CN106636098B - 一种紫花苜蓿hppd基因的启动子及其制备方法和应用 - Google Patents

一种紫花苜蓿hppd基因的启动子及其制备方法和应用 Download PDF

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    • C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
    • C12Y113/11027—4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (1.13.11.27)

Abstract

本发明公开了一种紫花苜蓿HPPD基因的启动子及其制备方法和应用，其基因序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，该基因的制备方法包括以下步骤：(1)基因组DNA的获取；(2)特异性引物的设计；(3)1st PCR反应；(4)2nd PCR反应；(5)3rd PCR反应；(6)取1st、2nd、3rd PCR反应液各5μl，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳；(7)切胶回收清晰的电泳条带，以SP3Primer为引物对PCR产物进行DNA测序；将测序获得的序列进行拼接，去除重叠序列，最终获得紫花苜蓿HPPD基因的启动子序列。HPPD基因的启动子在调控基因的光/暗反应以及多种逆境反应中起到了重要作用。可以作为一个逆境响应，尤其是光调控响应的启动子使用。

Description

一种紫花苜蓿HPPD基因的启动子及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及紫花苜蓿领域，特别是涉及一种紫花苜蓿启动子及其制备方法和应用。
背景技术
启动子是一段位于结构基因5’端上游的DNA序列，能与RNA聚合酶结合，使之与模板DNA准确结合并起始转录。一个典型的启动子包括CAAT-box和TATA-box等核心顺式作用元件，按功能及作用方式可大致将其分为组成型表达启动子、时空特异性表达启动子和诱导型表达启动子三类。目前，植物启动子已经被大量的分离并研究，花椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子和木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子即组成型启动子。Pyk10启动子是拟南芥中的组织特异性表达启动子。组成型表达的启动子在植物基因工程的早期研究中发挥了重要的作用，但是在应用过程中也存在一定的问题。组成型启动子在转基因作物中驱动相关基因持续高量的表达可能造成物质和能量上的浪费，甚至会影响作物的产量和品质，而特定时空表达和诱导型表达的启动子可以较好地解决这一问题。如马铃薯中冷诱导表达启动子pCL、拟南芥中干旱诱导表达启动子Prd29A等。
紫花苜蓿是世界上分布最广的一种多年生豆科牧草，也是我国最重要的豆科牧草之一。它不仅产量高而且营养丰富，为誉为“牧草之王”。但由于紫花苜蓿多年生，多倍体的特点，目前对紫花苜蓿基因方面的研究还远远落后于其它作物。对于紫花苜蓿启动子研究的相关报道还比较少。
维生素E是动物不能合成但又必须的营养物质。在维生素E的生物合成中，对羟基苯丙酮酸双加氧酶是第一个关键酶，对于维生素E的合成具有重要作用。本专利以紫花苜蓿为材料，研究编码对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因的启动子，旨在阐明该启动子不同区域发挥的功能，及其响应的诱导条件，为更真实的了解紫花苜蓿的基因表达调控特性，进而帮助我们了解紫花苜蓿的维生素E性状形成的生物学过程，探讨生物对其生长环境的适应机制以及更好地控制基因在转基因植物中的表达等具有重要意义。同时也为一个诱导型启动子，尤其是光/暗诱导启动子的开发奠定了理论基础。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种紫花苜蓿HPPD基因的启动子。
本发明的第二目的是提供一种紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法。
本发明的第三目的是提供一种紫花苜蓿HPPD基因的启动子的应用。
一种紫花苜蓿HPPD基因的启动子，其基因序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
本发明所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)基因组DNA的获取；
(2)特异性引物的设计；
(3)1st PCR反应；
(4)2nd PCR反应；
(5)3rd PCR反应；
(6)取1st、2nd、3rd PCR反应液各5μl，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳；
(7)切胶回收清晰的电泳条带，以SP3Primer为引物对PCR产物进行DNA测序；将测序获得的序列进行拼接，去除重叠序列，最终获得紫花苜蓿HPPD基因的启动子序列；
所述SP3Primer如序列表中SEQ ID NO:4所示。
本发明所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法，其特征在于：步骤(1)具体包括：取1.0g紫花苜蓿新鲜叶片，利用QIAGEN公司的DNeasy Plant Maxi Kit提取总DNA，所得的DNA量≥30μg。
本发明所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法，其特征在于：步骤(2)具体包括：根据已知的紫花苜蓿HPPD基因编码区DNA序列，设计三个特异性引物SP1：5'-GTGTTTGTCTTGGTGTTGTTGTTA-3'、SP2：5'-AGAGTAATGGAGCGACGG-CGTAGTTG-3'、SP3：5'-GTTCGGGCTCGATCAAACGACTACTG-3'；
设计方向为5'端；设计原则为：SP2位于SP1内侧，SP3位于SP2内侧；每两个引物之间的距离为100bp左右，引物长度22-26bp，GC含量45-55％，Tm值60-70℃；
所述引物SP1、SP2和SP3如序列表中SEQ ID NO:2-4所示。
本发明所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法，其特征在于：步骤(3)具体包括：
基因组DNA经OD测定，浓度为50ng/μl，取2μl作为模板，以TAKARA genome walking试剂盒AP Primer四种中的任意一种，作为上游引物，SP1Primer为下游引物，进行1st PCR反应；
A.按表1中的组份配制1st PCR反应液：
表1
试剂 使用量
紫花苜蓿基因组DNA，50ng/μL 2μL
dNTP Mixture，2.5mM each 8μl
10×LA PCR Buffer II，Mg2+plus 5μl
TaKaRa LA Taq，5U/μl 0.5μl
AP1Primer，100pmol/μl 1μl
SP Primer，10pmol/μl 1μl
dH2O 32.5μl
B.1st PCR反应条件及步骤如表2所示：
表2
本发明所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法，其特征在于：步骤(4)具体包括：取1μl 1st PCR反应液作为2nd PCR反应的模板，以AP1Primer为上游引物，SP2Primer为下游引物，进行2nd PCR反应；
A.按表3中的组份配制2nd PCR反应液：
表3
B.2nd PCR反应条件及步骤如表4所示：
表4
本发明所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法，其特征在于：步骤(5)具体包括：取1μl 2nd PCR反应液作为3rd PCR反应的模板，以AP Primer为上游引物，SP3Primer为下游引物，进行3rd PCR反应；
A.按表5中的组份配制3rd PCR反应液：
表5
试剂 使用量
2nd PCR反应液 1μL
dNTP Mixture，2.5mM each 8μl
10×LA PCR Buffer II，Mg2+plus 5μl
TaKaRa LA Taq，5U/μl 0.5μl
AP1Primer，100pmol/μl 1μl
SP3Primer，10pmol/μl 1μl
dH2O 33.5μl
总体积 50μl
B.3rd PCR反应条件及步骤如表6所示：
表6
本发明所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子在调控基因的光/暗反应以及逆境反应中的应用。
用PlantCARE软件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对该启动子序列进行了分析，发现该启动子中存在逆境响应，水杨酸(SA)以及多个光响应原件。为验证该启动子对MsHPPD基因的调控功能，构建了HPPDpromoter：：35S植物表达载体，将该载体转化到拟南芥中。用SA、干旱(PEG)、盐(NaCl)、脱落酸(ABA)和光/暗对转基因拟南芥幼苗进行处理，然后将整个植株进行GUS组织化学染色处理。
结果显示：经水杨酸，PEG，NaCl，ABA多种逆境处理后，与PBI::GUS对照相比，GUS染色浓度升高；光/暗处理时，暗处理后，GUS染色浓度显著升高，而恢复光照后，GUS染色变浅。
结果说明，HPPD基因的启动子在调控基因的光/暗反应以及多种逆境反应中起到了重要作用，可以作为一个逆境响应，尤其是光调控响应的启动子使用。
本发明的有益效果在于：
(1)获得了HPPD基因的启动子基因序列，并发现了HPPD基因的启动子在调控基因的光/暗反应以及多种逆境反应中的应用。
(2)阐明了该启动子不同区域发挥的功能，及其响应的诱导条件，为更真实的了解紫花苜蓿的基因表达调控特性，进而可以了解紫花苜蓿的维生素E性状形成的生物学过程，探讨生物对其生长环境的适应机制以及更好地控制基因在转基因植物中的表达等具有重要意义。同时也为一个诱导型启动子，尤其是光/暗诱导启动子的开发奠定了理论基础。
下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子及其制备方法和应用作进一步说明。
附图说明
图1为GUS组织化学的染色结果彩色图；
图2为GUS组织化学的染色结果灰度图。
具体实施方式
紫花苜蓿HPPD基因的启动子，其基因序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。通过染色体步移技术获得该序列，具体方法为：
(1)基因组DNA的获取
取1.0g紫花苜蓿新鲜叶片，利用QIAGEN公司的DNeasy Plant Maxi Kit提取总DNA，所得的DNA量≥30μg。
(2)特异性引物的设计
根据已知的紫花苜蓿HPPD基因编码区DNA序列，设计三个特异性引物SP1：5'-GTGTTTGTCTTGGTGTTGTTGTTA-3'、SP2：5'-AGAGTAATGGAGCGACGG-CGTAGTTG-3'、SP3：5'-GTTCGGGCTCGATCAAACGACTACTG-3'；
设计方向为5'端；设计原则为：SP2位于SP1内侧，SP3位于SP2内侧；每两个引物之间的距离为100bp左右，引物长度22-26bp，GC含量45-55％，Tm值60-70℃；
引物SP1、SP2和SP3如序列表中SEQ ID NO:2-4所示。
(3)1st PCR反应
基因组DNA经OD测定，浓度为50ng/μl，取2μl作为模板，以TAKARA genome walking试剂盒AP Primer四种中的任意一种，作为上游引物，SP1Primer为下游引物，进行1st PCR反应；
A.按表1中的组份配制1st PCR反应液：
表1
试剂 使用量
紫花苜蓿基因组DNA，50ng/μL 2μL
dNTP Mixture，2.5mM each 8μl
10×LA PCR Buffer II，Mg2+plus 5μl
TaKaRa LA Taq，5U/μl 0.5μl
AP1Primer，100pmol/μl 1μl
SP Primer，10pmol/μl 1μl
dH2O 32.5μl
B.1st PCR反应条件及步骤如表2所示：
表2
(4)2nd PCR反应
取1μl 1st PCR反应液作为2nd PCR反应的模板，以AP1Primer为上游引物，SP2Primer为下游引物，进行2nd PCR反应；
A.按表3中的组份配制2nd PCR反应液：
表3
试剂 使用量
1st PCR反应液 1μL
dNTP Mixture，2.5mM each 8μl
10×LA PCR Buffer II，Mg2+plus 5μl
TaKaRa LA Taq，5U/μl 0.5μl
AP1Primer，100pmol/μl 1μl
SP2Primer，10pmol/μl 1μl
dH2O 33.5μl
总体积 50μl
B.2nd PCR反应条件及步骤如表4所示：
表4
(5)3rd PCR反应
取1μl 2nd PCR反应液作为3rd PCR反应的模板，以AP Primer为上游引物，SP3Primer为下游引物，进行3rd PCR反应；
A.按表5中的组份配制3rd PCR反应液：
表5
试剂 使用量
2nd PCR反应液 1μL
dNTP Mixture，2.5mM each 8μl
10×LA PCR Buffer II，Mg2+plus 5μl
TaKaRa LA Taq，5U/μl 0.5μl
AP1Primer，100pmol/μl 1μl
SP3Primer，10pmol/μl 1μl
dH2O 33.5μl
总体积 50μl
B.3rd PCR反应条件及步骤如表6所示：
表6
(6)取1st、2nd、3rd PCR反应液各5μl，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。
(7)切胶回收清晰的电泳条带，以SP3Primer为引物对PCR产物进行DNA测序；将测序获得的序列进行拼接，去除重叠序列，最终获得紫花苜蓿HPPD基因的启动子序列；
所述SP3Primer如序列表中SEQ ID NO:4所示。
并且最终实验结果表明：AP1Primer扩增出的条带最清晰，非特异性扩增少，便于后期回收，条带最长，效果最好。
紫花苜蓿HPPD基因的启动子在调控基因的光/暗反应以及逆境反应中的应用：
用PlantCARE软件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对该启动子序列进行了分析，发现该启动子中存在逆境响应，水杨酸(SA)以及多个光响应原件。为验证该启动子对MsHPPD基因的调控功能，构建了HPPDpromoter::35S植物表达载体，将该载体转化到拟南芥中。用SA、干旱(PEG)、盐(NaCl)、脱落酸(ABA)和光/暗对转基因拟南芥幼苗进行处理，然后将整个植株进行GUS组织化学染色处理。
结果显示：经水杨酸、PEG、NaCl、ABA多种逆境处理后，与PBI：：GUS对照相比，GUS染色浓度升高；光/暗处理时，暗处理后，GUS染色浓度显著升高，而恢复光照后，GUS染色变浅(如图1-2所示及表7所示)。
表7GUS组织化学染色结果
对照Control 染色较浅
PEG 染色比对照深
NaCl 染色比对照深
ABA 染色比对照深
SA 染色比对照深
黑暗 染色比对照深
恢复光照 染色程度较黑暗处理浅
结果说明，HPPD基因的启动子在调控基因的光/暗反应以及多种逆境反应中起到了重要调控作用，可以作为一个逆境响应，尤其是光调控响应的启动子使用。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种紫花苜蓿启动子及其制备方法和应用
<130> None
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1264
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HPPD启动子序列
<400> 1
ggcttagtaa tctagagttc ggccgcgagg taatcatagc ctgaccaaaa attgttccat 60
ccaagaatca aactcgggta tatacactaa gcaagaatta agcatattac gcctcttaaa 120
aaaaacatat tgcctaaatt atttagctta actaataaat tggttcattc atatcaacaa 180
gaattgagtg tagattttca cttcaccgca tacaaatctc ggttgaaaca gatgtacata 240
ttaggtgttt gatgtacctc actgaaaaat atatatagaa aaaaaatgac acttaaatta 300
atatgacact tttagataaa tgatgctgac aatttaaatc taataagaaa taattgtggt 360
agctcataag tatgagcaga attaagatgt ggttggaggc actgatagag aatgtgtttt 420
gtagatagat ataaggtgct atgctggttt ttggcaatgt aaattttgat tggtttctaa 480
caatgtattt aaagaatatg gtgatgagga tgctagattt tagttatatt cttgcgcaga 540
agtcggttta ttaattatta tgtgtgagga tgtttgatgt catgcttatc ttgtgttaga 600
taaacatctt ttaatggttg acatgtttaa cgtagacttt aatggataag gaaaatatga 660
tgtttatatt tgtcgtgttc acacgtttga tacatcagta gtcgtttgat cgagcccgaa 720
ctattcatat tttaatataa attattcaat ctcgatcaac cactactgaa gtataattgt 780
gacaaattat tcgatcgtaa gatcgaagaa agtaatatca gttcatgaaa ttgcgattgc 840
gtttgccatt cttatttgga gttaactaac ttaggttact ttaatgaaag ttgagtgtgg 900
aggatgtttt ttccggttca atatttctaa aaacattccg acaaaaaaaa caaaaaacta 960
aaacaatact actatagaaa gtcgtgtttt tcttctccac ttccaatatt ttatttcttg1020
tctatttcct atgaaattat catcttcacc atttcttcct tcatcctcat ccatccactc1080
ttacacacca tttctcccac gcaacacaca aaattccaac tacgccgtcg ctccattact1140
ctcatccaat cacatttctc cacgtttcac cttccctcaa cataaaaaca ccaacaagta1200
caacaacact cttacaaatt ctaacaacaa caccaagaca aacactaaaa caacaatctc1260
catg 1264
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物SP1
<400> 2
gtgtttgtct tggtgttgtt gtta 24
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物SP2
<400> 3
agagtaatgg agcgacggcg tagttg 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物SP3
<400> 4
gttcgggctc gatcaaacga ctactg 26

Claims (3)

1.一种紫花苜蓿HPPD基因的启动子，其特征在于：其启动子序列如序列表中SEQ IDNO:1所示。
2.权利要求1所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子的制备方法，其特征在于：
包括以下步骤：
(1)基因组DNA的获取：取1.0g紫花苜蓿新鲜叶片，利用QIAGEN公司的DNeasy PlantMaxi Kit提取总DNA，所得的DNA量≥30μg；
(2)特异性引物的设计：根据已知的紫花苜蓿HPPD基因编码区DNA序列，设计三个特异性引物SP1：5'-GTGTTTGTCTTGGTGTTGTTGTTA-3'、SP2：5'-AGAGTAATGGAGCGACGG-CGTAGTTG-3'、SP3：5'-GTTCGGGCTCGATCAAACGACTACTG-3'；
Tm值60-70℃；
所述引物SP1、SP2和SP3如序列表中SEQ ID NO:2-4所示；
(3)1st PCR反应：基因组DNA经OD测定，浓度为50ng/μl，取2μl作为模板，以TAKARAgenome walking试剂盒AP Primer四种中的任意一种，作为上游引物，SP1 Primer为下游引物，进行1st PCR反应；
A.按表1中的组份配制1st PCR反应液：
表1
试剂 使用量 紫花苜蓿基因组DNA，50ng/μL 2μL dNTP Mixture，2.5mM each 8μl 10×LA PCR Buffer II，Mg2+plus 5μl TaKaRa LA Taq，5U/μl 0.5μl AP1 Primer，100pmol/μl 1μl SP Primer，10pmol/μl 1μl dH2O 32.5μl
B.1st PCR反应条件及步骤如表2所示：
表2
(4)2nd PCR反应：取1μl 1st PCR反应液作为2nd PCR反应的模板，以AP1 Primer为上游引物，SP2 Primer为下游引物，进行2nd PCR反应；
A.按表3中的组份配制2nd PCR反应液：
表3
试剂 使用量 1st PCR反应液 1μL dNTP Mixture，2.5mM each 8μl 10×LA PCR Buffer II，Mg2+plus 5μl TaKaRa LA Taq，5U/μl 0.5μl AP1 Primer，100pmol/μl 1μl SP2 Primer，10pmol/μl 1μl dH2O 33.5μl 总体积 50μl
B.2nd PCR反应条件及步骤如表4所示：
表4
(5)3rd PCR反应：取1μl 2nd PCR反应液作为3rd PCR反应的模板，以AP Primer为上游引物，SP3 Primer为下游引物，进行3rd PCR反应；
A.按表5中的组份配制3rd PCR反应液：
表5
试剂 使用量 2nd PCR反应液 1μL dNTP Mixture，2.5mM each 8μl 10×LA PCR Buffer II，Mg2+plus 5μl TaKaRa LA Taq，5U/μl 0.5μl AP1 Primer，100pmol/μl 1μl SP3 Primer，10pmol/μl 1μl dH2O 33.5μl 总体积 50μl
B.3rd PCR反应条件及步骤如表6所示：
表6
(6)取1st、2nd、3rd PCR反应液各5μl，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳；
(7)切胶回收清晰的电泳条带，以SP3 Primer为引物对PCR产物进行DNA测序；将测序获得的序列进行拼接，去除重叠序列，最终获得紫花苜蓿HPPD基因的启动子序列；
所述SP3 Primer如序列表中SEQ ID NO:4所示。
3.权利要求1所述的紫花苜蓿HPPD基因的启动子在调控基因的逆境反应中的应用，其特征在于：
所述逆境反应包括SA、干旱、盐、脱落酸或者先暗处理再恢复光照。
CN201710053596.5A 2017-01-22 2017-01-22 一种紫花苜蓿hppd基因的启动子及其制备方法和应用 Active CN106636098B (zh)

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