CN106566873B - 用于法医学个体识别的分子标记和试剂盒 - Google Patents

用于法医学个体识别的分子标记和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属法医遗传学技术领域，具体涉及用于法医学个体识别与亲子鉴定的分子标记和试剂盒。所述分子标记包含177个高分辨率单核苷酸多态遗传标记位点，其中的35个可由其它分子标记位点替代，具有非常明显优于其它分子标记系统的鉴别能力(达到2.096×10‑71到7.590×10‑71)；所述分子标记适用于不同分型技术平台，且与当前主要使用的短片段重复遗传标记试剂盒兼容。所述分子标记中所有40及以上的分子标记可组合应用，或其中的一个或多个分子标记可与其它相同应用的分子标记构成应用。本发明还提供基于第二代测序平台Ion Torrent的试剂盒。

Description

用于法医学个体识别的分子标记和试剂盒
技术领域
本发明属于法医遗传学领域，具体涉及一个用于法医学个体识别与亲子鉴定等应用的分子标记和试剂盒。
背景技术
DNA证据一般应用于人类个体识别领域，指犯罪现场DNA分型与法医数据库DNA分型的唯一匹配，需要在法庭诉讼过程中提交。同时，DNA证据也可用于进行亲权鉴定，一般为判定父母与孩子是否是亲生关系。DNA证据是法医物证鉴定领域的核心内容，使得提供DNA证据的法医学遗传标记位点成为人们关注的焦点。
目前世界主要国家(如美国、欧洲及中国等)主要使用十几至二十多个短片段重复遗传标记位点(Short tandem repeats,STRs)作为DNA证据。这些位点可以在一次PCR中进行扩增，并在毛细管电泳中进行样本各个位点等位基因的检测。
单核苷酸多态遗传标记位点(Single nucleotide polymorphisms,SNP)是由单个碱基的突变造成，且一般定义为在人群中的最小等位基因频率大于1％。虽然STR在法医学中的应用较为成功，但SNP相比STR具有诸多优势，使得其更适合作为标准的法医学分子标记位点。这些优点包括：
(1)SNP广泛分布于人类基因组上，意味着候选位点众多；
(2)SNP可用于推测犯罪嫌疑人的生物学祖先及表型；
(3)SNP可以设计比STR短的PCR扩增子，使得SNP位点可以很好的用于高度降解样本的分型；
(4)SNP位点的突变率低，一般在10-8，远比STR的小(STR的突变率一般在10-3)，使得SNP可以在亲权鉴定中被更好的应用；
(5)SNP已经在新的技术平台上(如第二代测序技术)实现了实验到分析的自动化操作，并且有潜力在未来的便携化分型设备上被更好的利用。
本发明通过设计一套系统化的筛选方法，从全基因组上大约360万个位点中最优的筛选出一组SNP位点用于法医学个体识别和亲权鉴定的应用。共筛选出177个在全球人群中高分辨率、低等位基因频率差异的常染色体SNP位点，而这些位点构成了高分辨率、多平台支持的SNP个体识别分型系统：复旦大学SNP分型体系(Fudan SNP panel，简写FID)。
与本发明相关的现有技术有：
1.Chakraborty,R.,Stivers,D.N.,Su,B.,Zhong,Y.X.&Budowle,B.The utilityof short tandem repeat loci beyond human identification:Implications fordevelopment of new DNA typing systems.Electrophoresis.20,1682-1696(1999).。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够进行法医学个体识别和亲权鉴定的分子标记及其应用，。
该应用能否应用的行业标准为：群体中的随机匹配概率小于等于10-15[1]。随机匹配概率是两个不同个体DNA分型结果偶然匹配的概率。对于一个特定的基因型，随机匹配概率等于群体中该基因型的期望频率。估计的随机匹配概率越低，说明两份检材偶然匹配的可能性越低，即两份检材来自同一个体的概率越大，证据越可靠。
具体的，本发明提供了177个常染色体单核苷酸多态遗传标记位点，通过对这些位点进行分型，通过比对犯罪现场和可疑犯罪人员，或父母与孩子的分型结果而实现。
本发明提供的177个常染色体单核苷酸多态遗传标记位点中，任取40个及以上的分子标记的组合均可完成本次应用。
本发明提供的177个常染色体单核苷酸多态遗传标记位点中，部分1-39个分子标记的组合达到行业标准，可完成本次应用。
本发明提供的177个常染色体单核苷酸多态遗传标记位点中，部分1-39个分子标记的组合可连同其它不包含在本次177个位点、且具有相同应用的分子标记一起构成本次应用，其它相同应用的分子标记包括短片段重复遗传标记位点(Short tandem repeats,STRs)、单核苷酸多态遗传标记位点(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)及插入缺失遗传标记位点(Insertion or deletions,Indels)等。
本发明提供的177个常染色体单核苷酸多态遗传标记位点中，任取40个及以上的分子标记的组合，连同其它不包含在本次177个位点、且具有相同应用的分子标记一起，可构成本次应用，其它相同应用的分子标记包括短片段重复遗传标记位点(Short tandemrepeats,STRs)、单核苷酸多态遗传标记位点(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)及插入缺失遗传标记位点(Insertion or deletions,Indels)等。
本发明提供的177个常染色体单核苷酸多态遗传标记位点中，有35个分子标记可由其它1个或多个分子标记替代。这些替代的其它分子标记是单核苷酸多态遗传标记位点，其可替代的原理为：其频率分布与本次35个分子标记分别具有强关联性(连锁不平衡)，使得其也具有相同的应用和效力。本次35个分子标记及对应可替换它的分子标记包括(其中，“——”前是本35个分子标记，后面是对应可替换的分子标记，由“；”分隔)：rs6424243——rs10797586；rs918331——rs13392863；rs2053911——rs6542479；rs7596380——rs6436899；rs1054975——rs2728949；rs716620——rs2304723；rs1487052——rs2129498；rs11722834——rs12499696；rs6536667——rs10023526；rs10517844——rs9992011；rs4518370——rs2656994；rs4868851——rs6875996；rs2053315——rs876922；rs2715107——rs2237453；rs507226——rs637577；rs10100663——rs13276787；rs11042840——rs11042841；rs9888281——rs1940001；rs1863370——rs2032414；rs4456584——rs7229040；rs9964333——rs8084507；rs994487——rs6039586；rs1000551——rs1201919；rs451826——rs448887；rs13554——rs2833930；rs2838788——rs2838787；rs9613776——rs4140643；rs2962520——rs248780、rs7715679；rs4075260——rs13265939、rs3935742；rs556968——rs561643、rs665554；rs9323218——rs4420443、rs731715；rs11155994——rs1521279、rs1521280、rs6934382；rs4813947——rs1997931、rs6104671、rs6108722；rs8074909——rs6504450、rs6504451、rs6504452、rs7215972；rs1206523——rs2064127、rs4712953、rs4712954、rs9461189、rs9467552。
进一步，本发明提供了一种用于法医学个体识别和亲权鉴定的试剂盒，其包括一系列检测所述的分子标记的引物。
更具体的，所述的的试剂盒包括：
(1)检测177个位点的特异性引物对，这些特异性引物对使用AmpliseqTM超高重PCR技术合成(Thermo Fisher Scientific Company,Carlsbad,USA)。位点号及引物序列表如表1所示。
(2)聚合酶链式(polymerase chain reaction,PCR)反应组件，包括IonAmpliSeqTM Library Kit 2.0(Thermo Fisher Scientific Company)、FuPa Reagent(Thermo Fisher Scientific Company)、Ion XpressTM Barcode adapters(Thermo FisherScientific Company)、Agencour
Figure BDA0000881293000000041
XP Reagent(Beckman Coulter)、DynaMag TM-96Side Magnet(Thermo Fisher Scientific Company)、70％乙醇溶液、
Figure BDA0000881293000000042
dsDNA HSAssay Kit(Thermo Fisher Scientific Company)、
Figure BDA0000881293000000043
2.0Fluorometer(ThermoFisher Scientific Company)、Ion Library Quantitation Kit(Thermo FisherScientific Company)。
(3)模板制备反应组件，包括OneTouchTM 200Template Kit v2DL(Thermo FisherScientific Company)、Ion OneTouchTM DL configuration(Thermo Fisher ScientificCompany)、Template-positive ISPs(Thermo Fisher Scientific Company)、IonOneTouchTM ES(Thermo Fisher Scientific Company)。
(4)测序反应组件，包括Ion 314TM或Ion 318TM芯片(Thermo Fisher ScientificCompany)、Ion PGMTM 200Sequencing Kit(Thermo Fisher Scientific Company)、IonTorrent Personal Genome Machine(Thermo Fisher Scientific Company)。
本发明还提供了使用上述试剂盒进行法医学个体识别和亲权鉴定的应用，具体步骤如下：
(1)采集生物样本并提取DNA 1-10ng；
(2)使用本试剂盒，特异性扩增包含177个常染色体单核苷酸多态位点的DNA片段，并对所获得DNA片段进行测序，得到所有位点的基因型数据；
(3)根据所得到的分型结果进行比对，得到个体识别或亲权鉴定结果。
本发明提供了包含177个高分辨率单核苷酸多态遗传标记位点，其中的35个可由其它分子标记位点替代，具有非常明显优于其它分子标记系统的鉴别能力(达到2.096×10-71到7.590×10-71)；所述分子标记适用于不同分型技术平台，且与当前主要使用的短片段重复遗传标记试剂盒兼容。所述分子标记中所有40及以上的分子标记可组合应用，或其中的一个或多个分子标记可与其它相同应用的分子标记构成应用。本发明还提供基于第二代测序平台Ion Torrent的试剂盒，用于法医学个体识别与亲子鉴定，其中使用的引物对数越多，分型的效果越好。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实验例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件进行。
实施例1：177个法医学个体识别单核苷酸多态位点在729个中国样本上的二代测序验证
1、中国样本的采集
研究对象为729个中国样本，分布于9个中国人群，包括99个山东汉族、82个广东汉族、97个吉林汉族、98个青海汉族、87个江苏汉族、50个傣族、87个蒙古族、73个藏族以及56个维吾尔族。所有样本依据知情同意原则签署知情同意书。
2、基因分型
提取样本DNA后，对包含177个单核苷酸多态位点的DNA片段进行扩异性扩增，并对所获得的DNA片段进行测序，得到177个位点的基因型数据。
3、结果分析
使用9个中国人群在177个位点上的基因型数据，估计得到表征试剂盒鉴别能力的统计量随机匹配概率，证明试剂盒在全球主要人群的随机匹配概率达到2.096×10-71到7.590×10-71，低于行业标准10-15，结果证明所述177个位点适用于本次应用。
实施例2：177个法医学个体识别单核苷酸多态位点中，随机抽取一万次40、80、120、160个位点的组合，估计这些组合在9个中国人群中的随机匹配概率。
1、中国样本的采集
研究对象为729个中国样本，分布于9个中国人群，包括99个山东汉族、82个广东汉族、97个吉林汉族、98个青海汉族、87个江苏汉族、50个傣族、87个蒙古族、73个藏族以及56个维吾尔族。所有样本依据知情同意原则签署知情同意书。
2、基因分型
提取样本DNA后，对包含177个单核苷酸多态位点的DNA片段进行扩异性扩增，并对所获得的DNA片段进行测序，得到177个位点的基因型数据。
3、结果分析
随机抽取1万个位点组合，这些组合包括40个分子标记位点。对应每一个组合，去除对应中国样本基因型数据，估计得到9个中国人群中的随机匹配概率分布于2.914×10-17到8.724×10-16，低于行业标准10-15，从而证明所有40个位点的组合适用于本次应用；
随机抽取1万个位点组合，这些组合包括80个分子标记位点。对应每一个组合，去除对应中国样本基因型数据，估计得到9个中国人群中的随机匹配概率分布于2.238×10-33到1.453×10-31，低于行业标准10-15，从而证明所有80个位点的组合适用于本次应用；
随机抽取1万个位点组合，这些组合包括120个分子标记位点。对应每一个组合，去除对应中国样本基因型数据，估计得到9个中国人群中的随机匹配概率分布于2.282×10-49到1.521×10-47，低于行业标准10-15，从而证明所有120个位点的组合适用于本次应用；
随机抽取1万个位点组合，这些组合包括160个分子标记位点。对应每一个组合，去除对应中国样本基因型数据，估计得到9个中国人群中的随机匹配概率分布于4.276×10-65到9.569×10-64，低于行业标准10-15，从而证明所有160个位点的组合适用于本次应用；
通过上述分析，证明随机匹配概率的大小随着使用的分子标记的增加而减小，从而证明使用越多的分子标记位点可提供更好的法医学应用。
通过上述分析，证明所有40个及以上的位点的组合均适用于本次应用。
实施例3：177个法医学个体识别单核苷酸多态位点中，35个位点与其它位点的连锁不平衡分析。
1、35个位点及50个对应强关联位点在全球13个重要人群中的基因型数据研究对象为1050个全球样本，分布于13个人群，包括包括56个ASW(美国西南部非洲裔祖先的后代)、85个CEU(美国犹他州的北欧及西欧的后代)、97个CHB(中国北京汉族)、93个CHS(中国南方汉族)、60个CLM(哥伦比亚的麦德林人)、93个FIN(芬兰人)、89个GBR(英格兰和苏格兰的英国人)、89个JPT(日本东京人)、87个LWK(肯尼亚韦布耶Luhya人)、60个MXL(美国洛杉矶的墨西哥裔)、55个PUR(秘鲁人)、98个TSI(意大利的托斯卡尼人)和88个YRI(尼日利亚伊巴丹的约鲁巴人)。
2、基因分型结果
所有样本基因型数据下载于千人全基因组数据库(http:// www.1000genomes.org/)。
3、结果分析
使用r2作为度量两个位点关联强度的统计量。在群体遗传学中，r2是最常用的用于度量两两位点之间连锁不平衡强弱的统计量，其值分布于0-1，越接近1，说明两个位点之间的连锁不平衡强度越大，其频率在群体中的关联程度越强。在群体中，如果位点A和B具有强连锁不平衡，则可使用B的频率推测出A的频率。一般认为r2值大于0.3为强连锁。
本发明中，发现35个位点与50个其它位点具有非常高的r2值，具体为(其中，“——”前是本次35个分子标记，后面是对应可替换的分子标记)：rs6424243——rs10797586、rs918331——rs13392863、rs2053911——rs6542479、rs1054975——rs2728949、rs716620——rs2304723、rs1487052——rs2129498、rs11722834——rs12499696、rs6536667——rs10023526、rs10517844——rs9992011、rs4518370——rs2656994、rs2962520——rs248780、rs2962520——rs7715679、rs4868851——rs6875996、rs11155994——rs1521279、rs11155994——rs1521280、rs11155994——rs6934382、rs2053315——rs876922、rs2715107——rs2237453、rs507226——rs637577、rs10100663——rs13276787、rs4075260——rs13265939、rs4075260——rs3935742、rs11042840——rs11042841、rs556968——rs561643、rs556968——rs665554、rs9888281——rs1940001、rs1863370——rs2032414、rs9323218——rs4420443、rs9323218——rs731715、rs8074909——rs6504450、rs8074909——rs6504451、rs8074909——rs6504452、rs8074909——rs7215972、rs4456584——rs7229040、rs9964333——rs8084507、rs994487——rs6039586、rs4813947——rs1997931、rs4813947——rs6104671、rs4813947——rs6108722、rs1000551——rs1201919、rs451826——rs448887、rs2838788——rs2838787、rs9613776——rs4140643在13个人群中r2值均大于0.3；rs7596380——rs6436899和rs13554——rs2833930在11个人群中r2值均大于0.3；rs1206523——rs2064127、rs1206523——rs4712953、rs1206523——rs4712954、rs1206523——rs9461189、rs1206523——rs9467552在7个人群中r2值均大于0.3。
上述结果证明所述35个位点的等位基因频率与对应50个位点的等位基因频率在全球重要人群中具有强关联性，证明其在本次应用中能够得到相同的效力。
表1引物序列
Figure BDA0000881293000000081
Figure BDA0000881293000000091
Figure BDA0000881293000000101
Figure BDA0000881293000000111
Figure BDA0000881293000000121

Claims (8)

1.一种用于个体识别的分子标记，其特征在于，包括下述177个单核苷酸多态位点：rs6678302,rs12742293,rs6671669,rs12042109,rs10779650,rs2453236,rs537250,rs6424243,rs4971514,rs1734440,rs6432423,rs12990278,rs918331,rs13028059,rs2053911,rs13031497,rs2122080,rs1561393,rs6717510,rs7596380,rs1054975,rs711725,rs716620,rs11927356,rs2176993,rs11716835,rs9856667,rs774763,rs905457,rs1104570,rs6790068,rs11714258,rs4697215,rs4235308,rs4832887,rs6813884,rs12640116,rs2164537,rs1381964,rs1502770,rs4449484,rs1487052,rs13113625,rs11722834,rs6536667,rs10517844,rs17062044,rs7441242,rs7703985,rs10057763,rs2371382,rs7710068,rs10474433,rs4518370,rs1848483,rs1898625,rs6885821,rs11745646,rs4512160,rs700702,rs2188471,rs2962520,rs4868851,rs295999,rs17137114,rs926533,rs2782195,rs1206523,rs2235254,rs6914356,rs6933870,rs6934646,rs9352768,rs7767965,rs2747737,rs9320609,rs6927250,rs3757155,rs545242,rs909981,rs11155994,rs4709032,rs2285914,rs4723858,rs2053315,rs2715107,rs12386695,rs6961695,rs507226,rs3801786,rs2157752,rs1024676,rs10100663,rs7814747,rs11779605,rs13279230,rs11779762,rs4075260,rs13255815,rs1887619,rs944662,rs7857478,rs4878020,rs10820181,rs11788825,rs4880651,rs10490978,rs1999942,rs7911308,rs7095088,rs6482647,rs11042840,rs10765879,rs7945310,rs10501269,rs3758758,rs12362773,rs556968,rs238925,rs10790071,rs948690,rs11217974,rs9888281,rs1863370,rs11832736,rs10505850,rs6421248,rs11174191,rs7980449,rs7979370,rs7297643,rs968360,rs7137797,rs1571182,rs689338,rs7329072,rs9598152,rs6572117,rs9323218,rs7159423,rs7160304,rs910792,rs676476,rs899086,rs11642358,rs1898230,rs12924985,rs2926143,rs7211529,rs8074909,rs790085,rs12605006,rs4456584,rs8089593,rs9964333,rs1217612,rs4801083,rs3809990,rs7234184,rs11665154,rs6565924,rs994487,rs4813947,rs761015,rs6106298,rs8118105,rs8125857,rs4811868,rs1000551,rs915857,rs2826949,rs451826,rs13554,rs2836791,rs2837768,rs2838788,rs9613776；
所述分子标记在全球主要人群中具有高分辨率、低等位基因频率差异、不同基因分型或测序平台适用性及与短片段重复位点兼容的特性；所述分子标记的鉴别能力由随机匹配概率表示，为4.77×10-71到1.06×10-64；
所述单核苷酸多态位点中随机选择40个及40以上的分子标记的组合其匹配概率低于标准10-15；其中，所述的低于177个分子标记的组合的随机匹配概率分布于2.914×10-17到8.724×10-16；177个分子标记的组合的随机匹配概率分布于4.77×10-71到1.06×10-64。
2.根据权利要求1所述的用于个体识别的分子标记，其特征在于，所述的分子标记组合中的任一组合与其它相同应用的分子标记构成应用；所述的其它相同应用的分子标记包括短片段重复遗传标记位点(Short tandem repeats,STRs)、单核苷酸多态遗传标记位点(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)及插入缺失遗传标记位点(Insertion ordeletions,Indels)。
3.根据权利要求1所述的用于个体识别的分子标记，其特征在于，其中35个分子标记可由其它1个或多个分子标记替代；所述替代的其它分子标记是单核苷酸多态遗传标记位点，所述35个分子标记及对应可替换的分子标记包括：
rs6424243——rs10797586；rs918331——rs13392863；rs2053911——rs6542479；rs7596380——rs6436899；rs1054975——rs2728949；rs716620——rs2304723；rs1487052——rs2129498；rs11722834——rs12499696；rs6536667——rs10023526；rs10517844——rs9992011；rs4518370——rs2656994；rs4868851——rs6875996；rs2053315——rs876922；rs2715107——rs2237453；rs507226——rs637577；rs10100663——rs13276787；rs11042840——rs11042841；rs9888281——rs1940001；rs1863370——rs2032414；rs4456584——rs7229040；rs9964333——rs8084507；rs994487——rs6039586；rs1000551——rs1201919；rs451826——rs448887；rs13554——rs2833930；rs2838788——rs2838787；rs9613776——rs4140643；rs2962520——rs248780、rs7715679；rs4075260——rs13265939、rs3935742；rs556968——rs561643、rs665554；rs9323218——rs4420443、rs731715；rs11155994——rs1521279、rs1521280、rs6934382；rs4813947——rs1997931、rs6104671、rs6108722；rs8074909——rs6504450、rs6504451、rs6504452、rs7215972；rs1206523——rs2064127、rs4712953、rs4712954、rs9461189、rs9467552。
4.一种用于法医学个体识别和亲权鉴定的试剂盒，其特征在于，包括一系列检测如权利要求1中所述的分子标记的引物，检测引物，其中所述引物为：
Figure FDA0003736290840000041
Figure FDA0003736290840000051
Figure FDA0003736290840000061
Figure FDA0003736290840000071
Figure FDA0003736290840000081
5.按权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中，在177对引物中随机选择至少40对，实现该试剂盒分型目标，且使用的引物对数越多，分型的效果越好。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，其中，1)所有位点可使用1个PCR反应进行扩增；2)使用DNA量为1-10ng。
7.如权利要求1-3任一项所述的分子标记在用于制备法医学个体识别和亲权鉴定试剂盒中的用途。
8.一种进行法医学个体识别和亲权鉴定的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)采集生物样本并提取DNA 1-10ng；(2)使用权利要求4所述试剂盒，特异性扩增包含177个常染色体单核苷酸多态位点的DNA片段，并对所获得DNA片段进行测序，得到所有位点的基因型数据；(3)根据所得到的分型结果进行比对，得到个体识别或亲权鉴定结果。
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