CN106632197B - 单羽火筒树抗癌活性部位la-d及其药物组合物和其化学成分分离和鉴定方法 - Google Patents

单羽火筒树抗癌活性部位la-d及其药物组合物和其化学成分分离和鉴定方法 Download PDF

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Abstract

提供单羽火筒树[九节狸，Leea asiatica(Linnaeus)Ridsdale]抗癌活性部位LA‑D及其中的化学成分的提取和鉴定方法，以及，以该活性部位组成的药物组合物，以及它们在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本发明采用色谱柱层析及半制备高效液相色谱的分离方法，以及质谱和核磁共振波谱的鉴定方法，从LA‑D中分离、鉴定出了山奈酚、山萘酚‑3‑O‑α‑L‑吡喃鼠李糖苷、槲皮素、异槲皮苷、槲皮素‑3‑O‑α‑L‑吡喃鼠李糖苷、杨梅素、杨梅素‑3‑O‑α‑L‑吡喃鼠李糖苷、Europetin、Europetin 3‑O‑α‑L‑rhamnopyranoside和(‑)‑儿茶素和山楂酸。本发明首次阐明LA‑D的主要化学成分，通过提供的方法，可以简单、快速地从单羽火筒树及其抗癌活性部位LA‑D中获取上述化学成分，用于建立单羽火筒树及其抗癌活性部位LA‑D的质量控制标准。

Description

单羽火筒树抗癌活性部位LA-D及其药物组合物和其化学成分 分离和鉴定方法
技术领域：
本发明属于天然产物提取分离技术领域，尤其涉及单羽火筒树抗癌活性部位LA-D，其药物组合物，及其化学成分分离和鉴定方法。
背景技术：
单羽火筒树[Leea asiatica(Linnaeus)Ridsdale]，又名九节狸，为葡萄科火筒树属植物。单羽火筒树的根具有清热利但的功能，用于治疗黄疸肝炎[朱兆云,云南天然药物图鉴(第5卷).昆明:云南科技出版社.2009:285]。本申请人调查发现，在云南德宏，当地居民称单羽火筒树为“九节狸”，用其治疗扁桃腺炎、三腺炎、乳房纤维瘤、子宫肌瘤、卵巢囊肿、毛囊炎等疾病。前人曾报道该植物甲醇提取物具有抗肠道寄生虫和抗氧化的作用[SenS,De B,Devanna N,Chakraborty R.Anthelmintic and in vitro antioxidantevaluation of fractions of methanol extract of Leea asiatica leaves.AncientScience of Life 2012,31(3),101-106]。单羽火筒树的化学成分及其提取物的抗癌活性尚未见报道。因此，阐明单羽火筒树抗癌活性的化学物质基础，对进一步的新药研发和质量控制具有重要的意义。
发明内容：
本发明针对现有技术存在了上述问题，提供单羽火筒树[Leea asiatica(Linnaeus)Ridsdale]抗癌症活性部位LA-D，以其活性成分的药物组合物，以及LA-D中的化学成分的提取和鉴定方法。由于单羽火筒树具有一定的抗癌症活性，但是其活性部位及其化学成分不清楚，不能建立质量控制标准。所以，本发明提供了单羽火筒树的活性部位乙酸乙酯部位LA-D分离鉴定方法用于解决这个技术问题。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
单羽火筒树提取物乙酸乙酯萃取部位LA-D，所述的LA-D由下述方法制备而得：单羽火筒树干燥全株粉碎后用甲醇冷浸7天，过滤，滤渣继续提取，总共提取4次，合并滤液，回收溶剂，得浸膏，将浸膏用水制成混悬液，分别用石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取，回收溶剂获得石油醚部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分，乙酸乙酯部分为LA-D。
如所述的单羽火筒树提取物乙酸乙酯萃取部位LA-D，其中所述的LA-D中化学成分山奈酚、山萘酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、槲皮素、异槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、杨梅素、杨梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、Europetin、Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside、(-)-儿茶素和山楂酸的总含量以重量百分比计，占LA-D的10-95％。
如所述的单羽火筒树提取物乙酸乙酯萃取部位LA-D，其中所述的LA-D中化学成分山奈酚、山萘酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、槲皮素、异槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、杨梅素、杨梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、Europetin、Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside、(-)-儿茶素和山楂酸是从单羽火筒树乙酸乙酯部位LA-D分离得到，步骤为：
(1)LA-D经硅胶柱层析用20:1，15:1，10:1，5:1，3:1，1:1的氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱划段，得到Fr.A1、Fr.A2、Fr.B1、Fr.B2、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F、Fr.G、Fr.H等10个部分；
(2)取Fr.A1部分经C18反相硅胶柱层析，10:90→100:0的甲醇-水，得到80％甲醇洗脱部分纯化得到化合物山楂酸；
(3)取Fr.B1部分经C18反相硅胶柱层析，10:90→100:0的甲醇-水，得到5％甲醇洗脱部分，过LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱后得到B1-2-3和B1-2-5两个主要部分。B1-2-3经半制备高效液相色谱纯化得到山奈酚、山萘酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、Europetin和Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside；B1-2-5经半制备高效液相色谱纯化得到(-)-儿茶素；
(4)取Fr.B2部分和Fr.C部分合并后经C18反相硅胶柱层析，10:90→100:0的甲醇-水，得到15％和20％甲醇洗脱部分。15％甲醇洗脱部分用半制备高效液相色谱纯化得到异槲皮苷；20％甲醇洗脱部分经LH-20凝胶柱层析得到槲皮素、杨梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷和一个混合物，后者经半制备高效液相色谱纯化得到杨梅素；
(5)取Fr.D部分和Fr.E部分合并后经C18反相硅胶柱层析，10:90→100:0的甲醇-水，得到40％甲醇洗脱部分，40％甲醇洗脱部分经LH-20凝胶层析柱得到槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷；
其中，(3)所述B1-2-3的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小4.6×300mm，洗脱剂为甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例40:60，流速2mL/min；B1-2-5的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小4.6×300mm，洗脱剂为甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例15:85，流速2mL/min；(4)所述15％甲醇洗脱部分的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小4.6×300mm，洗脱剂为甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例15:85，流速2mL/min；20％甲醇洗脱部分的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小4.6×300mm，洗脱剂为甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例30:70，流速2mL/min。
本发明还提供了一种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的单羽火筒树乙酸乙酯萃取部位LA-D和药学上可接受的载体。
本发明另外还提供了一种单羽火筒树乙酸乙酯萃取部位LA-D的化学成分分离鉴定方法，该方法是从单羽火筒树乙酸乙酯萃取部位LA-D分离得到山奈酚、山萘酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、槲皮素、异槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、杨梅素、杨梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、Europetin、Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside、(-)-儿茶素和山楂酸，其步骤为：
(1)LA-D经硅胶柱层析用20:1，15:1，10:1，5:1，3:1，1:1的氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱划段，得到Fr.A1、Fr.A2、Fr.B1、Fr.B2、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F、Fr.G、Fr.H等10个部分；
(2)取Fr.A1部分经C18反相硅胶柱层析，10:90→100:0的甲醇-水，得到80％甲醇洗脱部分纯化得到化合物山楂酸(maslinic acid)；
(3)取Fr.B1部分经C18反相硅胶柱层析，10:90→100:0的甲醇-水，得到5％甲醇洗脱部分，过LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱后得到B1-2-3和B1-2-5两个主要部分。B1-2-3经半制备高效液相色谱纯化得到山奈酚、山萘酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、Europetin和Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside；B1-2-5经半制备高效液相色谱纯化得到(-)-儿茶素；
(4)取Fr.B2部分和Fr.C部分合并后经C18反相硅胶柱层析，10:90→100:0的甲醇-水，得到15％和20％甲醇洗脱部分。15％甲醇洗脱部分用半制备高效液相色谱纯化得到异槲皮苷(isoquercitrin)；20％甲醇洗脱部分经LH-20凝胶柱层析得到槲皮素、杨梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷和一个混合物，后者经半制备高效液相色谱纯化得到杨梅素；
(5)取Fr.D部分和Fr.E部分合并后经C18反相硅胶柱层析，10:90→100:0的甲醇-水，得到40％甲醇洗脱部分。40％甲醇洗脱部分经LH-20凝胶层析柱得到槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷；
其中，(3)所述B1-2-3的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小4.6×300mm，洗脱剂为甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例40:60，流速2mL/min；B1-2-5的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小4.6×300mm，洗脱剂为甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例15:85，流速2mL/min；(4)所述15％甲醇洗脱部分的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小4.6×300mm，洗脱剂为甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例15:85，流速2mL/min；20％甲醇洗脱部分的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小4.6×300mm，洗脱剂为甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例30:70，流速2mL/min。
根据所述的一种单羽火筒树乙酸乙酯萃取部位LA-D的化学成分分离鉴定方法，该方法从LA-D中分离得到11个化合物，通过质谱MS及核磁共振波普NMR对其进行化学结构的确定。
根据所述的一种单羽火筒树乙酸乙酯萃取部位LA-D的化学成分分离鉴定方法，该方法从LA-D中分离提取得到化学成分山奈酚、山萘酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、槲皮素、异槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、杨梅素、杨梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、Europetin、Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside、(-)-儿茶素和山楂酸，用于建立LA-D的质量控制标准。
本发明同时还提供了所述的单羽火筒树乙酸乙酯萃取部位LA-D在制备治疗或预防癌症疾病的药物中的应用。
根据所述的单羽火筒树乙酸乙酯萃取部位LA-D在制备治疗或预防癌症疾病的药物中的应用，其所述的癌症为白血病、肝癌、肺癌。
本发明的乙酸乙酯萃取部位用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。也可以与其他药物组成复方的形式使用，该药物组合物含有10～99％，优选为30～90％的本发明的乙酸乙酯萃取部位，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的药物制剂常用的药用载体和/或赋形剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。可以使用不同的药用辅料，制成固体制剂(片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂等)或液体制剂(注射剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂等)。本发明的药物可经口服和注射(静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、皮下注射等)形式给药。
与现有技术相比，本发明具有下述的优异效果：单羽火筒树提取物，特别是乙酸乙酯部位(LA-D)对白血病HL-60细胞、肝癌SMMC-7721细胞、肺癌A-549细胞有抑制活性。本发明首次阐明了单羽火筒树抗癌活性部位LA-D的主要化学成分，这些成分可以用于制定LA-D的质量控制标准。
具体实施方式：
下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1：
本发明的LA-D的制备及其所含化学成分的分离：
LA-D的制备：单羽火筒树的干燥全株(1.3kg)粉碎后用甲醇(4L)浸泡7天，过滤，滤渣继续提取。总共提取4次，合并滤液，回收溶剂，得浸膏(编号LA)167g。将LA用水(500mL)制成混悬液，分别用石油醚(0.5L×3)、氯仿(0.5L×3)萃取，萃取后的母液继续用乙酸乙酯(0.5L×3)萃取，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯萃取部位(编号LA-D)18g。
LA-D所含化学成分的分离：
取重量为18g的LA-D经硅胶柱层析用氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱划段(20:1，15:1，10:1，5:1，3:1，1:1)的，得到Fr.A1(1.34g)、Fr.A2(1.54g)、Fr.B1(1.40g)、Fr.B2(0.67g)、Fr.C(2.38g)、Fr.D(4.77g)、Fr.E(0.47g)、Fr.F(0.83g)、Fr.G(0.68g)、Fr.H(0.51g)等10个部分；
取Fr.A1部分1.34g过C18反相硅胶柱层析甲醇-水(10:90→100:0)洗脱，得到80％甲醇洗脱部分，纯化得到化合物山楂酸(3.0mg)。取Fr.B1部分1.40g经C18反相硅胶柱层析甲醇-水(10:90→100:0)洗脱，得到5％甲醇洗脱部分690.4mg，过LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱后得到B1-2-3(157.0mg)和B1-2-5(222.4mg)两个主要部分。B1-2-3经半制备高效液相色谱[安捷伦1200，Ultimate AQ-C18色谱柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，40:60，流速2mL/min]纯化得到山奈酚(3.1mg，保留时间11.368min)、山萘酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(5.1mg，保留时间4.980min)、Europetin(3.0mg，保留时间16.187min)和Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside(3.0mg，保留时间33.208min)；B1-2-5经半制备高效液相色谱[安捷伦1200，Ultimate AQ-C18色谱柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，15:85，流速2mL/min]纯化得到(-)-儿茶素(3.3mg，保留时间8.284min)。取Fr.B2部分0.67g和Fr.C部分2.38g合并后为3.05g经C18反相硅胶柱层析甲醇-水(10:90→100:0)得到15％(362.1mg)和20％(368mg)甲醇洗脱部分。15％甲醇洗脱部分用半制备高效液相色谱[安捷伦1200，Ultimate AQ-C18色谱柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，15:85，流速2mL/min]纯化得到异槲皮苷(isoquercitrin，3.0mg，保留时间37.685min)；20％甲醇洗脱部分经LH-20凝胶柱层析得到槲皮素(1.9mg)、杨梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(5.1mg)和一个混合物(48.6mg)，后者经半制备高效液相色谱[安捷伦1200，Ultimate AQ-C18色谱柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，30:70，流速2mL/min]纯化得到杨梅素(5.3mg，保留时间12.082min)。取Fr.D部分4.77g和Fr.E部分0.47g合并后为4.91g经C18反相硅胶柱层析甲醇-水(10:90→100:0)得到40％(599.8mg)甲醇洗脱部分。40％甲醇洗脱部分经LH-20凝胶层析柱得到槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(quercitrin，18.3mg)。
实施例2
本发明的LA-D化学成分的结构鉴定：
山奈酚(kaempferol)，黄色针状晶体，分子式C15H10O6，CAS登记号520-18-3。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:6.19(1H,s),6.41(1H,s),6.91(2H,d,J＝8.6Hz),8.10(2H,d,J＝8.6Hz)。13C NMR(CD3OD,125MHz)δ:179.4,165.6,162.5,160.6,158.3,148.1,136.5,130.7,130.7,123.7,116.3,116.3,104.5,99.2,99.4。ESI-MS m/z 285[M-H]-。其1H NMR跟文献[Chang Y C,Chang F R,Wu Y C.The constituents of Lindera glauca.Journal of theChinese Chemical Society,2000,47(2),373-380.]中有报道的一致。
山萘酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，黄色粉末，分子式C21H20O10，CAS登记号5041-73-6。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:6.21(1H,d,J＝2.0Hz),6.39(1H,d,J＝2.0Hz),7.77(2H,d,J＝8.8Hz),6.93(2H,d,J＝8.8Hz),5.38(1H,d,J＝1.6Hz),0.92(1H,d,J＝5.7Hz)。13C NMR(CD3OD,125MHz)δ:179.6,165.8,162.2,161.6,159.3,158.6,136.2,131.8,131.8,122.6,123.7,116.5,116.5,105.9,103.5,99.8,94.7,73.2,72.1,72.0,71.9,17.7。ESI-MS m/z430[M-H]-。其NMR数据跟文献[汪琼,王易芬,鞠鹏,罗士德.锥序蜜心果中酚性成分的研究(英文).天然产物研究与开发,2008,4:641-643]中的数据基本一致。
槲皮素(quercetin)，黄色颗粒状结晶，分子式C15H10O7，CAS登记号117-39-5。1HNMR(CD3OD,400MHz)δ:6.18(1H,d,J＝2.1Hz),6.37(1H,d,J＝2.1Hz),7.63(1H,dd,J＝8.8Hz),7.78(1H,d,J＝2.0Hz)。13C NMR(CD3OD,125MHz)δ:177.4,165.6,162.5,158.2,148.8,147.9,146.2,136.8,124.1,121.6,116.2,115.9,104.5,99.2,94.4。ESI-MS m/z301[M-H]-。其NMR数据跟文献[Chang Y C,Chang F R,Wu Y C.The constituents ofLindera glauca.Journal of the Chinese Chemical Society,2000,47(2),373-380.]中的数据基本一致。
异槲皮苷(isoquercitrin)，黄色粉末，分子式C21H20O12，CAS登记号21637-25-2。1HNMR(CD3OD,500MHz)δ7.84(1H,d,J＝2.1Hz),7.59(1H,dd,J＝8.5,2.1Hz),6.86(1H,d,J＝8.5Hz),6.41(1H,s),6.21(1H,d,J＝1.8Hz),5.17(1H,d,J＝7.8Hz),3.87–3.43(7H,m)。13CNMR(CD3OD,125MHz)δ:179.5,166.1,163.0,158.8,158.5,149.9,145.8,135.7,122.9,122.8,117.7,116.1,105.6,105.3,99.8,94.6,77.2,75.1,73.1,69.3,61.9。ESI-MS m/z463[M-H]-。其NMR数据与文献[王志伟,谭晓杰,马婷婷,陈晓辉,毕开顺.茵陈化学成分的分离与鉴定.沈阳药科大学学报,2008,25(10):781-783]中的数据基本一致。
槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(quercitrin)，黄色针晶，分子式C21H20O11，CAS登记号522-12-3。1H NMR(500MHz,CD3OD)δ7.39–7.23(m,2H),6.97–6.80(m,1H),6.43–6.11(m,2H),5.35(d,J＝1.6Hz,1H),4.46–4.09(m,1H),3.95–3.66(m,1H),3.65–3.11(m,5H),0.94(d,J＝6.2Hz,3H)。13C NMR(CD3OD,125MHz)δ:179.6,165.8,163.2,159.3,158.5,149.8,146.4,136.2,122.9,122.8,116.9,116.4,105.8,103.5,99.8,94.6,77.2,75.1,73.1,69.3,61.9。ESI-MS m/z 447[M-H]-。其NMR数据与文献[杨秀岭,袁志芳,许慧君,范丽芳,霍长虹,张兰桐.照山白黄酮类化学成分的研究.药物分析杂志,2010,30(9):1750-1752]中的数据基本一致。
杨梅素(myricetin)，黄色针状晶体，分子式C15H10O8，CAS登记号529-44-2。1H NMR(CD3OD,500MHz)δ7.33(1H,s),6.37(1H,d,J＝2.1Hz),6.17(1H,d,J＝2.1Hz)。13C NMR(CD3OD,125MHz)δ177.3,165.6,162.5,158.2,147.9,146.7,137.4,136.9,123.1,108.5,104.5,99.2,94.3。ESI-MS m/z 316[M-H]-。其NMR数据与文献[周志宏,杨崇仁.矮杨梅鲜叶的酚性化学成分.云南植物研究,2000,22(2):6219-224]中的数据基本一致。
杨梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，黄色片状晶体，分子式C21H20O12，CAS登记号17912-87-7。1H NMR(CD3OD,500MHz)δ6.94(2H,s),6.36(1H,d,J＝2.1Hz),6.20(1H,d,J＝2.1Hz),5.31(1H,d,J＝1.5Hz),4.21(1H,dd,J＝3.3,1.7Hz),3.78(1H,dd,J＝9.5,3.4Hz),3.51(1H,m),3.30(1H,t,J＝9.2Hz),0.96(3H,d,J＝6.2Hz)。13C NMR(CD3OD,125MHz)δ179.7,165.8,163.2,159.4,158.5,146.8,137.8,136.3,121.8,105.8,103.6,99.7,94.6,73.3,72.1,72.0,71.8,17.6。ESI-MS m/z 463[M-H]-。其NMR数据与文献[Chung S K,Kim YC,Takaya Y,Terashima,K.,&Niwa,M.Novel flavonol glycoside,7-O-methylmearnsitrin,from Sageretia theezans and its antioxidant effect.Journal ofAgricultural and Food Chemistry,2004,52(15),4664-4668]中的数据基本一致。
Europetin，分子式C16H12O8，CAS登记号16280-27-6。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.30(2H,s),6.36(1H,s),3.85(3H,s)。13C NMR(CDCl3,100MHz)δ175.5,164.6,160.1,155.7,147.1,145.5,135.9,135.8,120.5,107.2,103.6,97.2,91.5,55.8。ESI-MS m/z 331[M-H]-。其13C NMR数据与文献[Matsuda H,Morikawa T,Toguchida I,Yoshikawa,M.Structural requirements of flavonoids and related compounds for aldosereductase inhibitory activity.Chemical and Pharmaceutical Bulletin,2002,50(6),788-795]中的数据基本一致。
Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside，分子式C22H22O12。1H NMR(CD3OD,500MHz)δ6.86(2H,s),6.35(1H,d,J＝1.8Hz),6.19(1H,d,J＝2.0Hz),5.29(1H,d,J＝1.6Hz),4.20(1H,dd,J＝3.3,1.7Hz),3.85(s,4H),0.92(3H,t,J＝5.6Hz)。13C NMR(CD3OD,125MHz)δ179.5,165.9,163.1,158.9,158.4,151.8,149.4,139.4,136.6,126.8,109.6,105.8,103.5,99.7,94.6,73.0,71.9,71.7,60.7,17.6。ESI-MS m/z 477[M-H]-。其NMR数据与文献[Chung S K,Kim Y C,Takaya Y,Terashima,K.,&Niwa,M.Novel flavonol glycoside,7-O-methyl mearnsitrin,from Sageretia theezans and its antioxidanteffect.Journal of agricultural and food chemistry,2004,52(15),4664-4668]中的数据基本一致。
(-)-儿茶素(ent-catechin)，白色粉末，分子式C15H14O6，CAS登记号18829-70-4。[α]D 26-11.9°(c＝0.33,MeOH)。1H NMR(CD3OD,500MHz)δ6.84(1H,d,J＝2.0Hz),6.78–6.74(1H,m),6.72(1H,dd,J＝8.3,2.0Hz),5.93(1H,d,J＝2.0Hz),5.85(1H,d,J＝2.3Hz),4.56(1H,d,J＝7.5Hz),3.97(1H,td,J＝8.0,5.5Hz),2.85(1H,dd,J＝16.1,5.4Hz),2.50(1H,dd,J＝16.1,8.2Hz)。13C NMR(CD3OD,125MHz)δ157.8,157.6,156.9,146.3,146.3,132.2,120.0,116.1,115.2,100.8,96.3,95.5,82.9,68.1,28.53。ESI-MS m/z 289[M-H]-。其NMR数据与文献[李勇军,何迅,刘丽娜,兰燕宇,王爱民,王永林.荭草化学成分的研究.中国中药杂志,2005,30(6):444-446]中的数据基本一致。
山楂酸(maslinic acid)，白色粉末，分子式C30H48O4，CAS登记号4373-41-5。1H NMR(CD3OD,500MHz)δ5.24(1H,m),3.64(1H,m),3.30(1H,m),1.32(3H,m),1.12(3H,s),1.01(3H,s),0.96(3H,s),0.87(3H,s),0.84(3H,s),0.84(3H,s)。13C NMR(CD3OD,125MHz)δ181.6,139.7,126.7,84.4,69.5,56.6,48.9,48.8,48.6,48.5,43.3,40.8,40.5,40.4,39.2,38.1,34.2,31.7,30.8,29.3,29.1,25.3,24.4,24.1,21.6,19.5,17.8,17.6,17.5,17.2。ESI-MS m/z 471[M-H]-。其NMR数据与文献[王东,崔征,董炎,付明耀,宋德兰.榆树根皮的化学成分.沈阳药科大学学报,2004,21(6):426-429]中的数据基本一致。
实施例3：
单羽火筒树提取物乙酸乙酯部位(LA-D)对肿瘤细胞生长抑制作用：
1.将LA-D进行分段。
取重量为18g的LA-D经硅胶柱层析用氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱划段(20:1，15:1，10:1，5:1，3:1，1:1)的，得到Fr.A1(1.34g)、Fr.A2(1.54g)、Fr.B1(1.40g)、Fr.B2(0.67g)、Fr.C(2.38g)、Fr.D(4.77g)、Fr.E(0.47g)、Fr.F(0.83g)、Fr.G(0.68g)、Fr.H(0.51g)等10个部分；
2.从重量大的部分中取少量样品，利用柱层析及半制备高效液相色谱技术快速获取化学成分。
取Fr.A1部分1.34g，过C18反相硅胶柱层析(甲醇-水洗脱)，得到80％甲醇洗脱部分，过LH-20凝胶柱层析(甲醇洗脱)纯化得到化合物山楂酸(3.0mg)。取Fr.B1部分1.40g经C18反相硅胶柱层析(甲醇-水洗脱)，得到5％甲醇洗脱部分690.4mg，过LH-20凝胶柱层析(甲醇洗脱)，后得到B1-2-3(157.0mg)和B1-2-5(222.4mg)两个主要部分。
取B1-2-3经半制备高效液相色谱(安捷伦1200，Ultimate AQ-C18色谱柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，40:60，流速2mL/min)纯化得到山奈酚(3.1mg，保留时间11.368min)、山萘酚-3-O-α-l-吡喃鼠李糖苷(5.1mg，保留时间4.980min)、Europetin(3.0mg，保留时间16.187min)和Europetin 3-O-α-l-rhamnopyranoside(3.0mg，保留时间33.208min)。
取B1-2-5经半制备高效液相色谱(安捷伦1200，Ultimate AQ-C18色谱柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，15:85，流速2mL/min)纯化得到(-)-儿茶素(3.3mg，保留时间8.284min)。
取Fr.B2部分0.67g和Fr.C部分2.38g合并后为3.05g经C18反相硅胶柱层析(甲醇-水洗脱)得到15％(362.1mg)和20％(368mg)甲醇洗脱部分
取15％甲醇洗脱部分用半制备高效液相色谱(安捷伦1200，Ultimate AQ-C18色谱柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，15:85，流速2mL/min)纯化得到异槲皮苷(isoquercitrin)(3.0mg，保留时间37.685min)。
取20％甲醇洗脱部分经LH-20凝胶柱层析(甲醇洗脱)得到槲皮素(1.9mg)、杨梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(5.1mg)和一个混合物(48.6mg)，后者经半制备高效液相色谱(安捷伦1200，Ultimate AQ-C18色谱柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，30:70，流速2mL/min)纯化得到杨梅素(5.3mg，保留时间12.082min)。
取Fr.D部分4.77g和Fr.E部分0.47g合并后为4.91g经C18反相硅胶柱层析(甲醇-水洗脱)得到40％(599.8mg)甲醇洗脱部分。40％甲醇洗脱部分经LH-20凝胶层析柱(甲醇洗脱)得到槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(quercitrin)(18.3mg)。
本次发明首阐明了单羽火筒树抗癌活性部位LA-D的主要化学成分，这些成分可以用于制定LA-D的质量控制标准。
将单羽火筒树及经过处理的各部位进行细胞毒活性测试，结果见表1，结果表明，乙酸乙酯萃取部位(LA-D)对白血病HL-60细胞、肝癌SMMC-7721细胞、肺癌A-549细胞有抑制活性。
表1单羽火筒树提取物乙酸乙酯萃取部位(LA-D)对肿瘤细胞生长抑制作用
实施例4：
注射液制剂的制备：
按实施例1的方法先制得本发明的单羽火筒树提取物乙酸乙酯萃取部位(LA-D)，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例5：
粉针剂的制备：
按实施例1的方法先制得本发明的单羽火筒树提取物乙酸乙酯萃取部位(LA-D)，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于2安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
实施例6：
粉剂的制备：
按实施例1的方法先制得本发明的单羽火筒树提取物乙酸乙酯萃取部位(LA-D)，与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
实施例7：
片剂的制备：
按实施例1的方法先制得本发明的单羽火筒树提取物乙酸乙酯萃取部位(LA-D)，按其与赋形剂重量比为1:5‐1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例8：
口服液制剂的制备：
按实施例1的方法先制得本发明的单羽火筒树提取物乙酸乙酯萃取部位(LA-D)，按常规口服液制法制成口服液。
实施例9：
胶囊剂、颗粒剂、或冲剂的制备：
按实施例1的方法先制得本发明的单羽火筒树提取物乙酸乙酯萃取部位(LA-D)，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

Claims (4)

1.单羽火筒树提取物乙酸乙酯萃取部位LA-D的化学成分分离及制备方法，其特征在于该方法包括下述步骤：单羽火筒树干燥全株粉碎后用甲醇冷浸7天，过滤，滤渣继续提取，总共提取4次，合并滤液，回收溶剂，得浸膏，将浸膏用水制成混悬液，分别用石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取，回收溶剂获得石油醚部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分，乙酸乙酯部分为LA-D，所述的LA-D中化学成分山奈酚、山萘酚-3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷、槲皮素、异槲皮苷、槲皮素-3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷、杨梅素、杨梅素-3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷、Europetin、Europetin3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷、(-)-儿茶素和山楂酸的总含量以重量百分比计，占LA-D的10-95%，所述的LA-D中化学成分山奈酚、山萘酚-3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷、槲皮素、异槲皮苷、槲皮素-3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷、杨梅素、杨梅素-3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷、Europetin、Europetin 3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷、(-)-儿茶素和山楂酸是从单羽火筒树乙酸乙酯部位LA-D分离得到，步骤为：
（1）LA-D经硅胶柱层析用20:1，15:1，10:1，5:1，3:1，1:1的氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱划段，得到Fr.A1、Fr.A2、Fr.B1、Fr.B2、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F、Fr.G、Fr.H共10个部分；
（2）取Fr.A1部分经C18反相硅胶柱层析，10:90→100:0的甲醇-水，得到80%甲醇洗脱部分纯化得到化合物山楂酸；
（3）取Fr.B1部分经C18反相硅胶柱层析，10:90→100:0的甲醇-水，得到5%甲醇洗脱部分，过LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱后得到B1-2-3和B1-2-5两个主要部分，B1-2-3经半制备高效液相色谱纯化得到山奈酚、山萘酚-3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷、Europetin和Europetin3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷；B1-2-5经半制备高效液相色谱纯化得到(-)-儿茶素；
（4）取Fr.B2部分和Fr.C部分合并后经C18反相硅胶柱层析，10:90→100:0的甲醇-水，得到15%和20%甲醇洗脱部分，15%甲醇洗脱部分用半制备高效液相色谱纯化得到异槲皮苷；20%甲醇洗脱部分经LH-20凝胶柱层析得到槲皮素、杨梅素-3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷和一个混合物，后者经半制备高效液相色谱纯化得到杨梅素；
（5）取Fr.D部分和Fr.E部分合并后经C18反相硅胶柱层析，10:90→100:0的甲醇-水，得到40%甲醇洗脱部分，40%甲醇洗脱部分经LH-20凝胶层析柱得到槲皮素-3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷；
其中，（3）所述B1-2-3的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，UltimateAQ-C18色谱柱，色谱柱大小4.6×300mm，洗脱剂为甲醇-水，含0.05%三氟乙酸，比例40:60，流速2mL/min；B1-2-5的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小4.6×300mm，洗脱剂为甲醇-水，含0.05%三氟乙酸，比例15:85，流速2mL/min；（4）所述15%甲醇洗脱部分的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小4.6×300mm，洗脱剂为甲醇-水，含0.05%三氟乙酸，比例15:85，流速2mL/min；20%甲醇洗脱部分的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小4.6×300mm，洗脱剂为甲醇-水，含0.05%三氟乙酸，比例30:70，流速2mL/min。
2.一种单羽火筒树乙酸乙酯萃取部位LA-D的化学成分分离鉴定方法，其特征在于该方法是从单羽火筒树乙酸乙酯萃取部位LA-D分离得到山奈酚、山萘酚-3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷、槲皮素、异槲皮苷、槲皮素-3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷、杨梅素、杨梅素-3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷、Europetin、Europetin 3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷、(-)-儿茶素和山楂酸，其步骤为：
（1）LA-D经硅胶柱层析用20:1，15:1，10:1，5:1，3:1，1:1的氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱划段，得到Fr.A1、Fr.A2、Fr.B1、Fr.B2、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F、Fr.G、Fr.H，10个部分；
（2）取Fr.A1部分经C18反相硅胶柱层析，10:90→100:0的甲醇-水，得到80%甲醇洗脱部分纯化得到化合物山楂酸；
（3）取Fr.B1部分经C18反相硅胶柱层析，10:90→100:0的甲醇-水，得到5%甲醇洗脱部分，过LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱后得到B1-2-3和B1-2-5两个主要部分，B1-2-3经半制备高效液相色谱纯化得到山奈酚、山萘酚-3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷、Europetin和Europetin3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷；B1-2-5经半制备高效液相色谱纯化得到(-)-儿茶素；
（4）取Fr.B2部分和Fr.C部分合并后经C18反相硅胶柱层析，10:90→100:0的甲醇-水，得到15%和20%甲醇洗脱部分，15%甲醇洗脱部分用半制备高效液相色谱纯化得到异槲皮苷；20%甲醇洗脱部分经LH-20凝胶柱层析得到槲皮素、杨梅素-3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷和一个混合物，后者经半制备高效液相色谱纯化得到杨梅素；
（5）取Fr.D部分和Fr.E部分合并后经C18反相硅胶柱层析，10:90→100:0的甲醇-水，得到40%甲醇洗脱部分，40%甲醇洗脱部分经LH-20凝胶层析柱得到槲皮素-3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷；
其中，（3）所述B1-2-3的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，UltimateAQ-C18色谱柱，色谱柱大小4.6×300mm，洗脱剂为甲醇-水，含0.05%三氟乙酸，比例40:60，流速2mL/min；B1-2-5的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小4.6×300mm，洗脱剂为甲醇-水，含0.05%三氟乙酸，比例15:85，流速2mL/min；（4）所述15%甲醇洗脱部分的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小4.6×300mm，洗脱剂为甲醇-水，含0.05%三氟乙酸，比例15:85，流速2mL/min；20%甲醇洗脱部分的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小4.6×300mm，洗脱剂为甲醇-水，含0.05%三氟乙酸，比例30:70，流速2mL/min。
3.根据权利要求2所述的一种单羽火筒树乙酸乙酯萃取部位LA-D的化学成分分离鉴定方法，其特征在于该方法从LA-D中分离得到11个化合物，通过质谱MS及核磁共振波谱NMR对其进行化学结构的确定。
4.根据权利要求2所述的一种单羽火筒树乙酸乙酯萃取部位LA-D的化学成分分离鉴定方法，其特征在于该方法从LA-D中分离提取得到化学成分山奈酚、山萘酚-3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷、槲皮素、异槲皮苷、槲皮素-3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷、杨梅素、杨梅素-3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷、Europetin、Europetin 3-O-a-l-吡喃鼠李糖苷、(-)-儿茶素和山楂酸，用于建立LA-D的质量控制标准。
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