CN106620877A - 一种毛细血管网及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种毛细血管网及其制备方法。本发明通过离心纺丝方法制备得到可溶性三维纺丝网，在可溶性三维纺丝网上培养动物细胞，动物体细胞沿可溶性三维纺丝网的生长增殖，可溶性三维纺丝网完全溶解后，得到一种毛细血管网。本发明不需要高压静电场，也不需要大量模具，仅利用离心力作为生产可溶性三维纺丝网的动力，不仅大大提高了生产产量，极大降低了能耗成本，而且提高了生产操作的安全性，满足了大规模生产工程化组织三维毛细血管网的需求,也有利于克服组织工程构建物进入临床的重要障碍。本发明毛细血管网制备成本低，能够为较厚的工程化组织或器官如肝脏、肾脏等构建充足有效的血管网系统提供所需的三维毛细血管网。

Description

一种毛细血管网及其制备方法
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域，具体而言，涉及一种毛细血管网及其制备方法。
背景技术
虽然部分组织工程化的器官如皮肤、气管等对血供要求不高的组织已开始运用于临床，并取得了令人满意的效果。但对于较厚的实质脏器如肝脏、肾脏等要实现体内的移植存活就没那么乐观。因此构建充足有效的毛细血管网系统是十分必要的。
目前体外构建人工血管的相关技术有浸渍一沥滤法、混凝法、去细胞组织复合法、同轴静电纺丝法、旋转曝光法以及3D快速成型技术等。去细胞组织复合法是将小肠粘膜下层膜剪成一定尺寸的膜片，卷至一定直径的聚乙烯轴上，通过粘接、交联、清洗和缝制获得小口径血管。这方法工序较为复杂且无法精确获得人工血管的二维以及三维微纳米结构。浸渍一沥滤法的原理是将模具在原料液中反复浸渍和晾干，到达成型的目的。采用这种方法可以控制人工血管的内径、壁厚、密度、孔径、孔隙率等尺寸参数和微观结构，进而改善人工血管的各项理化性能。而混凝法制备小口径人工血管的技术，与浸渍一沥滤法类似，同样是将模具进行混凝浴，此两种方法较步骤简单，但是无法精确获得人工血管的二维以及三维微纳结构，所以需要结合其他方法进行微纳米尺度加工。同轴静电纺丝技术是将不互溶的芯层和壳层材料溶液分别装入两个注射器中，以适当的流速通过一个同轴的内外层针头装置，壳层液体流出与芯层溶液汇合，在同一电压下形成泰勒锥，通过同轴静电纺丝得到“壳·芯”结构纳米纤维，然后用物理或化学法将芯质材料去除,留下壳层材料,就可以得到中空纤维，虽然此法制备的中空三维纳米纤维结构与天然细胞外基质(ECM)很相似且直径可以从几十纳米到几微米，同时具有孔隙率高、比表面积大、孔径分布较宽的特点，但该技术存在着制备过程中需要施加高压电场、生产效率低的固有缺陷，从而限制了该方法商业化的大规模使用。因此在成本、规模、可控性研究方面离实用化及应用需求还有很大距离。旋转曝光法是将光线精确聚焦在可旋转、透明的装有高分子预聚体系的圆桶模具的内壁处，然后在控制模具转动的同时，利用紫外聚合的方法，对聚合物溶液体系按照轴向进行可控光聚合加工。这种方法制备的人工血管即使具有仿生的内外表面微结构和具有良好的生物相容性，但无法精确获得人工血管的二维以及三维微纳米结构。就连目前快速成型行业中最有生命力之一的技术—三维快速成型打印机(three dimensional printing，3DP)技术也无法直接打印微纳米级的血管。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种毛细血管网的制备方法，所述的毛细血管网的制备方法工艺简单，不需要高压静电场，也不需要大量模具，仅利用同轴转筒旋转产生的离心力作为中空纳米纤维成丝的动力，不仅大大提高了生产产量，极大降低了能耗成本，而且提高了生产操作的安全性，满足了大规模生产工程化组织三维毛细血管网的需求。
本发明的第二目的在于提供一种采用上述的毛细血管网的制备方法制备得到的毛细血管网，所述的毛细血管网成本低，能够为较厚的工程化组织或器官如肝脏、肾脏等构建充足有效的血管网系统提供所需的三维毛细血管网。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种毛细血管网的制备方法，通过离心纺丝方法制备得到可溶性三维纺丝网，在所得可溶性三维纺丝网上培养动物细胞，所述动物体细胞沿可溶性三维纺丝网生长增殖，可溶性三维纺丝网完全溶解后，得到一种毛细血管网。
鉴于现有技术存在的诸多问题，本发明采用特定方法，借助离心纺丝手段，制备得到毛细血管网，离心纺丝是一种高效低耗的微纳米纤维制备技术，其原理是聚合物熔体或溶液从喷丝孔甩出后在离心力作用下拉伸成纤维。在此过程中，离心力起着重要作用，它对聚合物熔体或溶液有一定的压实作用，聚合物熔体或溶液被挤出后，高速旋转所产生的离心力是聚合物拉伸的主要作用力之一。理论上任何可溶解或熔融的材料均可进行离心纺丝加工。本发明动物细胞在培养过程中，轴芯可在数小时内溶解，然后形成中空的可溶性三维纺丝网，剩下的轴壳会逐渐溶解并释放细胞因子，至完全溶解时，毛细血管网早已形成。本发明毛细血管网的制备方法成本低，产量高，原料适应性广，纺丝原料既可以是溶液也可以是熔体，工艺参数可调易控，故更能满足植入物所需的毛细血管网的制备。
本发明不需要高压静电场，也不需要大量模具，仅利用离心力作为生产可溶性三维纺丝网的动力，不仅大大提高了生产产量，极大降低了能耗成本，而且提高了生产操作的安全性，满足了大规模生产工程化组织三维毛细血管网的需求,也有利于克服组织工程构建物进入临床的重要障碍。
优选地，所述可溶性三维纺丝网包括具有芯壳结构的可溶性三维纺丝网，所述具有芯壳结构的可溶性三维纺丝网包括轴芯和包覆在轴芯外侧的轴壳。
进一步优选地，所述轴芯的材质包括糖，优选包括在37℃或37℃以下可被水溶解的糖，进一步优选包括糖画糖、白沙糖、麦芽糖和艾素糖中的一种或多种，更进一步优选包括糖画糖。
进一步优选地，所述轴壳的材质包括水溶性可降解生物材料，优选包括聚乙烯醇、聚乳酸、壳聚糖、透明质酸、纤维素、聚环氧乙烷、聚丙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亚烷、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚乙醇酸、聚羟基脂肪酸酯、甲壳素和聚羟基脂肪酸脂中的一种或多种，进一步优选包括聚乙烯醇。
优选地，所述可溶性三维纺丝网由离心纺丝得到的纺丝纤维构成，所述纺丝纤维内包含细胞因子。
进一步优选地，所述细胞因子包括血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子中的一种或两种，更进一步优选包括血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子。
优选地，所述轴壳内包含细胞因子。
进一步优选地，所述细胞因子包括血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子中的一种或两种，更进一步优选包括血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子。
优选地，所述动物细胞包括血管内皮细胞、内皮祖细胞和成纤维细胞中的一种或多种，优选包括血管内皮细胞和成纤维细胞，或内皮祖细胞和成纤维细胞。
优选地，所述具有芯壳结构的可溶性三维纺丝网通过同轴离心纺丝方法制备得到。
优选地，所述离心纺丝方法所采用的离心转速为3000-9000rpm，优选为4500-7500rpm，进一步优选为6000rpm。
优选地，所述离心纺丝方法所采用的喷孔直径为0.8-1.2mm，优选为0.9-1.1mm，进一步优选为1mm。
采用上述的一种毛细血管网的制备方法制备得到的毛细血管网。
本发明毛细血管网制备成本低，能够为较厚的工程化组织或器官如肝脏、肾脏等构建充足有效的血管网系统提供所需的三维毛细血管网。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
鉴于现有技术存在的诸多问题，本发明采用特定方法，借助离心纺丝手段，制备得到毛细血管网，离心纺丝是一种高效低耗的微纳米纤维制备技术，其原理是聚合物熔体或溶液从喷丝孔甩出后在离心力作用下拉伸成纤维。在此过程中，离心力起着重要作用，它对聚合物熔体或溶液有一定的压实作用，聚合物熔体或溶液被挤出后，高速旋转所产生的离心力是聚合物拉伸的主要作用力之一。理论上任何可溶解或熔融的材料均可进行离心纺丝加工。本发明动物细胞在培养过程中，轴芯可在数小时内溶解，然后形成中空的可溶性三维纺丝网，剩下的轴壳会逐渐溶解并释放细胞因子，至完全溶解时，三维毛细血管网早已形成。本发明毛细血管网的制备方法成本低，产量高，原料适应性广，纺丝原料既可以是溶液也可以是熔体，工艺参数可调易控，故更能满足植入物所需的毛细血管网的制备。
本发明不需要高压静电场，也不需要大量模具，仅利用离心力作为生产可溶性三维纺丝网的动力，不仅大大提高了生产产量，极大降低了能耗成本，而且提高了生产操作的安全性，满足了大规模生产工程化组织三维毛细血管网的需求,也有利于克服组织工程构建物进入临床的重要障碍。
本发明毛细血管网制备成本低，能够为较厚的工程化组织或器官如肝脏、肾脏等构建充足有效的血管网系统提供所需的三维毛细血管网。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一种具体实施方式提供的同轴离心纺丝机示意图；
图2为本发明一种具体实施方式提供的动物细胞与具有芯壳结构的可溶性三维纺丝网共培养示意图；
附图标记：
1-内筒； 2-外筒； 3-同轴喷头；
4-三维纺丝网； 5-接收棒； 6-离心装置；
7-轴壳； 8-轴芯； 9-动物细胞。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
本发明提供了一种毛细血管网的制备方法，通过离心纺丝方法制备得到可溶性三维纺丝网4，在所得可溶性三维纺丝网4上培养动物细胞9，所述动物体细胞沿可溶性三维纺丝网4生长增殖，可溶性三维纺丝网4完全溶解后，得到一种毛细血管网。
鉴于现有技术存在的诸多问题，本发明采用特定方法，借助离心纺丝手段，制备得到毛细血管网，离心纺丝是一种高效低耗的微纳米纤维制备技术，其原理是聚合物熔体或溶液从喷丝孔甩出后在离心力作用下拉伸成纤维。在此过程中，离心力起着重要作用，它对聚合物熔体或溶液有一定的压实作用，聚合物熔体或溶液被挤出后，高速旋转所产生的离心力是聚合物拉伸的主要作用力之一。理论上任何可溶解或熔融的材料均可进行离心纺丝加工。本发明动物细胞9在培养过程中，轴芯8可在数小时内溶解，然后形成中空的可溶性三维纺丝网，剩下的轴壳7会逐渐溶解，至完全溶解时，三维毛细血管网早已形成。本发明毛细血管网的制备方法成本低，产量高，原料适应性广，纺丝原料既可以是溶液也可以是熔体，工艺参数可调易控，故更能满足植入物所需的毛细血管网的制备。
优选地，所述可溶性三维纺丝网4采用医用级原材料，通过离心纺丝方法制备得到。
优选地，所述可溶性三维纺丝网4包括具有芯壳结构的可溶性三维纺丝网4，所述具有芯壳结构的可溶性三维纺丝网4包括轴芯8和包覆在轴芯8外侧的轴壳7。
进一步优选地，所述轴芯8的材质包括糖，优选包括在37℃或37℃以下可被水溶解的糖，进一步优选包括糖画糖、白沙糖、麦芽糖和艾素糖中的一种或多种，更进一步优选包括糖画糖。
进一步优选地，所述轴壳7的材质包括水溶性可降解生物材料，优选包括聚乙烯醇、聚乳酸、壳聚糖、透明质酸、纤维素、聚环氧乙烷、聚丙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亚烷、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚乙醇酸、聚羟基脂肪酸酯、甲壳素和聚羟基脂肪酸脂中的一种或多种，进一步优选包括聚乙烯醇。
优选地，所述轴芯8和轴壳7的材质分别采用食用级和医用级原材料。
本发明采用特定的具有芯壳结构的可溶性三维纺丝网4，有助于其在动物细胞9生长过程中充分溶解，其中轴芯8材料先溶解，形成中空结构，促进轴壳7材料的充分溶解，当轴壳7材料完全溶解时，动物细胞9早已形成三维毛细血管网。
优选地，所述可溶性三维纺丝网4由离心纺丝得到的纺丝纤维构成，所述纺丝纤维内包含细胞因子。
进一步优选地，所述细胞因子包括血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子中的一种或两种，更进一步优选包括血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子。
优选地，所述轴壳7内包含细胞因子。
进一步优选地，所述细胞因子包括血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子中的一种或两种，更进一步优选包括血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子。
本发明采用特定细胞因子，能够促进动物细胞9生长和增殖。
优选地，所述动物细胞9包括血管内皮细胞、内皮祖细胞和成纤维细胞中的一种或多种，优选包括血管内皮细胞和成纤维细胞，或内皮祖细胞和成纤维细胞。
本发明可选择人或其他动物的细胞，采用特定动物细胞9，有助于其以可溶性三维纺丝网4作为支架，通过生长和增殖，形成三维毛细血管网。
优选地，所述具有芯壳结构的可溶性三维纺丝网4通过同轴离心纺丝方法制备得到。
优选地，所述离心纺丝方法所采用的离心转速为3000-9000rpm，优选为4500-7500rpm，进一步优选为6000rpm。
优选地，所述离心纺丝方法所采用的喷孔直径为0.8-1.2mm，优选为0.9-1.1mm，进一步优选为1mm。
优选地，所述同轴离心纺丝方法所采用的同轴喷孔直径为0.8-1.2mm，优选为0.9-1.1mm，进一步优选为1mm。
本发明通过离心纺丝方法可制备得到具有芯壳包覆结构的可溶性三维纺丝网4，通过选择离心转速和喷孔直径，可以得到特定尺寸的可溶性三维纺丝网4，进而得到特定尺寸的毛细血管网。
采用上述的一种毛细血管网的制备方法制备得到的毛细血管网。
本发明毛细血管网制备成本低，能够为较厚的工程化组织或器官如肝脏、肾脏等构建充足有效的血管网系统提供所需的三维毛细血管网。
可选地，本发明毛细血管网的制备方法，包括如下步骤：
第一步：制备轴芯8材料，将轴芯8材料融化且高压灭菌,得到轴芯8材料液，然后以溶液状态保存备用；
第二步：制备轴壳7材料，配制轴壳7材料水溶液，灭菌后静置，然后加入细胞因子并充分混合，得到轴壳7材料液；
第三步：分别将步骤一和步骤二所得溶液灌注到带有内外两个储液筒的高速旋转同轴离心纺丝机中(已灭菌)，其中内筒1填装轴芯8材料液，外筒2填装轴壳7材料液。
第四步：采用同轴离心纺丝方法制备具有芯壳结构的可溶性三维纺丝网4；可通过离心装置6使内容和外筒2高速离心旋转，通过同轴喷头3，在同轴喷头3和接收棒5之间形成具有芯壳结构的可溶性三维纺丝网4；
第五步：然后将预先分离、培养好的动物细胞9滴加至步骤四所得可溶性三维纺丝网4上并置入细胞培养箱中培养一段时间，在培养的过程中轴芯8材料会在数小时内溶解，进而形成中空结构，与此同时，动物细胞9沿轴壳7材料爬附并增殖，待轴壳7材料完全溶解后，三维毛细血管网已形成。
优选地，本发明所采用的水为超纯水。
优选地，轴壳7材料水溶液中轴壳7材料的质量分数为10％-35％，优选为15％-25％，进一步优选为15％-20％。
优选地，所述细胞因子的浓度为5-15ng/mL，优选为5-10ng/mL，进一步优选为10ng/mL。
实施例1
一种毛细血管网的制备方法，包括如下步骤：
1)将50g糖画糖融化且高压灭菌，然后以溶液状态保存备用；
2)将5g医用级的聚乙烯醇溶解在50mL的超纯水中以配成质量百分浓度为10％的溶液，灭菌后在4℃下静置；然后将血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子与所得溶液充分混合；
3)将步骤一和步骤二所得溶液分别灌注到带有内外两个储液筒的无菌高速旋转同轴离心纺丝机中(已灭菌)，进行同轴离心纺丝；同轴纺丝工艺条件为：内筒溶液为轴芯材料，外筒溶液为轴壳材料，离心转速为3000r/mi n,同轴喷孔直径为0.8mm，收集装置到喷丝头的距离为15cm；轴壳材料溶液中血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的浓度均为10ng/mL；得到具有芯壳结构的可溶性三维纤维网后，然后将预先分离、培养好的第三代SD大鼠内皮细胞(浓度为1x106/mL)和第三代SD大鼠成纤维细胞(浓度为5x105/mL)分别滴加2滴在上述纤维网上并置入细胞培养箱中培养；细胞培养箱的参数为：温度37℃、二氧化碳体积浓度5％培养，糖画糖完全溶解后，得到中空结构，之后聚乙烯醇逐渐溶解并释放细胞因子，与此同时内皮细胞沿聚乙烯醇爬附并增殖，聚乙烯醇完全溶解后，三维毛细血管网已形成。
实施例2
一种毛细血管网的制备方法，包括如下步骤：
1)将50g白砂糖融化且高压灭菌，然后以溶液状态保存备用；
2)将5g医用级的聚乙烯醇和2.5g医用级的聚乙二醇溶解在50mL的超纯水中，所得溶液灭菌后在4℃下静置；然后将血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子与所得溶液充分混合；
3)将步骤一和步骤二所得溶液分别灌注到带有内外两个储液筒的无菌高速旋转同轴离心纺丝机中(已灭菌)，进行同轴离心纺丝；同轴纺丝工艺条件为：内筒溶液为轴芯材料，外筒溶液为轴壳材料，离心转速为4500r/mi n,同轴喷孔直径为0.9mm，收集装置到喷丝头的距离为15cm；轴壳材料溶液中血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的浓度均为15ng/mL；得到具有芯壳结构的可溶性三维纤维网后，然后将预先分离、培养好的第三代SD大鼠内皮细胞(浓度为1x106/mL)和第三代SD大鼠成纤维细胞(浓度为5x105/mL)分别滴加2滴在上述纤维网上并置入细胞培养箱中培养；细胞培养箱的参数为：温度37℃、二氧化碳体积浓度5％培养，白砂糖完全溶解后，得到中空结构，之后聚乙烯醇和聚乙二醇逐渐溶解并释放细胞因子，与此同时内皮细胞沿聚乙烯醇和聚乙二醇爬附并增殖，聚乙烯醇和聚乙二醇完全溶解后，三维毛细血管网已形成。
实施例3
一种毛细血管网的制备方法，包括如下步骤：
1)将50g麦芽糖融化且高压灭菌，然后以溶液状态保存备用；
2)将5g医用级的聚乙烯醇、2.5g医用级的聚乙二醇和2.5g医用级的聚乙烯吡咯烷酮溶解在50mL的超纯水中，所得溶液灭菌后在4℃下静置；然后将血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子与所得溶液充分混合；
3)将步骤一和步骤二所得溶液分别灌注到带有内外两个储液筒的无菌高速旋转同轴离心纺丝机中(已灭菌)，进行同轴离心纺丝；同轴纺丝工艺条件为：内筒溶液为轴芯材料，外筒溶液为轴壳材料，离心转速为9000r/mi n,同轴喷孔直径为1.2mm，收集装置到喷丝头的距离为15cm；轴壳材料溶液中血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的浓度均为5ng/mL；得到具有芯壳结构的可溶性三维纤维网后，然后将预先分离、培养好的第三代SD大鼠内皮细胞(浓度为1x106/mL)和第三代SD大鼠成纤维细胞(浓度为5x105/mL)分别滴加2滴在上述纤维网上并置入细胞培养箱中培养；细胞培养箱的参数为：温度37℃、二氧化碳体积浓度5％培养，麦芽糖完全溶解后，得到中空结构，之后聚乙烯醇、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮逐渐溶解并释放细胞因子，与此同时内皮细胞沿聚乙烯醇、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮爬附并增殖，聚乙烯醇、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮完全溶解后，三维毛细血管网早已形成。
实施例4
一种毛细血管网的制备方法，包括如下步骤：
1)将50g艾素糖融化且高压灭菌，然后以溶液状态保存备用；
2)将10g医用级的聚乙烯醇溶解在50mL的三蒸水中，所得溶液灭菌后在4℃下静置；然后将血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子与所得溶液充分混合；
3)将步骤一和步骤二所得溶液分别灌注到带有内外两个储液筒的无菌高速旋转同轴离心纺丝机中(已灭菌)，进行同轴离心纺丝；同轴纺丝工艺条件为：内筒溶液为轴芯材料，外筒溶液为轴壳材料，离心转速为7500r/mi n,同轴喷孔直径为1.1mm，收集装置到喷丝头的距离为15cm；轴壳材料溶液中血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的浓度均为5ng/mL；得到具有芯壳结构的可溶性三维纤维网后，然后将预先分离、培养好的第三代SD大鼠内皮细胞(浓度为1x106/mL)和第三代SD大鼠成纤维细胞(浓度为5x105/mL)分别滴加2滴在上述纤维网上并置入细胞培养箱中培养；细胞培养箱的参数为：温度37℃、二氧化碳体积浓度5％培养，艾素糖完全溶解后，得到中空结构，之后聚乙烯醇逐渐溶解并释放细胞因子，与此同时内皮细胞沿聚乙烯醇爬附并增殖，聚乙烯醇完全溶解后，三维毛细血管网早已形成。
实施例5
一种毛细血管网的制备方法，包括如下步骤：
1)将50g糖画糖融化且高压灭菌，然后以溶液状态保存备用；
2)将17.5g医用级的聚乙烯醇溶解在50mL的三蒸水中，所得溶液灭菌后在4℃下静置；然后将血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子与所得溶液充分混合；
3)将步骤一和步骤二所得溶液分别灌注到带有内外两个储液筒的无菌高速旋转同轴离心纺丝机中(已灭菌)，进行同轴离心纺丝；同轴纺丝工艺条件为：内筒溶液为轴芯材料，外筒溶液为轴壳材料，离心转速为6000r/mi n,同轴喷孔直径为1.0mm，收集装置到喷丝头的距离为15cm；轴壳材料溶液中血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的浓度均为13ng/mL；得到具有芯壳结构的可溶性三维纤维网后，然后将预先分离、培养好的第三代SD大鼠内皮细胞(浓度为1x106/mL)和第三代SD大鼠成纤维细胞(浓度为5x105/mL)分别滴加2滴在上述纤维网上并置入细胞培养箱中培养；细胞培养箱的参数为：温度37℃、二氧化碳体积浓度5％培养，糖画糖完全溶解后，得到中空结构，之后聚乙烯醇逐渐溶解并释放细胞因子，与此同时内皮细胞沿聚乙烯醇爬附并增殖，聚乙烯醇完全溶解后，三维毛细血管网早已形成。
本发明基于同轴离心纺丝技术，使用糖和水溶性可吸收降解生物材料(如PVA)及内皮细胞和成纤维细胞，制备毛细血管网。本发明将糖作为轴芯，医用级的水溶性可吸收降解生物材料及血管形成诱导因子为轴壳，同轴制备具有芯壳结构的可溶性三维纤维网，然后将预先培养好的第三代内皮细胞或内皮祖细胞及成纤维细胞按一定密度接种在所得具有芯壳结构的可溶性三维纤维网上进行培养，在培养的过程中轴芯材料会先溶解，进而形成中空结构，与此同时，内皮细胞沿轴壳爬附并增殖，待轴壳材料完全溶解之时，毛细血管网早已形成。相对于现有制备血管的方法，本发明采用同轴离心纺丝技术成本低，产量高，原料适应性广，纺丝原料既可以是溶液也可以是熔体，工艺参数可调易控，故更能满足植入物所需的毛细血管网的制备。本发明方法工艺简单且效率高，采用同轴离心纺丝方法制备具有芯壳结构的三维纤维网仅需要数分钟，轴芯材料完全溶解仅需要数小时，数天后，轴壳材料便可完全溶解，得到所需三维毛细血管网。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些替换和修改。

Claims (10)

1.一种毛细血管网的制备方法，其特征在于，通过离心纺丝方法制备得到可溶性三维纺丝网，在所得可溶性三维纺丝网上培养动物细胞，所述动物体细胞沿可溶性三维纺丝网的生长增殖，可溶性三维纺丝网完全溶解后，得到一种毛细血管网。
2.根据权利要求1所述的一种毛细血管网的制备方法，其特征在于，所述可溶性三维纺丝网包括具有芯壳结构的可溶性三维纺丝网，所述具有芯壳结构的可溶性三维纺丝网包括轴芯和包覆在轴芯外侧的轴壳。
3.根据权利要求2所述的一种毛细血管网的制备方法，其特征在于，所述轴芯的材质包括糖，优选包括在37℃或37℃以下可被水溶解的糖，进一步优选包括糖画糖、白沙糖、麦芽糖和艾素糖中的一种或多种，更进一步优选包括糖画糖。
4.根据权利要求2所述的一种毛细血管网的制备方法，其特征在于，所述轴壳的材质包括水溶性可降解生物材料，优选包括聚乙烯醇、聚乳酸、壳聚糖、透明质酸、纤维素、聚环氧乙烷、聚丙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亚烷、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚乙醇酸、聚羟基脂肪酸酯、甲壳素和聚羟基脂肪酸脂中的一种或多种，进一步优选包括聚乙烯醇。
5.根据权利要求1所述的一种毛细血管网的制备方法，其特征在于，所述可溶性三维纺丝网由离心纺丝得到的纺丝纤维构成，所述纺丝纤维内包含细胞因子；优选地，所述细胞因子包括血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子中的一种或两种，进一步优选包括血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子。
6.根据权利要求2所述的一种毛细血管网的制备方法，其特征在于，所述轴壳内包含细胞因子；优选地，所述细胞因子包括血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子中的一种或两种，进一步优选包括血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子。
7.根据权利要求1所述的一种毛细血管网的制备方法，其特征在于，所述动物细胞包括血管内皮细胞、内皮祖细胞和成纤维细胞中的一种或多种，优选包括血管内皮细胞和成纤维细胞，或内皮祖细胞和成纤维细胞。
8.根据权利要求2所述的一种毛细血管网的制备方法，其特征在于，所述具有芯壳结构的可溶性三维纺丝网通过同轴离心纺丝方法制备得到。
9.根据权利要求1所述的一种毛细血管网的制备方法，其特征在于，所述离心纺丝方法所采用的离心转速为3000-9000rpm，优选为4500-7500rpm，进一步优选为6000rpm；所述离心纺丝方法所采用的喷孔直径为0.8-1.2mm，优选为0.9-1.1mm，进一步优选为1mm。
10.采用权利要求1-9任一所述的一种毛细血管网的制备方法制备得到的毛细血管网。
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