CN106636068B - 一种丝素亲和肽的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丝素亲和肽的筛选方法。制备丝素材料，利用丝素膜材料对各种噬菌体进行筛选，获得能够与丝素膜特异性结合的噬菌体，将步骤中与丝素材料特异性结合的噬菌体进行基因测序，获得相应的基因序列，进而可推到出其氨基酸序列。本发明所筛选的噬菌体对丝素材料具有很高的亲和性，为丝素材料的鉴定与分析提高更多的选择，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及了一种丝素亲和肽的筛选方法，属于生物技术领域。
背景技术
我国是丝绸文明及丝绸文化的发源地，现今也是世界上生产和出口丝绸最多的国家，在我国的世界贸易总额中占有重要的分量。丝绸的主要成分是丝素纤维蛋白，约占蚕茧总质量的70﹪—80﹪，由丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丝氨酸等18种氨基酸通过多羧氨键连接形成。丝素纤维蛋白除在纺织工业中有其重要的应用外，在其它领域如食品、化工、生物医药等领域也有着重要的用途。由于丝素蛋白具有生物降解性、生物相容性、生物可降解性和可加工性等优良性能，可制备成多种形态的材料，如多孔状、膜状、纤维状和管状等，在科学研究中受到广泛的关注和研究。
随着对丝素材料功能化研究不断的深入，开发能够特异性结合丝素材料的试剂，用于对丝素材料的鉴别、结合、定量分析势在必行。申请号为01100056.2的专利，公开了一种用丝素蛋白修饰聚羟基酯材料的方法，用于丝素蛋白与其它材料的结合研究：具体方法是通过水溶性碳二亚胺(WSC)作为桥梁，将聚羟基酯材料与丝素蛋白进行固定，实现丝素蛋白对聚羟基酯材料的化学结合。然而，该方法主要是一种化学偶联的方法，操作过程中具有很强的毒性，存在化学试剂残留的缺点，还存在非特异性识别的问题(即，对所有蛋白都能交联)。时至今日，还没有一种环保、方便、快捷的方法能够专一识别并结合丝素材料的方法出现。
噬菌体展示是将遍码外源多肽的DNA序列通过基因工程技术插入到噬菌体基因的适当位置，使之稳定地在噬菌体外壳蛋白中表达外源多肽的技术。噬菌体是一种生物纳米纤维病毒，对人与动物无害，能特异性侵染含F因子的大肠杆菌。噬菌体展示技术最大的特点是直接将蛋白表型和对应基因型联系了起来，展示后的多肽能在相对独立的空间保持较好的生物活性。随着噬菌体展示技术的广泛应用，研究人员构建了大容量的噬菌体展示多肽库，在噬菌体外壳蛋白中展示约含1×1012种不同序列的多肽片段。通过对目标物的筛选，就能得到与目标物特异性结合的多肽。
发明内容
针对传统方法中存在的不足，本发明提出了一种丝素亲和肽的筛选方法，以丝素材料为目标物，利用商业化的M13-12噬菌体随机展示文库对其进行亲和筛选，筛选出与丝素材料高亲和性的多肽序列，具有安全、实用、方便和高效的优势。
因此可以用丝素材料对噬菌体展示文库进行亲和筛选，得到与丝素材料特异性结合的多肽，用于科学研究中丝素材料的鉴别、结合及分析，赋予丝素材料更多的功能。
本发明采用的技术方案是筛选过程中，通过洗涤去除非特异性结合丝素材料的噬菌体，通过洗脱将特异性结合丝素材料的噬菌体分离，然后对与丝素材料特异性结合的噬菌体基因测序，获得噬菌体外壳蛋白展示的多肽序列。
具体包括以下步骤：
1)制备丝素膜材料；
2)利用丝素膜材料对各种噬菌体进行筛选，获得能够与丝素膜特异性结合的噬菌体；
3)将步骤(2)中与丝素材料特异性结合的噬菌体进行基因测序，获得相应的基因序列，进而可推到出其氨基酸序列。
所述步骤1)中的丝素膜材料采用以下方式进行制备：先将蚕丝蛋白粉末溶于有机溶剂或者水中形成蚕丝蛋白溶液，将蚕丝蛋白溶液滴在聚乙烯板上风干，加酒精处理使蚕丝蛋白固化，得到不溶解于水的丝素膜。
所述步骤2)具体为：
a.封闭丝素材料：将家蚕丝素膜材料加入含有TBS和BSA的缓冲液，TBS和BSA各自的浓度可在0.1-10mg/ml的范围内变动；
b.丝素材料对噬菌体库的筛选：将噬菌体肽加入到丝素膜的缓冲液中，常温摇床中以160rpm转速下摇振0.5-8h；
c.洗涤：用洗涤液将丝素膜洗涤1-10遍；
d.洗脱：将洗涤液除去，加入洗脱液常温孵育1-20分钟，将与丝素材料特异性结合的噬菌体洗脱下来；
e.中和：加入中和液，使得洗脱后的噬菌体液与中和液混匀后呈中性；
f.噬菌体扩增：将中和后的噬菌体液转入到ER2738菌中，在37℃温度的摇床中以150-220rpm转速摇振3-24h，得到噬菌体和ER2738菌混合液；
g.噬菌体纯化：将噬菌体和ER2738菌混合液进行离心，再加入到PEG和NaCl的混合液中进行纯化，得到亲和丝素材料的噬菌体菌液；
i.上述步骤a～g过程为一次循环，将步骤a～g经过2-6次重复循环之后，得到与丝素材料特异性结合的噬菌体液。
本发明实施例进一步采用以下方式处理，来验证步骤(2)中与丝素材料特异性结合的噬菌体的亲和性：将筛选后的与丝素材料特异性结合的噬菌体进行涂板，具体是将噬菌体再次侵染ER2738菌，并均匀涂布在含有Xgal/IPTG的固体LB板上，如次日LB板上出现蓝色斑点，则表明噬菌体具有高亲和性。从而说明并不是由于噬菌体自身出现蓝色斑点，而是通过筛选与丝素材料特异性结合后出现蓝色斑点。
所述丝素膜材料替换为但不限于丝素膜、丝素多孔支架、丝素粉末、丝素纳米纤维、丝素微/纳球、丝素水凝胶、丝织物等丝素材料。
所述步骤2)中的洗涤包括用TBST洗涤，还可选用磷酸盐缓冲液(PBS)、模拟体液(SBF)、生理盐水、Tris-HCl缓冲液等非烈性缓冲液，洗涤次数为1-10遍，优选次数为3-7遍。
所述步骤2)中的洗脱包括用Gly-HCl洗脱液，还可选用酸性、碱性或者烈性洗脱液。
所述步骤2)中的中和液采用Tris-HCl中和液。
由此本发明获得了包含活性成分的丝素亲和肽，所述小肽是通过噬菌体展示技术得到。
与现有技术相比，本发明具有以下突出特点：
(1)安全：比起传统的化学耦联，采用噬菌体筛选出的多肽的更加温和、不存在化学试剂残留的缺点；
(2)高效：具有与丝素材料结合的专一性，而不结合其它蛋白；
(3)方便：有效成分单一(短肽)，与丝素材料结合的时候不存在复杂的反应过程。同时通过洗脱试剂能够达到丝素亲和肽与丝素材料之间的解脱，突破了其它连接方式连接方式不可逆的问题；
(4)实用：所筛选出是丝素亲和肽能够用于对所有类型的丝素材料进行特异性结合、鉴定及分析。
附图说明
图1为实施例1丝素膜材料对噬菌体库经过4轮筛选后噬菌体的数量柱状图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
本发明的实施例如下：
实施例1：
1)制备丝素膜：
a.获取蚕丝蛋白水溶液，浓度为0.5mg/mL；
b.将蚕丝蛋白溶液滴在聚乙烯板中风干，加质量分数为90％的甲醇水溶液处理使其固化，得到不溶解于水的家蚕丝素膜。
2)筛选与丝素蛋白结合的多肽序列
a.封闭丝素材料：家蚕丝素膜中加入TBS+BSA(0.1mg/ml)的缓冲液；
b.丝素材料对噬菌体库的筛选：这对每一噬菌体种类，将商业化的M13-12噬菌体随机展示文库10微升加入到丝素膜中，常温摇床中160rpm摇0.5h；
c.洗涤：用TBST洗涤液将丝素膜洗涤1遍；
d.洗脱：将聚乙烯板孔板中的TBST洗涤液尽量除去，加入Gly-HCl洗脱液(加入了BSA)，常温孵育1分钟，将与丝素材料特异性结合的噬菌体洗脱下来。
e.中和：加入Tris-HCl中和液，混匀后为中性；
f.噬菌体扩增：将噬菌体洗脱液转入到已过夜摇的ER2738菌中(OD600约为0.5)，37℃摇床中摇150rpm，3h，得到的噬菌体/ER2738菌的混合液。
g.噬菌体纯化：将上述得到的噬菌体/ER2738菌混合液离心，再加入到PEG/NaCl混合液中进行纯化，PEG和NaCl混合液中各自的浓度是20g/L和40g/L，得到噬菌体液。
h：上述过程为1个循环，重复步骤a～g经过4轮循环之后，得到富集的丝素亲和噬菌体溶液。
3)验证所筛选的噬菌体与丝素材料的亲和性：将筛选后的噬菌体进行涂板：将噬菌体再次侵染ER2738菌，并均匀涂布在含有Xgal/IPTG的固体LB板上，如次日LB板上出现蓝色斑点，则表明噬菌体具有亲和性。并进行计数，四轮的计数分别如图1所示，其中，最高的一组噬菌体扩增前数目能够达到4.9×106个，表明获得的噬菌体与丝素膜材料具有很高的亲和性。
4)基因测序获得丝素亲和肽；对筛选的得噬菌体进行基因测序，获得基因序列，进而推到出亲和噬菌体外壳蛋白展示的多肽序列，实施例获得的基因序列有上百种，因此获得多肽序列也有上百种。
实施例2：
1)制备丝素膜：
a.获取蚕丝蛋白水溶液；
b.将蚕丝蛋白溶液滴在聚乙烯板中风干，加质量分数为70％的酒精处理使其固化，得到不溶解于水的丝素膜。
2)筛选与丝素膜的多肽序列
a.封闭丝素材料：家蚕丝素膜中加入TBS+BSA(10mg/ml)的缓冲液；
b.丝素材料对噬菌体库的筛选：将培养皿中的噬菌体加入到丝素膜中，常温摇床中160rpm摇8h；
c.洗涤：用TBST洗涤液将丝素膜洗涤10遍；
d.洗脱：将聚乙烯板孔板中的TBST洗涤液尽量除去，加入Gly-HCl洗脱液(加入了BSA)，常温孵育20分钟，将与丝素材料特异性结合的噬菌体洗脱下来。
e.中和：加入Tris-HCl中和液，混匀后中性；
f.噬菌体扩增：将噬菌体洗脱液转入到已过夜摇的ER2738菌中，37℃摇床中摇220rpm，24h，得到的噬菌体/ER2738菌的混合液。
g.噬菌体纯化：将上述得到的噬菌体/ER2738菌混合液离心，再加入到PEG/NaCl混合液中进行纯化，PEG和NaCl混合液中各自的浓度是20g/L和40g/L，得到噬菌体液。
h：上述过程为1个循环，重复步骤a～g经过6轮循环之后，得到富集的丝素亲和噬菌体液。
3)验证所筛选的噬菌体与丝素材料的亲和性：将筛选后的噬菌体进行涂板：将噬菌体再次侵染ER2738菌，并均匀涂布在含有Xgal/IPTG的固体LB板上，如次日LB板上出现蓝色斑点，则表明噬菌体具有亲和性。
4)基因测序获得丝素亲和肽：对筛选的得噬菌体进行基因测序，获得基因序列，进而推到出亲和噬菌体外壳蛋白展示的多肽序列。
实施例3：
1)制备丝素纳米纤维：
a.将丝素蛋白溶解在六氟异丙醇溶液中；
b.通过静电纺丝仪器制备得到纳米级的丝素纳米纤维。
2)筛选与丝素纳米纤维的多肽序列
a.封闭丝素纳米纤维：家蚕丝素膜中加入TBS+BSA(5mg/ml)的缓冲液；
b.丝素材料对噬菌体库的筛选：将培养皿中的噬菌体加入到丝素纳米纤维中，常温摇床中160rpm摇4h；
c.洗涤：用TBST洗涤液将丝素纳米纤维洗涤5遍；
d.洗脱：将孔板中的TBST洗涤液尽量除去，加入Gly-HCl洗脱液(加入了BSA)，常温孵育10分钟，将与丝素纳米纤维特异性结合的噬菌体洗脱下来。
e.中和：加入Tris-HCl中和液，混匀后中性；
f.噬菌体扩增：将噬菌体洗脱液转入到已过夜摇的ER2738菌中，37℃摇床中摇220rpm，12h，得到的噬菌体/ER2738菌的混合液。
g.噬菌体纯化：将上述得到的噬菌体/ER2738菌混合液离心，再加入到PEG/NaCl混合液中进行纯化，得到噬菌体液。
h：上述过程为1个循环，重复步骤a～g经过3轮循环之后，得到富集的丝素亲和噬菌体液体
3)验证所筛选的噬菌与丝素纳米纤维的亲和性：将筛选后的噬菌体进行涂板：将噬菌体再次侵染ER2738菌，并均匀涂布在含有Xgal/IPTG的固体LB板上，如次日LB板上出现蓝色斑点，则表明噬菌体具有亲和性。并进行计数，经过第3轮筛选，最高的一组噬菌体扩增前数目能够达到3.5×105个，表明获得的噬菌体与丝素纳米纤维具有很高的亲和性。
4)基因测序获得丝素亲和肽：对筛选的得噬菌体进行基因测序，获得基因序列，进而推到出亲和噬菌体外壳蛋白展示的多肽序列。
由上述实施例可见，本发明所筛选的噬菌体对丝素材料具有很高的亲和性，为丝素材料的鉴定与分析提高更多的选择，应用前景广阔。
Claims (4)
1.一种丝素亲和肽的筛选方法，其特征是采用如下步骤：
1)制备丝素膜材料；
所述步骤1)中的丝素膜材料采用以下方式进行制备：先将蚕丝蛋白粉末溶于有机溶剂或者水中形成蚕丝蛋白溶液，将蚕丝蛋白溶液滴在聚乙烯板上风干，加酒精处理使蚕丝蛋白固化，得到不溶解于水的丝素膜；
2)利用丝素膜材料对各种噬菌体进行筛选，获得能够与丝素膜特异性结合的噬菌体；
所述步骤2)具体为：
a.封闭丝素膜材料：将丝素膜材料加入含有TBS和BSA的缓冲液；
b.丝素膜材料对噬菌体库的筛选：将噬菌体肽加入到丝素膜的缓冲液中，常温摇床中以160rpm转速下摇振0.5-8h；
c.洗涤：用洗涤液将丝素膜洗涤1-10遍；
d.洗脱：将洗涤液除去，加入洗脱液常温孵育1-20分钟，将与丝素膜材料特异性结合的噬菌体洗脱下来；
e.中和：加入中和液，使得洗脱后的噬菌体液与中和液混匀后呈中性；
f.噬菌体扩增：将中和后的噬菌体液转入到ER2738菌中，在37℃温度的摇床中以150-220rpm转速摇振3-24h，得到噬菌体和ER2738菌混合液；
g.噬菌体纯化：将噬菌体和ER2738菌混合液进行离心，再加入到PEG和NaCl的混合液中进行纯化，得到亲和丝素膜材料的噬菌体菌液；
i.将步骤a～g经过2-6次重复循环之后，得到与丝素膜材料特异性结合的噬菌体液；
3)将步骤(2)中与丝素膜材料特异性结合的噬菌体进行基因测序，获得相应的基因序列，进而推导出其氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的一种丝素亲和肽的筛选方法，其特征在于：所述步骤2)中的洗涤包括用TBST、磷酸盐缓冲液、模拟体液、生理盐水、Tris-HCl缓冲液，洗涤次数为1-10遍。
3.如权利要求1所述的一种丝素亲和肽的筛选方法，其特征在于：所述步骤2)中的洗脱包括用Gly-HCl洗脱液或者酸性、碱性洗脱液。
4.如权利要求1所述的一种丝素亲和肽的筛选方法，其特征在于：所述步骤2)中的中和液采用Tris-HCl中和液。
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