、Ｈ、ＬおよびＭ両親媒性α−ヘリックスまたはそれらの断片の逆ペプチド配列を含むペプチドからなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のナノ小胞。
20. 前記ペプチドは、好ましくは、アポＢ−１００、アポＢ−４８、アポＣ、アポＥおよびアポＡからなる群から選択される、アポタンパク質の連続するアミノ酸からなる、請求項１９に記載のナノ小胞。
21. 前記ペプチドは、２Ｆ（ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ）、４Ｆ（ＤＷＦＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＦＫＥＡＦ）および前記の逆配列からなる群から選択される、請求項１９に記載のナノ小胞。
22. 前記ペプチドは、Ｒ４Ｆペプチド（Ａｃ−ＦＡＥＫＦＫＥＡＶＫＤＹＦＡＫＦＷＤ）である、請求項１９に記載のナノ小胞。
23. 前記少なくとも１つの両親媒性α−ヘリックスまたはペプチドは、６から３０アミノ酸長、８から２８アミノ酸長、１０から２４アミノ酸長、１１から２２アミノ酸長、１４から２１アミノ酸長、１６から２０アミノ酸長または１８アミノ酸長である、請求項２０または２１に記載のナノ小胞。
24. 前記疎水性コアは、疎水性診断剤または治療剤を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のナノ小胞。
25. 前記疎水性コアは、パクリタキセル、ドセタキセル、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨウ化物ビス−オレエート（ＤｉＲ−ＢＯＡ）を含む、請求項２５に記載のナノ小胞。
26. 前記ナノ小胞はＰＥＧを含まない、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のナノ小胞。
27. ＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ−脂質、さらに好ましくはＰＥＧ−ＤＳＰＥをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のナノ小胞。
28. ターゲティング分子をさらに含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のナノ小胞。
29. 対象における標的領域上でイメージングする方法であって、
    ａ．請求項１〜２８のいずれか一項に記載のナノ小胞を提供する工程と、
    ｂ．前記ナノ小胞を前記対象に投与する工程と、
    ｃ．前記標的領域をイメージングする工程と
    を含む、方法。
30. 前記標的領域は腫瘍である、請求項２９に記載の方法。
31. 対象における標的領域、好ましくは腫瘍上でイメージングを実施するための請求項１〜２８のいずれか一項に記載のナノ小胞の使用。
32. 対象における標的領域上で光線力学療法を実施する方法であって、
    ａ．請求項１〜２８のいずれか一項に記載のナノ小胞を提供する工程と、
    ｂ．前記ナノ小胞を前記対象に投与する工程と、
    ｃ．ある波長の光を用いて前記標的領域において前記ナノ小胞を照射する工程であって、前記ある波長の光はポルフィリン−リン脂質結合体を活性化して一重項酸素を生成する、工程と
    を含む、方法。
33. 前記標的領域は腫瘍である、請求項３２に記載の方法。
34. 疎水性薬剤を対象に送達する方法であって、
    ａ．請求項１〜２３のいずれか一項に記載のナノ小胞を提供する工程であって、前記疎水性コアが前記薬剤を含む、工程と、
    ｂ．前記ナノ小胞を前記対象に投与する工程と
    を含む、方法。
35. 前記標的領域が腫瘍である、請求項２８に記載の方法。
36. 対象における標的領域上でイメージングを実施して、疎水性薬剤を送達するための請求項１〜２３のいずれか一項に記載のナノ小胞の使用であって、前記疎水性コアが前記薬剤を含む、使用。

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