CN106577277A

CN106577277A - 一种南美油藤愈伤组织诱导，分化和植株再生的方法

Info

Publication number: CN106577277A
Application number: CN201611041750.9A
Authority: CN
Inventors: 陈德生; 熊翠英; 杨植芳; 文凤; 薛必猛
Original assignee: XISHUANGBANNA YINQI BIOLOGICAL RESOURCES DEVELOPMENT Co Ltd; Yunnan Cloud Cast Ecological Environment Polytron Technologies Inc
Current assignee: XISHUANGBANNA YINQI BIOLOGICAL RESOURCES DEVELOPMENT Co Ltd; Yunnan Cloud Cast Ecological Environment Polytron Technologies Inc
Priority date: 2016-11-23
Filing date: 2016-11-23
Publication date: 2017-04-26

Abstract

本发明涉及一种南美油藤的愈伤组织诱导，分化及植株再生的方法。南美油藤种子含有棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等多种不饱和脂肪酸，同时还含有多种维生素和丰富的蛋白质，是优质的保健食用油和化妆品原料。为了克服南美油藤规模化引种在种植中出现的较原产地存活期短，抗病性差，种质退化等现象，对南美油藤进行种质改良，提高抗病性及耐寒性，筛选及培育适应性强的南美油藤新品种刻不容缓。本发明以南美油藤种子为繁殖材料，利用植物组织培养技术，通过种子无菌萌发、愈伤组织诱导及分化，再生植株形成等过程，建立了一套植物脱分化，再分化的体系。本发明是现代生物技术育种必要的技术基础，对南美油藤的品种改良及优良品种繁育具有重要意义。

Description

一种南美油藤愈伤组织诱导，分化和植株再生的方法

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种南美油藤愈伤组织诱导，分化和植株再生的方法。

背景技术

南美油藤(Plukenetia volubilis L.)，又名星油藤、印加果、印加花生，为大戟科多年生木质藤本植物，原生长在南美洲安第斯山脉的热带雨林。南美油藤种子含有棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等多种不饱和脂肪酸，含量高达90％以上，同时还含有维生素A，维生素E等抗氧化成分和丰富的蛋白质，具有较强的抗氧化性的药食保健功能，是优质的保健食用油和化妆品原料，目前在云南南部及周边低海拔地区大面积推广种植。

南美油藤生长迅速，种子繁殖可当年育苗当年开花结实，种子产量700～2000kg/hm2的，盛产年份可达10年以上。但由于南美油藤为近年来新引种植物，引种资源较少，遗传基础窄，对新种植环境的适应性尚不稳定，迄今尚未筛选出适应性强的优良品种。目前在种植地区已出现南美油藤较原产地存活期短，抗病性较差，种质退化等现象。因此利用现代生物技术手段对南美油藤进行种质改良，提高抗病性及耐寒性，筛选及培育适应性强的南美油藤新品种是大面积推广种植南美油藤的必要措施。本发明以南美油藤种子为繁殖材料，利用植物组织培养技术，通过种子无菌萌发、愈伤组织诱导及分化，再生植株形成等过程，建立了一套植物脱分化，再分化的体系。本发明是现代生物技术育种必要的技术基础，对南美油藤的品种改良及优良品种繁育具有重要意义。

发明内容

本发明的要解决的问题是建立一套南美油藤外植体脱分化再分化的植物再生体系，为现代生物技术育种奠定技术基础。

为了上述目的，本发明提供了包括一种南美油藤种子的无菌萌发、初代培养及愈伤组织诱导与分化、不定芽的增殖培养、不定芽的继代培养、生根培养和驯化和移栽等步骤，具体如下：

1、南美油藤种子的无菌萌发：

(1)种子的预处理：选取当年采集成熟饱满的种子，用0.1％高锰酸钾溶液浸泡15min消毒，清水冲洗后用60℃温水浸泡42小时催芽，流水冲洗30min，用无菌滤纸吸干水分，剥去外种皮。

(2)消毒处理:将上述种子用75％乙醇浸泡30s，无菌水洗一次，置入0.1％升汞溶液消毒15min，无菌水冲洗5～6次，无菌滤纸吸干水分备用。

(3)种子萌发：将消毒处理后的种子，以胚为纵轴，切去两边胚乳，接入种子萌发培养基中，26℃±1℃下散射光培养，光照强度500～1000Lx。培养30～35d后，种子萌发生长至3cm以上后，以无菌幼苗为外植体。

2、初代培养及愈伤组织诱导与分化：

取无菌幼苗子叶为外植体，切段，接种于诱导与分化培养基中，26℃±1℃下培养，每天光照12小时，光照强度2000～2500Lx 20～25天后形成愈伤组织，继续培养40天左右分化出不定芽。

3、不定芽的增殖：

将形成不定芽块转入转移至增殖培养基中，26℃±1℃下继代培养，每天光照12小时，光照强度2000～2500Lx培养，不定芽可增殖，培养周期40～45天。

4、不定芽的继代培养：

新增殖的芽细小，叶片有些卷曲皱缩，将其转接入继代培养基中继续生长，使之叶片伸展，茎伸长，成为健壮无根小苗。培养温度26℃±1℃，光照强度2000～3000Lx，每天光照12小时。当小苗长至3～4cm时，进入生根培养。

5、生根培养：

将生长正常的无根芽苗从基部切下接入生根培养基中，25±1℃培养，光照12h，光照强度2000～2500lx。20～30天后，小苗开始生根。当根在三条以上，长度1cm左右，即可进入驯化阶段。

6、驯化和移栽：

将生根苗培养瓶置于大棚中，自然光下二周后开盖驯化，一周后将小苗移出，洗净基部培养基，在多菌灵500倍液中浸泡15min，移入草炭土：珍珠岩：黄心土＝1：1：1的基质中种植，常规水肥管理。

上述各步骤所用的培养基分别为：

种子萌发培养基：B₅+蔗糖30g/L+琼脂4～6g/L pH 5.8。

诱导与分化培养基：1/3MS+6-BA0.5～1.0mg/L+IBA0.1～0.5mg/L+L-谷氨酰胺15～30mg/L+L-精氨酸15～30mg/L+椰乳100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4～6g/L pH 5.8。

增殖培养基：改良MS+2ip0.1～0.5mg/L+糖30g/L+琼脂4～6g g/L pH 5.8。

继代培养基：1/4MS+糖30g/L+琼脂4～6g/L pH 5.8。

生根培养基：改良MS+NAA0.2～0.5mg/L+糖30g/L+琼脂4～6g g/L pH 5.8。

具体实施方法通过下面实施实例对本发明进行具体描述

实施例1

南美油藤种子无菌萌发培养基的筛选与优化：

(2)消毒处理:将上述已除去外种皮的种子用75％乙醇浸泡30s，无菌水洗一次，置入0.1％升汞溶液消毒15min，无菌水冲洗5～6次，无菌滤纸吸干水分备用。

(3)种子萌发：将消毒处理后的种子，以胚为纵轴，切除两边胚乳，接入种子无菌萌发培养基中，种子无菌萌发培养基共5组(见表1)。26℃±1℃下散射光培养，光照强度500～1000Lx。培养30～35天后，观察记录结果。

(4)观察结果：培养5天后，可见部分种子开始萌动，30～35天形成具有两片绿色较大子叶的幼苗，当幼苗生长至3cm以上后，可作为无菌外植体进行愈伤组织诱导。观察统计各组培养基对种子萌发的状况，结果表明：以B₅培养基中的种子萌发状况明显优于MS培养基，尤其以第5组培养基B₅+蔗糖30g/L+琼脂4.0～6.0g/L pH5.8为最佳。加入细胞分裂素和生长素对种子的萌发的最初阶段影响不明显。

各组培养基培养状况统计详见下表

实施例2

诱导与分化培养基的筛选与优化：

将上述无菌萌发的无菌小苗切段，接种于诱导与分化培养基中，26℃±1℃下培养，光照强度2000～2500Lx，每天光照12小时。

诱导与分化培养基共包括以下4组培养基：

B0:对照组(MS,1/3MS,改良MS)

B1:1/3MS+6-BA0.5～4.0mg/L+IBA0.1mg/L+L-谷氨酰胺15mg/L+L-精氨酸15mg/L+椰乳100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L pH5.8；

B2:MS+ZT0.5-1.0mg/L+IBA0.1mg/L+椰乳100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L pH5.8。；

B3:改良MS+6-BA0.5～1.0mg/L+IBA0.1mg/L+JA(茉莉酸)50-100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L pH5.8。

(5)试验结果：培养20天左右，外植体产生愈伤组织，继续培养45-45天后，愈伤组织分化产生不定芽，各培养基培养对诱导和分化的影响不同，其中对照组中，外植体产生的白色疏松的愈伤组织，且不容易分化为不定芽。其它三组均可诱导产生愈伤组织，继而分化不定芽，其分化率以B1为佳，B3次之，B2较差。

通过反复对比试验，最终以1/3MS+6-BA0.5～1.0mg/L+IBA0.1～0.5mg/L+L-谷氨酰胺15～30mg/L+L-精氨酸15～30mg/L+椰乳100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4～6g/L pH 5.8为所选的最优诱导与分化培养基。

实施例3

增殖、继代与生根培养

(1)增殖培养：将上述分化的芽苗团块转接入增殖培养基中，即

改良MS-5+2ip0.1～0.5mg/L+糖30g/L+琼脂4～6g g/L pH 5.8，接种后置于26℃±1℃下培养，光照强度2000～2500Lx，光照时间每天12小时，40～45天一个周期。

(2)继代培养：新增殖的芽细小，叶片有些卷曲皱缩，将其转接入继代培养基中继续生长，使之叶片伸展，茎伸长，成为健壮无根小苗。小苗继代培养基为：1/4MS+糖30g/L+琼脂4～6g/L pH 5.8；培养温度26℃±1℃，光照强度2000～3000Lx，每天光照12小时。当小苗长至3～4cm时，进入生根培养。

(3)生根培养：将上述无根小苗接入生根培养基诱导生根，并于26℃±1℃下培养，光照强度2000～3000Lx，光照时间每天12小时，20～30天左右可以生根。

上述实施例的描述只为说明本发明的技术构思及特点。本行业的技术人员应该了解，其目的在于供本领域技术人员了解本发明的内容并据以实施,本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内,本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效果界定。

Claims

1.一种南美油藤愈伤组织诱导，分化和植株再生的方法，其特征在于：包括南美油藤种子的无菌萌发、初代培养及愈伤组织诱导与分化、不定芽的增殖培养、不定芽的继代培养、生根培养和驯化和移栽：

第一步：南美油藤种子的无菌萌发：

种子用常规方法消毒催芽，剥去外种皮；将上述剥去外种皮的种子用75％乙醇浸泡30s后置入0.1％升汞溶液消毒15min，无菌水冲洗5～6次，无菌滤纸吸干水分。将消毒处理后的种子，以胚为纵轴，切去两边胚乳，接入种子无菌萌发培养基中，26℃±1℃下散射光培养，光照强度500～1000Lx。培养30～35天后，种子萌发生长至3cm以上后，以无菌幼苗为外植体。

第二步：初代培养及愈伤组织诱导与分化

第三步：不定芽的增殖培养

将形成不定芽块转入转移至增殖培养基中，26℃±1℃下继代培养，光照强度2000～2500Lx培养，每天光照12小时，不定芽可增殖，培养周期40～45天。

第四步：不定芽的继代培养

第五步：生根培养

将生长正常的无根芽苗从基部切下接入生根培养基中，25±1℃培养，光照12h，光照强度2000～3000lx。培养20～30天后生根。

第六步：驯化和移栽

将生根苗培养瓶置于大棚中，自然光下培养二周后开盖驯化，一周后将小苗移出，洗净基部培养基，在多菌灵500倍液中浸泡15min，移入草炭土：珍珠岩：黄心土＝1：1：1的基质中种植，常规水肥管理。

2.按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(1)所述的种子无菌萌发培养基为：B₅+蔗糖30g/L+琼脂4～6g/L pH 5.8。

3.按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(2)所述的诱导与分化培养基为：1/3MS+6-BA0.5～1.0mg/L+IBA0.1～0.5mg/L+L-谷氨酰胺15～30mg/L+L-精氨酸15～30mg/L+椰乳100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4～6g/L pH 5.8。

4.按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(3)所述的增殖培养基为：改良MS+2ip0.1～0.5mg/L+糖30g/L+琼脂4～6g/LpH 5.8。

5.按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(4)所述的继代培养基为：1/4MS+糖30g/L+琼脂4～6g g/L pH 5.8。

6.按照权利要求1的方法，其特征在于步骤(5)所述的生根培养基为：改良MS+NAA0.2～0.5mg/L+糖30g/L+琼脂4～6g g/LpH 5.8。