CN106611094B - 基于肠道微生物菌群预测及干预化疗药物毒副反应的系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于检测肠道微生物菌群预测和预防化疗药物毒副反应的方法。本发明主要内容包括提取受检者的粪便微生物DNA并分析肠道（粪便）微生物菌群种类及丰度，然后与构建好的药物毒副反应严重和轻微的两种样本库进行相似性比较从而预测该受检者可能发生的化疗药物毒性。对于具有严重化疗药物毒副反应的患者根据肠道菌群种类和丰度进行针对性的调节从而达到干预目的。

Description

基于肠道微生物菌群预测及干预化疗药物毒副反应的系统

技术领域

本发明涉及分子生物学、微生物学和药物代谢领域，涉及核酸测、微生物种类鉴定与药物干涉。

背景技术

不同患者接受相同抗肿瘤方案时药物的疗效和毒性会呈现比较大的差异,这种个体间差异是多因素的，其中包括基因遗传因素和环境因素。目前关于化疗药物的毒副作用研究主要集中在分子遗传领域，例如在肿瘤领域的药物基因组学中，与药物反应表型相关的遗传标记包括单核苷酸多态（SNPs）、单倍体型、微卫星或者简单序列重复（SSR）、小片段插入与删除（Insertion and Deletion，InDel）、拷贝数变异（CNV）、非整倍体和杂合性缺失¹。毒副作用相关候选基因一般都选择涉及到药物代谢、运输以及下游与细胞凋亡相关的信号通路上的基因，并通过全基因组关联分析基因型与表型的关系。例如在入组了968个英国患者的一项研究中，作者分析了5-FU通路的25个候选基因附近的1456个多态性位点和稀有变异，确定了DYPD的多态性位点rs1213152和ENOSF1多态性位点rs2612091与卡培他滨毒性强相关。另外使用二代测序还发现了DPYD编码区稀有突变p.Ala551会导致严重的毒性，证明了影响到基因功能的非多态性的稀有变异对药物毒性也有重要的影响²。然而根据全基因组关联分析（GWAS）得到与基因组变异位点对药物毒性的预测没有显著作用，比值比/相对危险度（Odd Ratio）一般小于1.5，意味着目前药物基因组学对化疗毒性的研究还需要进一步的探索。

本发明选择紫杉醇联合卡铂方案对胃肠道毒副作用作为实施例。卵巢上皮癌是妇科常见三大生殖道恶性肿瘤之一，由于其生物学特性以及器官位置的特殊性，临床上不容易早期发现，有70%的患者在发现时已经是晚期（Ⅲ期或Ⅳ期），对于这部分晚期卵巢上皮癌患者的标准治疗模式是手术联合术后化疗，美国妇科肿瘤学组（Gynecologic OncologyGroup，GOG）进行的GOG111研究已经证实紫杉醇联合顺铂方案优于传统的环磷酰胺联合顺铂方案³，接着进行的三项前瞻性随机分组研究^4-6结果显示紫杉醇联合卡铂方案与紫杉醇联合顺铂方案的疗效相当（有效率和总生存率），而卡铂的毒性反应要明显要轻于顺铂，特别是神经毒性和耳肾毒性，所以目前紫杉醇联合卡铂方案是卵巢上皮癌的标准化疗方案。虽然紫杉醇联合卡铂方案的胃肠道反应要轻于紫杉醇联合顺铂方案，但是据报道其胃肠道副反应发生率仍然达到50%以上，即使是Ⅱ级（含Ⅱ级）以上的胃肠道副反应发生率仍能达到20%至30%⁶。这些较重的胃肠道反应降低了患者对化疗的耐受性,导致一部分患者不能完成预定的化疗疗程数,从而影响最终的疗效。

已有研究表明MTHFR、ERCC1、GSTP1和TP53等基因的特定SNP（多核苷酸多态）与铂类药物和紫杉醇的毒性或疗效相关⁷，然而由于其弱相关性并没有应用于临床实践中。肠道微生物作为个体遗传因素之外的环境因素，与胃肠道异常反应之间有明确的联系，已有研究表明溃疡性结肠炎与肠道微生物种群分布强相关。Zwielehner等使用qPCR方法研究表明化疗和抗生素治疗前后肠道微生物会发生改变，尤其是难辨梭状芽孢杆菌（C.difficil）和粪肠球菌（Enterococcus faecium）菌群⁸。另有研究表明化疗会影响哺乳期女性乳汁中的微生物组成⁹，但是目前国内外尚无关于卵巢上皮癌化疗毒副作用与肠道微生物之间联系的研究。本发明创新性的提出并验证化疗毒副反应与肠道微生物之间的联系，并进一步分析何种特定肠道微生物种群改变导致了毒副反应，为提高临床化疗的整体治疗效果和患者生活质量提供新的技术。

发明内容

本发明人公开了一种能够预测特定个体的化疗药物毒副反应的检测方法，该方法的理论核心是受检人肠道微生物生态与化疗药物毒副反应之间强相关。为了证明肠道微生物和化疗毒副反应之前的关系，发明人分别选取对化疗方案呈现不同胃肠道毒副反应的两组卵巢癌患者各9例，并采集其用药前后的粪便。提取DNA行16S测序后分析肠道微生物的种类和丰度信息并以此计算所有样本间的相关性。相关性数据可以明显区分毒副反应严重和轻微的两类人群，证明了肠道微生物和化疗药物毒副反应之间存在强烈相关。依据此理论本发明提供的检测方法包括以下步骤：（1）构建包括化疗毒副反应严重和轻微两组病人的肠道微生物数据，数据包括用药前的粪便微生物种类、丰度或功能基因；

（2）检测受检人化疗用药前的粪便微生物种类和丰度或者功能基因丰度；

（3）将（2）中得到的受检人数据和（1）中构建的两个数据库进行相似性分析或者对比数据库中特定微生物丰度比的阈值。

（4）根据（3）中结果判断受检者可能的毒副反应程度。

本发明还公开了肠道微生物中和化疗药物毒副反应强烈相关的几类细菌种类，包括Veillonellaceae科、Porphyromonadaceae科、Enterobacteriaceae科。进一步优选和化疗药物毒副反应相关的微生物种类包括Phascolarctobacterium属、Parabacteroides属以及Dialister属。

我们还公开了分析粪便菌群数据的方法，具体可以是采用核糖体RNA基因16S扩增联合高通量测序的分类分析法，也可采取其它菌群特异基因进行定量分类，如荧光定量PCR方法，生物芯片杂交法等。粪便微生物数据不仅包括菌群的种类和丰度，还可以包含菌群DNA中含有的功能基因，特别是和药物代谢相关的功能基因，优选为和化疗毒性强相关的Veillonellaceae科、Porphyromonadaceae科、Enterobacteriaceae科细菌特有的功能基因。

本发明公开了一种干预严重化疗药物毒副反应的方法，其特征在于：（1）检测或确定受检人为化疗药物毒副作用高风险；（2）分析此受检人肠道微生物与化疗药物轻微毒副反应数据库中种类和丰度有显著差异的菌群或功能基因差异；（3）调节该受检人的肠道微生物生态使（2）中确定的异常菌群或基因功能达到新平衡状态。

本发明进一步披露了能够干预化疗药物毒副反应的异常菌群优选为Veillonellaceae科、Porphyromonadaceae科、Enterobacteriaceae科，并进一步优选Phascolarctobacterium属、Parabacteroides属以及Dialister属。

本发明还披露了调节人肠道微生物菌群的方法。调节方法包括服用含有特定微生物菌群的食物、药品、肠溶胶囊，采用能够影响肠道微生物菌群丰度的口服类和注射类药物，以及能够调节特异肠道微生物微生物功能基因活性的药物。

附图说明

图1. 基于OUT分析的受检人微生物种类及丰度柱状图。

图2. Pearson相似性分析受检人用药前后粪便样本聚类图。

图3. Bray-Curtis法分析受检人用药前后粪便样本聚类图。

图4. 以微生物丰度比值为指标区分化疗毒性反应效果图。

本发明的实施方式举例

除非特别说明，本发明所用术语的含义均按照相关领域公知的广义含义来理解。

实施例1. 化疗药物毒副反应与肠道微生物生态聚类分析

1.1筛选患者

拟选取计划行化疗的卵巢上皮癌患者18例，其中化疗后无明显胃肠道反应的9例（对照组），化疗后出现明显胃肠道反应（≥2级，CTCAE V3.0分级标准）的9例（毒性反应组），筛选患者的入组标准和排除标准如下：

1.1.1入组标准:入选本研究的受试者必须符合所有下列条件

（1）年龄：18-60岁

（2）经组织学确诊的卵巢上皮癌

（3） FIGO临床分期：IC期～Ⅳ期

(4)需要接受3个疗程(含3个)以上的化疗.

（5）签署书面知情同意书

1.1.2排除标准: 所有受试者不具有下列任何情况

（1）既往曾经接受过化疗或者放疗。

（2）既往患有其它恶性肿瘤。

（3）妊娠

（4）既往患有胃溃疡、溃疡性结肠炎、克隆氏病等慢性胃肠道疾病。

（5）精神异常、痴呆等理解力障碍不能完成知情同意

符合入组标准患者签署知情同意书后，在化疗开始前留取患者粪便标本，并在化疗第三疗程结束后3周再次留取粪便标本，化疗过程中详细记录患者的毒副作用，包括胃肠道毒副反应，出现严重胃肠道反应的患者为毒性反应组，无明显毒副作用的患者归入对照组。粪便样本对应的临床信息见表1.

表1

1.2 粪便DNA提取及16SV4区测序

1.2.1 称取200mg粪便DNA使用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取DNA，并使用Nanodrop与琼脂糖电泳测定DNA浓度与质量；

1.2.2 PCR扩增

使用16S V4区引物515F与806R按照同样条件对全部样本进行平行PCR扩增，扩增后PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱； 2%琼脂糖电泳检测。

1.2.3 PCR产物定量

参照电泳初步定量结果，将PCR产物用Nanodrop2000进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。

1.2.4文库构建（PCR free 法）与测序

1）使用illumina PCR-free 建库试剂盒对PCR产物混合物连接测序所需的“Y”字形接头；

2）使用磁珠筛选去除接头自连片段；

3）使用illumina HiSeq2500测序仪的PE250测序策略，平均每个样本测得4万条reads。

1.3 生物信息分析流程

测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后进行OTU聚类分析和物种分类学分析。基于分类学信息进行群落结构统计分析、样本间Pearson相似性分析和Bray-Curtis聚类分析。

1.4 结果与讨论

基于OUT聚类的微生物种类及丰度如图1所示。如图所见，Bifidobacteriaceae科、Bacteroidaceae科、Porphyromonadaceae科、Prevotellaceae科、Streptococcaceae科、Clostridiaceae科Clostridium、Lachnospiraceae科、Ruminococcaceae科、Veillonellaceae科、Veillonellaceae科、Alcaligenaceae科、Desulfovibrionaceae科、Enterobacteriaceae科和Pasteurellaceae科微生物在所有受检人的肠道微生物中丰度较高。根据微生物种类和丰度对18个受检人36个用药前后粪便样本进行Pearson相似性分析。如图2中所示，所有样本分为如下四个大组：

A组：17,25,1,9,2,34,13,36,33

B组：8,28,27,16,5，15

C组：26,12,11,23,21,22,18,35

D组：7,14,24,3,30,29,10,31,32,6,19,20,4

其中化疗毒性反应严重的用药前样本除了27外，样本3、7、11、19、21、23、27、29、31均在C和D组；化疗毒性反应轻微的对照组用药前样本除了35之外全部归在A和B组。根据Pearson相似性分析预测化疗药物毒副反应程度的准确率在89%（18人组中有16人归类正确）。此数据证明依据肠道微生物种类和丰度可以有效的预测化疗药物毒性反应。

而同样根据微生物种类和丰度数据使用Bray-Curtis聚类分析结果如图3所示。所有样本分为如下五个组： A组：27,28,15,16,8,4,19,20,5

B组：2,18,33,35,11,26,12

C组：10,29,30,31,32

D组：17,25,13,9,34,26,1

E组：7,14,6,21,22,3,24,23

其中C组和E组包括且仅包括具有严重毒性患者的用药前样本3，7，21，23，29和31。D组中包括且仅包括具有轻微毒性患者的用药前样本1，9，13，17和25。但A组和B组中两组样本没有明显区分开，预测准确率为67%（18人组中共有12人正确归类）。综合以上数据说明Pearson相似性归类分析法预测化疗药物毒副反应准确性更高。

实施例2.寻找与利用和化疗药物毒副反应相关的特定微生物种群

表2和表3所示为化疗药物毒性高低两组受检者的用药前肠道微生物优势种群的相对丰度数据。表2和表3中灰色填充单元格表示相对丰度大于0.01（在肠道微生物中群落含量超过1%），有黑色边框的单元格表示相对丰度大于0.1（在肠道微生物中群落含量超过10%）。结合图1、表2和表3可以看出，Bacteroides和Veillonella属微生物几乎在所有样本中存在，而Phascolarctobacterium微生物相对丰度则在对照组明显高于毒性反应组。相反Enterobacteriaceae科则在毒性反应组有较高丰度，这种现象提示Phascolarctobacterium属和Enterobacteriaceae科微生物对于化疗药物毒性反应具有重要作用。本实施例主要探讨以Phascolarctobacterium属、Enterobacteriaceae科、Bacteroides和Veillonella属微生物之间比值作为预测化疗药物毒副反应的可行性。以AB（ph）、AB（En）、AB（ba）和AB（ve）表示Phascolarctobacterium属、Enterobacteriaceae科、Bacteroides属和Veillonella属的相对丰度并选择

、

和

的比值作为三个独立评价指标并比较其预测准确性。根据表2和表3中的不同样本的细菌丰度数据计算三个评价指标结果显示在表4中并可视化为图4。表4和图4结合可以看出

除了样本27外可以将对照组和毒性反应组明显区分，预测准确性为94%（17/18）；

和

指标除了样本15外同样可以将对照组和毒性反应组明显区分，准确性也有94%；而对于

指标而言，如果将阈值选择在0.06-0.1之间，则预测准确性可达100%（18/18），更能反映出化疗药物毒副反应可能发生的程度。这个实施例证明科学选择少数微生物菌群同样可以达到甚至能更精准的预测化疗药物毒副反应的程度。

表2

表3

表4

预测指标	1	5	9	13	15	17	25	33	35	3	7	11	19	21	23	27	29	31
																			AB(ph)/AB(ba)	0.80946	1.10734	0.6292	0.91784	0.64121	1.44925	2.51307	0.65959	0.4642	0.00739	0.01473	0.02797	0.01247	0.03529	0.01543	1.70005	0.02839	0.08497
AB(ph)/AB(ba+ve)	0.74262	0.25043	0.62306	0.66345	0.02102	1.38495	2.1764	0.40271	0.44757	0.00516	0.01213	0.02747	0.01116	0.01901	0.0108	0.02255	0.02819	0.08464
																			AB(ph)/AB(ba+En)	0.79062	1.08487	0.61121	0.8924	0.11214	1.39703	2.18007	0.54204	0.4584	0.00567	0.01442	0.02757	0.00615	0.03457	0.01058	0.0565	0.0275	0.0658

参考资料

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Claims (13)

1.一种预测化疗药物毒副反应大小的系统，其特征在于，该系统包括：(1)提取模块,用于提取受检人粪便DNA并分析其中菌群的种类、丰度和功能基因；(2)分析模块，用于提取模块中得到的菌群数据分别与具有不同化疗药物毒副反应的病人肠道微生物种类和丰度的数据库中的严重和轻微毒副作用两类数据库做相似性分析；(3)判断模块，用于根据分析模块的分析结果判断受检者可能的毒副反应程度；其中，所述具有不同化疗药物毒副反应的病人肠道微生物种类和丰度的数据库包括：

a、至少包括化疗毒副反应严重和轻微两组病人的肠道微生物数据；b、肠道微生物数据包括用药前的粪便微生物种类、丰度和功能基因。

2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，肠道微生物数据至少包括如下微生物种类：Bifidobacteriaceae科；Bacteroidaceae科；Porphyromonadaceae科；Prevotellaceae科；Streptococcaceae科；Clostridiaceae科Clostridium；Lachnospiraceae科；Ruminococcaceae科；Veillonellaceae科；Alcaligenaceae科；Desulfovibrionaceae科；Enterobacteriaceae科；Pasteurellaceae科。

3.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述化疗药物选自铂类、紫杉类、烷化剂类和抗代谢类药物中的一种；其中，铂类药物包括卡铂、顺铂、奈达铂和奥沙利铂。

4.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述化疗药物选自紫杉醇联合卡铂。

5.如权利要求1所述的系统，其特征在于，提取模块中，分析粪便菌群数据采用核糖体RNA基因16S分类分析法，或者采取其它菌群特异基因进行定量分类，或者是阈值比较。

6.如权利要求1所述的系统，其特征在于，分析模块中，相似性分析选自Pearson相似性分析、Bray-Curtis聚类分析、Jaccard及UniFrac PCoA/Tree分析方法中的一种。

7.如权利要求1所述的系统，其特征在于，分析模块中，样本与数据库做相似性分析时不同微生物种类给予不同的权重，或仅有选择的使用少数微生物种类进行分析。

8.如权利要求7所述的系统，其特征在于，所述微生物种类选自Bacteroidaceae科、Veillonellaceae科、Porphyromonadaceae科、Enterobacteriaceae科和Veillonellaceae科。

9.如权利要求7所述的系统，其特征在于，所述微生物种类选自Bacteroides属、Phascolarctobacterium属、Parabacteroides属以及Dialister属。

10.如权利要求7所述的系统，其特征在于，选用少数微生物种类进行相似性分析时，其相似性分析指标为微生物种类丰度的比值。

11.如权利要求10所述的系统，所述相似性分析指标为分别以Phascolarctobacterium属、Enterobacteriaceae科、Bacteroides属和Veillonella属微生物之间的相对丰度的比值。

12.如权利要求7-10任一项所述的系统，其特征在于，选择少数微生物种类分析也包括选择这些微生物所特有的功能基因。

13.如权利要求12所述的系统，其特征在于，所述功能基因选自药物代谢相关的基因。

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