CN106581743A - 锌在制备骨或关节修复再生材料中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及化学技术领域，具体是锌在制备骨或关节修复再生材料中的应用,以正硅酸乙酯、硝酸锌及硝酸钙为原料制成锌修饰硅酸钙涂料，将所述锌修饰硅酸钙涂料涂覆在骨或关节修复再生材料的表面形成锌修饰硅酸钙涂层，并与BMSCs共培养。本发明的有益效果在于，在本实验中，BMSCs被用于在各组材料表面培养，通过粘附、增殖及分化实验研究Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层对BMSCs的生物学影响，证实了锌修饰硅酸钙涂层的表面形貌、化学组分及其释放的生物活性离子同时对BMSCs的生物活性产生了影响，锌钙摩尔比为0.3的锌修饰硅酸钙涂层拥有最优的促BMSCs生物活性效果。

Description

锌在制备骨或关节修复再生材料中的应用
技术领域
本发明涉及化学技术领域，具体是锌在制备骨或关节修复再生材料中的应用。
背景技术
众所周知，细胞与基底之间的相互作用是影响细胞活性的关键因素，其中包括了细胞的粘附、增殖及分化。相关实验已经证明，生物材料的表面形貌和化学组分可以对细胞产生显著的生物学影响。例如Zreiqat等已表明，使用二价微量元素如镁(Mg)和锌(Zn)进行表面化学修饰的钛合金(Ti-6Al-4V)可以调节骨细胞的活性。
近年来，羟基磷灰石(HA)通过等离子喷涂于植入体表面形成涂层已广泛应用于临床，其能诱导周围骨组织生长的能力毋庸置疑，但该涂层与钛基的结合强度欠佳以及降解性较高限制了它在临床的远期疗效。
CaSiO3陶瓷是典型的钙硅基生物陶瓷材料，目前研究已证实其在SBF中能形成磷酸钙层和富硅层，产生类HA，具有骨传导和骨诱导的生物活性。由于其相对于HA拥有更加良好的生物活性和可降解性，以及其涂层与钛基底更高的结合强度，一度被研究作为可应用于骨再生和植入体涂层的有前景的陶瓷材料。然而，CaSiO3机械强度低、化学稳定性较弱，因其较高的溶解率，会伴随浸泡过程降解，与基体间的结合强度降低，如在与钛基的结合强度会因浸泡液的腐蚀而显著降低等缺点，限制了它在临床的应用前景，在进一步研究中受到了重大限制。
于是，我们引入阳离子修饰的理念，将Zn离子通过溶胶凝胶法掺杂到CaSiO3中获得了一种以Ca2ZnSi2O7成份为主的新型材料(其中含少量Ca2SiO4和CaSiO3)，并将该粉末高温融化后运用等离子喷涂的方法，在钛合金材料表面形成Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层。CaSiO3陶瓷中锌的掺入形成了Ca2ZnSi2O7陶瓷，也就是锌黄长石，研究发现锌的掺入提高了CaSiO3陶瓷的化学稳定性和机械性能。我们选择Zn离子作为掺入的元素，不仅因为它具有提高CaSiO3陶瓷结构稳定性的积极作用，而且同时也因为它是在人体中最重要的微量元素之一，并已被证明其通过对成骨细胞的刺激在骨骼发育、维护和修复中发挥着重要作用。通过XRD分别对制备好的原材料粉末及涂层后材料进行物相分析，证明等离子喷涂前后Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层的组成成分无明显改变。使用MC3T3-E1细胞，通过细胞毒性实验、粘附及增殖实验、成骨分化实验及抗菌实验等，证明了该涂层材料具有良好的细胞相容性、促成骨细胞粘附、增殖、分化的作用，及优秀的抗菌性能。
在前期工作中我们用于实验的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层锌钙摩尔比为0.5，虽然实验已证实它对于MC3T3-E1细胞具有优秀的促粘附、增殖、成骨分化、矿化等一系列生物学活性具有明显的促进作用，但是该锌钙摩尔比是否为最优，以及该材料对于更具应用前景和实际意义的BMSCs是否具有同样优秀的效果仍然存在疑问。由于Zn离子对成骨细胞的生长有浓度依赖性(浓度过高对细胞有一定的毒性，过低则无显著效果)，且不同Zn离子浓度修饰的CaSiO3陶瓷涂层与钛基体材料的结合强度不同、化学稳定性也不同。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提出构建并优化锌修饰硅酸钙陶瓷涂层，研究锌钙摩尔比分别为0.1、0.3、0.5的锌修饰硅酸钙陶瓷涂层材料的表面形貌，对作为成骨细胞前体来源的BMSCs的生物学影响，探索理想出的锌钙摩尔比，系统研究Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层及其促粘附、增殖及促成骨分化的作用。
为了达到上述目的，本发明提出了一种锌在制备骨或关节修复再生材料中的应用，以正硅酸乙酯、硝酸锌及硝酸钙为原料制成锌修饰硅酸钙涂料，将所述锌修饰硅酸钙涂料涂覆在骨或关节修复再生材料的表面形成锌修饰硅酸钙涂层，并与所述骨或关节修复再生材料中的BMSCs共培养。
所述的骨或关节修复再生材料可以是人工骨、关节、融合器、螺钉等植入材料，所述锌修饰硅酸钙涂料与所述骨或关节修复再生材料中的BMSCs共培养并植入到动物体内。
优选地，所述的锌修饰硅酸钙中锌钙摩尔比为0.3。
优选地，所述的BMSCs取第4代处于对数生长期的BMSCs。
优选地，所述的锌修饰硅酸钙涂料中正硅酸乙酯、硝酸锌及硝酸钙的摩尔比为1:0.1:1、1:0.3:1或1:0.5:1。
在本发明的一个优选实施例中，所述的形成锌修饰硅酸钙涂层的方法为：以正硅酸乙酯、硝酸锌及硝酸钙为原料制成锌修饰硅酸钙陶瓷粉体，以等离子火焰球化，将钛合金金属片作为基底材料，使用等离子喷涂方式将所述锌修饰硅酸钙陶瓷粉体喷涂在钛合金金属片上。
本发明的有益效果在于：
骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一种极具吸引力的组织工程细胞来源，因为它们容易获得，可高度增殖，并且可以多能分化成不同谱系，如成骨细胞、牙周膜细胞、和神经细胞等。然而，BMSCs在不同锌钙摩尔比的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层表面粘附、增殖及分化的情况尚不清除。在本实验中，BMSCs被用于在各组材料表面培养，通过粘附、增殖及分化实验研究Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层对BMSCs的生物学影响。
Ca2ZnSi2O7涂层在促BMSCs粘附、增殖及成骨分化方面显著优于CaSiO3涂层，除了同样拥有粗糙的表面形貌，可以释放Si、Ca离子之外，主要的区别在于其还可以持续释放Zn离子。不同锌钙摩尔比的Ca2ZnSi2O7涂层对BMSCs的影响效果不尽相同，是由于掺杂的Zn离子浓度不同，导致释放出的Zn离子浓度各异，甚至会影响Ca、Si离子的释放浓度。根据实验结果显示，锌钙摩尔比为0.3的Ca2ZnSi2O7涂层拥有最优的促BMSCs生物活性效果，是因为其释放的Zn、Ca以及Si浓度最适合BMSCs的生长。
然而，虽然我们知道材料涂层的表面形貌、化学组分及其释放的生物活性离子同时对BMSCs的生物活性产生了影响，但是我们并不清楚对于Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层来说，在其显著促进BMSCs的粘附、增殖及成骨分化等生物学活性表达的诸多因素中，是表面形貌、化学组分，还是其释放的生物活性离子起了最为关键的作用。因此，在下一部分的实验中，我们将剔除各组材料表面形貌和化学组分对BMSCs的直接接触的影响，使用各组涂层材料的浸提液用于培养BMSCs，检测浸提液对于BMSCs的生物学影响，以证实Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层作用于BMSCs的主要因素，为下一步对该涂层材料影响BMSCs的作用机制奠定基础。
附图说明
图1为Ca2ZnSi2O7陶瓷分体及涂层大体观，其中A：Ca2ZnSi2O7陶瓷粉体，B：Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层；
图2为三组Ca2ZnSi2O7涂层的表面形貌(SEM)，其中A、B、C分别代表锌钙摩尔比为0.1、0.3、0.5的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层，1、2、3、4分别代表放大50倍、500倍、3000倍及30000倍；
图3为三组Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层及CaSiO3陶瓷涂层的结合强度注：Zn-Ca1、Zn-Ca2、Zn-Ca3分别代表锌钙摩尔比0.1，0.3、0.5的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层，*表示差异具有统计学意义(P<0.05)；
图4为各组材料对BMSCs粘附功能的影响，*表示差异具有统计学意义(P<0.05)；
图5为各组材料对BMSCs增殖活性的影响，*表示差异具有统计学意义(P<0.05)；
图6为BMSCs在各组材料表面培养不同时间点下ALP的生成情况，*表示差异具有统计学意义(P<0.05)；
图7为BMSCs在各组材料表面培养不同时间点下BGP的生成情况，*表示差异具有统计学意义(P<0.05)；
图8为BMSCs在各组材料表面培养不同时间点下COL-I的生成情况，*表示差异具有统计学意义(P<0.05)；
图9为3D micro-CT分析用于评估未涂层钛合金、羟基磷灰石(HA)、CaSiO3，Zn-Ca0.1和Zn-Ca 0.3涂层钛棒在植入骨质疏松白兔股骨1，2，3个月后，分别在涂层表面新形成的骨组织(A)在植入1、2、3月时未涂层钛合金、HA、CaSiO3、Zn-Ca 0.1和Zn-Ca 0.3涂层表面上骨小梁的3D图像，白色箭头指示新骨形成。(B)通过Micro-CT评估植入体植入后1、2、3月后，植入体骨整合和植入体周围微结构参数的定量结果，如骨矿物质密度，骨体积/骨总体积，骨小梁数，骨小梁厚度和骨小梁分离度。所有数据表示为平均值±SD(n＝3)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图10为组织切片通过甲苯胺蓝染色，切片分别未涂层钛棒(Control)，羟基磷灰石(HA)，CaSiO3，Zn-Ca 0.1和Zn-Ca 0.3涂层钛棒植入有骨质疏松的新西兰大白兔股骨髁后1、2、3月，比例尺为500μm。
具体实施方式
本发明提出了一种锌在制备骨或关节修复再生材料中的应用，以正硅酸乙酯、硝酸锌及硝酸钙为原料制成锌修饰硅酸钙涂料，将所述锌修饰硅酸钙涂料涂覆在骨或关节修复再生材料的表面形成锌修饰硅酸钙涂层，并与所述骨或关节修复材料中的BMSCs共培养。
所述的锌修饰硅酸钙中锌钙摩尔比为0.3。
所述的BMSCs取第4代处于对数生长期的BMSCs。
所述的锌修饰硅酸钙中的锌钙摩尔比为1:0.1:1、1:0.3:1或1:0.5:1。
一、材料和方法
(一)材料
1、实验材料和仪器
钛合金金属片、CaSiO3陶瓷涂层钛片、锌修饰硅酸钙陶瓷涂层钛片(以纯钛金属片为基材，规格：圆形直径10mm，厚度2mm，涂层原料为CaSiO3、锌钙摩尔比分别为0.1、0.3、0.5的锌修饰硅酸钙粉体，涂层厚度约为170um，中国科学院上海硅酸盐研究所提供)，将钛合金金属片用逐级打磨光滑，分别将上述材料依次放入丙酮溶液、无水乙醇溶液、去离子水中振荡清洗30min，然后置于干燥箱中干燥后，经高温、高压灭菌备用。第4代SD大鼠BMSCs由第一部分实验获得，酶标仪(BioTek Synergy H1，美国)，超纯水机(MASTER-SUVF，中国)，CO2培养箱(Thermo BNA-311，美国)，倒置相差显微镜(OLMPUS SIX70，日本)，5ml、15ml、50ml离心管(Corning公司，美国)，鼓风干燥箱(DHG-9070A，中国)，荧光显微镜(Leica AF6000，德国)，高速离心机(Eppendorf 5424，德国)，超低温冰箱(Thermo Forma700series，美国)，全自动压力灭菌锅(LDZX-50KB，德国)，大气等离子喷涂系统(APS；SulzerMetco F4-MB，瑞士)，场发射扫描电子显微镜(SEM；Hitachi S-4800，日本)，电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICPAES；Varian 710-ES，英国)，万能试验机(Zwick Z010/TN2A；Ulm公司，德国)，超声清洗器(KQ3200E，中国)。
2、实验试剂
胎牛血清(Gibco公司，美国)，含EDTA的0.25％胰蛋白酶(Gibco公司，美国)，PBS(Gibco公司，USA)，DMEM/F12培养基(Gibco公司，美国)，青霉素/链霉素(Gibco公司，USA)，PBS(Sigma公司，美国)，CCK-8细胞活力检测试剂盒(日本同仁)，β-甘油磷酸钠(Sigma公司，美国)，地塞米松(Sigma公司，美国)，抗坏血酸(Sigma公司，美国)，Clearfil Core New自凝固树脂粘合剂(Kuraray公司，日本)，Panavia 21复合树脂(Kuraray公司，日本)，OxyguardII阻气凝胶(Kuraray公司，日本)，COL-I ELISA试剂盒(GBD公司，美国)、BGP ELISA试剂盒(GBD公司，美国)，ALP检测试剂盒(碧云天公司，中国)。
3、配置试剂
诱导成骨培养基制备：DMEM/F12培养基，10％FBS，1％青霉素/链霉素，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠，0.1mmol/L地塞米松，50μg/ml抗坏血酸。
(二)研究方法
1、等离子喷涂不同锌钙摩尔比锌修饰硅酸钙陶瓷涂层的制备方法
以正硅酸乙酯：硝酸锌：硝酸钙＝1:0.1:1、1:0.3:1及1:0.5:1的摩尔比分别制作成锌修饰硅酸钙陶瓷粉体，以等离子火焰球化，将钛合金金属片作为基底材料，使用等离子喷涂方式将所述锌修饰硅酸钙陶瓷粉体喷涂在钛合金金属片上。
2、不同锌钙摩尔比锌修饰硅酸钙陶瓷涂层的表征
(1)涂层表面形貌
取不同锌钙摩尔比锌修饰硅酸钙陶瓷涂层，超声清洗并干燥，喷金后由扫描电镜(Scanning electron microscope，SEM)观察表面形貌。
(2)涂层结合强度
所有样本在测试前，使用40KHz频率在98％异丙醇中进行超声清洗3min。将Clearfil Core New自凝固树脂粘合剂填充内径为3.3mm的PMMA管。在PMMA管填充7min后，利用校准装置将其与锌修饰硅酸钙陶瓷涂层表面通过Panavia 21复合树脂相结合。去除过量的树脂后，将Oxyguard II阻气凝胶涂抹在其边缘。粘合的样本在37℃下固化10min，随后用水漂洗。每个组需要6个样本。拉伸结合强度使用万能试验机以2mm/min的试验速度进行测试。
3、不同锌钙摩尔比锌修饰硅酸钙陶瓷涂层对BMSCs的生物学影响
(1)实验分组：分五组，未涂层钛合金金属片为阴性对照组(Control组)，CaSiO3陶瓷涂层作为阳性对照组(CaSiO3组)，锌钙摩尔比分别为0.1(Zn-Ca1组)、0.3(Zn-Ca2组)、0.5(Zn-Ca3组)的锌修饰硅酸钙陶瓷涂层作为实验组。
(2)各组材料与BMSCs细胞共培养：取第4代处于对数生长期的BMSCs，弃去培养液，用PBS洗涤2遍，加入预热含EDTA的0.25％胰酶消化液，在37℃消化1-2min，加入少量完全培养基终止消化，反复吹打，移至15ml离心管中离心(1000rpm，5min)，弃上清，加入完全培养基吹打使细胞分散均匀，制成1×104/ml的细胞悬液。将各组材料分别置于24孔板中，每孔加入1ml DMEM/F12培养液浸泡1h后弃去培养基，用PBS分别清洗2次，然后于各孔中加入1mlBMSCs悬液，置于37℃、5％CO2及饱和湿度培养箱中培养，每2-3天换液一次。
(3)各组材料对BMSCs粘附功能的影响：BMSCs在各组材料表面分别培养4h、8h、12h后，将材料置于含1ml完全培养基的24孔板中，加入100μl CCK-8试剂，反应1h后，吸取100μl上清液加入96孔板，置入到酶标仪中，检测每孔的吸光度值(450nm波长)。每组重复6次，设6个复孔。
(4)各组材料对BMSCs细胞增殖活性的影响：BMSCs在各组材料上分别培养1d、4d、7d、14d后，将各组材料取出移入到新的24孔板中，加入100μl CCK-8试剂，反应1h后，吸取100μl上清液加入96孔板，置入到酶标仪中，在450nm波长下检测每孔的吸光度。每组重复6次。
(5)各组材料对BMSCs成骨分化的影响：BMSCS使用成骨诱导培养基在各组材料表面培养，分别培养1d、7d、14d、21d后将长满细胞的材料移置到新的24孔板中，PBS反复清洗，加入不含EDTA的细胞裂解液200μl，在4℃放置15min后反复吹打，将裂解液转移至1.5ml EP管中反复冻融3次，4℃、10000rpm离心5min，以25μl细胞裂解液作为一个待测样本。按照ALP检测试剂盒说明测定BMSCs中ALP的表达量，按照BGP和COL-I ELISA检测试剂盒说明测定BMSCs中的BGP和COL-I的表达量。每个样品重复3次。4、锌修饰硅酸钙涂层促进骨整合的体内实验研究
(1)骨质疏松模型的建立：选用45只雌性新西兰大白兔，体重为2-2.5kg，动物实验操作在第二军医大学动物实验室完成。予戊巴比妥钠腹腔内注射(30毫克/公斤体重)进行全身麻醉，麻醉后常规消毒铺巾，行双侧卵巢切除术，术后逐层关闭切口。术后肌内注射甲强龙琥珀酸钠(MPS)(辉瑞)，剂量为1.0毫克/公斤/天，连续4个月。通过Micro-CT扫描胫骨近端，证实骨质疏松模型的建立。
(2)手术操作过程：骨质疏松模型建立好后，予戊巴比妥钠腹腔内注射(30毫克/公斤体重)进行全身麻醉。麻醉后常规消毒铺巾，于股骨远端行长约2cm纵行切口，逐层剥离肌肉至股骨髁。用电钻钻出直径约2mm、深约1cm的骨道，然后将植入体材料植入股骨髁内。40只卵巢切除的新西兰大白兔被随机分为5组(每组8只)：Ti-6Al-4V(Control组)、HA涂层组、硅酸钙涂层组、Zn-Ca 0.1组和Zn-Ca0.3组。随后,关闭切口用可吸收缝合线(马林、德国),术后常规抗生素和镇痛肌内注射。术后于1、2和3个月各个时间点分别处死大白兔，收集标本，行Micro-CT分析和组织学检查。
(3)Micro-CT分析检查:标本取出后用4％多聚甲醛固定24小时，4℃保存。Micro-CT成像系统(美国Brukermicro CT SkyScan1076)是常用于评估缺陷区域内新骨形成。设置在49kV、200μA，空间分辨率为35μm。选择直径3mm、高度4mm的VOI指数评估骨再生水平及通过三维Micview软件进行分析骨矿物质密度(BMD)、骨体积/骨总量(BV/TV)，骨小梁数目(Tb.N)，骨小梁厚度(Tb.Th)和小梁分离(Tb.Sp)自动确定评价的缺陷区域内新骨形成股头。所有生成的图像均通过SkyScan CTVOX 2.1测量分析。
(4)组织学检测：Micro-CT扫描后，标本采用组织4％多聚甲醛固定3天,采用浓度70％、100％乙醇各逐级脱水1天。然后暴露于二甲苯嵌通过甲基丙烯酸甲酯进行不脱钙包埋处理。垂直于植入物长轴，使用的切割机(Norderstedt EXAKT 300CP Band System,德国)将每个标本沿植入物中心轴的被切成3μm厚的制片。每组制片采用1％甲苯胺蓝进行染色，然后采用光学显微镜进行组织学观察(Olympus,Japan BX51,日本)。
(三)统计分析
所得到的数据均通过SPSS 21.0软件进行统计学分析和处理，计量数据均以均数±标准差表示，进行单因素ANOVA方差分析进行比较，P≤0.05统计学有意义。使用GraphpadPrism 5作为制图软件。二、结果
(一)不同锌钙摩尔比Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层的表征
1、Ca2ZnSi2O7陶瓷原始粉体及涂层大体观
Ca2ZnSi2O7陶瓷原始粉体为白色细腻粉末，钛合金金属片未喷涂前表面光滑，等离子喷涂后可见表面覆盖一层白色陶瓷涂层，质地较硬(见图1)。
2、三组Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层的表面形貌
从扫描电镜(SEM)检测结果可以看出，三组Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层材料表面在低倍电镜下显示均较为粗糙，凹凸不平，3000倍电镜下可见粉末融化后大小约60-120μm液滴状颗粒，涂层由颗粒堆积而成，30000倍电镜下可以发现体积更小，大小约0.5-1.5μm的球状熔融或半熔融微小颗粒。三组涂层材料的表面形貌基本一致，仅存在细微的个体差异(见图2)。由此可见对Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层的等离子喷涂，并没有因锌钙摩尔比的变化而产生差异，形成的颗粒大小跨度较广，形成了大大小小不同的孔隙，为细胞的爬行生长提供了良好的形貌基础。
3、三组Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层及CaSiO3陶瓷涂层的结合强度
拉伸结合强度试验结果显示，三组Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层的结合强度均比CaSiO3陶瓷涂层高(P<0.05)，其中锌钙摩尔比为0.5的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层结合强度最高，锌钙摩尔比为0.3和0.1的涂层递减，但是这三组间的差异无统计学意义(P>0.05)(见表1和图3)。
拉伸结合强度试验结果展示了Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层(35MPa)相比硅酸钙陶瓷涂层(20MPa)更加优异的结合强度，其结合强度随着Zn离子含量的增加而逐渐增高，但是差异并不明显，这为该涂层的体内应用奠定了坚实的基础。
表1各组Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层及CaSiO3陶瓷涂层的结合强度
注：锌钙摩尔比0.1，0.3、0.5的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层分别为Zn-Ca1、Zn-Ca2、Zn-Ca3，*表示和其余组差异具有统计学意义(P<0.05)
(二)不同锌钙摩尔比Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层对BMSCs的生物学影响
1、各组材料对BMSCs粘附功能的影响
BMSCs在各组材料表面种植4h、8h和12h后的粘附情况，根据CCK-8检测结果可见，接种4h后，BMSCs已开始在各组材料表面粘附。未涂层钛合金金属片除了在4h时和CaSiO3涂层没有显著差异(P＞0.05)之外，在各时间点粘附的细胞量均显著低于其余各组涂层(P＜0.05)；三组锌钙摩尔比的Ca2ZnSi2O7涂层表面于各时间点粘附的细胞量均显著高于两组对照组(Control组和CaSiO3组)(P＜0.05)；4h时三种锌钙摩尔比的Ca2ZnSi2O7涂层表面粘附的细胞量无显著差异，8h时锌钙摩尔比为0.3的Zn-Ca2组显著高于锌钙摩尔比为0.5的Zn-Ca3组(P＜0.05)，12h时Zn-Ca2组相对于Zn-Ca1组和Zn-Ca3组粘附的细胞量均显著升高(P＜0.05)(见图4)。
2、各组材料对BMSCs增殖活性的影响
BMSCs在各组材料表面接种1d、4d、7d和14d后的增殖情况，根据CCK-8检测结果可见，BMSCs在各组材料表面随培养时间的延长逐渐增多。接种1d后，BMSCs在各组材料表面增殖情况未见明显区别，实验组略微偏高(P＞0.05)；4d、7d和14d后BMSCs在Zn-Ca1组、Zn-Ca2组和Zn-Ca3组材料表面增殖情况均显著高于两组对照组(Control组和CaSiO3组)(P＜0.05)，其中7d时Zn-Ca2组显著高于Zn-Ca1组和Zn-Ca3组(P＜0.05)，14d时Zn-Ca2组显著高于Zn-Ca1组(P＜0.05)，且在各时间点Zn-Ca2组材料表面BMSCs的增殖率均为最高(见图5)。
BMSCs在三组Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层表面粘附和增殖情况均显著优于未涂层钛片及CaSiO3陶瓷涂层，其中锌钙摩尔比为0.3的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层显著优于其余两组，其余两组总体无明显区别。粘附实验和增殖实验结果显示，相对于未涂层钛合金金属片和CaSiO3涂层，三组Ca2ZnSi2O7涂层均表现出更好的促粘附和促增殖作用，结果同前期使用锌钙摩尔比为0.5的Ca2ZnSi2O7涂层一致。
CaSiO3涂层、Ca2ZnSi2O7涂层因粗糙凹凸的表面和大大小小的孔隙为细胞的粘附和增殖提供了良好的基底形貌条件，相对于光滑的未涂层钛片更加具有优势。而CaSiO3涂层与Ca2ZnSi2O7涂层之间，甚至不同锌钙摩尔比的Ca2ZnSi2O7涂层之间存在显著差异，这和组成涂层的化学组分密不可分。例如Kim HS等将钙(Ca)和锶(Sr)通过阳离子修饰的方法结合到钛植入体表面，通过该材料生物活性离子的持续释放，可以显著促进间充质干细胞的粘附、增殖及成骨分化能力。CaSiO3涂层除了拥有粗糙的表面，还能持续释放Ca、Si离子，这也是它促BMSCs粘附、增殖及成骨分化的作用强于未涂层钛片的原因之一。已有研究证明，CaSiO3涂层具有良好的促进骨整合能力，其中Si离子在促细胞增殖方面发挥着重要作用，CaSiO3浸提液可以增加成骨细胞的增殖率，并可通过促进碱性磷酸酶的分泌，促进前成骨细胞的成骨分化。Ca离子更是BMSCs成骨分化和矿化不可或缺的重要离子。
本实验再次验证了Ca2ZnSi2O7涂层优异的促粘附和促增殖作用，该作用不但对于MC3T3-E1细胞有效，而且对于作为成骨前体细胞的BMSCs同样有效，且作用效果显著，其中效果最佳的锌钙摩尔比为0.3，其效果显著优于锌钙摩尔比为0.5的Ca2ZnSi2O7涂层。
3、各组材料对BMSCs成骨分化的影响
(1)碱性磷酸酶(ALP)活性检测
BMSCs在含诱导成骨培养基的各组材料表面培养1d、7、14d和21d后的ALP活性的表达情况，经ALP活性检测试剂盒检测可见，BMSCs在各组材料表面培养后ALP活性随时间延长逐渐增加，14d达到峰值后回落，21d时均较前有所降低。培养1d后，BMSCs的ALP活性在实验组(Zn-Ca1组、Zn-Ca2组和Zn-Ca3组)略微偏高，无统计学意义(P＞0.05)；7d、14d和21d时，BMSCs在实验组(Zn-Ca1组、Zn-Ca2组和Zn-Ca3组)的ALP活性均显著高于两组对照组(Control组和CaSiO3组)(P＜0.05)，其中Zn-Ca2组显著高于其余两组实验组(P＜0.05)，且CaSiO3组均显著高于Control组(P＜0.05)；Zn-Ca3组除了在14d时BMSCs的ALP活性显著高于Zn-Ca1组之外(P＜0.05)，其余各时间点均无明显区别(P＞0.05)。在各时间点Zn-Ca2组材料表面BMSCs的ALP活性均为最高(见图6)。
(2)ELISA检测骨钙素(BGP)含量
BMSCs在含诱导成骨培养基的各组材料表面培养1d、7d、14d和21d后的BGP的含量生成情况，经ELISA试剂盒检测可见，BMSCs在各组材料表面培养后BGP含量随时间逐渐增加，21d达到最高峰。培养1d后，BMSCs的BGP含量在各组之间的差别无统计学意义(P＞0.05)；7d、14d和21d时，BMSCs在实验组(Zn-Ca1组、Zn-Ca2组和Zn-Ca3组)的BGP含量均显著高于两组对照组(Control组和CaSiO3组)(P＜0.05)，其中14d和21d时Zn-Ca2组显著高于其余两组实验组(P＜0.05)，CaSiO3组也均显著高于Control组(P＜0.05)；Zn-Ca1组和Zn-Ca3组在各时间点均无明显区别(P＞0.05)。在各时间点Zn-Ca2组材料表面BMSCs的BGP含量均为最高(见图7)。
(3)ELISA检测I型胶原(COL-I)含量
BMSCs在含诱导成骨培养基的各组材料表面培养1d、7d、14d和21d后的COL-I的含量生成情况，经ELISA试剂盒检测可见，BMSCs在各组材料表面培养后COL-I含量随逐渐增加，14d达到峰值后降低。培养1d后，BMSCs的COL-I含量在各组之间的差别无统计学意义(P＞0.05)；7d、14d和21d时，BMSCs在实验组(Zn-Ca1组、Zn-Ca2组和Zn-Ca3组)的COL-I含量均显著高于两组对照组(Control组和CaSiO3组)(P＜0.05)，CaSiO3组也均显著高于Control组(P＜0.05)，其中14d时Zn-Ca2组显著高于其余两组实验组(P＜0.05)，而Zn-Ca3组显著高于Zn-Ca1组(P＜0.05)。在各时间点Zn-Ca2组材料表面BMSCs的COL-I含量均为最高(见图8)。
成骨分化实验结果显示，添加了成骨诱导剂之后，与各组材料共培养的BMSCs成骨分化程度随时间推移均逐渐加深，ALP、COL-I表达量均在14d左右达到高峰，BGP表达量在21d中随时间推移而递增，符合ALP、COL-I在成骨分化早期表达，后期减少，而BGP表达在后期达到高峰的生理规律。三组Ca2ZnSi2O7涂层均比未涂层钛合金金属片和CaSiO3涂层拥有更强的促BMSCs成骨分化能力，其中锌钙摩尔比为0.3的Ca2ZnSi2O7涂层效果最佳，与粘附和增殖实验结果相一致。骨植入体表面的化学组分、粗糙程度、释放的活性离子等因素均会影响成骨前体细胞的粘附、增殖及分化功能。
4、各组涂层植入体材料促进骨整合的体内实验研究
(1)Micro-CT评估
为了评估不同锌钙摩尔比Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层促进骨整合的动物体内效果，我们分为钛合金组(Control组)、羟基磷灰石涂层组(HA组)、硅酸钙陶瓷涂层组(CaSiO3组)、锌钙摩尔比为0.1的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层组(Zn-Ca 0.1组)、锌钙摩尔比为0.3的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层组(Zn-Ca 0.3组)，将各涂层植入体分别植入存在骨质疏松的新西兰大白兔股骨内，钛棒直径为2.0mm、长度10mm。使用3D Micro-CT初步评价对照组和实验组之间的骨植入体界面和植入物周围骨组织的骨小梁显微结构的差异(图9A)。在植入1个月后，在对照组、HA和CaSiO3涂层表面几乎没有显示新骨形成，而锌修饰硅酸钙涂层则展示出了更佳的骨修复和骨整合能力，并且随着锌钙摩尔比的增加而增强。在植入后2-3个月，所有组都随着植入时间的延长增加了骨形成。此外，可以直观地观察到，Zn-Ca 0.3涂层表面上的骨密度与未涂层对照组以及其它涂层组相比得到了显著增强。以成骨作用的大小排序如下：Zn-Ca 0.3>Zn-Ca 0.1>CaSiO3>HA>对照组。这一结果表明，Zn-Ca0.3涂层在植入后的骨形成中表现出更强的促进作用。
所有Micro-CT参数的综合定量分析如图9B所示。在植入1月后，虽然锌修饰涂层对所有Micro-CT参数产生了轻微的影响，但是这些涂层之间的差异不显著。植入后2至3个月，HA、CaSiO3、Zn-Ca 0.1和Zn-Ca 0.3涂层所有结构骨参数显着增加，参数包括骨矿物质密度(BMD)，骨体积/组织体积(BV/TV)，骨小梁数(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)，以及较低的骨小梁分离(Tb.Sp)。此外，Zn-Ca 0.3涂层对这些参数具有最强的影响，并且在所有五组中出现显著差异，这恰恰提供了对Micro-CT图像结果的支持。
(2)组织学分析
组织学分析可以弥补Micro-CT分析的节段性缺陷，能显示骨植入体界面和植入体周围骨组织的细节(图10)。在植入1月和2月后，未涂层钛棒组的表面没有形成新骨，植入3月后，仅有少部分新骨形成，并且在植入体周围几乎没有形成骨整合；HA涂层，在植入1月后开始形成少量新骨，随后在植入2月时，HA涂层表面的形成了更多新骨，并且在植入3月后有少量骨整合形成；CaSiO3涂层在植入1月时，表面发现少量新骨，而且更多的新骨在植入2月时再次沿着界面生成，植入3月时形成了少量骨整合。Zn-Ca 0.1和Zn-Ca 0.3涂层组在植入1个月时就显示出了卓越的新骨形成诱导能力，并且从第2个月起，植入体周围有大量以矿化骨为特征的新骨形成，充斥在植入体和骨组织之间的空隙中。我们发现，从植入2个月开始，大量新骨与Zn-Ca 0.3涂层表面整合，在植入3月时，新骨几乎已经与植入体表面形成了紧密的整合。总的来说，我们的研究结果表明，Zn-Ca 0.3涂层在植入体内后能够促进骨界面的构建和骨整合的形成。
图10为组织切片通过甲苯胺蓝染色，切片分别未涂层钛棒(Control)，羟基磷灰石(HA)，CaSiO3，Zn-Ca 0.1和Zn-Ca 0.3涂层钛棒植入有骨质疏松的新西兰大白兔股骨髁后1、2、3月，比例尺为500μm。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (7)

1.锌在制备骨或关节修复再生材料中的应用，其特征在于，
以正硅酸乙酯、硝酸锌及硝酸钙为原料制成锌修饰硅酸钙涂料，将所述锌修饰硅酸钙涂料涂覆在骨或关节修复再生材料的表面形成锌修饰硅酸钙涂层，并与骨髓间充质干细胞BMSCs共培养。
2.根据权利要求1所述的锌在制备骨或关节修复再生材料中的应用，其特征在于，所述的锌修饰硅酸钙中锌钙摩尔比为0.3。
3.根据权利要求1所述的锌在制备骨或关节修复再生材料中的应用，其特征在于，所述的BMSCs取第4代处于对数生长期的BMSCs。
4.根据权利要求1所述的锌在制备骨或关节修复再生材料中的应用，其特征在于，所述的锌修饰硅酸钙涂料中正硅酸乙酯、硝酸锌及硝酸钙的摩尔比为1:0.1:1、1:0.3:1或1:0.5:1。
5.根据权利要求1至4任一项所述的锌在制备骨或关节修复再生材料中的应用，其特征在于，所述的骨或关节修复再生材料为人工骨、关节、融合器、螺钉。
6.根据权利要求1至4任一项所述的锌在制备骨或关节修复再生材料中的应用，其特征在于，所述的形成锌修饰硅酸钙涂层的方法为：以正硅酸乙酯、硝酸锌及硝酸钙为原料制成锌修饰硅酸钙陶瓷粉体，以等离子火焰球化，将钛合金金属片作为基底材料，使用等离子喷涂方式将所述锌修饰硅酸钙陶瓷粉体喷涂在钛合金金属片上。
7.根据权利要求3所述的锌在制备骨或关节修复再生材料中的应用，其特征在于，已涂覆好锌修饰硅酸钙涂层的骨或关节修复再生材料与第4代处于对数生长期的BMSCs细胞共培养1天以上。
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