CN106573970A

CN106573970A - 用于hdl和apoa1的纯化和检测的组合物和方法

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Publication number: CN106573970A
Application number: CN201580030344.XA
Authority: CN
Inventors: T·科利尔; C·比斯特隆; A·希金斯
Original assignee: Cleveland Heartlab Inc
Current assignee: Cleveland Heartlab Inc
Priority date: 2014-05-15
Filing date: 2015-05-15
Publication date: 2017-04-19
Anticipated expiration: 2035-05-15
Also published as: WO2015175864A1; AU2023222961A1; AU2020244532A1; CN106573970B; EP3143041A4; EP3620466B1; JP2017516108A; JP2020115134A; CA2948367C; US11061039B2; AU2015258962B2; US12085577B2; US20210373038A1; US20150331000A1; US20190250177A1; JP6669670B2; EP4159754A1; CN113834925A; EP3143041A1; JP6866517B2

Abstract

本发明提供使用包含HDL亲脂核结合肽(例如，ApoA1的部分)和亲和标签的HDL标记分子纯化来自样品(例如，血液样品)的HDL分子的方法、试剂盒和组合物。本发明还提供用质谱法检测非片段化ApoA1的方法、试剂盒和组合物。本发明进一步提供用可检测标记的ApoA1分子标记样品中的HDL分子，使得可确定可检测标记的ApoA1分子与原生ApoA1蛋白的比率的方法、试剂盒和组合物。

Description

用于HDL和APOA1的纯化和检测的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年5月15日提交的美国临时申请号61/993,696的优先权，所述临时申请以引用的方式并入本文。

发明领域

背景

血清脂蛋白包含脂质-蛋白复合物的异质群体，所述复合物可基于与脂质和蛋白含量有关的粒子密度的差异分组成广泛类别，即极低(VLDL)、低(LDL)和高(HDL)密度。VLDL和LDL主要由脂质构成，而高密度脂蛋白具有较高的蛋白含量(约50％)。LDL的密度在1.006-1.063g/ml之间，而HDL和HDL样粒子的密度为1.063-1.21g/ml。分离HDL与VLDL和LDL的经典方法采用连续密度超速离心，所述连续密度超速离心使用制备成具有在各脂蛋白类别范围内的密度的溴化钾盐溶液。这些用于制备纯化的HDL的方法的一种缺点是其需要最少两个延长的超速离心步骤。分离VLDL和LDL与HDL的第一步骤在d＝1.063g/ml KBr盐溶液中需要18小时超速离心旋转。易浮的VLDL和LDL浓缩于盐梯度的上层中并且可容易地去除，留下不太易浮的HDL连同其它较重蛋白一起浓缩于底层中。接着通过在d＝1.21g/ml KBr盐溶液中执行第二超速离心步骤持续21小时使HDL与其它无脂质血清蛋白分离。所述HDL在这一密度盐溶液中是易浮的，因此在所述离心结束时，所述梯度的上层主要含有HDL，留下其它血浆蛋白在底部部分中。这种连续密度梯度超速离心程序是用于HDL的分离的“优质标准”。然而，两个超速离心步骤所需的延长的时间和对于多次密度调节的需要清楚地限制了所述程序的通过量。

发明概述

本发明提供使用包含HDL亲脂核结合肽(例如，ApoA1的部分)和亲和标签的HDL标记分子纯化来自样品(例如，血液样品)的HDL分子的方法、试剂盒和组合物。在某些实施方案中，所述HDL纯化是快速的(例如，少于1小时)并且允许至少一种心血管风险因素(例如，胆固醇水平、ApoA1的氧化状态等)的确定。本发明还提供用于检测非片段化ApoA1的方法、试剂盒和组合物。本发明进一步提供用可检测标记的ApoA1分子标记样品中的HDL分子，使得可确定可检测标记的ApoA1分子与原生ApoA1蛋白的比率的方法、试剂盒和组合物。

在一些实施方案中，此处提供产生纯化的样品的方法，所述方法包括：a)混合含有HDL分子(例如，成熟HDL分子)和非HDL生物分子的群组的初始样品(例如，ApoB/LDL缺失或未缺失的样品)与HDL标记分子的群组以产生混合样品，其中所述HDL分子各自包含：i)HDL亲脂核和ii)多种HDL脂蛋白，并且其中所述HDL标记分子各自包含：i)HDL亲脂核结合肽，和ii)亲和标签；b)孵育所述混合的样品，使得至少一些所述HDL标记分子结合至少一些所述HDL分子，由此产生标记的HDL分子的群组；和c)纯化所述标记的HDL分子的群组的至少一部分与所述非HDL生物分子(和未标记HDL分子)分开以产生纯化的样品，其中所述纯化包括使所述混合的样品与对所述亲和标签有特异性的捕获分子的群组接触。

在某些实施方案中，将所述HDL标记分子添加至所述初始样品中，使得标记的ApoA1分子与未标记ApoA1分子的比率为约1:10-10:1、1:5-4:1或约1:3-3:1或约1:2-2:1；或约1:1。在某些实施方案中，所述初始样品为血清样品，并且添加至所述血清样品中的HDL标记分子的量为约0.1mg-4mg/ml血清样品，或约0.5mg-2mg/ml血清样品，或约1mg/ml血清样品。

在一些实施方案中，本文中提供组合物，所述组合物包含：a)HDL标记分子的群组，所述分子包含：i)ApoA1或ApoA1模拟物的至少一部分，其能够结合HDL，和ii)亲和标签；和b)未标记、野生型ApoA1分子的群组；其中存在于所述组合物中的所述HDL标记分子与所述未标记分子的所述比率为1:2-2:1。

在特定实施方案中，所述组合物进一步包含人血清、全血、血浆或重构HDL样品。在进一步实施方案中，所述人血清是非LDL缺失的人血清、全血或血浆。在其它实施方案中，所述亲和标签不含不成对电子。在额外实施方案中，所述未标记、野生型ApoA1分子是HDL分子的一部分。

在一些实施方案中，本文中提供组合物，所述组合物包含：a)非LDL缺失的血液、血浆或血清样品；和b)HDL标记分子的群组，各自包含：i)HDL亲脂核结合肽，和ii)亲和标签。在某些实施方案中，所述HDL亲脂核结合肽包含载脂蛋白A-I(ApoA1)的HDL结合区，并且其中所述非LDL缺失的血液、血浆或血清样品包含未标记ApoA1分子。在额外实施方案中，所述HDL标记分子存在于所述非LDL缺失的血液、血浆或血清样品中，使得所述HDL标记分子与所述未标记ApoA1分子的比率在所述组合物中为1:2-2:1。

在一些实施方案中，本文中提供包含HDL标记分子的组合物，所述HDL标记分子包含：a)HDL亲脂核结合肽，和b)亲和标签，其中所述亲和标签不含不成对电子。

在特定实施方案中，本文中提供包含标记的HDL分子的组合物，其中所述标记的HDL分子包含：a)HDL分子，所述分子包含：i)HDL亲脂核和ii)多种HDL脂蛋白，和b)HDL标记分子，所述HDL标记分子包含：i)HDL亲脂核结合肽和ii)亲和标签，其中所述亲和标签不含不成对电子，并且其中所述HDL亲脂核结合肽结合所述HDL亲脂核。

在进一步实施方案中，本文中提供组合物，所述组合物包含：a)HDL标记分子，所述分子包含：i)HDL亲脂核结合肽，和ii)亲和标签；和b)捕获分子的群组，其中所述捕获分子对所述亲和标签有特异性。

在某些实施方案中，本文中提供试剂盒和系统，其包含：a)HDL标记分子，所述分子包含：i)HDL亲脂核结合肽，和ii)亲和标签；和b)捕获分子的群组，其中所述捕获分子对所述亲和标签有特异性。在某些实施方案中，所述HDL标记分子在第一容器中，并且其中所述捕获分子的群组在第二容器中。

在某些实施方案中，所述HDL亲脂核结合肽包含载脂蛋白A-I(ApoA1)的HDL结合区。在某些实施方案中，所述亲脂核结合肽包含人ApoA1的一部分，如人ApoA1的氨基酸残基188-243。在其它实施方案中，在所述HDL分子的每一个中的所述多种HDL脂蛋白包含第一和第二原生ApoA1蛋白，并且其中当所述标记的HDL分子结合所述HDL分子时，所述HDL标记分子的至少一个置换(或结合所述亲脂核连同所述第一和第二原生ApoA1分子)在所述HDL分子的每一个中的所述第一原生ApoA1蛋白。在进一步实施方案中，所述HDL亲脂核结合肽包含ApoA1或ApoA1模拟物的至少一部分。

在进一步实施方案中，所述HDL亲脂核结合肽包含载脂蛋白A-II(ApoA2)(例如人ApoA1)的HDL结合区。在额外实施方案中，所述HDL亲脂核结合肽包含ApoA2或ApoA2模拟物的至少一部分。在某些实施方案中，所述HDL亲脂核结合肽包含载脂蛋白E(ApoE)(例如人ApoE)的HDL结合区。在额外实施方案中，所述HDL亲脂核结合肽包含ApoE或ApoE模拟物的至少一部分。

在特定实施方案中，所述亲和标签不含不成对电子(例如，所述亲和标签无法充当自旋标记)。在其它实施方案中，所述亲和标签包含选自由以下组成的组的肽标签：AviTag、钙调蛋白-标签、聚谷氨酸标签、FLAG-标签、HA-标签、His-标签、Myc-标签、S-标签、SBP-标签、Softag 1、Sotftag 3、Strep-标签、TC标签、V5标签、Xpress标签、Isopeptag和SpyTag。在某些实施方案中，所述亲和标签是基于点击化学的标签。在额外实施方案中，所述捕获分子是选自由以下组成的组：抗体、抗生蛋白链菌素、钙调蛋白、镍螯合物和钴螯合物。在进一步实施方案中，所述捕获分子结合固体支撑物。在额外实施方案中，所述固体支撑物是选自珠粒、亲和柱、载玻片或其它可用固体支撑物。

在某些实施方案中，初始样品是血液样品、血清样品、血浆样品或其它生物流体(例如尿液)。在特定实施方案中，所述初始样品是来自哺乳动物(例如狗、猫、马、猪或其它家畜)。在某些实施方案中，所述初始样品是来自人(例如，处于心血管疾病风险中或患有心血管疾病的人)。在某些实施方案中，所述初始样品缺失LDL粒子。

在某些实施方案中，在纯化的样品中的所有所述蛋白的至少90％是HDL脂蛋白(例如至少90％...94％...98％...99％...或至少99.9％)。在一些实施方案中，在纯化的样品中的所有所述蛋白的少于10％是非HDL脂蛋白(例如少于10％...5％...1％...0.2％)。在某些实施方案中，所述非HDL脂蛋白主要或完全是血清白蛋白。在其它实施方案中，所述方法在1小时或更少时间(例如1小时…45分钟…37分钟…30分钟…21分钟…15分钟…或10分钟)内从初始样品产生纯化的样品。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括分析所述纯化的样品以便确定所述标记的HDL分子的群组的至少一个特征。在特定实施方案中，所述至少一个特征包括存在于所述标记的HDL分子的群组中的胆固醇的水平。在其它实施方案中，其中所述标记的HDL分子包含至少一种原生ApoA1蛋白，并且其中所述至少一个特征包括确定所述原生ApoA1蛋白的氧化状态。在特定实施方案中，确定所述原生ApoA1蛋白的氧化状态(例如，在所述原生ApoA1蛋白中的以下酪氨酸氨基酸残基之一处：29、166、192和236)。在进一步实施方案中，所述分析用选自由以下组成的组的技术执行：质谱法(MS)、色谱法、LC-MS、等离子体共振和包括聚乙烯基磺酸(PVS)和聚乙二醇-甲醚(PEGME)的使用的分析。在某些实施方案中，定量来自分离的HDL分子的原生ApoA1(例如，通过质谱法)。

在某些实施方案中，所述标记的HDL分子的群组的所述至少一个特征是针对受试者的心血管疾病风险标志物并且用于受试者中的心血管疾病的诊断和/或治疗。在特定实施方案中，所述心血管疾病标志物包含受试者中的HDL-c水平。在进一步实施方案中，所述治疗包括向受试者施用心血管相关治疗剂(例如斯达汀、ACE抑制剂、醛固酮抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂、β-阻断剂、钙通道阻断剂、降胆固醇药物、地高辛、利尿剂、钾、镁、血管扩张剂或杀鼠灵)或生活方式改变的建议。

在某些实施方案中，本文中提供包括以下的方法：使包含大体上纯化的非片段化ApoA1蛋白的样品经历质谱法，使得关于所述非片段化ApoA1蛋白产生质谱报告(例如电子报告、纸质报告等)。

在某些实施方案中，所述质谱法在至少5000半高全宽(FWHM)(例如，至少5000…6000…10,000…15,000…25,000…30,000…35,000或更高)的分辨率下执行。在一些实施方案中，所述非片段化ApoA1蛋白的至少一部分包含与增加的心血管疾病风险有关的至少一种修饰的氨基酸(例如，至少一种、两种、三种、四种或更多种修饰的氨基酸)。在某些实施方案中，谱报告包含关于包含至少一种修饰的氨基酸的所述非片段化ApoA1蛋白的部分的谱。在进一步实施方案中，所述修饰的氨基酸是选自由以下组成的组：修饰的酪氨酸、修饰的色氨酸和修饰的甲硫氨酸。在其它实施方案中，所述修饰的酪氨酸处于ApoA1内选自由以下组成的组的位置处：29、166、192和236。在特定实施方案中，所述修饰的甲硫氨酸处于ApoA1内选自由以下组成的组的位置处：86、112和148。在某些实施方案中，所述样品是来自受试者，并且其中所述方法进一步包括以下行为中的至少一个：i)向所述受试者或所述受试者的医师告知所述受试者处于增加的心血管疾病(CVD)风险中；ii)向所述受试者或所述受试者的医师提供质谱报告；iii)向所述受试者推荐、开立处方或施用CVD相关治疗剂；和iv)向所述受试者推荐、开立处方或施用与检测CVD风险有关的跟踪测试。

在某些实施方案中，本文中提供包括以下的方法：a)使纯化的HDL样品经历色谱法，使得产生大体上不含HDL相关磷脂的纯化的ApoA1样品，其中所述纯化的HDL样品包含HDL分子，并且其中所述纯化的ApoA1样品包含非片段化ApoA1蛋白；和b)使所述纯化的ApoA1样品经历质谱法，使得关于所述非片段化ApoA1蛋白产生质谱报告。

在进一步实施方案中，用本文所述的方法(例如，使用HDL标记分子)产生所述纯化的HDL。在进一步实施方案中，所述HDL分子包含：i)所述非片段化ApoA1蛋白，和ii)HDL标记分子，其中所述HDL标记分子包含：A)HDL亲脂核结合肽，和B)亲和标签。在进一步实施方案中，步骤a)中的所述经历和步骤b)中的所述经历通过将所述纯化的HDL样品注射至执行色谱法和质谱法的器件中来实现。在一些实施方案中，所述器件是液相色谱-质谱(LC/MS)机器。在额外实施方案中，所述质谱法在至少5000半高全宽(FWHM)的分辨率下执行。

在额外实施方案中，所述非片段化ApoA1蛋白的至少一部分包含与增加的心血管疾病风险有关的至少一种修饰的氨基酸。在其它实施方案中，最大谱报告包含关于包含至少一种修饰的氨基酸所述非片段化ApoA1蛋白中的部分的谱。在其它实施方案中，所述修饰的氨基酸是选自由以下组成的组：修饰的酪氨酸、修饰的色氨酸和修饰的甲硫氨酸。在额外实施方案中，所述修饰的酪氨酸处于ApoA1内选自由以下组成的组的位置处：29、166、192和236。在进一步实施方案中，所述修饰的甲硫氨酸处于ApoA1内选自由以下组成的组的位置处：86、112和148。在其它实施方案中，所述样品是来自受试者，并且其中所述方法进一步包括以下行为中的至少一个：i)向所述受试者或所述受试者的医师告知所述受试者处于增加的心血管疾病(CVD)风险中；ii)向所述受试者或所述受试者的医师提供质谱报告；iii)向所述受试者推荐、开立处方或施用CVD相关治疗剂；和iv)向所述受试者推荐、开立处方或施用与检测CVD风险有关的跟踪测试。

在一些实施方案中，一种系统包括：a)包括质谱仪的器件；和b)包含HDL分子的纯化的HDL样品，其中所述HDL分子包含：i)非片段化ApoA1蛋白，和ii)HDL标记分子，所述HDL标记分子各自包含：i)HDL亲脂核结合肽，和ii)亲和标签。

在某些实施方案中，本文中提供包括以下的方法：a)混合含有HDL分子和非HDL生物分子的群组的初始样品与可检测标记的ApoA1分子的群组以产生混合样品，其中所述HDL分子各自包含：i)HDL亲脂核和ii)多种原生ApoA1蛋白，并且其中所述可检测标记的ApoA1分子是选自：ApoA1蛋白、ApoA1蛋白片段、ApoA1蛋白变体和ApoA1模拟物；b)孵育所述混合的样品，使得至少一些所述ApoA1分子结合至少一些所述HDL分子，由此产生标记的HDL分子的群组；c)纯化所述标记的HDL分子的群组的至少一部分与所述非HDL生物分子分开以产生包含所述标记的HDL分子的纯化的样品；和d)分析所述纯化的样品以便确定可检测标记的ApoA1分子与所述原生ApoA1蛋白的比率。在某些实施方案中，采用所述比率来确定所述样品中所述HDL的逆向胆固醇转运能力。

在某些实施方案中，所述可检测标记的ApoA1分子包含放射性标记的原子。在其它实施方案中，所述可检测标记的ApoA1分子包含可检测标记。在进一步实施方案中，所述可检测标记是选自：荧光标记、亲和标签、化学发光标记、抗体标记或酶标记。在进一步实施方案中，分析所述纯化的样品是用包括质谱法的方法执行。

在某些实施方案中，经由本文所述的亲和标签纯化方法捕获的HDL的量与初始样品中HDL的总量相比以便确定用作所述样品中HDL的逆向胆固醇转运能力的代表的比率。总HDL的确定可通过测量HDL胆固醇来执行，所述测量通常使用“均相”分析来执行，所述分析使用以特定顺序添加的所选试剂以“清除”含有脂蛋白ApoB的LDL胆固醇粒子的血清样品。随后，使用传统酶偶联分析以化学方式确定HDL胆固醇。测量总HDL也可利用HDL粒子分离的物理方法，典型地超速离心来执行(例如Warnick等人,Clinical Chemistry2001年9月第47卷第9期1579-1596，以引用的方式并入本文)。

在一些实施方案中，经由本文所述的亲和标签纯化方法捕获的原生ApoA1的量与初始样品中原生ApoA1的总量相比以便确定用作所述样品中HDL的逆向胆固醇转运能力的代表的比率。ApoA1是各HDL粒子的主要脂蛋白组分。虽然HDL胆固醇而非ApoA1的确定已经是心血管风险评估的主要支持，但由于ApoA1的确定可用于亚临床动脉粥样硬化的鉴别，这种观点正在改变(Florvall等人,Journal of Gerontology:BIOLOGICAL SCIENCES 2006,第61A卷,第12期,1262–1266，以引用的方式并入本文)。总ApoA1典型地使用广泛可得的免疫分析平台分析来测量。

附图描述

图1示出当由实施例1中的方法分离时ApoA1(主要HDL相关蛋白)和血清白蛋白的丰度。图1B示出当使用超速离心从血清纯化ApoA1时ApoA1和血清白蛋白的丰度。

图2示出来自实施例1的各种制剂的SDS page，包括：1)梯带；2)血清(1:50稀释度)；3)Ni-NTA HDL制剂(10ul)；4)UC HDL制剂(10ul)；和5)ApoA1(从人纯化，5ug)。

图3示出针对完整ApoA1的示例性质谱谱图。在本图中，分别在标称m/z值878、851和826下的电荷状态32、33和34提供最强烈信号。

图4A-C示出ApoA1和ApoA1单一氧化的完整检测结果。具体说来，图4A示出使用在标称分辨率1000下操作的质谱仪时ApoA1的原生和氧化形式针对+35电荷状态(+H加合物)的理论分辨率。指示了归因于不充足分辨率的在两种形式之间的信号重叠。图4B示出使用在标称分辨率2000下操作的质谱仪时ApoA1的原生和氧化形式针对+35电荷状态(+H加合物)的理论分辨率。指示了归因于不充足分辨率的在两种形式之间的信号重叠。图4C示出使用在标称分辨率10000下操作的质谱仪时ApoA1的原生和氧化形式针对+35电荷状态(+H加合物)的理论分辨率。在这一实施例中，各峰充分地彼此分辨。

图5A和5B示出在大约2500FWHM的标称分辨率下操作的低分辨率离子阱(图5A)上所收集的ApoA1和ApoA1氧化形式的+35电荷状态的数据，而底部图(图5B)示出在>30,000FWHM的标称分辨率下qTOF仪器操作所收集的相同样品。

图6示出来自HDL蛋白的混合物的质谱数据、针对ApoA1和血清白蛋白的特定信号可如何通过过滤特定信号来选择性地进行提取。顶部图(图6A)示出在色谱操作中在质谱仪上观察到的总信号。中间图(图6B)示出通过过滤在m/z 803.38下针对+35电荷状态的数据而导出的ApoA1信号。底部图(图6C)示出来源于在m/z 1231下的+54电荷状态的污染物血清白蛋白。

图7示出条形图，所述条形图示出在LDL缺失/不缺失的纯血清中标记的ApoA1和原生HDL相关蛋白的回收。

图8示出条形图，所述条形图示出从使用标记的ApoA1与原生ApoA1的增加的比率的血清纯化的HDL中标记的ApoA1和原生HDL相关蛋白的回收。

图9A和9B示出A)扩增图，所述扩增图示出两个患者样品的快速纯化的HDL以及阳性对照中miRNA-223和miRNA-16(内源对照)的RT-PCR，和B)条形图，所述条形图示出扩增的miRNA-223的相对丰度。

图10A和10B示出来自相同样品的人血清(A)和快速纯化的HDL(B)的粒子概况分析。

定义

如本文所用，“高密度脂蛋白”或“HDL”是使得如胆固醇和三酸甘油酯的脂质能够在基于水的血流中转运的两亲蛋白的循环、非共价组合件。HDL由约50质量％的使脂质乳液稳定化的两亲蛋白构成，所述脂质乳液由用游离胆固醇(约4％)包埋的磷脂单层(约25％)和具有三酸甘油酯(约3％)和胆固醇酯(约12％)的核构成。HDL的亚类包括HDL2和HDL3。HDL2粒子较大并且含有较高含量的脂质，而HDL3粒子较小并且含有较少脂质。进一步亚类包括(从最大粒子至最小粒子)HDL2b、HDL2a、HDL3a、HDL3b和HDL3c。

如本文所用，“脂蛋白”是指一种或多种脂质分子连接或能够连接的蛋白的类型。在一些情况下，脂蛋白可为“脂质贫乏脂蛋白”，其中结合磷脂的四个或更少分子。如本文所用，脂蛋白包括不连接脂质但可在HDL粒子中进行交换的蛋白(例如载脂蛋白)。

如本文所用，“样品”是指待测试的较大整体中的一部分。样品包括但不限于体液，如血液、脑脊髓液、尿液、唾液等。

如本文所用，“血液样品”是指全血样品或来源于其的血浆或血清部分。在某些实施方案中，血液样品是指人血液样品，如全血或来源于其的血浆或血清部分。在一些实施方案中，血液样品是指非人哺乳动物(“动物”)血液样品，如全血或来源于其的血浆或血清部分。

如本文所用，术语“全血”是指尚未部分化并且含有细胞和流体组分的血液样品。

如本文所用，“血浆”是指所述全血的流体、非细胞组分。视所用的分离方法而定，血浆可完全地不含细胞组分，或可含有多种量的血小板和/或少量的其它细胞组分。因为血浆包括多种凝血因子，如纤维蛋白原，所以术语“血浆”与如下文陈述的“血清”不同。

如本文所用，术语“血清”是指全哺乳动物血清，例如全人血清、来源于测试动物的全血清、来源于宠物的全血清、来源于家畜的全血清等。此外，如本文所用，“血清”是指已经去除凝血因子(例如纤维蛋白原)的血浆。

详述

本发明提供使用包含HDL亲脂核结合肽(例如，ApoA1的部分)和亲和标签的HDL标记分子纯化来自样品(例如，血液样品)的HDL分子的方法、试剂盒和组合物。在某些实施方案中，所述HDL纯化是快速的(例如，少于1小时)并且允许至少一种心血管风险因素(例如，胆固醇水平、ApoA1的氧化状态等)的确定。本发明还提供用质谱法检测全长ApoA1而不片段化ApoA1的方法、试剂盒和组合物。本发明进一步提供用可检测标记的ApoA1分子标记样品中的HDL分子，使得可确定可检测标记的ApoA1分子与原生ApoA1蛋白的比率的方法、试剂盒和组合物。

I.HDL标记分子

在某些实施方案中，本发明采用HDL标记分子将亲和标签添加至HDL分子中。HDL标记分子各自包含：i)HDL亲脂核结合肽，和ii)亲和标签。

A.HDL亲脂核结合肽

所述HDL标记分子的HDL亲脂核结合肽组分可为可结合HDL分子(例如成熟HDL分子)并且可连接于亲和标签的任何类型的分子。所述结合肽可包括例如至少ApoA-I、ApoA-II和ApoE的脂质结合部分。

ApoA-I是作为HDL的主要组分的脂蛋白。apoA-I蛋白的实例为人apoA-I蛋白(例如登录号NM_000039.1)。人apoA-I蛋白的其它实例为ApoA-1米兰蛋白和apoA-爱荷华蛋白。所述术语还涵盖来自例如小鼠、大鼠、兔、狗、猪、非人灵长类动物等的非人哺乳动物的apoA-I蛋白。术语apoA-I还涵盖apoA-I的同系物。在某些实施方案中，HDL核结合肽包含ApoA1的脂质结合部分。

ApoA-II是作为HDL的第二最丰富组分的脂蛋白。ApoA-II蛋白的实例为人ApoA-II蛋白(例如NP_001634)蛋白。所述术语还涵盖来自例如小鼠、大鼠、兔、狗、猪、非人灵长类动物等的非人哺乳动物的ApoA-II蛋白。在某些实施方案中，HDL结合肽包含ApoAII的脂质结合部分。

ApoE是指牵涉于脂质代谢和胆固醇转运中的脂蛋白。apoE蛋白的实例为人apoE蛋白(例如NM_000041.2)蛋白。存在人apoE蛋白的三种亚型ApoE2、ApoE3、ApoE4。ApoE3是apoE的主要形式，而apoE2和apoE4在脂蛋白粒子(HDL、LDL、VLDL)当中呈现不同分布。所述术语还涵盖来自例如小鼠、大鼠、兔、狗、猪、非人灵长类动物等的非人哺乳动物的apoE蛋白。在某些实施方案中，HDL结合肽包含ApoE的脂质结合部分。

在某些实施方案中，ApoA1蛋白、片段、模拟物用于HDL脂质结合肽中，尤其是ApoA1中能够结合HDL的部分。ApoA1的HDL结合部分论述于例如Murphy ISRN Physiology,2013,文章ID186365；以引用的方式并入本文)中。ApoA1可包括全长人ApoA1肽或其片段或结构域(例如包含A类两亲螺旋)。在某些实施方案中，HDL结合肽包含ApoA1模拟物或其片段。ApoA1模拟物包括例如本领域中已知的ApoA1的天然变体。例如，Weisgraber等人已经示出半胱氨酸可在称作ApoA1-米兰的突变型ApoA1中的位置173处取代精氨酸(Weisgraber等人(1983)J.Biol.Chem.258:2508-2513，以引用的方式并入本文)。ApoA1多肽模拟物也可包括来自ApoA1形式和变体的多肽，所述变体包括例如载脂蛋白A-1(Brewer等人,(1978))、载脂蛋白A-1米兰(Weisgraber(1983))、载脂蛋白A-1巴黎(Bielicki和Oda(2002)Biochemistry 41:2089-2096)、前载脂蛋白A-1或本领域中已知的ApoA1的任何其它突变形式(无论以合成方式形成抑或天然存在)。

在某些实施方案中，ApoA1的HDL结合区包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-43或SEQ IDNO:1的氨基酸5-38或SEQ ID NO:1的氨基酸1-43，除了一个或两个氨基酸缺失或改变但不破坏所述序列的HDL结合能力。在其它实施方案中，ApoA1的HDL结合区包含SEQ ID NO:1的氨基酸220-241或210-241或SEQ ID NO:1的223-238或220-241，除了其中一个或两个氨基酸缺失或改变但不破坏所述序列的HDL结合能力。在某些实施方案中，ApoA1的HDL结合区包含SEQ ID NO:1的氨基酸44-65或SEQ ID NO:1的氨基酸47-62或SEQ ID NO:1的氨基酸44-65，除了一个或两个氨基酸缺失或改变但不破坏所述序列的HDL结合能力。在某些实施方案中，ApoA1的HDL结合区包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-43和220-241或SEQ ID NO:1的氨基酸5-38和223-238或SEQ ID NO:1的氨基酸1-43和220-241，除了一个或两个氨基酸缺失或改变但不破坏所述序列的HDL结合能力。在特定实施方案中，ApoA1的HDL结合区包含SEQ IDNO:1的氨基酸1-43和/或220-241和/或44-65，或SEQ ID NO:1的氨基酸5-38和/或223-238和/或47-62，或所述氨基酸序列，除了一个或两个氨基酸缺失或改变但不破坏所述序列的HDL结合能力。人ApoA1(SEQ ID NO:1)的各种HDL结合区描述于Frank和Marcel,2000,J.Lipid Res.,41:853-872和Tanaka,J.Pept.Sci.,2009,15(1):36-42中，所述文献均以引用的方式并入本文，特定地是关于ApoA1和其HDL结合区的序列。Frank和Marcel的图1也特定地以引用的方式并入。这个图示出狒狒、狗、猪、兔、牛、刺猬、小鼠、大鼠、鸡、鸭和鲑鱼的Apoa1序列。这个图允许确定这些物种中对应于人序列的1-43、220-241和44-65的HDL结合区。所述序列预期为本发明描述的某些实施方案中ApoA1的HDL结合区。本领域技术人员可采用Frank和Marcel、Tanaka等人所描述的方法和以下实施例来确定ApoA1的特定序列(例如，具有一种或多种氨基酸改变)是否结合HDL(例如，通过用候选HDL结合序列再操作所述实验)。

可产生的氨基酸改变为ApoA1、ApoA2和ApoE，或其片段，所述改变不会破坏其结合HDL脂蛋白的能力。所述变体可通过使用例如以下实施例中所述的分析来分析所提出的变体并且针对结合HDL进行测试来鉴别。氨基酸取代一般是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。氨基酸侧链取代基的尺寸、形状和类型的分析披露了精氨酸、赖氨酸和组氨酸均为带正电的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸均为相似尺寸。因此，基于这些考虑，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸在本文中定义为生物学功能等同物。根据由Alton等人(WO83/04053；以引用的方式并入本文)公布的申请中描述的程序，可容易地设计并且制造针对具有不同于本文中关于一种或多种残基的身份或位置指定的构象的主要构象(例如，取代、末端和中间添加和缺失)的多肽的微生物表达进行编码的基因。或者，cDNA和基因组基因的修饰可容易地通过众所周知的定点诱变技术来实现并且用于产生ApoA1、ApoA1和ApoE的类似物和衍生物。

B.亲和标签

本发明不受用作所述HDL标记分子的一部分的亲和标签限制。所述标签的实例包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、绿色荧光蛋白(GFP)、AviTag(允许通过酶BirA进行生物素标记的肽并且因此所述蛋白可通过抗生蛋白链菌素分离)、钙调蛋白-标签(通过蛋白钙调蛋白结合的肽)、聚谷氨酸标签(有效地结合如Mono-Q的阴离子交换树脂的肽)、FLAG-标签(通过抗体识别的肽)、HA-标签(通过抗体识别的肽)、His标签(一般为通过镍或钴螯合物结合的5-10个组氨酸)、Myc-标签(通过抗体识别的短肽、S-标签、SBP-标签(结合抗生蛋白链菌素的肽)、Softag 1、Strep-标签(结合抗生蛋白链菌素或被称作streptactin的修饰的抗生蛋白链菌素的肽)、TC标签(通过FlAsH和ReAsH双砷化合物识别的四半胱氨酸标签)、V5标签、Xpress标签、Isopeptag(共价结合菌毛素-C蛋白的肽)和SpyTag(共价结合SpyCatcher蛋白的肽)。在某些实施方案中，所述标签是基于点击化学。

所述亲和标签可直接偶联于HDL磷脂核结合肽，或可通过如连接子的介入分子分离。在某些实施方案中，连接子用于所述HDL亲脂核结合肽与所述亲和标签之间。合适连接子的实例包括但不限于PEG连接子、肽连接子、烷基或取代的烷基连接子等。在一些实施方案中，亲和标签和HDL亲脂核结合肽直接地缀合、系栓、稠合等(例如，经由共价键)。在其它实施方案中，两个部分通过合适连接子连接。本发明不限于任何特定的连接子部分。在一些实施方案中，所述连接子连接两个部分。在一些实施方案中，所述连接子部分共价地连接两个部分。在一些实施方案中，连接子部分是可裂解的(例如，可化学裂解、可酶裂解等)，使得暴露于适当条件(例如，裂解酶)会裂解连接子部分并且分离所连接的部分。在一些实施方案中，所述连接子部分是共价键，其为：直链、支链、环状、杂环、饱和、不饱和或多种其组合。在一些实施方案中，所述连接子包含选自C、N、P、O和S的组的1-100个非氢原子(加上氢原子)(例如1-75、1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、1-5个等)。在一些实施方案中，所述连接子包含烷基、醚、硫醚、聚醚、胺、烷基、酰胺、酯、羧酰胺、磺酰胺、酰肼键和芳族或杂芳族键的任何组合。在一些实施方案中，所述连接子包含聚合物(例如核酸、多肽、脂质或多糖)、肽连接子、修饰的肽连接子、聚(乙二醇)(PEG)连接子、抗生蛋白链菌素-生物素或抗生物素蛋白-生物素连接子、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、官能化PEG、多糖、葡糖胺聚糖、如在WO93/06868中和由Tomalia等人在Angew.Chem.Int.Ed.Engl.29:138-175(1990)中描述的树枝状聚合物、如在W94/08629、WO94/09056和WO96/26754中描述的PEG-螯合剂聚合物、寡核苷酸连接子、磷脂衍生物、烯基链、炔基链、二硫化物或其合适组合。在一些实施方案中，连接子部分包含能够将第一和第二部分稳定地串在一起的任何共价或非共价分子连接子。

II.检测技术

本发明不受用于检测HDL和/或ApoA1(例如，用本文所述的方法分离)的方法限制。

A.检测方法

在某些实施方案中，经由本文所述的纯化方法分离的HDL(和缔合的ApoA1)用选自以下的检测方法检测：表面等离子体共振、体外分析、活性分析、免疫共沉淀分析、质谱法、荧光能量转移(FRET)、生物发光能量转移(BRET)、干涉测量法、生物层干涉测量法(BLI)、双偏振干涉测量法(“DPI”)、椭圆光度法和石英晶体微量天平(参看例如美国专利公布20130017556，以引用的方式整体并入本文)。

B.完整ApoA1的质谱检测

在某些实施方案中，本文中提供经由质谱法检测完整ApoA1蛋白(即，未消化、全长ApoA1)的方法。野生型蛋白ApoA1由特定氨基酸序列编码。这一序列表示在去除24个氨基酸的前体序列之后的功能性蛋白并且在以下SEQ ID NO:1中示出：

DEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ(SEQ ID NO:1)

ApoA1的质量由基于所述序列的ApoA1的原子组成导出。原子式为C₁₂₄₁H₁₉₇₇N₃₄₇O₃₈₉S₃，其给出28078.26Da的标称、平均中性质量。

在一个示例性实施方案中，在血清或血浆中的完整ApoA1可通过质谱法由以下方法检测。为通过LC/MS进行分离并且检测作准备，完整ApoA1蛋白在大体上水性条件下(例如，94.8％水、5％有机物和0.2％酸，其中所述有机物典型地为甲醇、乙腈或异丙醇，并且所述酸典型地为乙酸或甲酸)注射至HPLC柱上。由于蛋白的疏水性质，所述ApoA1蛋白结合所述柱并且盐和其它亲水性污染物在溶剂的恒定流下被冲走。为了分辨ApoA1与可存在于样品中的其它蛋白，调节所述溶剂流经过所述柱的组成以增加有机调节剂的百分比。这种变化可在样品或复杂线性梯度或一系列步骤中调节，使得具有不同结合亲和力的蛋白可在不同溶剂组成下从所述柱洗脱。来自HPLC柱的洗脱液可转移至多个检测器(UV/Vis、光散射等)。为了通过LC/MS进行检测，将洗脱液发送至基于控制气相粒子的行为检测分子的质谱仪，使得其可通过其质荷(m/z)比进行分辨。这一过程中的第一步骤是产生气相蛋白离子，所述离子典型地通过电喷雾电离产生。在这一过程中，溶剂在允许氢离子保持加合至所述蛋白从而形成带电气相离子的条件下从蛋白分子去除。在电场中，所述离子被吸引至质谱仪中，其中其通过其m/z比进行分辨。在多种分子的情况下，z可具有大于1的值并且ApoA1的全扫描谱是指导性的。所述谱是复杂的，其中所述谱中的各峰对应于具有针对所述信号的指定电荷状态(z)的ApoA1。完整ApoA1的示例性谱在图3中示出。

原则上，所鉴别的电荷状态中的任一个均可用于定量具有明显益处/限制的ApoA1。在示例性图3中，分别在标称m/z值878、851和826下的电荷状态32、33和34提供用于选择性检测的最强烈信号。然而，在某些实施方案中，如果存在干扰那些离子的其他共洗脱分子，那么可能无法始终使用所述最强烈信号。针对带多个电荷的离子的电荷状态分布可视多种参数进行修饰，所述参数包括流动相组成、热和气流以及电场强度。另外，也可使用除氢外的加合物。例如，钠原子具有单一正电荷，但具有23Da的质量。如果在电荷状态32下的ApoA1包含1个钠和31个质子的加合物，那么标称质量将为m/z 879。因此，将其它离子种类添加至色谱溶剂中在某些实施方案中可为修饰电荷状态分布的有用方式。可使用的加合物包括但不限于钠、钾、锂、铵。

完整ApoA1的质谱检测可用于鉴别ApoA1的修饰(例如，氧化)形式。在某些实施方案中，所述修饰与心血管疾病检测和风险评估有关。可检测的所述修饰包括修饰的甲硫氨酸(例如，对砜形成敏感)、色氨酸氧化和酪氨酸修饰(例如酪氨酸氯化、硝化或溴化)。ApoA1中用于检测关于酪氨酸的心血管疾病风险的最相关位置是位置29、166、192和236(参看例如美国专利8,338,110，以引用的方式整体并入本文)。关于甲硫氨酸，已知三个位置尤其相关(Met86、Met 112和Met148)，其均可氧化，使甲硫氨酸转化为亚砜形式(参看Pankhurst等人,J.Lipid Res.,44:349-355,2003；Shao等人,J Lipid Res.2010年7月；51(7):1849–1858；和Shao等人,Chem Res Toxicol.2010年3月15日；23(3):447–454；其均以引用的方式并入本文)。在生物样品中，这一过程的后果是ApoA1分子的整体可存在，其中亚砜的数目可介于0-3范围内。在其中可需要特定地确定ApoA1的量和在所述整体中各氧化形式的特定贡献的情况下，质谱仪应能够在足以区别各形式与其它形式的分辨率下操作。在图4a-c中，证明对所述质谱仪的分辨率的影响。使用ApoA1和具有在+35电荷状态下的单一氧化的ApoA1(分别为m/z 803.38和803.84)，提供来源于具有1000、2000和10000FWHM的分辨率的仪器的模型化数据。在较高分辨率下，归因于重叠的较低电荷氧化状态至较高电荷状态的同位素贡献减至最低。为了实现小于2％的归因于同位素重叠的贡献，所述质谱仪应在5000FWHM或更大的分辨率下操作。较低分辨仪器的使用一般将使得使用峰解卷积来估算并且随后校正重叠的信号成为必要。在某些实施方案中，采用如TOF或Orbitrap的高分辨率质量分析仪并且所述分析仪偏好使用低分辨率离子阱或四极。图5示出在大约2500FWHM的标称分辨率下操作的低分辨率离子阱(顶部图，图5A)上所收集的ApoA1和ApoA1氧化形式的+35电荷状态的数据。底部图(图5B)示出在>30,000FWHM的标称分辨率下qTOF仪器操作所收集的相同样品。

因为质谱法能够通过质量分辨离子，所以如果分辨率和质量差异充分，那么可分辨在质谱仪中洗脱的复杂蛋白混合物。特定针对所选择的质量的产生色谱图(萃取离子色谱图–EIC)可生成特定针对所述分子的色谱图。图6示出来自HDL蛋白的混合物的质谱数据、针对ApoA1和血清白蛋白的特定信号可如何通过过滤特定信号来选择性地进行提取。顶部图(图6A)示出在色谱操作中在质谱仪上观察到的总信号。中间图(图6B)示出通过过滤在m/z 803.38下针对+35电荷状态的数据而导出的ApoA1信号。底部图(图6C)示出来源于在m/z1231下的+54电荷状态的污染物血清白蛋白。

III.HLD、ApoA1和心血管疾病相关性

在某些实施方案中，采用完整ApoA1(例如修饰的ApoA1)的质谱检测和/或本文所述的HDL纯化方案通过用所述方法测试患者样品来检测患者中的心血管疾病(CVD)或CVD的风险。

例如，在某些实施方案中，所述方法可用于确定HDL支持逆向胆固醇转运的能力。逆向胆固醇转运(RCT)是一种用于从肝外细胞和组织去除过量胆固醇和最终转运至肝脏以便排泄，因此减少动脉中胆固醇的积聚的途径。RCT的评估是有价值的，例如用于估算总体心血管风险并且评估旨在加速RCT的可能疗法的效率。虽然本发明不限于任何特定机制，但相信ApoA1交换的程度(例如，当添加标记的或以其它方式标记的ApoA1至含有HDL的患者样品中时)直接与其脂质流出和载运能力有关。因此，在某些实施方案中，游离ApoA1(例如亲和标记的ApoA1)添加至系统中并且采用分析来确定多少所添加的ApoA1最终与HDL粒子缔合。

一个用于进行所述评估的示例性实施方案如下。首先，混合含有HDL的血清与标记的ApoA1，使得可从标记的ApoA1鉴别内源ApoA1。所述标记可能例如经由同位素并入、独特亲和标签的添加、额外氨基酸的添加或欲添加的ApoA1的化学修饰来并入。在混合物平衡之后，预期一定比例的HDL现在含有标记的ApoA1。在某些实施方案中，可能需要去除过量的标记的ApoA1以促进并入水平的测量。因此，采用能够分辨HDL与未并入的ApoA1的超速离心或其它分离技术。最后，使用任何合适技术来测量HDL(如果执行的话)以确定标记的ApoA1与未标记的ApoA1的比率。在所述方法中，高水平的ApoA1并入指示所述HDL分子具有高水平的逆向转运能力(一般对于心血管疾病健康来说是良好的)，并且具有低水平的逆向转运能力的HDL分子显示增加的心血管疾病风险。

第二示例性实施方案如下。首先，混合含有HDL的血清与标记的ApoA1，使得可从标记的ApoA1鉴别内源ApoA1并且所述标记可用于促进分离(例如，亲和标签用作所述标记)。在混合物平衡之后，一定比例的HDL现在将含有标记的ApoA1。接着使用亲和树脂来分离所有标记的ApoA1并且经由将所述标签并入所述HDL粒子中出现任何部分的内源ApoA1。最后，使用任何合适技术来测量HDL以确定标记的ApoA1与未标记的ApoA1的比率。在这种情况下，未标记的ApoA1的量是重要的值，因为其基于并入程度而产生。也可能确定所捕获的HDL与总的可得HDL的比率。

在某些实施方案中，分析ApoA1的氧化以评估CVD疾病风险。氧化的ApoA1具有如与未氧化的ApoA1相比减少的胆固醇流出刺激活性。因此，用本文所述的组合物和方法检测患者样品中提高水平的氧化的ApoA1可用于确定受试者处于患有心血管疾病的风险中(参看例如美国专利8,338,110，以引用的方式并入本文)。在某些实施方案中，询问酪氨酸残基，包括位置29、166、192和236(例如，以确定这些位置是否氯化或硝化)。

实施例

实施例1

从样品纯化HDL分子并且表征

这一实施例描述了使用连接于亲和标签的ApoA1分子纯化HDL分子的方法，以及表征纯化的HDL分子的方法。

快速分离功能性HDL

通过传统方法使人血清缺失LDL粒子。具体说来，人血清的600uL等分试样与40uL硫酸葡聚糖/氯化镁溶液混合。有力地搅动所述样品，在室温下孵育10分钟并且通过在6,600xg下离心10分钟来去除含有ApoB的沉淀物。倾析上清液并且用于进一步实验。

为了实现HDL纯化，12uL ApoB缺失的血清与24uL亲和标记的ApoA1和4uL PBS混合。这一实施例中的亲和标签是聚组氨酸。有力地混合所述样品并且在37℃下孵育。在用ApoB缺失的血清孵育his标记的ApoA1之后，所述样品用500uL 10mM咪唑缓冲液稀释。虽然本发明不受任何特定机制限制，并且应了解并非必需所述机制来实施本发明，但相信his标记的ApoA1置换成熟HDL分子上的典型地4-7种原生ApoA1蛋白之一，由此添加标签至成熟HDL分子中。所述样品应用于含有Ni-NTA亲和介质的离心柱中以捕获his标记的ApoA1和缔合的HDL。所述离心柱短暂地离心以分离his标记的ApoA1和缔合的HDL粒子。所述离心柱接着用500uL 20mM咪唑缓冲液洗涤以去除未特定结合的蛋白。最后，通过添加500mM咪唑缓冲液的200uL等分试样来洗脱结合的HDL粒子。

蛋白表征

通过LC-MS和SDS-PAGE凝胶电泳分析纯化的HDL蛋白库。关于在LC-MS之前的分析分离，使用在溶剂A(水+0.2％甲酸)中递增浓度的溶剂B(乙腈+0.2％甲酸)的多相、线性梯度用Waters柱(50×0.75uM,C18)执行所有形式的ApoA1(原生或标记的)。将HPLC洗脱液引导至以全扫描模式操作的Thermo Velos质谱仪中。

蛋白鉴别

使用分离的HDL粒子的胰蛋白酶和Lys-c消化的LC-MS/MS分析来确定HDL相关蛋白。在37℃下通过添加内蛋白酶Lys-C来消化使用超速离心或亲和标签-纯化获得的相同血清样品的三个重复制剂持续4小时。通过纳米流逆相液相色谱(C18柱75μm i.d.×100mm,15min.梯度)分离所得肽并且通过LTQ-Orbitrap Elite质谱仪进行检测。使用MaxQuant软件搜索质谱数据，所述软件采用安卓搜索引擎来产生存在于各样品中的蛋白的列表。

蛋白定量

使用ELISA分析来定量ApoA1。

PON1活性

Pon1是具有规定酶活性的HDL相关蛋白。根据Eckerson等人(Am J HumGenet.1983年11月；35(6):1126–1138)通过使用乙酸苯酯作为底物监测芳基酯酶活性来确定PON1活性。

胆固醇流出

在Vascular Strategies上评估胆固醇流出。所述分析确定了分离的HDL经由ABCA1转运体转运胆固醇离开细胞的能力。

结果

所述方法允许高纯度的功能性HDL粒子在温和条件下从人血清/血浆快速分离。

HDL相关蛋白的存在

HDL的一个特点是所述粒子的蛋白组成。多种研究已经证明了多种不同蛋白与HDL相关，其中ApoA1作为主要蛋白组分(例如，每个HDL分子典型地4-7种ApoA1蛋白)。虽然所用的质谱方法未针对蛋白质组覆盖的深度进行优化，但所鉴别的蛋白ID列表(下表1)与文献良好一致。

表1

从亲和柱洗脱的HDL相关蛋白的高度富集组成证明了来自血清的HDL粒子使用上文所述的亲和标记的ApoA1方法成功地分离。在HDL制备中仅鉴别了两种非特异性蛋白(血清白蛋白和核结合蛋白)。血清蛋白被识别为所有基于血清的蛋白质组学实验中的普遍存在污染物。核结合蛋白未作为HDL相关蛋白加以报告并且可表示对用于捕获his标记的ApoA1的镍亲和树脂具有非特异性亲和力的蛋白。

快速分离的HDL粒子的纯度

SDS page和LC-MS实验证明了快速分离的HDL的纯度。图1A指示当通过亲和方法分离时来自血清的主要HDL相关蛋白ApoA1和其相对丰度。当与图1B中示出的优质标准超速离心制备相比时，所述亲和制备的纯度是示例性的。SDS page结果在图2中示出。来自LC-MS和LC-MS/MS操作的强度数据的分析指示了his-标签纯化含有比可相当的超速离心制备少大约12倍的血清白蛋白。

分离的HDL粒子的功能

已知HDL具有多种生物功能，包括脂质转运、胆固醇流出、抗氧化剂和消炎行为以及内皮活化。对氧磷酯酶1是已知与HDL相关的具有酯酶和对氧磷酯酶活性的双功能酶。在使用亲和标记的ApoA1快速纯化HDL粒子之后，所述分离的粒子显示具有酯酶活性。所述粒子还显示具有ABCA1特异性胆固醇流出活性。

ApoA1亲和标签纯化方法的示例性益处

通过亲和色谱法进行的亲和ApoA1纯化的两种示例性益处是速度和纯度。使用亲和分离制备HDL可在15分钟内完成。例如，血清样品与适量亲和标记的ApoA1混合并且孵育1-10分钟以允许其与HDL粒子缔合。在用亲和树脂(NiNTA或Co-NTA珠粒)短暂平衡(例如1-2分钟)之后，过量蛋白用缓冲液洗掉并且在咪唑或酸的单一应用下从所述珠粒洗脱。这在15分钟或更少时间内产生具有>90％的表观纯度的HDL。

相比之下，用于HDL的分离的替代方法大体上更耗时。来自人血浆的HDL的平衡超速离心一般耗时18-24小时，但产生高质量HDL制剂，所述制剂已经被视为优质标准。尺寸排阻色谱法可每两小时制备1种样品并且已经广泛地使用，但产生稀释的部分，所述部分与大体上较低纯度有关，尤其对于较小HDL尺寸的粒子来说。

实施例2

从纯和LDL缺失的血清纯化HDL分子

这一实施例描述了使用来自LDL缺失的或纯(非ApoB/LDL缺失的)血清的亲和标记的ApoA1纯化HDL分子。

快速分离HDL

人血清如实施例1所述缺失LDL粒子或立即用于快速HDL分离而无LDL缺失。关于快速HDL纯化，12uL纯和LDL缺失的血清与24uL ¹⁵N标记的亲和标记的ApoA1混合。在这一实施例中，亲和标签为聚组氨酸。短暂地混合所述样品并且在37℃下孵育。在孵育之后，所述样品用10mM咪唑缓冲液稀释至700uL。25uL Ni-NTA亲和顺磁珠粒添加至所述样品中并且短暂地孵育以结合并入所述标记的ApoA1的HDL分子以及任何额外未并入的标签。所述珠粒依序用300uL 20mM咪唑缓冲液洗涤两次以去除非特异性结合的蛋白，接着用90uL 300mM咪唑缓冲液洗脱。10uL 0.5ng/uL内蛋白酶LysC接着添加至洗脱的HDL样品中并且在37℃下孵育四小时以使HDL相关蛋白特异性地裂解为用于LC-MS表征的特异性肽。

纯化的HDL表征

来自快速纯化的HDL的LysC消化的肽产物使用在溶剂A(水+0.1％甲酸)中递增浓度的溶剂B(乙腈+0.1％甲酸)的多相、线性梯度在Phenomenex逆相HPLC柱(3.0×50mm,C18)上分离。洗脱的肽直接地通过以多重反应监测模式操作的Agilent 6490三重四极质谱仪检测以检测对HDL相关蛋白有特异性的肽。

结果

对HDL相关蛋白有特异性的肽以及标记的ApoA-I在纯血清和LDL缺失的血清样品中进行检测，所述标记的ApoA-I可通过用¹⁵N富集标记的ApoA1来区别。图7示出标记的ApoA1和原生HDL特异性ApoA1和ApoA2的强度。这些结果指示无需先前LDL缺失而从患者血清快速地分离HDL的能力。

实施例3

用于快速HDL纯化的标记的ApoA1:原生ApoA1比率的优化

这一实施例描述了HDL分子的快速分离，其中标记的ApoA1的量具有变化以使分子回收增至最大。

快速分离HDL

关于快速HDL纯化，10uL纯(非LDL缺失的)人血清与24uL含有1、2、5、10、20、40或80ug总的标记的ApoA1(分别对应于1:10、1:5、1:2、1:1、2:1、4:1和8:1的标签:原生ApoA1比率)的¹⁵N标记的亲和标记的ApoA1混合。所述比率是基于以下假定来确定：人血清样品中的平均总ApoA1为约1mg/mL(ug/uL)。在这一实施例中，亲和标签为聚组氨酸。短暂地混合所述样品并且在37℃下孵育。在孵育之后，所述样品用10mM咪唑缓冲液稀释至700uL。25uL Ni-NTA亲和顺磁珠粒添加至所述样品中并且短暂地孵育以结合并入所述标记的ApoA1的HDL分子以及任何额外未并入的标签。所述珠粒依序用300uL 20mM咪唑缓冲液洗涤两次以去除非特异性结合的蛋白，接着用90uL 300mM咪唑缓冲液洗脱。10uL 0.5ng/uL内蛋白酶LysC接着添加至洗脱的HDL样品中并且在37℃下孵育四小时以使HDL相关蛋白特异性地裂解为用于LC-MS表征的特异性肽。

纯化的HDL表征

结果

图8示出标记的ApoA1、原生ApoA1和来自同一血清样品的纯化的HDL分子的原生ApoA-II的所测量的强度，在所述同一血清样品中使用变化量的标记的ApoA1来捕获HDL。标记的ApoA1可使用¹⁵N同位素标记从而产生可通过质谱法检测的独特质量特征的标记的ApoA1与原生ApoA-I区别。如所预期，标记的ApoA1的信号强度当在较大的标签:原生比率下使用时增加。如实施例1所说明，虽然本发明不受任何特定机制限制，并且应了解并非必需所述机制来实施本发明，但相信his标记的ApoA1置换成熟HDL分子上的典型地4-7种原生ApoA1蛋白之一，由此添加标签至成熟HDL分子中。这在图8中原生ApoA1的强度中观察到，因为所述强度增加直至1:1的比率，接着当标签:原生比率进一步增加时降低。假设这是每个HDL粒子中多个ApoA1分子被置换，从而以较大速率置换原生ApoA1的结果。未交换的另一HDL特异性蛋白ApoA2的测量充当总的HDL回收的指示。观察到ApoA2在1:1比率下增至最大并且当标签:原生ApoA1的比率进一步增加时达到稳定时期。

实施例4

ApoA1标记的纯化的HDL的表征

这一实施例描述了用于表征通过本文所述的亲和标记的方法分离的HDL的额外程序。

脂肪酸分析

His6标记的ApoA-I(0.5mg/mL)与人血清以1:2体积比组合并且在37℃下孵育15分钟。所得样品用10mM咪唑、50mM磷酸钠、300mM氯化钠(pH 8.0)稀释至700μL并且在室温下用含有Ni-NTA的顺磁珠粒孵育10分钟。所述珠粒用反萃取的血清洗涤两次并且用30μL 300mM咪唑洗脱。洗脱的HDL与500uL 2％硫酸在无水甲醇中组合并且在密封小瓶中在65℃下加热1.25小时。所得脂肪酸甲酯使用液-液萃取被萃取至1mL庚烷中。去除有机层并且所述庚烷在干燥氮气流下蒸发。所述脂肪酸甲酯通过添加氢氧化钠水解为脂肪酸并且随后通过LC-MS针对19种常见脂肪酸进行分析。

以下脂肪酸在HDL中依以下比例被检测：C14:0，肉豆蔻酸，0.4％；C15:0，0.1％，十五烷酸；C16:0，14.％，1.6％，棕榈酸；C16:1，棕榈油酸；C18:0，硬脂酸，10.7％；C18:1，油酸，19.7％；C18:2n6，25.5％，亚油酸；C18:3，亚麻酸，1.2％；C20:0，花生酸；C20:1，痕量％，二十碳二烯酸，0.2％；C20:2n6，二十碳二烯酸，0.2％；C20:3n6，高-γ-亚麻酸，4.2％；C20:4n6，17.2％，花生四烯酸；C22:2n6，二十二碳二烯酸，0.4％；C22:4n6，肾上腺酸，0.5％；C22:5n6，二十二碳五烯-6酸，0.3％；C20:5n3二十碳五烯酸0.8％；C22:6n3二十二碳六烯酸，1.9％；C22:5n3，二十二碳五烯酸，0.6％。在标记的ApoA1不存在下，未检测到脂肪酸。在HDL样品中检测的脂肪酸的组成不同于全血脂肪酸概况，显示不饱和脂肪酸的增加的比例。

miRNA分析

来自血清、快速纯化的HDL(使用本文所述的标记的ApoA1方法)和阳性血清对照的总RNA使用PureLink miRNA分离试剂盒(Life Technologies)分离并且再悬浮于无核酸酶的水中。使用TaqMan微RNA逆转录试剂盒(Life Technologies)执行逆转录。5μL总RNA(1-10ng)与1.0mM dNTP、3.33U/μL逆转录酶、1x逆转录缓冲液、0.25U/μL RNA酶抑制剂和共计12ul的无核酸酶的水混合。3μL 5x RT引物接着添加至共计15μL的RT反应混合物中。在Eppendorf MasterCycler pro热循环仪中根据制造商的说明书进行RT反应(30分钟，16℃；30分钟，42℃；5分钟，85℃；4℃保持)。cDNA存储于-15℃至-25℃下，或直接用于miRNA的定量分析。

使用TaqMan微RNA单一分析(分析ID002295,Life Technologies)来评估成熟miRNA-223表达。样品针对miRNA-16表达标准化(分析ID000391,Life Technologies)。关于PCR反应，1.0ul TaqMan miRNA分析与1.33ul cDNA、10ul TaqMan通用PCR反应混合物II(无UNG)和7.67ul无核酸酶的水以总计20ul混入反应混合物中。所有样品均一式两份操作。在Life Technologies Standard 7500实时PCR系统中执行实时PCR，其中循环条件为95℃持续10分钟，随后45个循环：95℃保持，15秒，接着60℃保持，60秒。执行比较性Ct分析以评估相对基因表达。图9中示出的结果指示在不同患者HDL样品中的差异miRNA-223表达，其水平类似于从未处理的血清样品(阳性对照)分离的miRNA的那些。

粒径分析

His6标记的ApoA-I(0.5mg/mL)与人血清以1:2体积比组合并且在37℃下孵育15分钟。所得样品用10mM咪唑、50mM磷酸钠、300mM氯化钠(pH 8.0)稀释至700μL并且在室温下用含有Ni-NTA的顺磁珠粒孵育10分钟。所述珠粒用反萃取的血清洗涤两次并且在反萃取的血清中用30μL 300mM咪唑洗脱。10μL在反萃取的血清中洗脱的HDL通过微流体电泳使用Agilent 2100Bioanalyzer分离。所得粒子概况披露了对应于洗脱的样品中的HDL2、HDL2b和HDL3粒子的存在的峰(图10)处于类似于未富集的血清样品中的相同峰的相对丰度下。

本申请中提到的所有出版物和专利均以引用的方式并入本文。本发明的所述方法和组合物的各种修改和变化将为本领域的技术人员显而易知的，而不偏离本发明的范围和精神。尽管本发明已经结合特定优选的实施方案加以描述，应了解所要求的本发明不应不当地限于所述特定实施方案。实际上，相关领域的技术人员显而易知的所述用于进行本发明的模式的多种修改意图在以下权利要求书的范围内。

序列表

<110> 克利夫兰心脏实验室公司（CLEVELAND HEARTLAB, INC.）

<120> 用于HDL和APOA1的纯化和检测的组合物和方法

<130> CHL-33754/WO-1/ORD

<150> US 61/933,696

<151> 2014-05-15

<160> 1

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 1

Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr

1 5 10 15

Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln

20 25 30

Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp

35 40 45

Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu

50 55 60

Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu

65 70 75 80

Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys

85 90 95

Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met

100 105 110

Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu

115 120 125

Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu

130 135 140

Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg

145 150 155 160

Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala

165 170 175

Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr

180 185 190

His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys

195 200 205

Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser

210 215 220

Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu

225 230 235 240

Asn Thr Gln

Claims

1.一种产生纯化的样品的方法，所述方法包括：

a)混合含有HDL分子和非HDL生物分子的群组的初始样品与HDL标记分子的群组以产生混合样品，

其中所述HDL分子各自包含：i)HDL亲脂核和ii)多种HDL脂蛋白，和

其中所述HDL标记分子各自包含：i)HDL亲脂核结合肽，和ii)亲和标签；

b)孵育所述混合的样品，使得至少一些所述HDL标记分子结合至少一些所述HDL分子，由此产生标记的HDL分子的群组；和

c)纯化所述标记的HDL分子的群组的至少一部分与所述非HDL生物分子分开以产生纯化的样品，其中所述纯化包括使所述混合的样品与对所述亲和标签有特异性的捕获分子的群组接触。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述HDL亲脂核结合肽包含载脂蛋白A-I(ApoA1)的HDL结合区，并且其中所述多种HDL脂蛋白包含未标记ApoA1分子。

3.如权利要求2所述的方法，其中将所述HDL标记分子添加至所述初始样品中，使得所述HDL标记分子与所述未标记ApoA1分子的比率为1:2-2:1。

4.如权利要求2所述的方法，其中在所述HDL分子的每一个中的所述多种HDL脂蛋白包含第一和第二原生ApoA1蛋白，并且其中当所述标记的HDL分子结合所述HDL分子时，所述HDL标记分子的至少一个置换在所述HDL分子的每一个中的所述第一原生ApoA1蛋白。

5.如权利要求2所述的方法，其中所述HDL亲脂核结合肽包含ApoA1或ApoA1模拟物的至少一部分。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述初始样品包含血清样品。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述血清样品是非LDL缺失的。

8.如权利要求1所述的方法，其中在所述纯化的样品中的所有所述蛋白的至少90％是所述HDL脂蛋白。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述方法在1小时或更少时间内从所述初始样品产生所述纯化的样品。

10.一种组合物，其包含：

a)HDL标记分子的群组，所述分子包含：

i)ApoA1或ApoA1模拟物的至少一部分，其能够结合HDL，和

ii)亲和标签；和

b)未标记、野生型ApoA1分子的群组；

其中存在于所述组合物中的所述HDL标记分子与所述未标记分子的所述比率为1:2-2:1。

11.如权利要求10所述的组合物，其中所述组合物进一步包含人血清。

12.如权利要求11所述的组合物，其中所述人血清是非LDL缺失的人血清。

13.如权利要求10所述的组合物，其中所述亲和标签不含不成对电子。

14.如权利要求10所述的组合物，其中所述未标记、野生型ApoA1分子是HDL分子的一部分。

15.一种系统，其包括：

a)HDL标记分子，所述分子包含：

i)HDL亲脂核结合肽，和

ii)亲和标签；和

b)捕获分子的群组，其中所述捕获分子对所述亲和标签有特异性。

16.如权利要求15所述的系统，其中所述HDL亲脂核结合肽包含载脂蛋白A-I(ApoA1)的HDL结合区。

17.如权利要求15所述的系统，其中所述HDL标记分子在第一容器中，并且其中所述捕获分子的群组在第二容器中。

18.一种组合物，其包含：

a)非LDL缺失的血清样品；和

b)HDL标记分子的群组，各自包含：

i)HDL亲脂核结合肽，和

ii)亲和标签。

19.如权利要求18所述的组合物，其中所述HDL亲脂核结合肽包含载脂蛋白A-I(ApoA1)的HDL结合区，并且其中所述非LDL缺失的血清样品包含未标记ApoA1分子。

20.如权利要求19所述的组合物，其中所述HDL标记分子存在于所述非LDL缺失的血清样品中，使得所述组合物中所述HDL标记分子与所述未标记ApoA1分子的比率为1:2-2:1。