CN106093428A - 一种鉴别实蝇是否经过检疫辐照处理的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种鉴别实蝇是否经过检疫辐照处理的方法,所述方法包括如下步骤:(a)从待检实蝇样品中提取总蛋白;(b)检测步骤(a)所得蛋白样品中γH2A含量以判断待检实蝇样品是否经过检疫辐照处理;当γH2A含量较未经辐照处理的实蝇增加时,表明待检实蝇样品经过检疫辐照处理。本发明所述方法具有准确性高,重复性好,不受个体差异影响等优点。

Description

一种鉴别实蝇是否经过检疫辐照处理的方法
技术领域
本发明涉及一种鉴别实蝇是否经过检疫辐照处理的方法,属于检疫学领域。
背景技术
全球经济一体化、国际贸易形式多样化和世界政治经济格局的不断变化导致外来有害生物入侵的频率加大,对生态环境、农业生产和粮食安全构成巨大的潜在威胁。全球气候变化更进一步导致生态灾难频发,给世界各国造成重大经济损失。因此,如何有效防控外来有害生物入侵,已经成为全世界关注的焦点和热点。
为保证有害生物不随国际贸易传播,根据国际惯例,在国际贸易中必须对可能携带有害生物的产品实施检疫处理措施。由于产品的特殊性,水果蔬菜、种苗花卉等鲜活植物产品携带有害生物的风险极高,因而是国际社会和各国检疫部门关注的焦点。
传统对于水果蔬菜、种苗花卉等鲜活植物产品的处理技术主要以熏蒸处理为主。熏蒸处理是指借助于熏蒸剂气体,在可以密闭的空间内经过一定时间将有害生物杀灭的技术或方法。使用熏蒸剂溴甲烷进行熏蒸是国际上最为通用的处理技术,但是由于溴甲烷对臭氧层的破坏作用,根据《蒙特利尔议定书》,必须逐步淘汰。为此,国际社会开发了辐照处理技术作为溴甲烷熏蒸的替代技术。
辐照处理是使用高能射线导致有害昆虫不育的处理技术。辐照处理技术可以使用钴源释放的伽马射线、高能X光或高能电子束作为能源,使用的剂量范围一般为100-300GY,具有清洁、快速、适用于冷藏水果等特点。目前,辐照处理技术在实蝇的检疫处理中的研究和应用最为成熟,国际植物保护公约组织(IPPC)颁布了多种实蝇辐照处理剂量的国际标准,并正在审议将150GY作为实蝇辐照处理的通用剂量。
辐照处理常常采用阻止害虫发育和繁殖作为控制目标,因此,与其他处理方法的最大区别就是处理后有害生物仍继续存活,常常能在口岸检疫查验过程中发现活虫。为了保证检疫处理的生物安全,需要确定害虫是否经过辐照处理,以及是否被处理了足够剂量,因此,需要开展有害生物辐照后的检测技术研究。
目前对于辐照后昆虫的检测,还处于技术研究层面,缺乏较为成熟的可应用技术。一些研究发现部分昆虫在辐照后会发生食道神经节缩小、体表变黑等形态学变化,或其精子结构、线粒体结构等会发生变化,可据此判断昆虫是否经过辐照处理。但这些组织形态学变化通常存在较大个体差异,很难在实际应用。
综上所述,随着全球经济一体化进程的加快,外来有害生物防控受到国际社会的普遍关注。辐照处理技术由于清洁高效,具有广阔应用前景,但还需解决辐照昆虫检测问题。现有一些检测技术存在个体差异大、重复性差等问题,急需开发方便快捷的辐照昆虫检测技术。
发明内容
为解决上述问题,本发明的主要目的在于提供一种鉴别实蝇是否经过检疫辐照处理的方法,该方法准确性高,重复性好,不受个体差异影响。
为实现上述目的,本发明提供一种鉴别实蝇是否经过检疫辐照处理的方法,所述方法包括如下步骤:
(a)从待检实蝇样品中提取总蛋白;
(b)检测步骤(a)所得蛋白样品中γH2A含量以判断待检实蝇样品是否经过检疫辐照处理;
当γH2A含量较未经辐照处理的实蝇增加时,表明待检实蝇样品经过检疫辐照处理。
本发明中所述“增加”通常是指与对照的未经辐照处理的实蝇样品比较,有显著性差异,显著性差异一方面可以通过肉眼观察得出,另一方面可以将western结果扫描黑度值,使用统计分析的方法得出。
本发明通过实验验证表明γH2A能作为辐照昆虫检测的生物标志物,使用γH2A的抗体通过免疫反应可实现对辐照昆虫的检测。由于本发明采用的是γH2A作为标志物,因而其具有准确性高,重复性好,且不受个体差异影响等优点。
作为本发明的一具体实施方式,在本发明所述方法中,在步骤(a)之后还包括对所述总蛋白中的组蛋白进行纯化;步骤(b)是对纯化后的蛋白样品进行检测。
本发明通过实验表明虽然使用总蛋白可以检测到γH2A在辐照后的幼虫中增加,但信号较弱,且有干扰条带,而使用纯化后的组蛋白进行检测,信号更强,背景更清晰,提高了检测的灵敏度。
本发明中所述“对所述总蛋白中的组蛋白进行纯化”采用现有技术即可实现。
作为本发明的一具体实施方式,本发明所述步骤(b)中所述检测为采用抗γH2A抗体进行检测。例如,所述抗γH2A抗体为抗γH2A的多克隆抗体。在本发明的一具体实施例中,本发明使用的抗体为组蛋白H2AvD pS137抗体(Histone H2AvD pS137Antibody,Rockland)。需要说明的是,虽然本案仅给出了一种抗体,但本领域技术人员应当知晓任一可检侧γH2A的抗体均可应用于本发明。
作为本发明的一具体实施方式,在本发明所述方法中,所述辐射的剂量为40GY以上,优选地,所述辐射剂量为40~400GY;更优先地,所述辐射的剂量为150GY。本发明通过实验证明γH2A对辐照处理较为敏感,40GY辐照后就可以检测到表达,并且以γH2A/Actin相对表达量(%)为纵坐标,以辐照强度为横坐标,拟合得曲线y=0.243x+0.083,R2=0.990,在40~400GY范围内,γH2A的表达与辐照剂量呈线性关系。
本发明中辐照的剂量单位为GY,其为辐照强度(剂量率)与辐照时间的乘积。具体辐照时,是先测定好距离辐照源不同远近位置的剂量率,计算好应辐照的时间,之后把样品放在那个位置,辐照处理指定时间,完成辐照。
作为本发明的一具体实施方式,在本发明所述方法中,
所述实蝇包括桔小实蝇、昆士兰实蝇、地中海实蝇、茄实蝇、橄榄实蝇和瓜实蝇中的一种或多种。
特别地,本发明所述桔小实蝇包括桔小实蝇幼虫;所述昆士兰实蝇包括昆士兰实蝇幼虫;所述地中海实蝇包括地中海实蝇幼虫;所述茄实蝇包括茄实蝇幼虫;所述橄榄实蝇包括橄榄实蝇幼虫;所述瓜实蝇包括瓜实蝇幼虫。
作为本发明的一具体实施方式,其中,所述实蝇为桔小实蝇幼虫。
虽然本发明具体实施例仅以桔小实蝇幼虫为例进行了具体说明,但需要指出的是组蛋白H2A在昆虫中极为保守,具体地,分析对比黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、昆士兰实蝇(Bactroceratryoni)、地中海实蝇(Ceratitiscapitata)、桔小实蝇(Bactroceradorsalis)、茄实蝇(Bactroceralatifrons)、橄榄实蝇(Bactroceraoleae)、瓜实蝇(Bactrocera cucurbitae)组蛋白H2A的蛋白质序列(如图1所示)可以发现组蛋白H2A在昆虫中极为保守,一致度高达96%,因而,本领域人员可以预见当上述蝇虫经检疫辐照处理后,同样地,其γH2A含量也应较未经辐照处理的蝇增加。因而,根据本发明的原理,本领域技术人员应当知晓本发明所述方法可应用于的蝇包括但不限于桔小实蝇、黑腹果蝇、昆士兰实蝇、地中海实蝇、茄实蝇、橄榄实蝇、瓜实蝇中的一种或多种。
另一方面,本发明提供一种防控外来实蝇入侵的方法,所述方法包括利用本发明所述方法的结果。
总体而言,本发明提供了一种鉴别实蝇是否经过检疫辐照处理的方法,该方法准确性高,重复性好,不受个体差异影响。
附图说明
图1为黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、昆士兰实蝇(Bactroceratryoni)、地中海实蝇(Ceratitiscapitata)桔小实蝇(Bactrocera dorsalis)茄实蝇(Bactroceralatifrons)橄榄实蝇(Bactroceraoleae)瓜实蝇(Bactrocera cucurbitae)组蛋白H2A的蛋白质序列比较图。
图2为实施例1使用全蛋白检测的实验结果图。
图3为实施例2使用纯化后的组蛋白检测的实验结果图。
图4为实施例3使用不同辐射剂量后检测的实验结果图。
图5为实施例3以γH2A/肌动蛋白(Actin)相对表达量(%)为纵坐标,以辐照强度为横坐标拟合得到的曲线。
图6为实施例4所得实验结果图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解,现结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进行以下详细说明,应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中,各原始试剂材料均可商购获得,未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件,或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例1
本实施例使用桔小实蝇幼虫的全蛋白进行了检测。检测程序如下:将-80℃冻存的辐照组(辐照剂量为150GY)及对照组(未经辐照)桔小实蝇幼虫置于室温下5分钟后,使用冷的1×TBS溶液(50mM tris,150mM NaCl,pH8.0)洗净,5头幼虫在1ml添加有蛋白酶抑制剂的冷的RIPA裂解液中研磨,4℃300×g离心5分钟,收集上清部分,为幼虫总蛋白。总蛋白样品定量后在-20℃冻存。
使用Western程序检测γH2A,具体程序如下:使用幼虫总蛋白在变性后进行SDS-PAGE电泳,每孔上样200微克,电泳后转膜,转膜完毕后,立即把蛋白膜放置到5%脱脂牛奶中,室温轻摇,封闭1小时。封闭结束后,按1:500将磷酸化组蛋白H2A的多克隆抗体(HistoneH2AvD pS137Antibody,Rockland)加入5%脱脂牛奶中。轻摇,4℃过夜。结束后用TBST洗涤5分钟,共洗涤3次。结束后将辣过氧化物酶标记的二抗加入5%脱脂牛奶。室温轻摇1h,结束后用TBST洗涤5分钟,共洗涤4次。结束后通过化学发光法获得检测结果。所得结果如图2所示(图2中“-”表示未经辐照的桔小实蝇幼虫,“+”表示经150GY辐照后的桔小实蝇幼虫,肌动蛋白为内参),从图2中可以看出,使用总蛋白可以检测到γH2A在辐照后的幼虫中增加(图2中箭头所指条),但信号较弱,且有干扰条带。
实施例2
本实施例改进了样品前处理程序,首先在实施例1的基础上纯化了桔小实蝇幼虫的组蛋白,再每孔使用2μg组蛋白,参照实施例1同样的Western程序进行了检测。
组蛋白纯化程序如下:桔小实蝇幼虫先使用TBS溶液清洗后,每5头幼虫置于添加有蛋白酶抑制剂的3ml低渗裂解液(10mM pH8.0Tris-HCl,1mM KCl,1.5mM MgCl2,1mM DDT)中,研磨裂解后,使用100um的尼龙膜过滤,在4℃轻摇30min,4℃15000×g离心10min,沉淀物使用400μl 0.8M H2SO4震荡重悬,直至完全溶解。4℃轻摇过夜,4℃15000×g离心10min,上清液使用33%的TCA4℃沉淀过夜,4℃15000×g离心10min,使用1ml冷的丙酮溶液清洗沉淀物3次,室温干燥沉淀物,溶解于150μl纯净水中,定量后-20℃冻存。
后续步骤参照实施例1同样的Western程序进行检测,每孔使用2μg组蛋白。所得结果如图3所示(图3中“-”表示未经辐照的桔小实蝇幼虫,“+”表示经150GY辐照后的桔小实蝇幼虫,肌动蛋白为内参),从图3中可以看出,使用纯化后的组蛋白进行检测,信号更强,背景更清晰,提高了检测的灵敏度。检测结果表明,辐照处理后,桔小实蝇体内的γH2A有明显增加,表明使用该方法可有效检测辐照后的桔小实蝇幼虫。
实施例3
为了研究γH2A与辐照剂量间是否存在响应规律,本实施例分别使用40、80、120、160、240、320和400GY对桔小实蝇幼虫进行了辐照处理,按实施例2相同的方法检测了各个样品中γH2A的表达情况。所得结果如图4所示(图4中40、80、120、160、240、320、400分别代表辐照剂量,肌动蛋白为内参),从图4中可以看出γH2A对辐照处理较为敏感,40GY辐照后就可以检测到表达,以γH2A/肌动蛋白(Actin)相对表达量(%)为纵坐标,以辐照强度为横坐标,拟合得曲线如图5所示,所得曲线方程为:y=0.243x+0.083,R2=0.990,在40~400GY范围内,γH2A的表达与辐照剂量呈线性关系。
实施例4 对脐橙中辐照桔小实蝇幼虫的检测。
将市场购置的脐橙置于桔小实蝇饲养室中自然接种,常温下放置4天待实蝇发育至幼虫阶段后,使用钴源辐照,经测定,辐照剂量为142GY。辐照2天后,分别从处理组脐橙和未处理组脐橙中剥出桔小实蝇幼虫,按实施例2相同的方法纯化组蛋白后,并且按实施例2相同的方法进行检测,所得结果如图6所示(图6中“-”表示未经辐照的桔小实蝇幼虫,“+”表示经142GY辐照后的桔小实蝇幼虫,肌动蛋白为内参),从图6中可以看出可以很清晰的区别处理组和对照组实蝇。
最后说明的是:以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点,而非限制本发明的技术方案,尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解:依然可以对本发明进行修改或者等同替换,而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换,均应涵盖在本发明的保护范围当中。

Claims (10)

1.一种鉴别实蝇是否经过检疫辐照处理的方法,所述方法包括如下步骤:
(a)从待检实蝇样品中提取总蛋白;
(b)检测步骤(a)所得蛋白样品中γH2A含量以判断待检实蝇样品是否经过检疫辐照处理;
当γH2A含量较未经检疫辐照处理的实蝇增加时,表明待检实蝇样品经过辐照处理。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,在步骤(a)之后还包括对所述总蛋白中的组蛋白进行纯化;步骤(b)是对纯化后的蛋白样品进行检测。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,步骤(b)中所述检测为采用抗γH2A抗体进行检测。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,所述抗γH2A抗体为抗γH2A的多克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,所述检疫辐照处理的剂量为40GY以上,优选地,所述检疫辐照处理的剂量为40~400GY。
6.根据权利要求5所述的方法,其中,所述检疫辐照处理的剂量为150GY。
7.根据权利要求1所述的方法,其中,
所述实蝇包括桔小实蝇、昆士兰实蝇、地中海实蝇、茄实蝇、橄榄实蝇和瓜实蝇中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的方法,其中,所述桔小实蝇包括桔小实蝇幼虫;所述昆士兰实蝇包括昆士兰实蝇幼虫;所述地中海实蝇包括地中海实蝇幼虫;所述茄实蝇包括茄实蝇幼虫;所述橄榄实蝇包括橄榄实蝇幼虫;所述瓜实蝇包括瓜实蝇幼虫。
9.根据权利要求1所述的方法,其中,所述实蝇为桔小实蝇幼虫。
10.一种防控外来实蝇入侵的方法,所述方法包括利用权利要求1~9中任一项所述方法的结果。
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