CN104521926A - 一种鉴别桔小实蝇辐照与否的技术方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种辐照处理桔小实蝇的方法：以40－160 Gy 剂量的⁶⁰Coγ射线辐照桔小实蝇卵、1龄、2龄幼虫；或者用160 Gy 以上剂量的⁶⁰Coγ射线辐照桔小实蝇3龄幼虫，同时本发明还公开了一种鉴别桔小实蝇是否经达标的辐照处理的方法：采集被检测植物或水果上的桔小实蝇活虫以检测其酚氧化酶、超氧化物歧化酶或/和乙酰胆碱酯酶酶活性，如果酚氧化酶酶活性为对照的80%以下、超氧化物歧化酶酶活性为对照的85%以下或/和乙酰胆碱酯酶酶活性低于对照，那么就可以确定幼虫是经过辐照处理。本发明通过测定酚氧化酶、超氧化物歧化酶（SOD）或/和乙酰胆碱酯酶（AChE）这三种酶活性，能够明确桔小实蝇是否经过辐照，及辐照时处于的虫期，该方法非常灵敏可靠，针对进口水果截获虫量少的特点，鉴定时只需一条虫。

Description

一种鉴别桔小实蝇辐照与否的技术方法

技术领域

本发明涉及一种鉴别桔小实蝇辐照与否的方法，属于植物虫害检测领域，具体涉及检验检疫技术。

背景技术

辐照检疫技术通过辐照杀死害虫或使检疫害虫的卵或幼虫不羽化来达到检疫的目的。新鲜水果和蔬菜在辐照之前很可能被卵期或幼虫期的害虫所侵染。在推荐的检疫剂量下辐照可以满足新鲜水果或蔬菜的检疫要求，但不能立即杀死检疫害虫(卵或幼虫形式)，因此很可能在辐照检疫处理的产品中发现无繁殖能力活检疫幼虫。20世纪90年代以来，人们一直在开发鉴定辐照产品中幼虫确实经过辐照处理的方法，确保辐照检疫技术的效果和避免检疫害虫对当地农业杀虫的危害。Nation等(1995)建议用辐照后的加勒比海实蝇多酚氧化酶活性的降低作为鉴定辐照的一种方法。他们发现20Gy辐照晚期的卵或幼龄的幼虫，可以很明显的减少3龄幼虫体内酚氧化酶的活性。Mansour等(1996)也观察到辐照对地中海实蝇也有类似的影响，肯定了40Gy辐照地中海实蝇的卵和幼虫可以更多的减少酚氧化酶在3龄幼虫体内的形成。辐照处理后，根据虫体是否变黑也可作为判断虫体是否经过辐照。辐照后幼虫虫体不能变黑。Nation等(1995)；Mansour等(1996)指出利用此法可判断加勒比实蝇、地中海实蝇幼虫是否经过了辐照处理。

昆虫种类不同，辐照后对酶的反应也不同，因此桔小实蝇辐照后酚氧化酶是否降低，及虫体是否黑化需经进一步试验验证。昆虫辐照后，由于射线作用使水分子产生自由基HO·，HO·再作用于DNA，使其产生损伤。由于超氧化物歧化酶(SOD)为生物体的保护酶，对消除昆虫体内过量的氧自由基,对抵御低温、光活化毒素等逆境因子起主要作用。昆虫辐照后抑制它的发育，乙酰胆碱酯酶(AChE)参与细胞的发育和成熟，能促进神经元发育和再生。同时辐照对昆虫超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰胆碱酯酶(AChE)的影响还未见过相关的研究报道。本发明方法通过测定这三种酶活性，能够明确桔小实蝇是否经过辐照，及辐照时处于的虫期。由于我省等南方地区是桔小实蝇疫区，因此果蔬外销受到检疫限制，因此解决此问题具有重要意义。

发明内容

辐照是应用于水果和蔬菜的一种新的检疫处理方法，但辐照不能阻止桔小实蝇卵或者幼虫发育到蛹阶段。因此本发明提供一种方法鉴别进口水果中发现活的幼虫是否能继续发育到具有繁殖能力的成虫，该方法通过测定酚氧化酶、超氧化物歧化酶(SOD)或/和乙酰胆碱酯酶(AChE)这三种酶活性，能够明确桔小实蝇是否经过辐照，及辐照时处于的虫期，该方法非常灵敏可靠，针对进口水果截获虫量少的特点，鉴定时只需一条虫。

本发明提供的技术方案是：一种辐照处理桔小实蝇的方法，该方法以40－160Gy剂量的⁶⁰Coγ射线辐照桔小实蝇卵、1龄、2龄幼虫；或者用160Gy以上剂量的⁶⁰Coγ射线辐照桔小实蝇3龄幼虫。

进一步地，所述的方法，以80－160Gy剂量的⁶⁰Coγ射线辐照桔小实蝇卵、1龄、2龄幼虫；或者用160Gy以上剂量的⁶⁰Coγ射线辐照桔小实蝇3龄幼虫；或者用160Gy以上剂量的⁶⁰Coγ射线辐照桔小实蝇卵、1龄、2龄、3龄幼虫。

本发明提供一种鉴别桔小实蝇是否经达标的辐照处理的方法，该方法是采集被检测植物或水果上的桔小实蝇活虫以检测其酚氧化酶、超氧化物歧化酶或/和乙酰胆碱酯酶酶活性，如果酚氧化酶酶活性为对照80％以下，则确定幼虫是经过辐照处理；或者超氧化物歧化酶酶活性为对照85％以下，则确定幼虫是经过辐照处理；或者乙酰胆碱酯酶酶活性低于对照，则确定幼虫是经过辐照处理。更优选地，如果酚氧化酶酶活性为对照80％以下、超氧化物歧化酶酶活性为对照85％以下则确定幼虫是经过辐照处理。再优选地，如果酚氧化酶酶活性为对照80％以下、超氧化物歧化酶酶活性为对照85％以下，并且乙酰胆碱酯酶酶活性低于对照，则确定幼虫是经过辐照处理。

所述的的方法，进一步检测被检测蔬菜或水果上的桔小实蝇幼虫是否能够黑化，将发现的活虫放入-18℃冰箱急冻后，确定虫体死亡后，将虫体拿出放入室温下，1h后观察，如果虫体呈黄白色，如果没有变黑色，可以确定幼虫经过辐照处理；如果黑化表明没有经辐照处理。

本发明具有以下有益效果：

由于出口水果要求品质高且没有感染有害生物的水果，才进行辐照除害处理，被卵和1、2龄幼虫感染的水果不易被发现，但3龄幼虫已引起水果腐烂，在挑选水果时，很易将其挑出。如果辐照水果剂量高于80Gy，将口岸发现的活虫经冰箱冷冻后或活虫直接进行研磨提取酶液进行测定酚氧化酶活性，如果酚氧化酶活性为对照80％以下，那么就可以确定幼虫经过辐照的；将口岸发现的活虫经冰箱冷冻后或活虫直接进行研磨提取酶液进行测定超氧化物歧化酶活性，如果酶活性为对照85％以下，亦可以确定幼虫经过辐照处理；将口岸发现的活虫经冰箱冷冻后或活虫直接进行研磨提取酶液进行测定乙酰胆碱酯酶酶活性，如果酶活性为对照1.0以下，亦可确定桔小实蝇幼虫经过辐照处理，同时易可确定产品辐照时桔小实蝇为卵或1龄幼虫；或将口岸发现的活虫放入-18℃冰箱急冻后，确定虫体死亡后，将幼虫拿出放入室温下，1h后观察，如果虫体黄白色，没有变黑色，亦可以确定幼虫经过辐照处理。因此，通过测定酚氧化酶活性、超氧化物歧化酶活性、乙酰胆碱酯酶活性或虫体的黑化情况能鉴定桔小实蝇实蝇幼虫辐照与否，而且该方法非常灵敏可靠，针对进口水果截获虫量少的特点，鉴定时只需一条虫，不需专业人员，也较适合在实地实用，尤其在水果检疫现场发现了实蝇科的检疫性有害生物，就可快速鉴定该幼虫是否经过辐照处理，为了适应快速通关的要求，上述方法非常简单实用。

附图说明

图1不同剂量辐照桔小实蝇卵培养至3龄末后虫体外观的比较。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

1.供试昆虫

桔小实蝇采自广州郊区的番石榴果园，用人工饲料培养至第4代。

早上9：00至10：00采卵1小时后，取出放入恒温(27℃)恒湿(相对湿度75％)培养箱内培养至辐照的龄期，到华南农业大学辐照中心用⁶⁰Co-γ射线辐照，辐照后继续放入恒温(27℃)恒湿(相对湿度75％)人工气候箱内培养，进一步发育至5日龄3龄幼虫(即幼虫的第7天)后，均在上午10点，采集对照和处理组的幼虫用于黑化观察和酶液制备。每组处理每次取1头幼虫，重复10次。

因1龄幼虫太小，测不出酶活性，因此从2龄虫开始测酶活性。

2.供试药剂

碘化硫代乙酰胆碱(Acetylthiocholine iodide,ATch)、5，5′－二硫双硝基苯甲酸(5，5′－Dithiobis，DTNB)和毒扁豆碱(Eserine)购自Fluka；曲拉通(Triton X-100)购自北京鼎国生物技术有限责任公司，Genview分装；邻苯二酚购自天津化学试剂公司；氯化硝基四氮唑蓝(NBT)购自上海前进化学试剂厂；核黄素和L-甲硫氨酸(MET)购自上海伯奥生物科技有限公司；其他试剂购自广州化学试剂厂。

3.测定方法

酶液制备：

酚氧化酶、超氧化物歧化酶的酶液提取方法是将采集的幼虫放入1.5ml离心管中，加入少量石英砂，按每1头幼虫加入0.20mL缓冲液的剂量，加入预冷的pH为7.0、浓度为0.1mol/L的PBS液，在冰浴条件下研磨，所得匀浆于16500×g离心10min。其上清液0.1ml为待测的酶液。10次重复。

乙酰胆碱酯酶酶液的提取，研磨时用预冷的pH为7.8、浓度为0.1mol/L含0.3％曲拉通(W/V)的PBS液，其它条件同上。

酶活性测定：

(1)酚氧化酶活性测定

参照Benjamin和Montgomery方法进行(Benjamin N D and Montgomery M W，1973)。

反应体系中含有0.05mol/L pH6.8的磷酸缓冲液、0.2mol/L的邻苯二酚和0.1ml酶液。于30℃反应30min后测其OD₄₂₀值。10次重复

(2)超氧化物歧化酶活性测定

参照NBT法进行(Beauchamp&Fridovich，1971；Malecka et al，2001)。

反应体系中含有80μmol/L的核黄素、77μmol/L的NBT、13mmol/L的MET、0.1mmol/L的EDTA和0.1ml酶液。于4000lx下光照5min后，遮光停止反应，测定OD₅₆₀，并测定酶液的蛋白质含量。10次重复。

(3)乙酰胆碱酯酶活性测定

参照Gorun改进的Ellman方法(Gorun V，1978)。

反应体系中含有10mmol/L的碘化硫代乙酰胆碱、0.1mol/L pH7.8的磷酸缓冲液和0.1ml酶液。于30℃反应15min后在每管中加入0.3mL 1mmol/L毒扁豆碱和0.2mLDTNB。混合后，在30min内测其OD₄₁₂值。10次重复。

4.数据分析

试验数据分析采用Excel(MS Office 2003版)和DPS数据处理系统(Data ProcessingSystem)11.50专业版进行统计与分析。

实施例1辐照桔小实蝇卵和各龄幼虫后对其酚氧化酶活性的影响

测定γ射线辐照桔小实蝇卵后和各龄幼虫对其酚氧化酶活活性影响，结果见表1、表2、表3。

表1 γ射线辐照桔小实蝇24小时卵后对其2-7天幼虫体内酚氧化酶(OD₄₂₀值)酶活性影响

注：表中数据为平均数±标准误。同列数据后不同字母表示在p＝0.05水平上存在差异(DMRT)；下表相同。

由表1可知，正常桔小实蝇的幼虫体内的酚氧化酶酶活性随龄期增加逐渐增强，在幼虫的第4天酶活性升高显著。辐照桔小实蝇24小时卵孵化后的幼虫，酶活性较对照降低，随剂量增加酶活性降低更加显著。因2龄幼虫较小，酶活性均较低。3龄后酚氧化酶活性显著升高，但辐照后的桔小实蝇卵孵化后的3龄幼虫，酚氧化酶酶活性较对照显著降低。160Gy辐照的桔小实蝇24小时卵孵化的3、4、5、7日龄幼虫体内的酚氧化酶的OD值分别为对照的13.54％、14.77％、18.61％、17.55％。

表2 γ射线辐照桔小实蝇不同发育阶段后对其5日龄3龄幼虫体内酚氧化酶(OD值)活性的影响

表3 γ射线辐照桔小实蝇不同发育阶段后对其5日龄3龄幼虫体内酚氧化酶(OD值)处理比对照的比率

由表2、3可知，辐照桔小实蝇的卵和各龄期不同天数的桔小实蝇幼虫，其5日龄幼虫体内的酚氧化酶酶活性较对照降低。辐照时虫龄越低，酶活性降的越低。10Gy辐照1龄、2龄、3龄幼虫其5日龄3龄幼虫体内的酚氧化酶酶OD值变化与对照不明显。80、160Gy辐照的的各龄期幼虫其5日龄3龄幼虫体内的酚氧化酶酶OD值与对照差异显著。160Gy辐照的卵和1、2、3、5日龄幼虫其5日龄幼虫体内的酚氧化酶酶的OD值分别为对照的17.55％、25.36％、28.59％、61.73％、73.02％。

实施例2辐照桔小实蝇卵和各龄幼虫后对其超氧化物歧化酶活性的影响

测定辐照桔小实蝇卵和各龄幼虫后对其超氧化物歧化酶活性的影响，结果见表4-6。

表4 γ射线辐照桔小实蝇24小时卵后对其2-7天幼虫体内超氧化物歧化酶(OD值)活性的影响

由表4可知，正常桔小实蝇的幼虫体内的超氧化物歧化酶酶活性随龄期增加逐渐增强，在幼虫第3天酶活性升高较显著。辐照桔小实蝇24小时的卵孵化后的幼虫，超氧化物歧化酶酶活性较对照降低，随剂量增加酶活性降低更加显著，但酶活性随虫龄的增大而逐渐恢复，差异不非常显著。20、40、80、160Gy辐照后的桔小实蝇卵孵化后的第2至第4天幼虫，超氧化物歧化酶酶活性与对照差异显著。160Gy辐照后的桔小实蝇卵孵化后第5、第7天幼虫，超氧化物歧化酶酶活性与对照差异显著。160Gy辐照的桔小实蝇24小时卵孵化的2、3、4、5、7日龄幼虫体内的超氧化物歧化酶的OD值分别为对照的46.95％、61.66％、64.51％、81.69％、78.24％。

表5 γ射线辐照桔小实蝇不同发育阶段后对其5日龄3龄幼虫体内超氧化物歧化酶(OD值)活性的影响

表6 γ射线辐照桔小实蝇不同发育阶段后对其5日龄3龄幼虫体内超氧化物歧化酶(OD值)处理比对照的比率

由表5、6可知，辐照桔小实蝇的卵和各龄期不同天数的桔小实蝇幼虫，其5日龄3龄幼虫体内的超氧化物歧化酶酶活性较对照降低。辐照时虫龄越低，酶活性降的越低。10、20、40Gy辐照卵、1龄、2龄、3龄幼虫其5日龄3龄幼虫体内的超氧化物歧化酶酶OD值变化与对照差异不明显。80、160Gy辐照的的卵和各龄期幼虫其5日龄3龄幼虫体内的超氧化物歧化酶酶OD值与对照差异显著。160Gy辐照的卵和不同天数的幼虫其5日龄3龄幼虫体内的超氧化物歧化酶酶的OD值分别为对照的78.27％、72.78％、72.76％、87.73％、95.06％。

辐照后对昆虫体内超氧化物歧化酶活性影响，还未见到相关的文献报道，本发明表明80Gy剂量辐照桔小实蝇卵、各龄期幼虫后，能显著抑制3龄老熟幼虫体内的超氧化物歧化酶活性。桔小实蝇的卵和1龄幼虫较2龄、3龄幼虫敏感，10Gy辐照桔小实蝇卵和1龄幼虫后，减少了超氧化物歧化酶在3龄幼虫体内的形成。10Gy辐照桔小实蝇2龄和3龄幼虫后，增加了其老熟幼虫体内的超氧化物歧化酶活性，表明辐照后，体内的氧自由基升高，诱导了超氧化物歧化酶活性，清除体内的氧自由基。80Gy、160Gy辐照桔小实蝇的1龄、2龄、3龄初幼虫后，桔小实蝇体内的超氧化物歧化酶活性较对照显著降低，因此可以通过测定超氧化物歧化酶活性鉴别桔小实蝇是否经过辐照处理。

实施例3辐照桔小实蝇卵和各龄幼虫后对其乙酰胆碱酯酶活性的影响

测定辐照桔小实蝇卵和各龄幼虫后对其乙酰胆碱酯酶活性的影响，结果见表7-9。

表7 γ射线辐照桔小实蝇24小时卵后对其2-7天幼虫体内乙酰胆碱酯酶(OD值)活性的影响

由表7可知，，正常桔小实蝇的幼虫体内的乙酰胆碱酯酶活性随龄期增加逐渐增强，尤其幼虫在第7天酶活性升高非常显著。辐照桔小实蝇24小时的卵孵化后的幼虫，乙酰胆碱酯酶酶活性变化较复杂，2龄幼虫酶活性较对照升高，剂量越低，酶OD值越高；第3天幼虫，10Gy辐照的卵孵化的幼虫乙酰胆碱酯酶酶OD值升高为对照的3.1倍，差异显著，20、40、80、160Gy辐照的卵孵化的幼虫乙酰胆碱酯酶酶OD值与对照差异不显著。第4天幼虫，对照的乙酰胆碱酯酶酶OD值显著升高，10、20、40、80Gy辐照的卵孵化的幼虫的乙酰胆碱酯酶酶OD值与对照差异不显著，但160Gy辐照卵孵化幼虫的乙酰胆碱酯酶酶OD值较对照显著降低，为对照的82.93％。第5天幼虫，10、20、40、80Gy辐照的卵孵化的幼虫的乙酰胆碱酯酶酶OD值与对照差异不显著，但160Gy辐照卵孵化幼虫的乙酰胆碱酯酶酶OD值较对照显著降低，为对照的75.82％。第7天幼虫，10、20、40Gy辐照卵孵化幼虫的乙酰胆碱酯酶酶OD值与对照差异不显著，80、160Gy辐照卵孵化的幼虫的乙酰胆碱酯酶酶OD值较对照显著降低，分别为对照的71.18％、68.03％。

表8 γ射线辐照桔小实蝇不同发育阶段后对其5日龄3龄幼虫体内乙酰胆碱酯酶(OD值)活性的影响

表9 γ射线辐照桔小实蝇不同发育阶段后对其5日龄3龄幼虫体内乙酰胆碱酯酶(OD值)处理比对照的比率

由表8、9可知，80、160Gy辐照桔小实蝇的卵、1龄幼虫其5日龄3龄幼虫体内乙酰胆碱酯酶酶OD值较对照降低，分别为对照的71.18％、68.03％、76.66％、71.39％；10Gy辐照桔小实蝇的卵、1、2龄幼虫其5日龄3龄幼虫体内的乙酰胆碱酯酶酶OD值较对照升高，分别为对照的1.19倍、1.20倍、1.18倍。10、20、40、80、160Gy辐照桔小实蝇的2龄、3龄幼虫其体内的乙酰胆碱酯酶酶OD值变化不大，与对照差异不显著。

本发明表明以不同剂量辐照桔小实蝇卵和各龄期幼虫后，其体内的乙酰胆碱酯酶活性变化，与辐照时的剂量及辐照时龄期有关。正常桔小实蝇的幼虫体内的乙酰胆碱酯酶酶活性随龄期增加逐渐增强，尤其幼虫在第7天酶活性升高非常显著。辐照桔小实蝇24小时的卵孵化后的幼虫，乙酰胆碱酯酶酶活性变化较复杂，以10、20、40Gy辐照桔小实蝇卵后，其第2-5天幼虫体内乙酰胆碱酯酶活性较对照显著升高，第7天幼虫体内乙酰胆碱酯酶活性与对照差异不显著。80、160Gy辐照桔小实蝇，因辐照时龄期不同，酶活变化较大。80、160Gy辐照桔小实蝇卵、1龄幼虫后，严重抑制了乙酰胆碱酯酶在3龄老熟幼虫体内的形成，乙酰胆碱酯酶的OD值分别为对照的71.18％、68.03％、76.66％、71.39％。10-160Gy辐照桔小实蝇2龄、3龄幼虫后，其老熟幼虫体内乙酰胆碱酯酶的OD较对照虽略有升高，但其老熟幼虫体内乙酰胆碱酯酶的OD值与正常桔小实蝇幼虫差异不显著。如果是高于80Gy辐照新鲜水果和蔬菜时感染的是桔小实蝇卵和1龄幼虫的，能够在发现的活虫中鉴定桔小实蝇是否经过辐照处理。

实施例4辐照桔小实蝇卵和各龄幼虫后其幼虫的黑化程度

观察虫体变黑方法如下：

辐照的卵是，早上9：00至10：00采卵1小时后，取出放入恒温(27℃)恒湿(相对湿度75％)人工气候箱内培养24小时后，到华南农业大学辐照中心用⁶⁰Co-γ射线辐照，辐照后继续放入恒温(27℃)恒湿(相对湿度75％)人工气候箱内培养，进一步发育至测试龄期后，均在上午10点，采集对照和各处理组的幼虫各10头，放入-18℃冰箱冷冻，观察时同时从冰箱拿出置入室温下，1小时后观察，并记录。

辐照的各龄期幼虫是，早上9：00至10：00采卵1小时后，取出放入取出放入恒温(27℃)恒湿(相对湿度75％)人工气候箱内培养至辐照的龄期，到华南农业大学辐照中心用⁶⁰Co-γ射线辐照，辐照后继续放入恒温(27℃)恒湿(相对湿度75％)培养箱内培养，进一步发育至5日龄3龄幼虫后，均在午10点，采集对照和各处理组的幼虫各10头，放入18℃冰箱冷冻，观察时同时从冰箱拿出置入室温下，1小时后观察，并记录。结果见表10至14。

表10 辐照桔小实蝇24小时卵后在不同时间检查幼虫的黑化程度

注：幼虫放入冰箱被冻死后，在室温下观察。-没变黑；+变黑；±不能确定是否变黑

从表10可知，1龄、2龄的幼虫不管在卵期辐照与否，虫体都不变黑。在卵期未辐照的幼虫在幼虫第4天起开始变黑。卵期用10Gy辐照的幼虫，在幼虫第4天起变黑，卵期20Gy辐照的幼虫，在幼虫期不能确定是否变黑。在卵期用40、80、160Gy辐照桔小实蝇的幼虫，在整个幼虫阶段虫体不变黑(见图1)，

表11 辐照桔小实蝇1龄幼虫后在不同时间检查幼虫的黑化程度

从表11可知，辐照1龄幼虫和对照在2龄时虫体都不变黑。未辐照的幼虫在幼虫第4天起开始变黑。1龄期用10Gy辐照的幼虫，在幼虫第4天起变黑，1龄期用20Gy辐照的幼虫，在幼虫期第2－4天不变黑，第5、6、7天不能确定是否变黑。在1龄期用40、80、160Gy辐照桔小实蝇的幼虫，在整个幼虫阶段虫体不变黑。

表12 辐照桔小实蝇2龄幼虫后在不同时间检查幼虫的黑化程度

从表12可知，对照在幼虫第4天变黑，在2龄期用10Gy辐照的幼虫在发育至第4天时虫体变黑。在2龄期用20Gy辐照的幼虫，在整个3龄期不确定是否变黑。用80、160Gy辐照的2龄期幼虫，在第3、4、5、6、7天虫体不变黑。

表13 辐照桔小实蝇4日龄(1日龄3龄)幼虫后在不同时间检查幼虫的黑化程度

从表13可知，在3日龄3龄用10、20、40Gy辐照，虫体在第6天均变黑。80、160Gy辐照的第3天幼虫，在第4、5、6、7天虫体不确定是否变黑，对照在第4天变黑。

表14 辐照桔小实蝇不同龄期卵和幼虫在幼虫第7天检查幼虫的黑化程度

从表14可知，10、20Gy辐照桔小实蝇卵和各龄期幼虫，幼虫在第7天均变黑。40、80、160Gy辐照桔小实蝇的卵、1龄、2龄幼虫，培养至幼虫第6天观察，虫体不变黑。80、160Gy辐照1日龄3龄幼虫，培养至第6天后，虫体不确定是否变黑。用10-160Gy辐照桔小实蝇的第5天幼虫，虫体在第6天变黑。

本发明也表明最低以40Gy辐照桔小实蝇卵、1龄、2龄幼虫后，其老熟幼虫虫体不能黑化，但以10-160Gy辐照桔小实蝇3龄幼虫后，其老熟幼虫虫体变黑。酚氧化酶是昆虫体内黑色素合成的关键酶，在昆虫免疫反应中起关键性的作用(Jing H B et al，1998)，正常桔小实蝇酚氧化酶在2龄幼虫开始检测到，3龄(3-7天)幼虫酶氧化酶主要形成阶段。因此最低40Gy辐照卵1龄、2龄幼虫能有效降低其3龄幼虫酚氧化酶活性，导致虫体不能黑化。虽然3龄幼虫辐照后其体内的酚氧化酶活性降低，但不能有效的阻止虫体变黑。

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Claims (8)

1.一种辐照处理桔小实蝇的方法，其特征在于：以40－160 Gy 剂量的⁶⁰Coγ射线辐照桔小实蝇卵、1龄、2龄幼虫；或者用160 Gy 以上剂量的⁶⁰Coγ射线辐照桔小实蝇3龄幼虫。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：以80－160 Gy 剂量的⁶⁰Coγ射线辐照桔小实蝇卵、1龄、2龄幼虫；或者用160 Gy 以上剂量的⁶⁰Coγ射线辐照桔小实蝇3龄幼虫；或者用160 Gy 以上剂量的⁶⁰Coγ射线辐照桔小实蝇卵、1龄、2龄、3龄幼虫。

3.一种鉴别桔小实蝇是否经达标的辐照处理的方法，其特征在于：采集被检测植物或水果上的桔小实蝇活虫以检测其酚氧化酶、超氧化物歧化酶或/和乙酰胆碱酯酶酶活性，如果酚氧化酶酶活性为对照80%以下、超氧化物歧化酶酶活性为对照85%以下或/和乙酰胆碱酯酶酶活性低于对照，则确定幼虫是经过辐照处理。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：进一步检测被检测植物或水果上的桔小实蝇幼虫是否能够黑化，将发现的活虫放入-18℃冰箱急冻后，确定虫体死亡后，将虫体拿出放入室温下，1h后观察，如果虫体呈黄白色，如果没有变黑色，可以确定幼虫经过辐照处理；如果黑化表明没有经过辐照处理。

5.按照权利要求3或4所述的方法，其特征在于：如果酚氧化酶酶活性为对照80%以下，则确定幼虫是经过辐照处理。

6.按照权利要求3或4所述的方法，其特征在于：如果超氧化物歧化酶酶活性为对照85%以下，则确定幼虫是经过辐照处理。

7.按照权利要求3或4所述的方法，其特征在于：如果酚氧化酶酶活性为对照80%以下、超氧化物歧化酶酶活性为对照85%以下，则确定幼虫是经过辐照处理。

8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于：如果酚氧化酶酶活性为对照80%以下、超氧化物歧化酶酶活性为对照85%以下，并且乙酰胆碱酯酶酶活性低于对照，则确定幼虫是经过辐照处理。