CN106596804A - 一种实蝇幼虫检疫处理的代谢组学判别方法 - Google Patents

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CN106596804A CN201611079689.7A CN201611079689A CN106596804A CN 106596804 A CN106596804 A CN 106596804A CN 201611079689 A CN201611079689 A CN 201611079689A CN 106596804 A CN106596804 A CN 106596804A
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Abstract

本发明涉及一种实蝇幼虫检疫处理的代谢组学判别方法，包括以下步骤：对检疫性实蝇幼虫样品进行代谢组学前操作，并将得到的实蝇幼虫样品进行代谢组学检测；将检测数据进行数据处理分析，得到样品数据；将样品数据与阴性对照数据和阳性对照数据进行统计学比较，如果所述样品数据与所述阳性对照数据的比较结果为无显著差异，并且与所述阴性对照数据的比较结果为差异显著，则判定所述检疫性实蝇进行了检疫处理。使用该方法可对检疫性实蝇幼虫进行快速、高通量筛查，灵敏度和准确度高，缩短了检疫处理观察期判别的时间，大大降低了检疫处理实验验证的时间和成本。

Description

一种实蝇幼虫检疫处理的代谢组学判别方法
技术领域
本发明涉及检验检疫领域，更特别地，一种判别检疫性实蝇是否进行了检疫处理的代谢组学方法。
背景技术
随着全球经济一体化进程的深入，国际贸易日趋频繁和多样化，导致外来有害生物入侵频率加大，对生态环境和农业生产构成巨大的潜在威胁。中国是水果进出口大国，如何有效防范有害生物的跨境传播，确保我国农业、林业及生态安全，提高我国出口水果产品质量，已经成为我国出入境检疫部门关注的重点之一。
水果能够传带多种危险性外来有害生物，特别是地中海实蝇、番石榴实蝇、木瓜实蝇等水果产业的毁灭性检疫有害生物，寄主范围极广，几乎包含所有经济类水果，繁殖力和适应性强，其卵、幼虫、蛹都可随寄主类果实、包装物及运输工具进行远距离传播。一旦传入就有暴发成灾的可能，其结果不仅酿成重大经济损失，而且对新侵入地区的果蔬种植业构成严重威胁。为了防止外来生物入侵并满足口岸快速通关的需要，一般的做法只能在入境口岸实施溴甲烷熏蒸处理。但溴甲烷作为臭氧层消耗物质，虽然检疫用途的溴甲烷消费属于《蒙特利尔议定书》的豁免范围，但是近年来，国际社会要求包括检疫中使用的溴甲烷都应加速淘汰的呼声越来越高，欧盟已于2010年全面禁止了所有用途的溴甲烷使用。目前较为广泛的检疫处理方法有冷处理和热处理等。
冷处理是常用的水果处理方法，然而，有些携带有害生物的水果不经冷处理，就试图进入我国市场。还有些进行过不合格的冷处理后，幼虫不会立刻死亡，甚至有些幼虫会通过滞育度过胁迫阶段。目前对于昆虫是否进行检疫处理判别的技术还处于空白阶段，主要还局限在实验室饲养观察的方法，须经实验室培养后才能判读是否进行过冷处理，或者判断处理是否有效，但这么做耗时较长(一般需一周以上)，影响入境货物的通关速度。
自70年代，热处理技术又因其环保、无残留、安全性高，逐渐重新引起人们的关注。热处理技术也随之开始了新一轮的蓬勃发展。热处理技术包括热水、蒸热、强制热空气和干热处理技术等逐步应用于检疫处理中。但对于番石榴实蝇，南亚果实蝇、粉蚧等的热处理的检疫标准，在国际上还是个空白。
所以，快速判别幼虫是否进行了检疫处理，以较好地防范外来有害生物的入侵，对保障我国生物安全有重要的理论意义和实用价值。因此，需要一种快速可靠的方法来鉴定待检疫的货物是否进行过检疫处理。
发明内容
本发明基于代谢组学技术，依靠现代化学计量学和计算机模型系统，处理分析不同处理的昆虫体内的代谢物质，提取出有用的特征，从而达到灵敏、准确、高效识别昆虫幼虫处理有效性的目的，为检验检疫决策做出有力的技术支持。
基于此，本发明提供了一种实蝇幼虫检疫处理的代谢组学判别方法，其包括以下步骤：
S1：对待检疫的实蝇幼虫样品进行代谢组学前操作，并将得到的实蝇幼虫样品进行代谢组学检测；
S2：将S1得到的检测数据进行数据处理分析，得到样品数据；
S3：将S2得到的样品数据与阴性对照数据和阳性对照数据进行统计学比较，如果所述样品数据与所述阳性对照数据的比较结果为无显著差异，并且与所述阴性对照数据的比较结果为差异显著，则判定所述待检疫的实蝇幼虫进行了检疫处理；否则，判定所述待检疫的实蝇幼虫未进行检疫处理。
进一步地，所述代谢组学检测通过GC/MS检测来进行。
进一步地，S1包括以下步骤：
S1.1：提取总代谢物，得到总代谢物提取液；
S1.2：向所述总代谢物提取液中添加内标；
S1.3：吹干，加入甲基化试剂进行甲基化；
S1.4：加入烷基化试剂进行烷基化；
S1.5：进行GC/MS检测。
进一步地，S2中得到样品数据包含以下数据：保留时间、质荷比、观察量和积分面积。
进一步地，所述阴性对照数据为从正常生长的实蝇幼虫得到的代谢组学检测数据，并且所述阳性对照数据为从检疫处理的实蝇幼虫得到的代谢组学检测数据。
进一步地，S3中所述统计学比较为主成分分析、偏最小二乘方-判别分析和正交偏最小二乘方-判别分析。
进一步地，S3包括以下步骤：
S3.1：将所述样品数据与阳性对照数据进行主成分分析，当结果大于1时，判定所述待检疫的实蝇幼虫样品未经检疫处理，当结果等于1时，将所述样品数据与所述对照数据进行主成分分析；
S3.2：当所述样品数据与所述对照数据的主成分分析结果等于1时，判定所述待检疫的实蝇幼虫样品未经检疫处理，当结果大于1并且t检验p值小于0.05时，进行偏最小二乘方-判别分析；
S3.2：当偏最小二乘方-判别分析结果为无显著差异时，则判定所述待检疫的实蝇幼虫未经检疫处理，当分析结果为差异显著时，则进行正交偏最小二乘方-判别分析；
S3.3：当所述正交偏最小二乘方-判别分析结果为无显著差异时，则判定所述待检疫的实蝇幼虫未经历检疫处理，当分析结果为差异显著时，则判定所述待检疫的实蝇幼虫经历了检疫处理。
进一步地，在所述偏最小二乘方-判别分析和正交偏最小二乘方-判别分析中还使用R2Y值和Q2值判定分析结果的置信度，当R2Y值和Q2值均大于0.5时，认为该判定可信。
进一步地，所述检疫处理为检疫冷处理或热处理。
进一步地，所述实蝇为桔小实蝇、地中海实蝇、番石榴实蝇或木瓜实蝇。
本发明将代谢组学分析技术用于检疫处理，特别是检疫冷处理有效性的判别中，通过本发明对检疫性实蝇幼虫进行快速、高通量筛查，灵敏度和准确度高，缩短了检疫处理观察期判别的时间，大大降低了检疫处理实验验证的成本，为保障我国水果进出口贸易顺利进行，提升我国生物安全，具有重要的经济和社会效益。
附图说明
图1为对照组和冷处理组的总离子流(TIC)色谱图；
图2为对照组与冷处理组PCA得分图；
图3为对照组与冷处理组PLS-DA得分图；
图4为冷处理组与对照组OPLS-DA得分图；
图5为对照组和热处理组的总离子流(TIC)色谱图；
图6为对照组与热处理组PCA得分图；
图7为对照组与热处理组PLS-DA得分图；
图8为热处理组与对照组OPLS-DA得分图。
具体实施方式
实施例1检疫冷处理的判别
1.检疫性实蝇幼虫冷处理
将实蝇幼虫裸虫放入含有保湿滤纸的培养皿中，置于0℃的控温箱中，保持6h。对照组幼虫为裸虫，置于25℃的恒温培养箱中，通过温度记录仪监测对照组和处理组的环境温度。然后用液氮将经冷处理的实蝇幼虫和对照组幼虫用液氮速冻，并储存于-80℃。
2.样本的代谢组前处理
取-80℃储存的实蝇幼虫(3龄，10头，总重约160mg)，加入200μL提取液(氯仿:甲醇:水＝2:5:2)，置入组织破碎仪(TissueLyser II)破碎(30Hz，2min)；取出，加入800μL提取液(氯仿:甲醇:水＝2:5:2)，涡漩震荡30s，4℃放置20min，冷冻离心(4℃，16000g，15min)，取800μL上清液转入一新的EP管中；向残渣加入1mL色谱级甲醇，涡漩震荡30s，4℃放置20min，冷冻离心(4℃，16000g，15min)，取上清液1mL，与第1次的上清液混合；
取100μL提取液加入玻璃衍生小瓶，加入20μl内标水溶液(dulicitol,100ng/μL)，混合，氮气吹干，加入40μL的20mg/mL盐酸甲氧胺吡啶溶液，37℃震荡反应90min；加入40μL的BSTFA(含1％TMCS)的衍生试剂，70℃反应60min；取出衍生后的样本，室温放置30min，进行GC/MS代谢组学分析。
3.检疫性实蝇幼虫代谢组GC/MS分析
采用Agilent 7890A GC/5975C MS系统，毛细管色谱柱为Agilent J&WScientific公司的HP-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)。
仪器参数设定为：进样口温度280℃，EI离子源温度230℃，四极杆温度150℃，高纯氦气(纯度大于99.999％)作为载气，不分流进样，进样量1.0μL。升温程序为：初始温度60℃，维持2min，10℃/min的速度升至140℃，然后以4℃/min的速度升至240℃，最后以15℃/min的速度升至300℃，并维持8min。采用全扫描模式进行质谱检测，质谱检测范围为50-600(m/z)。采用随机顺序进行连续样本分析，避免因仪器信号波动而造成的影响，得到的质谱图如图1所示。
4.数据处理
应用R软件进行数据预处理，包括基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和质谱碎片归属分析，最后在EXCEL2007软件中进行后期编辑，包括来自于柱流失和样本制备造成的杂质峰的剔除和定量离子选择等，将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量(rt_mz，即保留时间_质荷比)、观察量(样本)和积分面积。然后将所有数据归一化到内标峰(即峰面积除以内标峰面积)。将编辑后的数据矩阵导入Simca-P软件(版本11.0)分别进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判别分析和正交偏最小二乘方判别分析。
5.主成分分析
首先对对照组与冷处理组样本进行主成分分析。在Simca-P软件中，数据均采用默认的UV格式化(Unit Variance Scaling)和平均中心化(Mean-Centered)处理，以获得更加可靠且更加直观的结果。软件自动对数据进行模型拟合分析，共获得3个主成分，R2X＝0.579。PCA得分图(Scores plot)如图2所示，所有样本均处于95％置信区间(HotellingT2ellipse)内。模型质量参数表明，当前PCA模型能很好地用于解释两组样本之间的代谢差异。我们可以观察到，对照组和冷处理组两组样本在PCA得分图上分别处于PC1(即横坐标t[1])的左右两侧，因此两组样本之间具有显著的代谢差异。
6.偏最小二乘方判别分析(PLS-DA)
采用PLS-DA这种监督的多维统计分析方法对对照和冷处理两组样本进行模型分析。通过PLS回归分析建立的相关性模型,监督模型解释率(R2Y)、模型预测能力(Q2)，理论上R2Y、Q2数值越接近1，说明模型越好，通常两者高于0.5(50％)时说明模型的拟合性较好。实验结果共获得2个主成分，累积R2Y＝0.991，Q2＝0.906，得分图如图3所示(横坐标为第1主成分得分，用t[1]表示，R2Y＝0.935；纵坐标为第2主成分得分，用t[2]表示，R2Y＝0.0561))。模型解释率(R2Y)和模型预测率均接近于1(最高值为1)，说明PLS-DA模型可以非常好地解释两组样本之间的差异，而且当前模型的预测率也非常高，是对未知样本进行预测的理想数学模型。图3表明对照组和冷处理组之间在得分图上具有显著的代谢谱分离，两组样本分别处于第1主成分(即t[1])的正负两侧，因此两组样本之间具有显著的代谢差异。
7.正交偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)
采用正交偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)过滤与模型分类不相关信号即正交信号，建立可靠的OPLS-DA模型。模型质量参数为：1个主成分(R2Y＝0.935)和1个正交成分(R2Y＝0.0561)，累积R2Y＝0.991，Q2＝0.867，说明模型质量非常好。OPLS-DA得分图如图4所示。过滤掉与分类不相关的噪音信号后，两组样本在PC1(即t[1]P)上具有很好的代谢谱分离，即两组样本分别处于主成分(PC1，即t[1]P)的正负两侧。对照组内的变异性显著大于冷处理组，表现为对照组内具有各样本之间具有更大的离散性。
通过以上统计学比较可知，检疫冷处理组与未经处理的对照组之间的代谢组学数据存在显著的差异，可通过将待检疫样品的代谢组学数据分别与检疫冷处理的阳性对照组和未经处理的阴性对照的代谢组学数据进行比较，当待检疫样品的代谢组学数据与检疫冷处理的阳性对照组之间没有显著性差异，并且待检疫样品的代谢组学数据与未经处理的阴性对照之间没有显著性差异时，判定待检疫样品为经历了检疫冷处理，否则判定其未经历检疫冷处理。并且可通过R2Y值和Q2值来判别比较模型的置信度，当R2Y值和Q2值大于0.5时，认为该判定可信。
8.差异性代谢物及其结构判别
由于过滤掉了不相关的正交信号，因而获得的差异性代谢物更加可靠。采用OPLS-DA模型第一主成分的VIP(Variable Importance in the Projection)值(阈值>1)，并结合t检验(t-test)的p值＜0.05来寻找差异性表达代谢物。差异性代谢物的定性方法为：搜索NIST商业数据库(比较质谱和色谱保留时间RT或保留指数RI)，以及采用标准物质数据比对确定。
因此，该发明方法可以将冷处理组与对照组之间的差异性分开，灵敏度和特异性高，代谢物达到41个，其中23个代谢物下降，18个代谢物上升(表2)，确认了冷处理组和对照组的代谢差异，可用于检疫性实蝇幼虫冷处理判别检测。在以后的检测中，只需要针对表2中的这41个代谢物进行以上代谢组学检测以及PLS-DA和OPLS-DA分析即可。
对照检疫性实蝇是否进行冷处理，判别的标准为VIP＞1，t-test检验P值＜0.05，且经PLS-DA和OPLS-DA分析后R2Y和Q2大于0.5,即认为该实蝇进行了冷处理。
表2.冷处理组与对照组之间的差异性代谢物
*冷处理组与对照组均值之比的对数值(以2为底)，正号表示冷处理组相对于对照组上升，负号表示下降。
实施例2.热处理
1.检疫性实蝇幼虫热处理
将实蝇幼虫裸虫放入含有保湿滤纸的培养皿中，置于35℃的控温箱中，保持5h。对照组幼虫为裸虫，置于25℃的恒温培养箱中，通过温度记录仪监测对照组和处理组的环境温度。然后用液氮将经冷处理的实蝇幼虫和对照组幼虫用液氮速冻，并储存于-80℃。
2.样本的代谢组前处理
取-80℃储存的实蝇幼虫(3龄，10头，总重约160mg)，加入200μL提取液(氯仿:甲醇:水＝2:5:2)，置入组织破碎仪(TissueLyser II)破碎(30Hz，2min)；取出，加入800μL提取液(氯仿:甲醇:水＝2:5:2)，涡漩震荡30s，4℃放置20min，冷冻离心(4℃，16000g，15min)，取800μL上清液转入一新的EP管中；向残渣加入1mL色谱级甲醇，涡漩震荡30s，4℃放置20min，冷冻离心(4℃，16000g，15min)，取上清液1mL，与第1次的上清液混合；
取100μL提取液加入玻璃衍生小瓶，加入20μl内标水溶液(dulicitol,100ng/μL)，混合，氮气吹干，加入40μL的20mg/mL盐酸甲氧胺吡啶溶液，37℃震荡反应90min；加入40μL的BSTFA(含1％TMCS)的衍生试剂，70℃反应60min；取出衍生后的样本，室温放置30min，进行GC/MS代谢组学分析。
3.检疫性实蝇幼虫代谢组GC/MS分析
采用Agilent 7890A GC/5975C MS系统，毛细管色谱柱为Agilent J&WScientific公司的HP-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)。
仪器参数设定为：进样口温度280℃，EI离子源温度230℃，四极杆温度150℃，高纯氦气(纯度大于99.999％)作为载气，不分流进样，进样量1.0μL。升温程序为：初始温度60℃，维持2min，10℃/min的速度升至140℃，然后以4℃/min的速度升至240℃，最后以15℃/min的速度升至300℃，并维持8min。采用全扫描模式进行质谱检测，质谱检测范围为50-600(m/z)。采用随机顺序进行连续样本分析，避免因仪器信号波动而造成的影响，得到的质谱图如图5所示。
4.数据处理
应用R软件进行数据预处理，包括基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和质谱碎片归属分析，最后在EXCEL2007软件中进行后期编辑，包括来自于柱流失和样本制备造成的杂质峰的剔除和定量离子选择等，将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量(rt_mz，即保留时间_质荷比)、观察量(样本)和积分面积。然后将所有数据归一化到内标峰(即峰面积除以内标峰面积)。将编辑后的数据矩阵导入Simca-P软件(版本11.0)分别进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判别分析和正交偏最小二乘方判别分析。
5.主成分分析
首先对热处理组与对照组样本进行主成分分析。在Simca-P软件中，数据均采用默认的UV格式化(Unit Variance Scaling)和平均中心化(Mean-Centered)处理，以获得更加可靠且更加直观的结果。软件自动对数据进行模型拟合分析，共获得2个主成分，模型累积解释率R2X＝0.44。PCA得分图(Scoresplot)如图6所示，所有样本均处于95％置信区间(Hotelling T2ellipse)内。一般来说R2X值大于0.4就表示该模型可靠，因此当前PCA模型能可靠地用于解释两组样本之间的代谢差异。我们可以观察到，对照组和热处理组分别处于PC1(t[1]表示)的正负两侧，因此，两组样本之间具有显著的代谢差异。我们同时可以观察到对照组中49号样本远离组内其它样本。
6.偏最小二乘方判别分析(PLS-DA)
采用PLS-DA这种监督的多维统计分析方法对这两组样本进行模型分析。共获得2个主成分，R2Y＝0.997，Q2＝0.835，得分图如图7所示(横坐标为第1主成分得分，用t[1]表示，R2Y＝0.978；纵坐标为第2主成分得分，用t[2]表示，R2Y＝0.0194)。R2Y(即监督模型的解释率)说明PLS-DA模型已经可以很好地解释两组样本之间的差异。图7表明两组样本之间具有显著的代谢差异。
6.正交偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)
为了消除与分类(如对照组和热处理组)不相关的噪音信息，同时也为了获得导致对照组和热处理组之间显著差异的更加可靠的代谢物信息，我们采用正交偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)过滤与模型分类不相关信号即正交信号，获得OPLS-DA模型。本分析共获得1个主成分(P，R2Y＝0.978)和1个正交成分(O,R2Y＝0.0193)，其模型质量参数为累积R2Y＝0.997，Q2＝0.881，得分图如图8所示。类似于PLS-DA模型结果，模型的解释率(R2Y)和预测率均非常高，表明当前的模型非常可靠。图8表明两组样本在OPLS-DA得分图上具有显著的代谢差异。
通过以上统计学比较可知，检疫冷处理组与未经处理的对照组之间的代谢组学数据存在显著的差异，可通过将待检疫样品的代谢组学数据分别与检疫冷处理的阳性对照组和未经处理的阴性对照的代谢组学数据进行比较，当待检疫样品的代谢组学数据与检疫冷处理的阳性对照组之间没有显著性差异，并且待检疫样品的代谢组学数据与未经处理的阴性对照之间没有显著性差异时，判定待检疫样品为经历了检疫冷处理，否则判定其未经过检疫冷处理。并且可通过R2Y值和Q2值来判别比较模型的置信度，当R2Y值和Q2值大于0.5时，认为该判定可信。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种实蝇幼虫检疫处理的代谢组学判别方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：对待检疫的实蝇幼虫样品进行代谢组学前操作，并将得到的实蝇幼虫样品进行代谢组学检测；
S2：将S1得到的检测数据进行数据处理分析，得到样品数据；
S3：将S2得到的样品数据与阴性对照数据和阳性对照数据进行统计学比较，如果所述样品数据与所述阳性对照数据的比较结果为无显著差异，并且与所述阴性对照数据的比较结果为差异显著，则判定所述待检疫的实蝇幼虫进行了检疫处理；否则，判定所述待检疫的实蝇幼虫未进行检疫处理。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述代谢组学检测通过GC/MS检测来进行。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S1包括以下步骤：
S1.1：提取总代谢物，得到总代谢物提取液；
S1.2：向所述总代谢物提取液中添加内标；
S1.3：吹干，加入甲基化试剂进行甲基化；
S1.4：加入烷基化试剂进行烷基化；
S1.5：进行GC/MS检测。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中得到样品数据包含以下数据：保留时间、质荷比、观察量和积分面积。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阴性对照数据为从正常生长的实蝇幼虫得到的代谢组学检测数据，并且所述阳性对照数据为从检疫处理的实蝇幼虫得到的代谢组学检测数据。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S3中所述统计学比较为主成分分析、偏最小二乘方-判别分析和正交偏最小二乘方-判别分析。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，S3包括以下步骤：
S3.1：将所述样品数据与阳性对照数据进行主成分分析，当结果大于1时，判定所述待检疫的实蝇幼虫样品未经检疫处理，当结果等于1时，将所述样品数据与所述对照数据进行主成分分析；
S3.2：当所述样品数据与所述对照数据的主成分分析结果等于1时，判定所述待检疫的实蝇幼虫样品未经检疫处理，当结果大于1并且t检验p值小于0.05时，进行偏最小二乘方-判别分析；
S3.2：当偏最小二乘方-判别分析结果为无显著差异时，则判定所述待检疫的实蝇幼虫未经检疫处理，当分析结果为差异显著时，则进行正交偏最小二乘方-判别分析；
S3.3：当所述正交偏最小二乘方-判别分析结果为无显著差异时，则判定所述待检疫的实蝇幼虫未经历检疫处理，当分析结果为差异显著时，则判定所述待检疫的实蝇幼虫经历了检疫处理。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述偏最小二乘方-判别分析和正交偏最小二乘方-判别分析中还使用R2Y值和Q2值判定分析结果的置信度，当R2Y值和Q2值均大于0.5时，认为该判定可信。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述检疫处理为检疫冷处理或检疫热处理。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述实蝇为桔小实蝇、地中海实蝇、番石榴实蝇或木瓜实蝇。
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