CN106591259B - 一种产自黑曲霉的碱性脂肪酶及其生产方法 - Google Patents

一种产自黑曲霉的碱性脂肪酶及其生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种碱性脂肪酶及其生产方法。所述脂肪酶选用黑曲霉(Aspergillus niger)为产酶菌种，编号CICC41362。所产脂肪酶在pH 7.0‑13.0范围内稳定，最适作用pH值10.5；在60℃以下较为稳定，最适反应温度55℃；发酵液酶活力大于30000U/mL；发酵周期85‑95小时；液体酶回收率大于88％。

Description

一种产自黑曲霉的碱性脂肪酶及其生产方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种碱性脂肪酶及其生产方法。
背景技术：
脂肪酶是三脂酰甘油水解酶类的统称，是催化三酰甘油和其他底物羧基酯键水解的酶。脂肪酶的天然底物是不溶于水的脂复合物。脂肪酶作为一种重要的工业用酶，可以催化水解、酯合成、酯交换等一系列反应，因此在食品、皮革、饲料、洗涤、医药、油脂、化工等传统工业领域应用广泛。
脂肪酶广泛存在于动物组织、植物种子和微生物体中，其中微生物来源的脂肪酶比动植物来源的脂肪酶具有更广的作用pH、作用温度范围，以及高稳定性、高活性和底物专一性。不同微生物来源的脂肪酶有33种，其中18种来自霉菌。
碱性脂肪酶是在碱性条件下，对脂肪中的酯键进行作用的酶。1988年，诺和诺德公司将碱性脂肪酶应用到洗涤剂中，此后，日本的狮子油脂公司和联合利华等公司也推出了含有脂肪酶的洗涤剂。
国内对碱性脂肪酶的研究起步较晚，几十年来我国科研工作者为提高脂肪酶的发酵酶活力进行了不懈努力，如中国专利CN 103555596A的发明专利公开了一株高产脂肪酶的黑曲霉突变株WLlip1，保藏号为CCTCC NO：M2013478，该突变株的最高发酵酶活力可达5482U/mL；此外专利CN 105462863A公布了一株敲除了淀粉酶基因的黑曲霉菌株CCTCC NO：M2015761，通过异源表达来源于疏绵状嗜热丝孢菌的碱性脂肪酶基因，该菌株发酵产酶酶活最高可达15766U/mL。
尽管这些研究已经将酶活水平大幅提高，由于在碱性脂肪酶的菌种、提取工艺、发酵酶活力等技术与国外有很大差距，导致了产品的发酵酶活水平依然很低、成本高、耐碱性差和耐热性差等问题，限制了碱性脂肪酶在洗涤剂行业中的大规模应用。
发明内容：
本发明的目的在于避免上述现有技术中的不足之处，而提供一种耐热、耐碱性能好，酶活力高、性能稳定而且价格低廉的碱性脂肪酶。
所述碱性脂肪酶产自黑曲霉(Aspergillus niger)，CICC 41362；
利用上述菌株发酵发酵生产酶活力高、提取收率高、制造成本低的碱性脂肪酶的方法，具体如下：
(1)种子培养
摇瓶种子培养：32℃培养48h，摇床转速220r/min；
种子罐扩大培养：按接种量1％将摇瓶种子液接入种子罐，罐压0.05-0.08MPa，培养温度32℃，通风量30m3/h，搅拌转速180r/min，72h，pH控制7.5；
种子培养基组成(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨25，(NH4)2SO4 5，K2HPO4 1，MgSO4·7H2O0.5，橄榄油1.0，pH 7.5；121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌35min；
(2)液态发酵
发酵罐发酵工艺条件：接种量7-10％，罐压0.05-0.08Mpa，培养温度32℃，搅拌转速300r/min，初始pH控制7.5；通风量(V/V:min)：0-40h为1:0.5；40-58h为1：1.3：58h-出料为1：1.1；
发酵罐培养基组成(g/L)：蔗糖12，鱼粉蛋白胨12，橄榄油乳状液15，硫酸镁0.6，磷酸氢二钾3.0，pH 7.5；121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌35min；
(3)补料
当pH升至7.8时，开始补料，控制pH在7.8-8.0；
补料培养基质组成(g/L)：淀粉20，橄榄油乳状液30，氯化钙0.5，pH 7.5；
补料培养基的液化水解：培养基中加入3％高温淀粉酶升温至90℃，保温30min；
补料培养基液化水解后灭菌工艺条件：121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌30min；
(4)出料
培养至85-95h，酶活增长缓慢，菌体开始部分自溶，即可放罐；发酵液酶活力大于30000U/mL；
(5)碱性脂肪酶的提取
发酵液-预处理-压滤-脱色-精滤-超滤-调配-灌装-检测-成品；液体酶回收率大于88％。
本发明的碱性脂肪酶酶学特如下：
1、在pH 7.0-13.0范围内稳定，最适作用pH值10.5；
2、在60℃以下较为稳定，最适反应温度55℃。
附图说明：
图1最适反应pH测定曲线；
图2 pH稳定性测定曲线；
图3最适反应温度测定曲线；
图4耐热性测定曲线。
有益效果：
1.本发明提供了一种耐热、耐碱性能好，酶活力高、性能稳定而且价格较低的碱性脂肪酶产品。
2.提供了一种发酵活力更高、提取收率更高、制造成本更低的碱性脂肪酶液态生物发酵生产方法。低价，高性能的产品得到更广泛的应用。
具体实施方式：
以下通过具体实施例对本发明做更详细的说明：
实施例1一种碱性脂肪酶的制备方法
(1)种子培养
摇瓶种子培养：32℃培养48h，摇床转速220r/min；
种子罐扩大培养：按接种量1％将摇瓶种子液接入种子罐，罐压0.05MPa，培养温度32℃，通风量30m3/h，搅拌转速180r/min，72h，pH控制7.5；
种子培养基组成(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨25，(NH4)2SO4 5，K2HPO4 1，MgSO4·7H2O0.5，橄榄油1.0，pH 7.5；121℃℃，0.11MPa条件下，灭菌35min；
(2)液态发酵
发酵罐发酵工艺条件：接种量7％，罐压0.05Mpa，培养温度32℃，搅拌转速300r/min，初始pH控制7.5；通风量：0-40h为1:0.5；40-58h为1：1.3；58h-出料为1：1.1；
发酵罐培养基组成(g/L)：蔗糖12，鱼粉蛋白胨12，橄榄油乳状液15，硫酸镁0.6，磷酸氢二钾3.0，pH 7.5；121℃℃，0.11MPa条件下，灭菌35min；
(3)补料
当pH升至7.8时，开始补料，控制pH在7.8-8.0；
补料培养基质组成(g/L)：淀粉20，橄榄油乳状液30，氯化钙0.5，pH 7.5；
补料培养基的液化水解：加入3％高温淀粉酶升温至90℃，保温30min；
补料培养基液化水解后灭菌工艺条件：121℃℃，0.11MPa条件下，灭菌30min；
(4)出料
培养至85h，酶活增长缓慢，菌体开始部分自溶，即可放罐；发酵液酶活力大于31884U/mL。
实施例2一种碱性脂肪酶的制备方法
(1)种子培养
摇瓶种子培养：32℃培养48h，摇床转速220r/min；
种子罐扩大培养：按接种量1％将摇瓶种子液接入种子罐，罐压0.08MPa，培养温度32℃，通风量30m3/h，搅拌转速180r/min，72h，pH控制7.5；
种子培养基组成(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨25，(NH4)2SO4 5，K2HPO4 1，MgSO4·7H2O0.5，橄榄油1.0，pH 7.5；124℃，0.12MPa条件下，灭菌35min；
(2)液态发酵
发酵罐发酵工艺条件：接种量10％，罐压0.08Mpa，培养温度32℃，搅拌转速300r/min，初始pH控制7.5；通风量：0-40h为1:0.5；40-58h为1：1.3；58h-出料为1：1.1；
发酵罐培养基组成(g/L)：蔗糖12，鱼粉蛋白胨12，橄榄油乳状液15，硫酸镁0.6，磷酸氢二钾3.0，pH 7.5；124℃，0.12MPa条件下，灭菌35min；
(3)补料
当pH升至7.8时，开始补料，控制pH在7.8-8.0；
补料培养基质组成(g/L)：淀粉20，橄榄油乳状液30，氯化钙0.5，pH 7.5；
补料培养基的液化水解：加入3％高温淀粉酶升温至90℃，保温30min；
补料培养基液化水解后灭菌工艺条件：124℃，0.12MPa条件下，灭菌30min；
(4)出料
培养至89h，酶活增长缓慢，菌体开始部分自溶，即可放罐；发酵液酶活力大于33125U/mL。
实施例3一种碱性脂肪酶的制备方法
(1)种子培养
摇瓶种子培养：32℃培养48h，摇床转速220r/min；
种子罐扩大培养：按接种量1％将摇瓶种子液接入种子罐，罐压0.06MPa，培养温度32℃，通风量30m3/h，搅拌转速180r/min，72h，pH控制7.5；
种子培养基组成(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨25，(NH4)2SO4 5，K2HPO4 1，MgSO4·7H2O0.5，橄榄油1.0，pH 7.5；121℃℃，0.12MPa条件下，灭菌35min；
(2)液态发酵
发酵罐发酵工艺条件：接种量8％，罐压0.06Mpa，培养温度32℃，搅拌转速300r/min，pH控制7.5；通风量：0-40h为1:0.5；40-58h为1：1.3；58h-出料为1：1.1；
发酵罐培养基组成(g/L)：蔗糖12，鱼粉蛋白胨12，橄榄油乳状液15，硫酸镁0.6，磷酸氢二钾3.0，pH 7.5；121℃，0.12MPa条件下，灭菌35min；
(3)补料
当pH升至7.8时，开始补料，控制pH在7.8-8.0；
补料培养基质组成(g/L)：淀粉20，橄榄油乳状液30，氯化钙0.5，pH 7.5；
补料培养基的液化水解：加入3％高温淀粉酶升温至90℃，保温30min；
补料培养基液化水解后灭菌工艺条件：121℃，0.12MPa条件下，灭菌30min；
(4)出料
培养至95h，酶活增长缓慢，菌体开始部分自溶，即可放罐；发酵液酶活力大于33780U/mL。
实施例4碱性脂肪酶的提取
(1)预处理
称取1000g珍珠岩，加20L自来水进行压滤，使板框中珍珠岩得到预涂布。
(2)压滤
称取1000g珍珠岩与30L发酵液(酶活为32540U/mL)混匀压滤，压滤后吹气30min，挤干压滤饼，得到约26L压滤液。
(3)脱色
称取500g活性炭与压滤液混合搅拌30min脱色，加2000g硅藻土精滤2遍，再添加10L水压滤水洗酶饼得脱色液。
(4)精滤
称取2000g硅藻土，与脱色液混匀，精滤，最后得到26L澄清液。
(6)超滤
用超滤滤膜进行超滤，得到8.8L超滤液(酶活为98750U/mL)，发酵液的回收率为89％。
(7)调配
在超滤至不同酶活水平的超滤液中，加入15％氯化钠+8％山梨醇+1％苯甲酸钠+0.5％山梨酸钾，得到不同酶活水平的液态酶制剂。
(8)灌装
将上述液态酶制剂灌装入不同规格的塑料桶中。
(9)检测
随机抽取数桶检测酶活力，以确定酶活水平到达要求。
(10)成品
检测合格后，在同一批次的桶上贴标签，注明酶活和保质期，即得到成品。
实施例5碱性脂肪酶酶活力测定
(1)碱性脂肪酶酶活单位的定义
在40℃、pH值为7.5的条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
(2)底物溶液
秤取聚乙烯醇(PVA：聚合度1750±50)40g，加水800mL，浸泡4-6h，在沸水浴中加热，搅拌，直至全部溶解，搅拌冷却后定容至1000mL，用干净的6-8层纱布过滤，取滤液备用。量取上述滤液150mL，加橄榄油50mL，用高速匀浆机处理10min(分4次处理，间隔5min，每次处理2-3min)，即得乳白色PVA乳化液。现用现配。
(3)酶活测定
取两个100ml三角瓶，分别于空白瓶(A)和样品瓶(B)中各加入底物溶液4ml和pH7.5磷酸缓冲液5mL，再于空白瓶(A)中加入95％乙醇15mL，于40℃水浴中预热5min；向空白瓶(A)和样品瓶(B)中各加入待测酶液1mL，立即混匀计时，准确反应15min后，使用分样移液器于样品瓶(B)中立即补加95％乙醇15mL终止反应，取出；将上述反应液倒入50mL烧杯中，向三角瓶中加入5mL纯水，摇匀后倒入50mL烧杯中，加入2滴酚酞指示剂；使用校正过碱性条件的pH计，在搅拌的条件下向烧杯中加入0.05mol/L的氢氧化钠溶液，滴定至pH值为9.92；滴定至pH值在20s不再变化为终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。
酶活力计算公式：X＝(V1-V2)×C×50×N÷0.05÷15
X——碱性脂肪酶活力，U/mL；
V1——滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL；
V2——滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL；
C——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；
50——0.05mol/L氢氧化钠溶液1mL相当于脂肪酸50μmol；
N——酶液稀释倍数；
0.05——氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；
15——时间换算系数。
实施例6最适反应pH
取实施例4所得脂肪酶成品，在40℃，pH值分别为6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12的条件下，测定同一液态酶制剂样品的酶活力。选取在40℃，pH 7.5条件下测定的酶活为100％，计算相对酶活。结果如图1所示，本脂肪酶的最适反应pH为10.5。
实施例7 pH稳定性
取实施例4所得脂肪酶酶成品，将同一液态酶制剂样品分成数份，并用磷酸盐缓冲液分别调节至不同的pH值为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14，常温放置15h后，在40℃，pH7.5条件下测定酶活。选取pH 7.5条件下处理过的样品的酶活为100％，计算相对酶活。结果如图2所示，本脂肪酶在pH7-13的范围内稳定。
实施例8最适反应温度
取实施例4所得脂肪酶成品，在pH 7.5，不同温度30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃下测定同一液态酶制剂样品的酶活。选取在pH 7.5，40℃条件下测定的酶活为100％，计算相对酶活。结果如图3所示，本脂肪酶的最适反应温度为55℃。
实施例9耐热性
取实施例4所得脂肪酶成品，将pH调节至7.5并分成数份，置于不同的温度30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃下保温2h后，在40℃，pH7.5条件下测定酶活。选取在40℃保温的样品的酶活为100％，计算相对酶活。结果如图4所示，本脂肪酶在60℃以下较为稳定。

Claims (2)

1.一种碱性脂肪酶的生产方法，其特征在于，步骤如下：
(1)种子培养
摇瓶种子培养：32℃培养48h，摇床转速220r/min；
种子罐扩大培养：按接种量1％将摇瓶种子液接入种子罐，罐压0.05-0.08MPa，培养温度32℃，通风量30m3/h，搅拌转速180r/min，72h，pH控制7.5；
(2)液态发酵
发酵罐发酵工艺条件：接种量7-10％，罐压0.05-0.08Mpa，培养温度32℃，搅拌转速300r/min，pH控制7.5；通风量：0-40h为1:0.5；40-58h为1：1.3；58h-出料为1：1.1，通风量单位为V/V:min；
(3)补料
当pH升至7.8时，开始补料，控制pH在7.8-8.0；
(4)出料
培养至85-95h，酶活增长缓慢，菌体开始部分自溶，即可放罐；
所述碱性脂肪酶产自黑曲霉(Aspergillus niger)，保藏编号CICC 41362。
2.如权利要求1所述的碱性脂肪酶的生产方法，其特征在于，
种子培养基组成以g/L计：葡萄糖20，蛋白胨25，(NH4)2SO4 5，K2HPO4 1，MgSO4·7H2O0.5，橄榄油1.0，pH 7.5；121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌35min；
发酵罐培养基组成以g/L计：蔗糖12，鱼粉蛋白胨12，橄榄油乳状液15，硫酸镁0.6，磷酸氢二钾3.0，pH 7.5；121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌35min；
补料培养基质组成以g/L计：淀粉20，橄榄油乳状液30，氯化钙0.5，pH 7.5；
补料培养基的液化水解：培养基中加入3％高温淀粉酶升温至90℃，保温30min；
补料培养基液化水解后灭菌工艺条件：121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌30min。
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