CN106591168A - 一种烟嘧磺隆降解赤红球菌ymhl-1及其应用 - Google Patents

Abstract

一种烟嘧磺隆降解赤红球菌YMHL‑1及其应用。本发明提供一种消除废水中烟嘧磺隆残留的降解菌株YMHL‑1，经鉴定为赤红球菌属(Rhodococcus)。于2015年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.10542。主要生物学特性为革兰氏染色反应阴性，菌落呈桔黄色，圆形不透明，表面粗糙、干燥；细胞形态为球状或短杆状，无鞭毛，不运动，不产芽孢；好氧，化能异养。不能液化明胶，不能水解淀粉，接触酶阳性，V.P.反应阳性，甲基红反应阴性，不能降解酪蛋白，不还原硝酸盐；从葡萄糖产酸。能够利用葡萄糖、果糖、柠檬酸盐，不能利用甘露糖、阿拉伯糖、棉籽糖。降解菌产品直接施用可使水中抗生素残留量降低90％上。

Description

一种烟嘧磺隆降解赤红球菌YMHL-1及其应用

技术领域

本发明属于生物高技术领域，是利用微生物的方法降解化学农药，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工，具体涉及一种烟嘧磺隆降解赤红球菌YMHL-1及其应用。

背景技术

随着人们生活水平的提高和环境保护意识的增强，全社会对农药残留带来的直接危害和潜在影响亦愈来愈关注，人们迫切需要无农药残留污染的清洁的绿色农产品。但从目前我国的农业生产形式和人口状况来看，以停止农药使用降低农业产量为代价的无公害生产模式是行不通的，农药作为控制病虫害的有效手段还将继续在农业生产中发挥巨大的作用。如何能解决农业生产中的这个两难问题就成为各个学科的研究热点。实验室和实际应用研究都表明利用微生物来降解消除土壤中的农药残留“库”容量，从而降低粮食、蔬菜、茶叶等农产品中的农药残留，提高农产品的品质和经济价值是可行的。

磺酰脲类除草剂的大量使用给生态环境和人类健康带来诸多危害，如何清除其在环境中的残留已成为众多科学家关注的热点问题。利用降解菌及其产生的降解酶降解农药具有高效、无二次污染等特点，是修复农药污染环境和去除食品中农药残留的重要手段之一。

烟嘧磺隆是磺酰脲类除草剂中最重要的品种之一，又称玉嘧磺隆，化学名2-(4,6-二甲氧基嘧啶-2-基氨基甲酰氨基磺酰)N,N-二甲基烟酰胺，结构式如下：

由日本石原产业株式会社于上世纪80年代研发而成，是对玉米田中禾本科杂草具有特效的除草剂品种，我国于90年代初期开始引进并推广烟嘧磺隆,商品名玉农乐，为4％烟嘧磺隆的油悬浮剂。引进初期，烟嘧磺隆主要施用于玉米 种植面积大的东北三省，辽宁、黑龙江、吉林的部分地区。由于烟嘧磺隆对玉米安全性高、除草效果佳、低施用量等优点而广受欢迎。然而，由于售价偏高,用药成本大，其销量曾一度受到限制。直到90年代末，玉农乐的应用面积达到一定规模，并逐渐向东北以外的其他地区省份扩展。

烟嘧磺隆虽然具有极高的防治效果和较好的选择性，然而，在农田施用过程中会有一部分残存于土壤、大气和水等自然环境中，这些残留于自然环境和作物体内的磺酰脲类除草剂可通过饮用水、大气以及果实等最终传递到人类，造成一定的负面影响。

发明内容

本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，利用微生物的方法来降解土壤和水体中的烟嘧磺隆残留，从而降低烟嘧磺隆对环境造成的遗传毒性，起到修复烟嘧磺隆污染土壤、保护生态环境的作用。该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低、效率高、无二次污染，具有很好的应用前景。

本发明提供一种消除烟嘧磺隆残留的降解菌，其菌株YMHL-1是革兰氏染色反应阴性菌，于2015年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号CGMCC NO.10542，经鉴定是赤红球菌(Rhodococcus ruber)。生物学特性为革兰氏染色阴性，菌落呈桔黄色，圆形不透明，表面粗糙、干燥；细胞形态为球状或短杆状，无鞭毛，不运动，不产芽孢；好氧，化能异养。不能液化明胶，不能水解淀粉，接触酶阳性，V.P.反应阳性，甲基红反应阴性，不能降解酪蛋白，不还原硝酸盐；从葡萄糖产酸。能够利用葡萄糖、果糖、柠檬酸盐，不能利用甘露糖、阿拉伯糖、棉籽糖。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。

本发明提供了所述赤红球菌YMHL-1在烟嘧磺隆降解中的应用。

本发明提供了含有所述赤红球菌YMHL-1的菌剂。

本发明还提供了所述赤红球菌YMHL-1生产菌剂的方法。

所述赤红球菌YMHL-1生产菌剂的方法，包括：斜面种－摇瓶诱导－种子罐诱导发酵－生产罐－产品，所述产品的包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂。

所述生产菌剂的方法，具体为：

1)将烟嘧磺隆残留的赤红球菌YMHL-1的试管种接种于含有100mg/L烟嘧磺隆的LB培养基中，振荡培养至对数期；

2)将步骤1)培养好的菌种按5％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，即种子液；

3)将步骤2)所述种子液按10％的接种量接入生产罐进行发酵培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，发酵完成后的培养液即为菌剂。

步骤1)中所述的LB培养基配方为：烟嘧磺隆0.1g/L，NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉5.00g/L,pH7.0。

步骤2)所述的种子罐所用的培养基配方为：烟嘧磺隆0.1％，葡萄糖0.5％，(NH₄)₂SO₄ 1％，K₂HPO₄ 0.2％，MgSO₄ 0.05％，NaCl 0.01％，CaCO₃ 0.3％，酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5。

步骤2)所述种子罐和步骤3)所述的生产罐的培养过程中，无菌空气的通气量为1：0.6-1.2，搅拌速度为220转/分，培养温度为37℃，步骤2和3的整个工艺流程培养时间为48-60小时。

所述菌剂在烟嘧磺隆降解中的应用。

本发明所述的赤红球菌YMHL-1能使水体中烟嘧磺隆的残留量降低90％以上，降低烟嘧磺隆在环境中富集并影响环境微生态的风险。所制备的菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合在烟嘧磺隆污染的土壤和水体中大面积推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人类的身体健康，提高水环境质量安全具有重要的意义。

附图说明

图1本发明所述的赤红球菌YMHL-1的结晶紫染色照片；

图2接种量对本发明所述的赤红球菌YMHL-1降解效果的影响；

图3 pH对本发明所述的赤红球菌YMHL-1降解效果的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手 段。

实施例1烟嘧磺隆降解赤红球菌YMHL-1的筛选和分离

取从生产烟嘧磺隆的某农药厂生产车间的废水处理池中得到的活性污泥3.0ml加入烟嘧磺隆浓度为100mg/L的100ml LB培养基中，其配方为：每升含NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉5.00g/L,pH 7.0，于220r/min，37℃条件下振荡培养，每隔3天按3％的接种量转接到新鲜的无机盐培养基中，连续转接5次。

取上面得到的富集菌液1.0ml，加入9.0ml无菌水中，配成10^-1的富集液，再吸取1.0ml配好的10^-1的富集液加入9.0ml无菌水中，充分混匀配成10^-2的富集液，以此类推，对富集液进行梯度稀释。以此类推，对富集液进行梯度稀释。吸取各梯度的稀释液0.1ml涂布于含烟嘧磺隆的浓度为100mg/L无机盐固体培养基(配方为：每升1.50g K₂HPO₄、0.50gKH₂PO₄、0.20g MgSO₄·7H₂O、1.00g NaCl、1.00g(NH₄)₂SO₄，12.5g琼脂，pH 7.0)上，37℃培养5天。5天后从以上的无机盐固体培养基上挑取单菌落，于5.0ml的LB液体培养基中培养24小时后，LB液体培养基配方为：NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉5.00g/L，pH7.0于12000r/min的条件下离心2min，倒去上清液，加入3.0ml的无菌水摇匀，仍于12000r/min的条件下离心2min，按此方法用无菌水洗两遍后，加入3.0ml无菌水重悬该菌。吸取1.0ml该菌液加入100ml烟嘧磺隆浓度为100mg/L的烟嘧磺隆-无机盐液体培养基中，于220r/min，37℃条件下振荡培养72h后，用高效液相色谱测其降解效果。将降解效率较高的一株菌株保存，进行后续实验。

将降解菌株接种于LB固体培养基上，其配方为：烟嘧磺隆0.1g/L，NaCl10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉5.00g/L,琼脂12.5g/L,pH7.0,30℃恒温培养48h后观察菌落形态，菌落呈桔黄色，圆形不透明，表面粗糙、干燥；用光学显微镜观察菌体形态(1000X)，如图1所示，细胞形态为球状或短杆状，无鞭毛，不运动，不产芽孢。菌株的生理生化鉴定按照《常见细菌系统鉴定手册》进行。鉴定为赤红球菌属(Rhodococcus)；命名为：YMHL-1。

实施例2赤红球菌YMHL-1的摇瓶降解实验

2.1接种量对YMHL-1降解效率的影响

在100mg/L烟嘧磺隆的无机盐培养基中，其配方为：每升含0.50g K₂HPO₄、 0.50gKH₂PO₄、0.20g MgSO₄·7H₂O、1.00g NaCl、1.00g(NH₄)₂SO₄，pH 7.0，按1％、2％、3％、4％、5％、的接种量接种YMHL-1于培养液中，于37℃振荡培养，72小时取样测定。结果由图2可以看出，按1％进行接种时，降解率为91％，随着接种量的提高，烟嘧磺隆降解率有小幅增加，考虑到菌体生长和经济的原因，采用1％的接种量即可达到要求。

2.2pH对YMHL-1降解效率的影响

pH值是影响微生物生长和生存的另一个重要环境因素，微生物生长有一个适宜的pH值范围，超过适宜生长的pH值范围，大多数微生物都不能很好的生长。

在含100mg/L烟嘧磺隆的无机盐培养基中，其配方为：每升含100mg/L，1.50gK₂HPO₄、0.50g KH₂PO₄、0.20g MgSO₄·7H₂O、1.00g NaCl、1.00g(NH₄)₂SO₄，pH 7.0，按1％的接种量接种YMHL-1于培养液中，pH值分别调至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，于30℃振荡培养，72小时取样测定。结果由图3可以看出，pH过高或过低会影响YMHL-1对烟嘧磺隆的降解，范围6-9内均有较好的降解效果，能够满足绝大多数的土壤环境的需求，其最优pH范围为7。

实施例3含有赤红球菌YMHL-1菌剂的制备

将实施例1筛选和分离的烟嘧磺隆降解赤红球菌YMHL-1的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml含烟嘧磺隆的LB培养基的1000ml摇瓶中，LB培养基配方为：烟嘧磺隆100mg/L，酵母粉5.00g/L，蛋白胨10.00g/L，NaCl10.00g/L，pH 7.0，恒温振荡培养至对数期，准备接种种子罐。种子罐500升，投料量400升，培养基配方为：烟嘧磺隆0.1％，葡萄糖0.5％，(NH₄)₂SO₄ 1％，K₂HPO₄ 0.2％，MgSO₄ 0.05％，NaCl 0.01％，CaCO₃ 0.3％，酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5。投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至33℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按5％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1:0.8。生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同，容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm²的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，接种后的生产罐温度控制在35℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1.2，搅拌速 度为240转/分，整个工艺流程培养时间为60小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

Claims (9)

1.一种烟嘧磺隆降解赤红球菌YMHL-1，其保藏编号为CGMCC NO.10542。

2.权利要求1所述的赤红球菌菌株YMHL-1在烟嘧磺隆降解中的应用。

3.含有权利要求1所述赤红球菌菌株YMHL-1的菌剂。

4.一种权利要求3所述菌剂的生产方法，其特征在于，包括：斜面种－摇瓶诱导－种子罐诱导发酵－生产罐－产品，所述产品的包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂。

5.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1）将烟嘧磺隆残留的赤红球菌YMHL-1的试管种接种于含有100mg/L烟嘧磺隆的LB培养基中，振荡培养至对数期；

2）将步骤1）培养好的菌种按5％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，即种子液；

3）将步骤2）所述种子液按10％的接种量接入生产罐进行发酵培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，发酵完成后的培养液即为菌剂。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1）中所述的LB培养基配方为：烟嘧磺隆0.1g/L，NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉5.00g/L, pH7.0。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2）所述的种子罐所用的培养基配方为：烟嘧磺隆0.1%，葡萄糖0.5%，（NH₄）₂SO₄ 1%，K₂HPO₄ 0.2%，MgSO₄ 0.05%，NaCl 0.01%，CaCO₃0.3%，酵母膏0.02%，pH值7.2-7.5。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2）所述种子罐和步骤3）所述的生产罐的培养过程中，无菌空气的通气量为1：0.6-1.2，搅拌速度为220转/分，培养温度为37℃，步骤2和3的整个工艺流程培养时间为48-60小时。

9.权利要求5-8任一项所述的方法制备的菌剂在烟嘧磺隆降解中的应用。